Summary
Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.
Protocol
Nota: O texto abaixo descreve em pormenor um método para medir PtdInsPs em leveduras. Ele fornece os detalhes experimentais para as células de levedura de rotulagem com 3 H- mio-inositol, extraindo e desacilando lipídios e um protocolo de HPLC-eluição para fracionar e quantificar PtdInsPs desacilados. Por favor, note que a rotulagem, a desacilação, resolução e quantificação de PtdInsPs em células de mamíferos requerem otimização e perfis de HPLC-eluição mais longos. Esses detalhes podem ser encontrados em outros lugares, embora nós discutir alguns dos aspectos na discussão. Em geral, a metodologia para extrair os lípidos, desacilar e extrair o solúvel em água Gro-InsPs de levedura é determinada e é ilustrada na Figura 1.
1. Protocolo para Rotulagem e Análise PtdInsPs em leveduras
- Cultura de células e a marcação radioactiva
- Cresce de 20 ml de cultura líquido do SEY6210 estirpe de levedura a 30 ° C com agitação constante em sintético completomeios para a fase mid-log ou uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de cerca de 0,6-0,7.
Nota: Não use mídia YPD como isso pode afetar 3 H- mio-inositol incorporação. Este tamanho de cultura deve fornecer material suficiente para 2-3 corridas de HPLC. - Pellet um total de 10-14 OD das células de levedura (note que 1 mL de cultura com uma DO600 = 1 contém ~ 1x10 7 células) por centrifugação a 800 xg durante 5 min num tubo de 12 ml de fundo redondo. Ressuspender com 2 ml de livre-inositol mídia (IFM) (ver Tabela 1 para composição IFM).
- Repita centrifugação e aspirar a mídia. Ressuspender o sedimento com 440 ul de MFI e incubar à TA durante 15 min.
- Adicionar 60 ul de 3 H-mio-inositol (1 mL = 1 uCi) a cada amostra e incubar à temperatura crescente de 30 ° C durante 1 a 3 horas com agitação constante.
Cuidado: 3 H- mio-inositol é um companheiro radioativorial que deve ser tratado após o treinamento apropriado. Além disso, todos os produtos de consumo que fazem contacto com material contendo 3 H deve ser descartado de forma apropriada e designados como resíduos radioactivos.
Nota: A temperatura de crescimento podem ser alterados conforme necessário, desde que todas as estirpes a serem comparadas são cultivadas à mesma temperatura. - Transferir a suspensão de células (500 uL) para um tubo de microcentrifugadora contendo 500 ul de ácido perclórico a 9% e 200 uL de esferas de vidro lavadas com ácido. Misturar por inversão e incubar em gelo durante 5 min.
- Vortex a amostra à velocidade máxima durante 10 minutos e transferir os lisados para um novo tubo de microcentrífuga utilizando uma ponta de gel de carregamento a fim de evitar as esferas de vidro.
- Pellet da amostra a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento por banho de ultra-sons em 1 ml de EDTA a 100 mM arrefecido em gelo. Agregar novamente como antes.
- Cresce de 20 ml de cultura líquido do SEY6210 estirpe de levedura a 30 ° C com agitação constante em sintético completomeios para a fase mid-log ou uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de cerca de 0,6-0,7.
- Desacila�o e extração
- Aspirar o EDTA e sonicar o sedimento em 50 ul de água.
- Adicionar 500 ul de reagente a desacilação e sonicar a mistura. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
- Lípidos calor durante 50 min a 53 ° C num bloco de aquecimento. Secam-se as amostras completamente por centrifugação de vácuo ao longo de 3 horas ou O / N.
- Assegure-se que uma armadilha química está instalado entre o vácuo por meio de centrífuga e a bomba de vácuo, para evitar a entrada de vapores no ar.
- Ressuspender o sedimento com 300 ul de água por banho de sonicação e incubar à TA durante 20 min. Secam-se as amostras por centrifugação a vácuo durante 3 horas ou O / N. Repita este passo mais uma vez.
- Sonicar o sedimento com 450 ul de água. Esta é a fase aquosa durante a extracção.
- Recém preparar 10 ml da extraction reagente pela adição de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml de éter etílico e 0,40 ml de formato de etilo. Inverta para misturar.
- Adicionar 300 ul de reagente de extracção para a fase aquosa. Vortex a mistura à velocidade máxima durante 5 min e separar as fases por centrifugação a velocidade máxima (18.000 x g) durante 2 min.
- Recolher a fase aquosa inferior para um novo tubo de microcentrifuga, evitando a camada superior orgânica, a interface, e o sedimento. Repetir a extracção da fase aquosa mais duas vezes com reagente de extracção fresco.
- Completamente seca a camada aquosa recolhida por centrifugação a vácuo. Dispersa-se o sedimento em 50 ul de água por banho de sonicação.
- Adicionar 2 mL de cada amostra a 4 ml de fluido de cintilação num frasco de cintilação de 6 ml de polietileno. Determinar o número de contagens (em cpm) em cada amostra por cintilação líquida usando uma janela aberta.
- Armazenar as amostras a -20 ° C até estar pronto para a HPLC.
- Preparar tampão A por filtração 1 L de água ultrapura com uma garrafa topo filtro de 0,22 um vácuo, seguida de desgaseificação.
- Preparar tampão B, fazendo uma solução de 1 L de 1 M de fosfato de amónio dibásico (APS, MW 132,06) em água e ajustar o pH para 3,8 com ácido fosfórico. Filtra-se o fosfato de amónio com um frasco de topo filtro de 0,22 um vácuo, seguida de desgaseificação.
- Monte o frasco para injectáveis equipando um frasco de 2 ml com uma inserção de 250 ul volume pequeno de mola. Carga de 10 milhões de CPM e adicionar água para um volume total de 55 ul. Prepare um frasco vazio com 55 mL de água.
- Tapar os frascos com tampas de rosca equipado com um septo PTFE / silicone (lado vermelho de frente para o interior do frasco). Coloque cada frasco na bandeja de auto-amostragem do HPLC, começando com o frasco em branco.
- Use um HPLC e software associado que controla o fluxo de buffer, degasses buffers e controles de amostra injectiligar. Use um cintilador fluxo on-line e seu software associado para regular o caudal de cintilante e para monitorar o sinal de 3 H-decadência.
- Utilizar uma coluna de cromatografia líquida SAX com dimensões de 250 mm x 4,6 mm e contendo 5 uM de sílica na resina de HPLC. Equipar a coluna com uma coluna de guarda para evitar a injecção de contaminantes.
- Instalar uma célula compatível H-3 de fluxo de 500 uL na cintilador de fluxo.
NOTA: O fraccionamento pode ser realizado com um sistema de HPLC Agilent 1200 series infinito controlado por software Chemstation ou com outros sistemas de HPLC disponíveis comercialmente. Fluxo de cintilação do eluente de HPLC pode ser feito com um fluxo de cintilador β-RAM controlado pelo software Laura ou outro cintilador de fluxo disponível comercialmente ou software compatível.
- Inicializar a bomba quaternária, a uma taxa de fluxo de 1,0 ml / min com 100% de tampão A.
- Definir um perfil de equilíbrio no HPLCpara controlar o gradiente de tampões A e B (chamada de "Um protocolo de equilíbrio"): 1% de tampão B, durante 5 min, 1-100% de B durante 5 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 5 min, 1% de B durante 20 min. Definir o limite de pressão a 400 bar, 1,0 ml / min caudal, e 30 min tempo de execução.
- Defina-se um perfil de eluição (Figura 2) no HPLC para controlar o gradiente de tampões A e B (chamar este "Protocolo A"): 1% de B durante 5 min, 1-20% de B durante 40 min, 20-100% B durante 10 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 20 min, 1% de B durante 10 min. Definir o limite de pressão a 400 bar, 1,0 ml / min caudal, e 90 min tempo de execução.
- Configurar um protocolo de detecção no cintilador de fluxo (chamo isso de "Protocolo A detecção") para ser executado durante 60 minutos, com uma taxa de fluxo de fluido de cintilação de 2,5 ml / min e um tempo de permanência 8,57 seg.
- Programar uma sequência de injecção automática no HPLC para começar com o espaço em branco na água "Protocolo Um equilíbrio", seguido de each radiomarcado amostra em "Protocolo A". Inicializar a seqüência quando estiver pronto.
- Enquanto a corrida ainda está no protocolo de equilíbrio, criar um lote no cintilador fluxo para medir todas as amostras com "Protocolo A detecção." A injeção de cada nova amostra irá inicializar "Protocolo A" no HPLC, enquanto acionando o cintilador fluxo para começar "Protocolo A detecção."
- Após a conclusão de todas as corridas, lave a HPLC, a coluna eo fluxo cintilador com 100% de Tampão A durante 30 minutos a 1,0 ml / min caudal.
- Use um software de Laura ou qualquer outro software que pode quantificar o espectro de cromatografia. Os passos descritos nesta secção são representados na Figura 3.
- Abra os arquivos clicando em "Arquivo", "Abrir" e selecione o arquivo de dados brutos para cada amostra.
- Na aba "cromatogramas", zoom a esticar em cada um dos picos menores (cerca de 1000 contagens [eixo y]), mantendo a resolução de tempo. Zoom em cada pico indivíduo, se necessário.
- Realce cada um dos picos para a análise usando a opção "Adicionar ROI" ferramenta. Identificar picos por tempo de eluição: Parental Gro-Ins em 10 min, Gro-Ins3P aos 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 aos 29 min e Gro-Ins (4,5 ) P 2 em 32 min.
- Na aba "mesas regiões", gravar a "área (contagem)" de cada pico. Observe o "start (mm: ss)" o tempo eo "fim (mm: ss)" tempo de cada pico.
- Por subtracção do fundo, destacar uma região adjacente ao pico abrangendo a mesma quantidade de tempo. Subtrair o número de contagens do pico correspondente.
- Normalizar a área de cada pico parental contra Gro-Ins (expressa como "% do total de PtdIns"). Em seguida, normalizar cada um dos picos em cada condição experimental contra a condição de controle (expresso como "nfold aumento em relação ao controle ").
NOTA: Normalização de cada pico pode também ser feito contra as contagens totais, mas uma vez que o parental Gro-Ins é muito mais abundante do que todos os outros PtdInsPs os resultados tendem a ser semelhante. - Exportar os dados para os cromatógrafos pressionando "Arquivo", "Salvar como ...", e escolha a opção "CSV (separados por vírgula)" formato de arquivo. Plotar os dados em uma planilha e apresentar, se necessário.
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Representative Results
Usando este método, PtdInsPs de levedura foram marcadas metabolicamente com H-3 mio-inositol. Após marcação, os fosfolípidos foram precipitados com ácido perclórico, seguida por desacilação e fosfolípido extracção do Gro-InsPs solúvel em água (Figura 1). Nesta fase, é importante para quantificar o sinal radioactivo associado ao total de extraiu-Gro-InsPs por cintilação líquida para garantir suficiente rácio de sinal para ruído para os PtdInsPs muito baixa abundância como PtdIns (3,5) P 2; um total de 5-10 milhões de CPMs deve ser injectada. Uma vez que as células de levedura apresentam apenas quatro PtdInsPs, a resolução pode ser conseguido com um método de eluição em 1 h como descrito (Figura 2).
Aqui, de tipo selvagem, e vac14 atg18 ô ô mutantes de levedura foram marcadas e processada para analisar as alterações em PtdIns (3,5) P 2 e The menos abundante dos PtdInsPs em levedura 16,19,27. Como observado na Figura 4A-C, o perfil de eluição para todas as três estirpes produzidas 3 picos de sinal associada-H. O pico parental Gro-Ins elui primeiro (8-9 minutos; mostrado na Figura 3, mas não na Figura 4, uma vez Gro-Ins sobrepõe o sinal de espécies fosforiladas), seguido por Gro-Ins3P (~ 18 min), Gro- Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P 2 (~ 29 min) e Gro-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 minutos), o que corresponde, respectivamente, aos fosfolípidos PtdIns acilados, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P 2 e PtdIns (4,5) P 2. Há um par de picos menores adicionais a 4 min e que tende a seguir imediatamente o pai Gro-Ins (10 min); Estes representam, provavelmente inositol e um não-glycerated inositide fosfatos (Figura 3). O padrão de eluição é característica consistente e, embora o tempo exacto pode variar quando se emprega um difealugar sistema de HPLC e / ou uma nova coluna.
O pico associado com PtdIns (3,5) P 2 (Figura 4, seta vermelha) sofre a mudança mais dramática entre o tipo selvagem, atg18 Δ e cepas de leveduras vac14 ô. Em relação a células do tipo selvagem (A), há uma muito grande Gro-Ins (3,5) P 2 em células sinal -associated ô atg18 e um pico menor em células de levedura vac14 ô. A fim de quantificar o sinal radioactivo associado com cada um total de pico, as contagens foram integrados sob a área do pico (Figura 3). Além disso, uma vez que o sinal radioactivo absoluta varia entre amostras, a espécie Gro-Ins parental foi usada como um controlo interno através da normalização contra ele (pode-se também escolher para normalizar contra as contagens totais). Ao fazer isso, os dados sugerem que o PtdIns (3,5) P 2 constitui apenas 0,07% de PtdIns em células de levedura do tipo selvagem, enquanto de PtdIns (3,5) P 2 corresponde a 1,2% da PtdIns parental em células atg18 ô, ou um dramático aumento de 17 vezes em PtdIns (3,5) P 2 em relação às células do tipo selvagem (Figura 4A, B e D). Em comparação, PtdIns (3,5) P 2 andares foi de apenas 0,01% do sinal de PtdIns VAC14 -deleted em células de levedura, uma perda de 85%, em PtdIns (3,5) P 2 (Figura 4C e D). Em geral, estas medições estão de acordo com resultados publicados mostram que PtdIns (3,5) P 2 é de cerca de 0,1% de PtdIns em células do tipo selvagem, 90% reduzida em vac14 D, e 10 a 20 vezes mais elevadas nas células D atg18 relativamente às células de tipo selvagem 27,29.
Figura 1. Desacilação e extração de 3 H-Gro-Insp. Radiolabeled lipid precipitado com ácido perclórico é lavada com solução aquosa de EDTA. Este é então aspirado e adicionado reagente de desacilação e incubou-se a 53 ° C. A mistura de reacção de desacilação é, em seguida, seco sob vácuo e lavou-se duas vezes com água, seguido da adição de reagente de extracção. Este é em seguida agitada em vórtice, centrifugada e a fase aquosa é recolhida. O passo de extracção é repetido três vezes no total para remover contaminantes orgânicos e insolúveis. A fracção solúvel em água (azul), o que inclui 3 H-Gro-INSP, é, em seguida, seco sob vácuo e re-hidratadas com 60 ul de água. A quantidade de radioactividade é determinada por cintilação líquida (CPM) e contagens iguais em toda amostras são carregadas no HPLC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<br /> Figura 2. Gradiente de tampão fosfato de amônio para eluição de 3 H-Gro-Insp. resolução de Gro-INSP por cromatografia de troca aniônica forte depende da aplicação de fosfato dibásico de amónio, pH 3,8 (Tampão B). A escolha de gradiente depende da mistura de espécies Gro-INSP disponíveis para separação. Um protocolo é usada para amostras de leveduras, que possuem apenas quatro PtdInsPs. Resolução de cada um dos quatro picos é suficiente com um rápido aumento na (NH 4) 2 HPO 4 de concentração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. instrução guiada para a análise da abundância PtdInsP dados. Os arquivos de dados são carregados no Laura software e avaliadas visualmente utilizando o cromatógrafo (aberto por padrão). Usando o "zoom in" ferramenta (a), amplie os picos (b). Escolha picos distintos no cromatógrafo usando a ferramenta "adicionar ROI" (C). Na aba "tabela de região" (d), todas as informações resultantes das regiões destacadas de interesse é exibido como uma única tabela (e). Exportar as contagens brutas de cada pico (f) e normalizar cada espécie PtdInsP contra a phosphatidylinositol parental (g) ou contra as contagens totais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. PtdIns (3,5) P 2 em níveis de tipo selvagem e as células de levedura mutantes. Cromatógrafos representativos são mostrados para o fluxo de cintilação do extractoed 3 H-Gro-InsPs de tipo selvagem (A), atg18 Δ (B) e (C) vac14Δ cepas de leveduras utilizando protocolo A. As contagens brutas das regiões de interesse correspondentes a GRO-Ins (3,5) P 2 (seta) são extraídos a partir da cromatografia e fundo subtraído. Os valores resultantes são comparados com o tipo selvagem e expressa como vezes de alteração na Gro-Ins (3,5) P 2 níveis (D). Os níveis e mudanças na Gro-Ins (3,5) P 2 são interpretados para mostrar os níveis e mudanças nos PtdIns originais (3,5) P 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mídia livre-inositol (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% de glucose |
| KH2PO4 0,01 mM |
| Ácidos aminados 1X |
| 1X LPSM |
| Oligoelementos 1X |
| 5X Vitaminas |
| 10X fosfato e sulfato de mídia de baixo (LPSM) |
| CaCl2 9 mM |
| NaCl 17 mM |
| KCl 67 mM |
| Elementos Traço 1000X |
| Ácido bórico 8 mM |
| 250 uM de CuSO4 |
| 602? M KI |
| FeCl3 1,23 mM |
| MnSO4 2,65 mM |
| 971 pM de Na-molibdato |
| ZnSO4 2,48 mM |
| 500X Vitaminas |
| 4 uM de biotina |
| 2,27 mM de ácido fólico |
| Niacina 1,62 mM |
| 729 mM de ácido p-aminobenzóico |
| 973 uM Pryidoxine-HCl |
| 266? M Riboflavina |
| 593 uM de tiamina-HCl |
Tabela 1. Composição de células de levedura a levedura livre de inositol são meios de comunicação. Radiomarcada com IFM como os meios de comunicação de base a ser suplementado com 3 H- mio-inositol. Prepara-se uma solução de 100 ml de MFI usando as soluções indicadas, Filtro de esterilizar utilizando uma garrafa de 0,22 top filtro a vácuo e armazenar a RT. Para preparar baixo fosfato e sulfato de mídia (LPSM), gerar uma solução de 100 ml usando os sais indicados, filtro de esterilizar utilizando uma garrafa de 0,22 top filtro a vácuo e armazenar a RT. Dissolver os sais indicados para preparar uma solução de 1.000x 1 L de oligoelementos. Misturar bem antes de uso e / ou armazenar alíquotas a -20 ° C. Dissolve-se as vitaminas indicadas para preparar uma solução de 1 L de vitamina 500x. Misture bem antes de usar e armazenar alíquotas a -20 ° C.
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Discussion
Este artigo detalha o protocolo experimental necessária para quantificar os níveis celulares de PtdnsPs por acoplado-HPLC fluxo de cintilação de levedura. A metodologia permite que a marcação metabólica de PtdInsPs com 3 H-mio-inositol, seguido de processamento e extracção de lípido solúvel em água 3H-Gro-InsPs, fraccionamento por HPLC e análise. Usando este método, os níveis relativos de PtdInsPs em células sob várias condições pode ser quantificada, como é mostrado para PtdIns (3,5) P 2 em de tipo selvagem, vac14 D e células de levedura atg18 D (Figura 4).
Há um número de etapas críticas e modificações que podem ser feitas para optimizar os resultados e / ou solucionar. Um dos parâmetros mais importantes para alcançar quantificação fiável de PtdInsPs é o nível total do sinal radioactivo. Normalmente, injetar 3-5 milhões de contagens para o HPLC é muitas vezes suficiente para quantificar de forma fiável as mudanças no oiabundância das espécies PtdInsP gher como PtdIns (4,5) P 2. No entanto, a injecção de até 10 milhões de contagem pode ser necessário para a quantificação da espécie menor abundância tais como PtdIns (3,5) P 2. Existem vários parâmetros que podem afectar o nível do sinal radioactivo alcançado incluindo o número total de células utilizadas para preparar a amostra, o tempo de rotulagem e a temperatura, a concentração de 3 H-mio-inositol, a taxa de rotação de PtdInsPs e a síntese endógena de inositol, que irá competir com o inositol radiolabeled. Por exemplo, as células de levedura para a marcação radioactiva, pelo menos, um tempo de duplicação permite a incorporação metabólica de mio- inositol 3 H- em PtdInsPs, mas a extensão do tempo de rotulagem para os mutantes de levedura que crescem mais lentamente ou que tenham actividade metabólica mais lenta pode ser necessário. Além disso, o protocolo descrito aqui utiliza uma mudança diauxic da cultura de levedura, onde as células crescido até à fase mid-log foram então concentradas foR etiquetagem ao longo de um tempo de duplicação. No entanto, pode-se reduzir a mudança diauxic por células rotulagem durante a primeira fase e mid-log e por longos períodos de tempo-como feito anteriormente 32. Ao fazer isso, esses autores observaram níveis mais elevados de PtdIns (3) P, PtdIns (4) P e PtdIns (4,5) P 2 do que as células submetidos diauxic mudança 32.
Do mesmo modo, o período de marcação de células de mamíferos podem requerer optimização uma vez que algumas células de mamíferos, como a linha de macrófagos RAW 264.7 duplica a cada 12 horas, ao passo que outros podem dividir muito mais lento, ou como no caso de neurónios, não em todos 20,35,39. Além disso, pode-se aumentar a concentração de 3 H-mio-inositol para atingir um nível de sinal radioactivo ideal. No entanto, note que alguns 3 H- mio-inositol é embalado em 90% de etanol, adicionando excessivo 3 H- mio-inositol vai aumentar o teor de etanol na mídia e pode ter um effe não intencionalCT nas células. Finalmente, radiomarcação prolongada também pode privar as células de inositol. Isto é particularmente evidente na cultura de células de mamífero, onde DMEM completo contém 40 uM de myo-inositol, 0,5 uM em comparação com 3 H-mio-inositol, quando marcado com 10 uCi / ml. Assim, se necessário, é recomendada simplesmente aumentar o número de células de mamíferos durante a etiquetagem.
A lise e processamento de lípido passos celulares também são críticos para a obtenção de um rendimento óptimo, bem como a manutenção da saúde da coluna de HPLC. A lise com ácido perclórico permite a precipitação de lípidos e outras macromoléculas, um método utilizado para a primeira cultura de tecidos e depois usado para levedura 28,33. Em comparação com a extracção de lipidos totais usando o tradicional metanol / HCl método / clorofórmio, o uso de ácido perclórico melhora a recuperação de PtdInsPs, incluindo PtdIns (3,5) P 2, com menos variação entre experiências 28. Subaplicação subsequente de metilamina quebra as ligações éster entre o esqueleto de glicerol e as duas cadeias de acilo hidrófobas, deixando a água solúvel Gro-INSP ser a partir de ácidos gordos livres e os lípidos 28,34 intactas de fases separadas. Deve haver um cuidado especial para evitar que transportam solventes orgânicos para a frente indesejados e material insolúvel durante a etapa de extração. Isso pode entupir o sistema, causar picos de pressão e / ou quimicamente danificar a coluna. Além disso, a coluna deve ser condicionado no início de cada dia, expondo a coluna a uma alta concentração de fosfato de amónio (tampão B) antes de uso; assim, um protocolo curto "Equilíbrio" é empregado antes de executar amostras experimentais. Falha ao fazer isso resulta condicionado passo em um perfil de eluição atrasada dos picos Gro-InsPs da primeira amostra experimental que é executado.
Há vários pontos-chave relacionados à análise e quantificação de considerar também. Em primeiro lugar, o quantification em si deve ser uma integração de sinal e área de cada pico, e não apenas a altura do pico. Além disso, um controlo interno é geralmente necessária porque a integração de sinal absoluta para cada pico pode variar significativamente entre as amostras e experiências, sem reflectindo uma alteração na abundância PtdInsP numa célula. O pico parental Gro-Ins é tipicamente utilizado como controle interno através da normalização cada pico de Gro-Insp contra ela. O pico de Gro-Ins tipicamente detém quase 90% do sinal radioativo e não tendem a mudar entre as condições. Como alternativa, pode-se escolher para normalizar contra contagens totais, especialmente se se suspeita que os PtdIns dos pais sofre uma mudança significativa nas condições experimentais. Finalmente, para PtdInsPs baixa abundância, subtração de fundo é recomendado por definir uma zona para não pico próximo com a mesma "escala de tempo" como o pico de interesse (Figura 3D).
Uma consideração final refere-se aa análise de amostras de mamífero, que possuem sete espécies, incluindo espécies PtdInsP três mono-fosforilados e três bis-fosforilados. Infelizmente, é difícil de resolver totalmente PtdIns4P de PtdIns5P, e PtdIns (3,5) P 2 de PtdIns (3,4) P 2 em amostras de mamíferos, resultando em siameses double-picos. Existem vários métodos publicados anteriormente que aumentam a resolução destes picos. Tipicamente, isso envolve a modificação do comprimento de eluição, começando a concentração de tampão de fosfato de amónio, e a taxa de passos através da qual as alterações da concentração de fosfato de amónio tampão durante o perfil de eluição e do pH do tampão de fosfato de amónio 33,35-38. Talvez o método mais bem sucedido desenvolvido para PtdIns separadas (4) P e PtdIns (5) P foi recentemente descrito por Sarkes Rameh e 39, que empregou colunas SAX de dois em tandem e um tampão de fosfato de amónio a pH 6,0.
Tal como acontece com a maioria dos métodos, utilizando HPLC C-oupled fluxo de cintilação para quantificar PtdInsPs em células tem vantagens e desvantagens em comparação com outros métodos disponíveis. Por exemplo, o fluxo de cintilação em linha acoplado a detecção por HPLC oferece-vivo de GRO-InsPs mas limita o tempo de contagem de cintilações, a redução da sensibilidade do presente método. Alternativamente, o eluente de HPLC pode ser com um amostrador automático em vez de alimentar para um cintilador de fluxo recolhido-fracção. As fracções manuais podem então ser lidos por uma fora de linha contador de cintilação líquida por longos períodos de tempo, oferecendo, assim, uma sensibilidade mais elevada - no entanto, esta abordagem é mais demorado e trabalhoso e reduz a resolução de acordo com o número de fracções recolhidas 38,40 . Além disso, a análise de células inteiras mede de forma inequívoca os níveis de uma PtdInsP específico, mas não vai informar sobre as alterações à distribuição subcelular de que PtdInsP, embora se pudesse cintilação fluxo casal para métodos de fraccionamento sub-celular como Previously feito 39. Em comparação, com base FP-PtdInsP domínios de ligação são úteis para investigar a localização e a dinâmica de uma espécie PtdInsP em uma célula, mas podem também ligar-se a outras do que o alvo PtdInsP factores. Além disso, o método descrito aqui simplifica a análise dos níveis de PtdInsP eliminando as cadeias de acilo, o que aumenta a diversidade molecular de PtdInsPs. Mas, pela mesma razão, esta é também uma desvantagem fundamental, uma vez que a desacilação de lípidos conduz a uma perda de informação estrutural sobre a cadeia de acilo, um aspecto pouco apreciada de sinalização PtdInsP 41,42. Se este é de grande preocupação, então cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) deve ser empregue 14,17. No entanto, é difícil, actualmente, concomitantemente analisar todas as espécies PtdInsPs por LC-MS 43. Assim, uma combinação de métodos é a melhor abordagem, a fim de investigar a localização, dinâmica, a diversidade molecular e os níveis de todas as sete espécies PtdInsPs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
