Summary
Phosphoinositides sont des lipides dont l'abondance relative change rapidement en réponse à divers stimuli de signalisation. Cet article décrit une méthode pour mesurer l'abondance des phosphoinositides par les cellules métaboliquement étiquetage avec 3 H- myo-inositol, suivie par l'extraction et la désacylation. Glycéro-inositides extraites sont ensuite séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance et quantifiés par scintillation de flux.
Protocol
Note: Le texte ci-dessous décrit en détail une méthode pour mesurer PtdInsPs dans la levure. Il fournit les détails expérimentaux pour les cellules d'étiquetage de levure avec 3 H- myo-inositol, l'extraction et désacylante lipides et un protocole HPLC-élution de fractionner et de quantifier PtdInsPs désacylés. S'il vous plaît noter que l'étiquetage, la désacylation, la résolution et la quantification des PtdInsPs dans des cellules mammifères exiger optimisation et profils plus longs HPLC-élution. Ces détails peuvent être trouvés ailleurs, si nous discuter de certains des aspects à la discussion. Dans l'ensemble, la méthode pour extraire les lipides, désacyler et extrait soluble dans l'eau le Gro-InsPs de levure est donnée et est illustré sur la figure 1.
1. Protocole pour l'étiquetage et Analyse PtdInsPs dans la levure
- Culture cellulaire et radiomarquage
- Cultiver un 20 ml culture liquide de la souche de levure SEY6210 à 30 ° C avec agitation constante en synthétique completles médias à la phase mi-log ou une densité optique à 600 nm (DO600) d'environ 0,6-0,7.
Note: Ne pas utiliser les médias YPD car cela peut affecter 3 H- myo-inositol incorporation. Cette taille de la culture devrait fournir suffisamment de matériel pour 2-3 HPLC pistes. - Pellet un total de 10 à 14 DO des cellules de levure (à noter que 1 ml de culture avec une OD 600 = ~ 1 contient 1x10 7 cellules) par centrifugation à 800 xg pendant 5 min dans un tube de 12 ml à fond rond. Remettre en suspension avec 2 ml de milieu sans inositol (IFM) (voir le tableau 1 pour la composition IFM).
- Répétez centrifugation et aspirer les médias. Reprendre le culot avec 440 ul d'IFM et incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter 60 ul de myo-inositol 3 H- (1 pi = 1 uCi) à chaque échantillon et incuber à la température croissante de 30 ° C pendant 1 à 3 heures avec une agitation constante.
Attention: 3 H- myo-inositol est une matière radioactiverial qui doit être manipulé après une formation appropriée. En outre, tous les consommables qui font contact avec un matériau contenant 3 H-doivent être éliminés de manière appropriée et désignés comme des déchets radioactifs.
Note: La température de croissance peut être changé selon les besoins, tant que toutes les souches à comparer sont cultivés à la même température. - Transférer la suspension cellulaire (500 ul) à un tube de microcentrifugation contenant 500 pi d'acide perchlorique à 9% et 200 ul d'acide lavé les billes de verre. Mélanger par inversion et on incube sur de la glace pendant 5 min.
- Vortex de l'échantillon à la vitesse supérieure pendant 10 min et transférer les lysats à un nouveau tube en utilisant une pointe de gel de chargement pour éviter les perles de verre.
- Pellet l'échantillon à 12 000 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
- Reprendre le culot par bain sonication dans 1 ml de glace froid 100 mM d'EDTA. Pellet de nouveau comme précédemment.
- Cultiver un 20 ml culture liquide de la souche de levure SEY6210 à 30 ° C avec agitation constante en synthétique completles médias à la phase mi-log ou une densité optique à 600 nm (DO600) d'environ 0,6-0,7.
- Désacylation et l'extraction
- Aspirer le EDTA et sonication du culot dans 50 ul d'eau.
- Ajouter 500 pi de réactif de désacylation et soniquer pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
- Les lipides de la chaleur pendant 50 minutes à 53 ° C dans un bloc chauffant. Sécher les échantillons complètement par centrifugation à vide de plus de 3 h ou O / N.
- Assurez-vous que le piège chimique est installé entre la centrifugeuse sous vide et la pompe à vide pour empêcher les vapeurs d'entrer dans l'air.
- Reprendre le culot avec 300 pi d'eau par bain sonication et incubation à température ambiante pendant 20 min. Sécher les échantillons par centrifugation sous vide pendant 3 heures ou O / N. Répétez cette étape une fois de plus.
- Soniquer le culot avec 450 pi d'eau. Ceci est la phase aqueuse lors de l'extraction.
- Fraîchement préparer 10 ml de la extraction aun réactif par addition de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml d'éther éthylique et 0,40 ml de formiate d'éthyle. Inversez pour mélanger.
- Ajouter 300 ul de réactif d'extraction de la phase aqueuse. Vortex le mélange à la vitesse supérieure pendant 5 min et séparer les couches par centrifugation à la vitesse supérieure (18.000 xg) pendant 2 min.
- Recueillir la phase aqueuse inférieure dans un nouveau tube de centrifugeuse, tout en évitant la couche supérieure organique, l'interface, et le culot. Répéter l'extraction de la phase aqueuse encore deux fois avec le réactif d'extraction frais.
- Complètement sécher la couche aqueuse recueillie par centrifugation sous vide. Disperser le culot dans 50 ul d'eau par bain sonication.
- Ajouter 2 ul de chaque échantillon de 4 ml de liquide de scintillation dans un flacon à scintillation de 6 ml de polyéthylène. Déterminer le nombre de comptes (en cpm) dans chaque échantillon par scintillation liquide en utilisant une fenêtre ouverte.
- Conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'au moment de l'HPLC.
- Préparer le tampon A en filtrant 1 L d'eau ultra-pure avec une bouteille couvre-filtre de 0,22 pm sous vide, suivie d'un dégazage.
- Préparer tampon B en faisant une solution à 1 L de 1 M phosphate d'ammonium dibasique (APS, MW 132.06) dans l'eau et ajuster le pH à 3,8 avec de l'acide phosphorique. Filtrer le phosphate d'ammonium avec une bouteille haut de filtre de 0,22 um à vide, suivie par dégazage.
- Assemblez le flacon d'injection en équipant un flacon de 2 ml avec un petit volume 250 pi insert à ressort. Chargez 10 millions de CPM et ajouter de l'eau pour un volume total de 55 pi. Préparer un flacon vide avec 55 pi d'eau.
- Boucher les flacons avec bouchons à vis équipé d'un septum PTFE / silicone (côté rouge face à l'intérieur du flacon). Placez chaque flacon dans la barre d'auto-échantillonnage de l'HPLC, en commençant avec le flacon vide.
- Utilisez une HPLC et le logiciel associé qui contrôle le flux de tampon, les tampons et les contrôles dégaze échantillon INJECTIsur. Utilisez un scintillateur de flux en ligne et son logiciel associé pour réguler le débit scintillant et de surveiller le signal 3 H-dentaire.
- Utiliser une colonne de chromatographie liquide SAX avec des dimensions de 250 mm x 4,6 mm et contenant de 5 um dans la résine de la silice HPLC. Équipez la colonne avec un garde de la colonne pour éviter l'injection de contaminants.
- Installation d'une cellule d'écoulement 500 ul de 3H-compatible dans le scintillateur de l'écoulement.
NOTE: Le fractionnement peut être effectué avec une série de système HPLC Agilent infinité de 1200 commandé par un logiciel ChemStation ou avec d'autres systèmes HPLC disponibles dans le commerce. Flux de scintillation de l'éluant de CLHP peut être fait avec un débit scintillateur β-RAM commandé par le logiciel ou un autre scintillateur Laura d'écoulement disponibles dans le commerce ou un logiciel compatible.
- Initialiser la pompe quaternaire à un débit de 1,0 ml / min avec 100% de tampon A.
- Définir un profil d'équilibrage sur la HPLCpour contrôler le gradient de tampons A et B (appelons cela "Protocole Un équilibrage"): 1% de tampon B pendant 5 min, 1-100% de B pendant 5 min, 100% de B pendant 5 min, 100-1% de B pendant 5 min, 1% de B pendant 20 min. Régler la limite de pression à 400 bars, 1,0 ml / débit min, et 30 min le temps d'exécution.
- Définir un profil d'élution (figure 2) sur la HPLC pour contrôler le gradient de tampons A et B (appelons cela "Protocole A"): 1% de B pendant 5 min, 1-20% de B pendant 40 min, 20-100% B pendant 10 min, 100% de B pendant 5 min, 100-1% de B pendant 20 min, 1% de B pendant 10 min. Régler la limite de pression à 400 bars, 1,0 ml / débit min, et 90 min le temps d'exécution.
- Mettre en place un protocole de détection sur le scintillateur de flux (appeler cette "Un protocole de détection") de fonctionner pendant 60 minutes, avec un taux d'écoulement de fluide de scintillation de 2,5 ml / min et un temps de séjour 8.57 sec.
- Programmer une séquence d'injection automatisée sur la HPLC pour commencer l'ébauche de l'eau sur le thème "Un protocole d'équilibrage", suivi par ehaque radiomarqué échantillon sur "Protocole A". Initialisation de la séquence lorsque vous êtes prêt.
- Alors que la marche est toujours sur le protocole d'équilibrage, créer un lot sur le scintillateur de flux pour mesurer tous les échantillons avec "Un protocole de détection." L'injection de chaque nouvel échantillon va initialiser la "Protocole A" sur la HPLC tout en déclenchant le scintillateur de débit pour commencer "Un protocole de détection."
- À la fin de toutes les courses, rincer la HPLC, la colonne et le débit scintillateur avec 100% de tampon A pendant 30 min à 1,0 ml / débit min.
- Utilisez un logiciel Laura ou tout autre logiciel qui permet de quantifier les spectres de chromatographie. Les étapes décrites dans cette section sont illustrés dans la Figure 3.
- Ouvrez les fichiers en cliquant sur "Fichier", "Ouvrir", et sélectionnez le fichier de données brutes pour chaque échantillon.
- Dans l'onglet "chromatogrammes", zoOM pour étirer chacun des pics moindres (environ 1000 chefs d'accusation [axe y]) tout en conservant la résolution de temps. Zoomez sur chaque pic individuelle si nécessaire.
- Mettez en surbrillance chacun des pics pour l'analyse en utilisant la fonction "Ajouter ROI". Identifier les pics par le temps d'élution: Parental Gro-Ins à 10 min, Gro-Ins3P à 18 min, Gro-Ins4P à 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 à 29 min et Gro-Ins (4,5 ) P 2 à 32 min.
- Dans l'onglet "tables des régions", enregistrer la "zone (chiffres)" de chaque pic. Notez le "commencer (mm: ss)" temps et «fin (mm: ss)" temps de chaque pic.
- Pour la soustraction du fond, mettre en évidence une région adjacente à la pointe couvrant la même quantité de temps. Soustraire le nombre de coups de pic correspondant.
- Normaliser l'aire de chaque pic contre parentale Gro-Ins (exprimé en "% de Ptdlns totales"). Ensuite, normaliser chacun des pics dans chaque condition expérimentale contre la condition de commande (exprimée en "n-fold augmentation par rapport à contrôler »).
NOTE: La normalisation de chaque pic peut également être fait contre les coups totaux, mais depuis le parentale Gro-Ins est beaucoup plus abondante que tous les autres PtdInsPs les résultats ont tendance à être similaires. - Exporter les données pour les chromatographes en appuyant sur "Fichier", "Enregistrer sous ...", et choisissez le "CSV (Comma Separated)" format de fichier. Tracer les données sur une feuille de calcul et de présenter, si nécessaire.
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Representative Results
En utilisant cette méthode, PtdInsPs de levure ont été marquées métaboliquement avec 3 H- myo-inositol. Après marquage, les phospholipides ont été précipités avec de l'acide perchlorique, suivie d'une désacylation phospholipide et l'extraction de la Gro-InsPs soluble dans l'eau (figure 1). A ce stade, il est important de quantifier le signal radioactif total associé avec le Gro-InsPs extraite par scintillation liquide pour assurer un rapport signal à bruit suffisant pour que les PtdInsPs très faible abondance comme Ptdlns (3,5) P2; un total de 5-10 millions de CPM doit être injecté. Etant donné que les cellules de levure présentent seulement quatre PtdInsPs, la résolution peut être obtenue avec un procédé d'élution de 1 heure comme décrit (figure 2).
Ici, de type sauvage, atg18 mutants de levure et ô ô vac14 ont été étiquetés et traités pour analyser les changements dans Ptdlns (3,5) P 2, ee moins abondante des PtdInsPs dans la levure 16,19,27. Comme observé sur la figure 4A-C, le profil d'élution pour les trois souches ont produit 3 crêtes du signal H-associé. Le pic parental Gro-Ins élue en premier (8-9 min; le montre la figure 3, mais pas sur la figure 4 depuis Gro-Ins occulte le signal de l'espèce phosphorylés), suivie de Gro-Ins3P (~ 18 min), Gro Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P2 (~ 29 min) et Gro-Ins (4,5) P2 (~ 32: 00 min), ce qui correspond respectivement aux phospholipides acylés Ptdlns, PtdIns3P, PtdIns4P, Ptdlns (3,5) P2 et Ptdlns (4,5) P2. Il ya un couple de pics mineurs supplémentaires à 4 min et celle qui tend à suivre immédiatement le parent Gro-Ins (10 min); ceux-ci représentent probablement inositol et un non-inositide glycerated phosphates (Figure 3). Le schéma d'élution est cohérente et caractéristique, bien que l'heure exacte peut varier lors de l'utilisation d'un diffélouer système HPLC et / ou une nouvelle colonne.
Le pic associé à Ptdlns (3,5) P 2 (figure 4, flèche rouge) subit le changement le plus dramatique entre-type sauvage, atg18 Δ et des souches de levure vac14 de ô. Par rapport aux cellules de type sauvage (A), il ya une très grande Gro-Ins (3,5) P 2 de signal -Associated dans les cellules de ô atg18 et un petit pic dans les cellules de levure vac14 de ô. Afin de quantifier le signal radioactif total associé à chaque pic, les chiffres ont été intégrés sous la surface du pic (Figure 3). En outre, puisque le signal radioactif absolue varie entre les échantillons, l'espèce Gro-Ins parentale a été utilisé comme un contrôle interne en normalisant contre elle (on peut aussi choisir de normaliser contre coups totaux). En faisant cela, les données suggèrent que le Ptdlns (3,5) P 2 ne représente que 0,07% de Ptdlns dans des cellules de levure de type sauvage, tandis que Ptdlns (3,5) P 2 correspond à 1,2% des Ptdlns parentales dans les cellules de atg18 ô, ou une augmentation de 17 fois spectaculaire Ptdlns (3,5) P 2 par rapport aux cellules de type sauvage (figure 4A, B et D). En comparaison, Ptdlns (3,5) P 2 niveaux était seulement 0,01% du signal de Ptdlns dans VAC14 Supprimé par des cellules de levure, soit une perte de 85% de Ptdlns (3,5) P2 (figure 4C et D). Globalement, ces mesures sont en accord avec les résultats publiés montrant que Ptdlns (3,5) P 2 est d'environ 0,1% de Ptdlns dans les cellules de type sauvage, 90% réduit vac14 D, et 10 à 20 fois plus élevé dans les cellules atg18 D par rapport aux cellules de type sauvage 27,29.
Figure 1. Désacylation et l'extraction de 3 H-Gro-InsP. Radiolabeled lipid précipité à l'acide perchlorique est lavée avec une solution aqueuse d'EDTA. Cet article est alors aspiré et le réactif de désacylation ajouté et incubé à 53 ° C. Le mélange de réaction de désacylation est ensuite séché sous vide et on le lave deux fois avec de l'eau, suivi par l'addition de réactif d'extraction. Il est ensuite agité par tourbillonnement, centrifugé et la phase aqueuse est recueillie. L'étape d'extraction est répétée trois fois au total pour éliminer les contaminants organiques et insolubles. La fraction soluble dans l'eau (bleu), qui comprend 3 H-Gro-InsP, est ensuite séché sous vide et réhydraté avec 60 pi d'eau. La quantité de radioactivité est déterminée par scintillation liquide (CPM) et effectifs égaux à travers les échantillons sont chargés dans la HPLC. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
<br /> la figure 2. Gradient de ammonium tampon de phosphate pour l'élution de 3 H-Gro-InsP. Définition de Gro-InsP par Chromatographie d'échange d'anions forts dépend de l'application de phosphate d'ammonium dibasique, pH 3,8 (tampon B). Le choix du gradient dépend du mélange d'espèces Gro-INSP disponibles pour la séparation. Protocole A est utilisé pour les échantillons de levure, qui possèdent seulement quatre PtdInsPs. Résolution de chacun des quatre sommets est suffisante avec une augmentation rapide de (NH 4) 2 HPO 4 de concentration. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. guidée instruction pour l'analyse des données de PtdInsP abondance. Les fichiers de données sont chargées sur le Laura software et évalué visuellement en utilisant le chromatographe (ouvert par défaut). Utilisation du "zoom" outil (a), magnifier les pics (b). Sélectionnez pics distincts sur le chromatographe à l'aide de la fonction "ajouter ROI" (c). Dans l'onglet "région la table" (d), toutes les informations résultant des régions soulignées d'intérêt est affiché comme une seule table (e). Exporter les chiffres bruts de chaque pic (f) et de normaliser chaque espèce PtdInsP contre la phosphatidylinositol parentale (g) ou contre le compte total. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Ptdlns (3,5) P 2 niveaux dans de type sauvage et des cellules de levure mutantes. Chromatographes représentatifs sont présentés pour la scintillation d'écoulement de l'extraited 3 H-Gro-InsPs de type sauvage (A), atg18 Δ (B), et vac14Δ (C) des souches de levure utilisant le protocole a. Les chiffres bruts des régions d'intérêt correspondant à Gro-Ins (3,5) P 2 (flèche) sont extraits à partir de la chromatographie et de fond soustrait. Les valeurs obtenues sont comparées au type sauvage et exprimés en facteur de variation de Gro-Ins (3,5) P 2 niveaux (D). Les niveaux et les changements de Gro-Ins (3,5) P 2 sont interprétés de présenter des niveaux et des changements dans les Ptdlns originaux (3,5) P 2. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Médias sans inositol (IFM) |
| 27,8 mM de (NH4) 2SO4 |
| 2% de glucose |
| MM KH2PO4 0,01 |
| Acides aminés 1X |
| 1X LPSM |
| Oligo-éléments 1X |
| 5X Vitamines |
| 10X médias de phosphate et sulfate Bas (LPSM) |
| 9 mM CaCl2 |
| 17 mM de NaCl |
| KCl 67 mM |
| Éléments 1,000X Trace |
| L'acide borique 8 mM |
| 250 um CuSO4 |
| 602 uM KI |
| FeCl3 1,23 mM |
| MnSO4 2,65 mM |
| 971 pM de Na-molybdate |
| ZnSO4 2,48 mM |
| 500X Vitamines |
| 4 uM de biotine |
| 2,27 uM d'acide folique |
| Niacine 1,62 mM |
| L'acide 729 uM p-aminobenzoïque |
| 973 uM Pryidoxine-HCl |
| 266 uM riboflavine |
| 593 uM de thiamine-HCl |
Tableau 1. Composition des cellules de levure la levure sans inositol médias. Sont radiomarqué avec IFM que les médias de base à être complétées par 3 H- myo-inositol. Préparer une solution 100 ml de l'OIF en utilisant les solutions indiqué, Filtre stériliser l'aide d'un bouchon de bouteille de 0,22 um de filtre à vide et stocker à température ambiante. Pour préparer bas de phosphate et de sulfate médias (de LPSM), générer une solution 100 ml en utilisant les sels indiqués, stériliser par filtration à l'aide d'un bouchon de bouteille de 0,22 um de filtre à vide et stocker à température ambiante. Dissoudre les sels indiqués pour préparer une solution 1,000x 1 L d'oligo-éléments. Mélanger soigneusement avant l'utilisation et / ou de stocker des aliquotes à -20 ° C. Dissoudre les vitamines indiquées pour préparer une solution de vitamine 500x 1 L. Mélanger soigneusement avant l'utilisation et entreposer des portions à -20 ° C.
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Discussion
Cet article détaille le protocole expérimental nécessaire de quantifier les niveaux cellulaires de PtdnsPs par flux scintillation HPLC couplé à de la levure. La méthodologie permet au marquage métabolique avec de PtdInsPs myo-inositol 3 H-, suivi par un traitement d'extraction des lipides et de 3 H-Gro-InsPs, CLHP et fractionnement analyse soluble dans l'eau. En utilisant cette méthode, les niveaux relatifs de PtdInsPs dans les cellules dans diverses conditions peuvent être quantifiés, comme le montre par Ptdlns (3,5) P 2 de type sauvage, vac14 D et des cellules de levure atg18 D (figure 4).
Il ya un certain nombre d'étapes et de modifications critiques qui peuvent être faites pour optimiser les résultats et / ou dépanner. L'un des paramètres les plus importants pour atteindre une quantification fiable de PtdInsPs est le niveau de signal radioactif totale. Typiquement, injecter 3-5 millions de comptes dans la HPLC est souvent suffisante pour quantifier de manière fiable l'évolution de la salutl'abondance des espèces gher PtdInsP tels que Ptdlns (4,5) P 2. Cependant, l'injection de jusqu'à 10 millions de chiffres peut être nécessaire pour la quantification d'espèces de faible abondance comme Ptdlns (3,5) P2. Il ya différents paramètres qui pourraient influer sur le niveau de signal radioactif atteint, y compris le nombre total de cellules utilisées pour préparer l'échantillon, le temps de l'étiquetage et de la température, la concentration de 3 H-myo-inositol, le taux de PtdInsPs de chiffre d'affaires et la synthèse endogène de l'inositol, qui sera en concurrence avec l'inositol radiomarqué. Par exemple, les cellules de levure radiomarquage pour au moins un temps de doublement permet l'incorporation métabolique de 3 H- myo-inositol dans PtdInsPs, mais l'extension de la durée de l'étiquetage pour les mutants de levure qui croissent plus lentement ou avoir une activité métabolique plus lent peut être nécessaire. En outre, le protocole décrit ici utilise un changement diauxique de la culture de levure, où les cellules cultivées à la phase mi-log sont ensuite concentrées foétiquetage r sur un temps de doublement. Cependant, on peut réduire le décalage diauxique par les cellules d'étiquetage au début et au milieu de la phase log et pour de plus longues périodes de temps comme précédemment 32. En faisant cela, ces auteurs ont observé des niveaux plus élevés de Ptdlns (3) P, Ptdlns (4) P et Ptdlns (4,5) P 2 que les cellules subissant changement diauxique 32.
De même, la période de marquage des cellules de mammifères peut exiger l'optimisation puisque certaines cellules de mammifères comme la ligne de macrophages RAW 264.7 double tous les 12 h, tandis que d'autres peuvent diviser beaucoup plus lent, ou comme dans le cas des neurones, pas du tout 20,35,39. En outre, on peut augmenter la concentration de 3 H-myo-inositol pour atteindre un niveau idéal de signal radioactif. Toutefois, s'il vous plaît noter que certains 3 H- myo-inositol est emballé dans 90% d'éthanol, en ajoutant excessive 3 H- myo-inositol va augmenter la teneur en éthanol dans les médias et peut avoir un effe involontairect sur les cellules. Enfin, le marquage radioactif prolongée peut également affamer les cellules de l'inositol. Cela est particulièrement évident dans la culture de cellules de mammifères où DMEM complet contenant 40 pM myo-inositol, par rapport à 0,5 pM myo-inositol 3 H- lorsqu'ils sont marqués avec 10 uCi / ml. Ainsi, si nécessaire, il suffit d'augmenter le nombre de cellules de mammifère au cours de l'étiquetage est recommandée.
La lyse et de traitement des lipides cellulaires étapes sont également essentiels pour l'obtention d'un rendement optimal, ainsi que le maintien de la santé de la colonne de CLHP. La lyse avec de l'acide perchlorique permet précipitation des lipides et d'autres macromolécules, un premier procédé utilisé pour la culture de tissus et ensuite utilisé pour la levure 28,33. Par rapport à l'extraction des lipides totaux en utilisant le methanol traditionnelle / HCl / Méthode de chloroforme, on utilise de l'acide perchlorique améliore la récupération de PtdInsPs, y compris Ptdlns (3,5) P2, avec moins de variation entre les expériences 28. Sousapplication ultérieure de la méthylamine casse des liaisons ester entre la chaîne principale du glycérol, et les deux chaînes hydrophobes d'acyle, en laissant l'eau soluble Gro-InsP être phases séparées à partir d'acides gras libres et des lipides 28,34 intactes. Un soin particulier doit être pris pour éviter de transporter des solvants organiques indésirables avant et insoluble lors de l'étape d'extraction. Cela peut obstruer le système, provoquer des pics de pression et / ou chimiquement endommager la colonne. En outre, la colonne doit être conditionné au début de chaque jour de l'exposition de la colonne à une concentration élevée en phosphate d'ammonium (tampon B) avant utilisation; Ainsi, un protocole court "équilibrage" est employé avant d'exécuter les échantillons expérimentaux. Tout manquement à cette étape de conditionnement des résultats dans un profil d'élution retardée des pics Gro-InsPs dans le premier échantillon expérimental qui est exécuté.
Il ya plusieurs points clés liés à l'analyse et la quantification à considérer ainsi. Tout d'abord, la qUANTIFICATION lui-même devrait être une intégration de signal et aire de chaque pic, et pas seulement la hauteur du pic. En outre, un contrôle interne est généralement nécessaire parce que l'intégration de signal absolu pour chaque pic peut varier considérablement entre les échantillons et les expériences sans réfléchir un changement dans PtdInsP abondance dans une cellule. Le pic parentale Gro-Ins est généralement utilisé comme contrôle interne en normalisant chaque pic Gro-InsP contre elle. Le pic Gro-Ins détient généralement près de 90% du signal radioactif et n'a pas tendance à changer entre les conditions. Alternativement, on peut choisir de normaliser les contre coups totaux, surtout si l'on soupçonne que les Ptdlns parentales souffre un changement significatif dans les conditions expérimentales. Enfin, pour PtdInsPs de faible abondance, la soustraction de fond est recommandé par la définition d'une zone de non-crête proximité avec le même "échelle de temps" que le pic d'intérêt (Figure 3D).
Une dernière considération concernel'analyse des échantillons de mammifères, qui possèdent sept espèces, dont les espèces PtdInsP trois mono-phosphorylés et phosphorylés trois bis. Malheureusement, il est difficile de résoudre entièrement PtdIns4P de PtdIns5P et Ptdlns (3,5) P 2 à partir de Ptdlns (3,4) P 2 dans des échantillons de mammifères, résultant en double-sommets conjoints. Il existe plusieurs méthodes déjà publiées qui augmentent la résolution de ces pics. Typiquement, ceci implique la modification de la longueur de l'élution, la concentration de départ du tampon de phosphate d'ammonium, le taux et les étapes par lesquelles les phosphates d'ammonium changements de concentration de tampon pendant le profil d'élution et le pH du tampon de phosphate d'ammonium 33,35-38. Peut-être, la méthode la plus efficace élaboré pour Ptdlns séparés (4) P et Ptdlns (5) P a été récemment décrit par Sarkes Rameh et 39, qui utilise deux colonnes SAX-tandem et un tampon de phosphate d'ammonium à pH 6,0.
Comme avec la plupart des procédés, en utilisant une HPLC-coupled écouler scintillation pour quantifier PtdInsPs dans les cellules a des avantages et des inconvénients par rapport à d'autres méthodes disponibles. Par exemple, scintillation de flux en ligne couplé à HPLC-détection en temps réel offre de Gro-InsPs mais limite le temps de comptage par scintillation, en réduisant la sensibilité de cette méthode. Alternativement, l'éluant de HPLC peut être fraction recueillie avec un échantillonneur automatique au lieu de nourrir dans un scintillateur de flux. Les fractions manuels peuvent alors être lus par un compteur à scintillation liquide hors ligne pendant de longues périodes de temps, offrant ainsi une plus grande sensibilité - Néanmoins, cette approche est plus de temps et de main-d'œuvre et réduit la résolution en fonction du nombre de fractions collectées 38,40 . En outre, l'analyse des cellules entières mesure sans ambiguïté les niveaux d'un PtdInsP spécifique, mais il ne sera pas informer des changements à la distribution subcellulaire de ce PtdInsP, si l'on pourrait coupler flux scintillation à des méthodes de fractionnement sous-cellulaires que Previously fait 39. En comparaison, basées FP-domaines PtdInsP contraignants sont utiles pour étudier l'emplacement et de la dynamique d'une espèce PtdInsP dans une cellule, mais peut également se lier à des facteurs autres que la cible PtdInsP. En outre, le procédé décrit ici simplifie l'analyse des niveaux PtdInsP en éliminant les chaînes acyle, ce qui augmente considérablement la diversité moléculaire des PtdInsPs. Mais, du même coup, cela est également un inconvénient essentiel, étant donné que les lipides de la désacylation conduit à une perte d'informations concernant la structure de la chaîne acyle, un aspect sous-estimé de PtdInsP signalisation 41,42. Si cela est une grande préoccupation, puis chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) devrait être employée 14,17. Cependant, il est actuellement difficile d'analyser en même temps toutes les espèces PtdInsPs par LC-MS 43. Ainsi, une combinaison de méthodes est la meilleure approche afin d'enquêter sur l'emplacement, la dynamique, la diversité moléculaire et les niveaux de tous les sept PtdInsPs espèces.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
