Summary
ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。
Protocol
注：テキストは、以下に詳細に酵母でPtdInsPsを測定する方法について説明します。これは、3 H- ミオ -イノシトールの 、脂質を抽出し、脱アシル化及び脱アシル化PtdInsPsを分別し、定量化するためのHPLC溶出プロトコルで標識する酵母細胞のための実験の詳細を提供します。最適化と長いHPLC溶出プロファイルを必要とする哺乳動物細胞におけるPtdInsPsのラベリング、脱アシル化、解像度および定量に注意してください。我々は議論中の側面のいくつかを議論してもこれらの詳細は、他の場所で見つけることができます。全体的に、脂質を抽出しアシル基を除去すると、酵母から水溶性GRO-InsPsを抽出する方法が与えられ、 図1に示されています。
酵母におけるラベル付けとの解析法PtdInsPs 1.プロトコル
- 細胞培養および放射性標識
- 定数は完全に合成で振とうしながら30℃で酵母株SEY6210 20mlの培養液を成長させます対数期中期または約0.6〜0.7の600 nmの（OD 600）での光学密度のメディア。
注：これは3 H- ミオ -イノシトールの取り込みに影響を与える可能性があるとして、YPDメディアを使用しないでください。この培養サイズは2-3のHPLCの実行のために十分な材料を提供する必要があります。 - 12ミリリットル丸底チューブ中で5分間800×gで遠心分離することによって（OD 600 = 1で1mlの文化が〜1×10 7個の細胞が含まれていることに注意してください）酵母細胞の10〜14 ODの合計をペレット化。イノシトールを含まない培地（IFM）の2mlで再懸濁（IFM組成については表1を参照）。
- 遠心分離を繰り返し、メディアを吸引除去します。 IFMの440μlのペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。
- 各試料に3 H- ミオ -イノシトール（1μL=1μCiの）の60μlを添加して、振盪しながら1〜3時間、30℃の成長温度でインキュベートします。
注意：3 H- ミオ -イノシトールのは、放射性メイトであります適切なトレーニングの後に処理されるべきであるリアル。また、3 H含有材料と接触するすべての消耗品が適切に配置されるべきであり、放射性廃棄物として指定されました。
注：成長温度を変化させることができる限り、全ての株が、同じ温度で成長され比較されるように、必要に応じ。 - 9％過塩素酸500μlのを含むマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液（500μl）を転送し、酸200μlのガラスビーズを洗浄しました。反転によって混合し、5分間氷上でインキュベートします。
- 10分間最高速度でサンプルをボルテックスし、ガラスビーズを回避するために、ゲルローディングチップを使用して、新しいマイクロ遠心チューブに溶解物を移します。
- 4℃で10分間12,000×gで試料をペレット化し、上清を吸引します。
- 氷冷100 mMのEDTA、1mlのバス超音波処理によってペレットを再懸濁。以前のように再びペレット化します。
- 定数は完全に合成で振とうしながら30℃で酵母株SEY6210 20mlの培養液を成長させます対数期中期または約0.6〜0.7の600 nmの（OD 600）での光学密度のメディア。
- 脱アシル化および抽出
- EDTAを吸引し、50μlの水にペレットを超音波処理します。
- 脱アシル化試薬の500μlを添加して、混合する超音波処理。室温で20分間インキュベートします。
- ヒートブロック中で53℃で50分間熱脂質。 3時間またはO / Nを介して真空遠心分離によって完全にサンプルを乾燥させます。
- 化学トラップは空気が入るの蒸気を防ぐために、真空遠心分離機と真空ポンプとの間に設置されていることを確認します。
- 風呂超音波処理によって水300μlのペレットを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。 3時間またはO / Nのための真空遠心分離によりサンプルを乾燥させます。もう一度この手順を繰り返します。
- 水450μlのペレットを超音波処理。これは、抽出時の水相です。
- たてextractioの10ミリリットルを準備1-ブタノールの8.0 mlの、エチルエーテル、ギ酸エチル0.40 mlの1.6 mlで添加することにより、n個の試薬。混合するために反転します。
- 水相に抽出試薬を300μlを追加します。 5分間トップスピードでボルテックス混合物を、2分間、最高速度（18,000 XG）で遠心分離して層を分離します。
- トップ有機層、インターフェース、およびペレットを避けながら、新しいマイクロチューブに底部の水層を収集します。新鮮な抽出試薬で二回以上の水性相の抽出を繰り返します。
- 完全真空遠心分離によって収集し、水層を乾燥させます。風呂超音波処理によって水50μlにペレットを分散させます。
- 6ミリリットルのポリエチレンシンチレーションバイアルにシンチレーション液4mlのに各2μlのサンプルを追加します。開いているウィンドウを使用して、液体シンチレーションにより各サンプルにおける（CPM）でカウント数を決定します。
- HPLCの準備が整うまで-20℃でサンプルを保管してください。
- 脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、と超純水1Lをフィルタリングすることにより、緩衝液Aを準備します。
- 水に、1Mリン酸アンモニウム二塩基（APS、MW 132.06）の1 L溶液を作ることによってバッファBを準備し、リン酸でpHを3.8に調整します。脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、とリン酸アンモニウムをフィルタリングします。
- バネ付き250μlの小容量インサートを2ミリリットルバイアルを艤装によって注射バイアルを組み立てます。千万インプレッションをロードし、55μlの総体積のために水を追加します。水55μlのブランクバイアルを準備します。
- PTFE /シリコンセプタムを装備し、スクリューキャップ付きバイアルに蓋（バイアルの内側に面した赤側）。ブランクバイアルから始まる、HPLCの自動サンプリングトレイに各バイアルを置きます。
- 、バッファの流れを制御し、HPLCと関連ソフトウェアを使用して、バッファおよびコントロールサンプルinjectiを脱ガスに。シンチラント流量を調節するために、オンラインフローシンチレータおよびその関連ソフトウェアを使用して、3 H-減衰信号を監視します。
- X 4.6ミリメートル250ミリメートルの寸法のSAX液体クロマトグラフィーカラムを使用し、HPLCに5μmのシリカ樹脂を含みます。汚染物質の注入を防止するために、カラムガードカラムを装い。
- フローシンチレータに3 H-互換500μlのフローセルをインストールします。
注：分画はChemStationソフトウェアによって、または他の市販のHPLCシステムを用いて制御のAgilent 1200無限シリーズHPLCシステムを用いて行うことができます。 HPLCの溶離液の流れシンチレーションは、ローラ・ソフトウェアまたは他の市販の流れシンチレータまたは互換性のあるソフトウェアによって制御β-RAMフローシンチレータで行うことができます。
- 100％緩衝液Aと1.0 ml /分の流速で四級ポンプを初期化します
- HPLCで平衡プロファイルを設定5分間の1％緩衝液B、5分間の1-100％のB、5分間100％B、5用100-1％のB：緩衝液AおよびBの勾配（この「プロトコル平衡」と呼ぶ ）を制御します分で、20分間、1％B。 400バール、1.0 ml /分の流速、および30分の実行時の圧力限界を設定します。
- 緩衝液AおよびBの勾配を制御するために、HPLCで溶出プロフィール（ 図2）を設定し （この「プロトコルA」と呼ぶ ）：5分間1％のB、40分間の1〜20％のB、20〜100％ 10分、5分間100％B、20分100-1％のB、10分間で1％BのB。 400バール、1.0 ml /分の流速、および90分の実行時に圧力限界を設定します。
- 2.5ミリリットル/分、8.57秒の滞留時間のシンチレーション液の流速で、60分間実行する（この「プロトコル検出」と呼ぶ ）の流れシンチレータで検出プロトコルを設定します。
- プログラムEに続いて「プロトコル平衡 」に水を空白で開始するHPLCで自動注入シーケンス、「プロトコルA」の放射性標識サンプルをACH。準備ができたらシーケンスを初期化します。
- ランが平衡プロトコルに入れたまま、と全てのサンプルを測定するためのフローシンチレータのバッチを作成する「プロトコル検出を 。」開始するフローシンチレータをトリガしながら、それぞれの新しい試料の注入は、HPLC の 「プロトコルA」を初期化する」 を検出プロトコル 。 "
- すべてのランの完了時、HPLC、カラムをフラッシュし、1.0 ml /分の流速で30分間、100％緩衝液Aを用いてシンチレータを流します。
- ローラ・ソフトウェアまたはクロマトグラフィースペクトルを定量化することができる任意の他のソフトウェアを使用してください。このセクションで説明する手順は、図3に示されています。
- 「ファイル」、「開く」をクリックしてファイルを開いて、各サンプルの生データファイルを選択します。
- 「クロマトグラム」タブで、ZO時間分解能を維持しながら、より小さなピーク（約1000カウント[Y軸]）のそれぞれを伸ばすことでOM。必要に応じて、それぞれの個々のピークに拡大します。
- 「ROIを追加」ツールを使用して、分析のための各ピークを強調表示します。 18分にGRO-Ins3P、10分で親グロイン、29分とグロインでのGRO-Ins4P 20分で、グロイン（3,5）P 2（4,5：溶出時間によってピークを同定32分で）、P 2。
- 「地域・テーブル」タブで、各ピークの「面積（カウント）」を記録します。時間と「終了（MM：SS）」は、各ピークの時間：「（SS mm）の起動」を注意してください。
- バックグラウンド除去のために、同じ時間に及ぶピークに隣接する領域を強調表示します。対応するピークからのカウント数を減算します。
- （「合計のPtdInsの％」と表記）親グロインに対する各ピークの面積を正規化します。その後、N」として表現（制御条件に対して、各実験条件での各ピークを正規化倍増加）」を制御するために比較されます。
注：各ピークの正規化は、全カウントに対しても行うことができますが、親のグロインは、結果が似ている傾向にある他のすべてのPtdInsPsよりもはるかに豊富であるため。 - 「CSV（カンマ区切り） "ファイル形式を" ...として保存」、「ファイル」を押して、クロマトグラフ用のデータをエクスポートし、選択します。スプレッドシート上のデータをプロットし、必要に応じて提示します。
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Representative Results
この方法を用いて、酵母PtdInsPsは、代謝的に3 H- ミオ -イノシトールを用いて標識しました。標識後、リン脂質は、リン脂質脱アシル化し、水溶性GRO-InsPs（ 図1）を抽出し、過塩素酸を用いて沈殿させました。この段階では、それはのPtdIns（3,5）P 2のような非常に低存在量PtdInsPsために十分な信号対雑音比を確保するために、液体シンチレーションによって抽出されたGRO-InsPsに関連付けられた総放射活性シグナルを定量化することが重要です。 5から10000000のCPMの合計を注入する必要があります。酵母細胞は、わずか4 PtdInsPsを示すので（ 図2）に記載のように、分解能は1時間の溶出法を用いて達成することができます。
ここでは、野生型、ΔとΔvac14酵母変異体が標識とのPtdInsの変更（3,5）を分析するために加工したatg18 P 2、第E酵母16,19,27におけるPtdInsPsの少なくとも豊富。 図4A-C、3 H-関連する信号のピークを生成し、すべての3つの株の溶出プロファイルで観察されたように。 GRO-、GRO-Ins3P（〜18分）、続いて、親のグロインのピークは（グロインがリン酸化種の信号を影が薄いので、 図3ではなく、 図4に示す8-9分）最初の溶出しますそれぞれアシル化リン脂質のPtdInsに対応しています（00分〜32）、Ins4P（〜20分）、グロアドイン（3,5）、P 2（〜29分）、グロイン（4,5）P 2 PtdIns3P、PtdIns4P、のPtdIns（3,5）P 2とのPtdIns（4,5）P 2。 4分、すぐに親グロイン（10分）に追従する傾向がある1での追加小ピークがいくつかあります。これらは、おそらくイノシトールと非glyceratedリン酸inositide（ 図3）を表します 。溶出パターンは、diffeを採用した場合、正確な時間は変更になる場合がありますが、一貫性の特徴でありますHPLCシステムおよび/または新しい列を借ります。
PtdIns（3,5）P 2（ 図4、赤い矢印）に関連したピークは、ΔとΔvac14酵母株atg18野生型との間に最も劇的な変化を受けます。野生型細胞（A）と比較して、非常に大規模なグロイン（3,5）P 2 atg18の Δ細胞内-関連信号とvac14Δを酵母細胞内での小さいピークがあります。各ピークに関連した総放射性シグナルを定量化するために、カウントがピークの面積（ 図3）の下に統合されました。絶対放射性シグナルがサンプル間で変化するので、また、親のグロイン種は、（1つはまた、総カウントに対して正規化するために選択することができます）それに対して正規化することによって、内部対照として使用しました。これにより、データは、一方のPtdInsのイノシトール（PtdIns（3,5）P 2 は、3,5、野生型酵母細胞でのPtdInsのみの0.07％を構成していることを示唆しています）P 2はatg18の Δ細胞における親のPtdIns、またはのPtdInsの劇的な17倍の増加（3,5）、P野生型細胞（ 図4A、BおよびD）に2相対の1.2％に相当します。比較では、のPtdIns（3,5）P 2レベルがVAC14でのPtdIns信号のわずか0.01％が酵母細胞、のPtdIns（3,5）P 2（ 図4C および D）で85％の損失を-deletedました。全体として、これらの測定値は、のPtdIns（3,5）P 2 は、野生型細胞でのPtdInsの約0.1％、vac14 Dに減少し90％であり、atg18の D細胞において10〜20倍高いことを示す公表された結果と一致しています野生型細胞27,29の相対。
図1.脱アシル化および 3 H-GRO-INSP の抽出 。放射性標識LIPI過塩素酸中のd沈殿物をEDTA水溶液で洗浄しました。次いで、これを吸引し、脱アシル化試薬を添加し、53℃でインキュベートします。脱アシル化反応混合物は、抽出試薬を加え、その後、真空乾燥し、水で2回洗浄されます。これは、その後、ボルテックスし、遠心分離し、水相を回収しています。抽出工程は、有機および不溶性汚染物質を除去するために3回、合計繰り返されます。 3 H-GRO-INSPを含む水溶性画分（青）、次いで乾燥させ、水60μLで再水和真空れます。放射能の量を液体シンチレーション（CPM）によって決定され、サンプル全体で同じ数をHPLCにロードされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<3 H-GRO-INSP の溶出用リン酸アンモニウム緩衝液の BR /> 図2.グラデーション 。GRO-INSPの解像度強い陰イオン交換クロマトグラフィーによってpHを3.8（緩衝液B）、リン酸アンモニウム、二塩基性の用途に依存します。勾配の選択は、分離のために利用可能なGRO-INSP種の混合物に依存する。 プロトコルAは 4つしかPtdInsPsを保有する酵母サンプルに使用されます。 4つのピークのそれぞれの解像度は急速な増加（NH 4）2 HPO 4濃度で十分である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. PtdInsPの豊富のデータ分析のための指示をガイド付き。データファイルには、ローラの上にロードされていますoftwareと視覚的にクロマトグラフ（デフォルトで開い）を使用して評価しました。ツール「ズーム」使用する（A）、ピークを拡大する（B）。 「ROIを追加」ツール（C）を使用してクロマトグラフに明瞭なピークを選択します。 「領域テーブル」タブ（D）において、関心の強調表示された領域からのすべての結果の情報は、単一のテーブル（E）として表示されます。各ピークの生のカウントをエクスポート（f）および親のホスファチジルイノシトール（G）に対して、または合計数に対して各PtdInsP種を正規化する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4のPtdIns（3,5）P 野生型および変異体酵母細胞における 2 レベル。代表的クロマトグラフは、抽出物のフローシンチレーションのために示されていますΔ（B）、およびvac14Δ プロトコルAを使用して、（C）酵母株。（3,5）アドインをGROに対応する関心領域からの生のカウントatg18、野生型（A）から3 H-GRO-InsPsエドP 2（矢印）を差し引いクロマトグラフと背景から抽出されます。結果の値は、野生型と比較し、グロイン（3,5）P 2のレベル（D）の倍数変化として表されます。グロインでレベルと変更が（3,5）P 2は、レベルと、元のPtdIns（3,5）P 2の変化を示すように解釈されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| イノシトールを含まない培地（IFM） |
| 27.8 mMの（NH 4）2 SO 4 |
| 2％グルコース |
| 0.01 mMのKH 2 PO 4 |
| 1Xアミノ酸 |
| 1X LPSM |
| 1X微量元素 |
| 5Xビタミン |
| 10X低リン酸塩および硫酸塩メディア（LPSM） |
| 9 mMの塩化カルシウム |
| 17のNaCl |
| 67のKCl |
| 1,000倍微量元素 |
| 8 mMのホウ酸 |
| 250μMの硫酸銅 |
| 602μMKI |
| 1.23 mMのFeCl 3を |
| 2.65 mMのMnSO4 |
| 971μMのNa-モリブデン |
| 2.48 mMののZnSO 4 |
| 500Xビタミン |
| 4μMのビオチン |
| 2.27μM葉酸 |
| 1.62 mMのナイアシン |
| 729μMのp-アミノ安息香酸 |
| 973μMPryidoxine - 塩酸 |
| 266μMリボフラビン |
| 593μMチアミン塩酸 |
ベースメディアは、3 H- ミオ -イノシトールで補充するよう酵母イノシトールを含まない培地。酵母細胞の表1の組成は、IFMで放射性標識されています。示された解決策を使用してIFM 100mlの溶液を調製します、フィルターはRTでボトルトップ0.22μmの真空フィルターとストアを使用して滅菌します。低リン酸塩および硫酸塩メディア（LPSM）を調製するには、示された塩を使用しての100mlの溶液を生成し、フィルターを室温でボトルトップ0.22μmの真空フィルターとストアを使用して滅菌します。微量元素の1 L 1,000倍溶液を調製するために示した塩を溶解します。 -20℃での使用および/またはストアアリコートの前に完全に混合。 1 L 500倍ビタミン溶液を調製するために示されたビタミンを溶かします。 -20℃での使用や店舗のアリコートの前に完全に混合。
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Discussion
この記事では、酵母からHPLC結合フローシンチレーションによりPtdnsPsの細胞レベルを定量化するために必要な実験プロトコルの詳細について説明します。方法論は、脂質処理、水溶性3 H-GRO-InsPs、HPLC分画と分析を抽出した3 H- ミオ -イノシトールとPtdInsPsの代謝標識を可能にします。 PtdInsについて示されているように、この方法を用いて、種々の条件下での細胞におけるPtdInsPsの相対的レベルは、定量することができる（3,5）は、野生型、vac14の D及びD atg18酵母細胞におけるP 2（ 図4）。
結果を最適化および/またはトラブルシューティングするために行うことができます重要なステップや修正がいくつかあります。 PtdInsPsの信頼できる定量化を達成するための最も重要なパラメータの一つは、全放射能の信号レベルです。一般的に、HPLCに3から5000000カウントを注入することは、多くの場合、確実にハイの変化を定量化するのに十分ですそのようなのPtdIns（4,5）P 2としてgher豊富PtdInsP種。しかし、最大10百万カウントの注射は、のPtdIns（3,5）P 2と下側存在量の種の定量化のために必要であり得ます。放射性シグナルのレベルは、サンプルを調製するために使用される細胞の総数、ラベリング時間および温度、3 H- ミオ -イノシトールの濃度、PtdInsPsの代謝回転速度と内因性の合成を含む達成影響を及ぼす可能性がある様々なパラメータがあります放射性標識されたイノシトールと競合するイノシトール、の。例えば、少なくとも1つの倍加時間のための放射性標識酵母細胞は、代謝PtdInsPs への3 H- ミオイノシトールの取り込みが、遅い成長または遅い代謝活性が必要になる場合があります持っている酵母の変異株のためのラベリング時間の延長を可能にします。また、ここで説明するプロトコルは、酵母培養のdiauxicシフトを使用して、対数期中期に増殖した細胞は、その後、FOを集中している場所1倍加時間にわたってRラベリング。以前に32を行ったようにしかし、1時間の長い期間の初期および中期対数期の間とするために標識した細胞によるdiauxicシフトを減らすことができます。こうすることで、これらの著者は、のPtdIns（3）P、のPtdIns（4）Pとdiauxicシフト32を受けている細胞以外のPtdIns（4,5）P 2のより高いレベルが観察されました。
RAW 264.7マクロファージラインのようないくつかの哺乳動物細胞は、12時間毎に倍増するので、他の人が全くない20,35,39、ニューロンの場合のようにはるかに遅い分割、または場合がある。同様に、哺乳動物細胞の標識期間は、最適化が必要な場合があります。さらに、1つの理想的な放射性シグナルのレベルを達成するために、3 H- ミオ -イノシトールの濃度を増加させることができます。しかし、いくつかの3 H- ミオ -イノシトールを90％エタノールにパッケージ化されていることに注意してください; ミオ -イノシトール過度の 3 H- を追加すると、メディアでのエタノール含有量を増加させると、意図しないEFFEを有することができます細胞上のCT。最後に、長期の放射性標識はまた、イノシトールの細胞を飢えさせることができます。これは、完全DMEMが0.5μm3 H- ミオ -イノシトール10μCiの/ mlのラベルされた場合に比べて、40μMのミオ -イノシトールのが含まれている哺乳動物細胞培養中で特に顕著です。このように、必要に応じて、単にラベル付けの際に、哺乳動物細胞の数を増やすことをお勧めします。
細胞溶解および脂質処理ステップはまた、最適な収率を得ること、ならびにHPLCカラムの健康を維持するために重要です。過塩素酸による溶解は、メソッドが最初に組織培養のために使用し、後で酵母28,33に使用される、脂質および他の高分子の沈殿を可能にします。従来のメタノール/塩酸/クロロホルム法を使用して、総脂質の抽出に比べて、過塩素酸の使用は、実験28との間のより少ない変動でのPtdIns（3,5）P 2を含む 、PtdInsPsの回復を向上させます。サブメチルアミンのシークエントアプリケーションは、相分離し、遊離脂肪酸および無傷の脂質28,34からのものであると、水溶性GRO-INSPを残し、グリセロール骨格と2つの疎水性アシル鎖との間のエステル結合を破壊します。特に注意は、抽出工程中に前方に不要な有機溶剤不溶物を運ぶ避けるようにしなければなりません。これは、システムを詰まらせる原因の圧力スパイクおよび/または化学的に列を損傷することがあります。また列は、使用前にリン酸アンモニウム（緩衝液B）を高濃度に列を暴露することにより、毎日の初めに調整されなければなりません。このように、短い「 平衡 」プロトコルは、実験サンプルを実行する前に採用されています。実行された最初の実験試料中のグロ - InsPsピークの遅延溶出プロファイルでは、このコンディショニング工程の結果を行うに失敗しました。
同様に検討するための分析と定量化に関連するいくつかの重要なポイントがあります。まず、Quantification自体は信号と各ピークの面積の統合だけでなく、ピーク高さでなければなりません。各ピークの絶対的な信号の統合は、細胞内PtdInsPの存在量の変化を反映せずにサンプルと実験の間で大幅に変わる場合があるので、また、内部統制は、通常必要です。親グロインピークは、典型的には、それに対して各GRO-INSPピークを正規化することにより、内部対照として使用されます。グロインのピークは、通常、放射性シグナルの約90％を保持し、条件との間で変化する傾向はありません。あるいは、一つは親のPtdInsは、実験条件の大きな変化を受けていることを疑う場合は特に、総カウントに対して正規化するために選択することができます。最後に、少量のPtdInsPsため、バックグラウンド減算は、目的のピーク（ 図3D）と同じ「時間スケール」と近くの非ピーク面積を定義することによって推奨されています。
最後にもう一つの考慮事項はに関し、3モノリン酸化され、3ビス - リン酸化種を含む7 PtdInsP種を、所有する哺乳類サンプルの分析。残念ながら、それは完全にPtdIns5PからPtdIns4Pを解決することは困難である、とのPtdIns（3,5）結合した二重ピークをもたらす哺乳類サンプル中のPtdIns（3,4）P 2からP 2。これらのピークの分解能を増大させる以前に公開されたいくつかの方法があります。通常、これは、リン酸アンモニウム緩衝液の出発濃度は、溶出プロフィールおよびリン酸アンモニウム緩衝液のpH 33,35-38間に速度およびリン酸アンモニウム緩衝液濃度変化によるステップを溶出の長さを変更することを含みます。おそらく、別個のPtdInsに開発された最も成功した方法は、（4）PとのPtdIns（5）Pは、最近、pH6.0で二タンデムSAXカラムおよびリン酸アンモニウム緩衝液を用いSarkesとRameh 39で説明しました。
ほとんどのメソッドと同様に、HPLC-Cを使用して、細胞内でPtdInsPsを定量化するoupledフローシンチレーションは、他の利用可能な方法に比べて利点と欠点があります。例えば、HPLCに結合されたオンラインフローシンチレーションは、グロ - InsPsのライブ検出を提供していますが、この方法の感度を低減し、シンチレーション計数の時間を制限します。また、HPLCの溶離液は、画分収集代わりに流れシンチレータへの供給のオートサンプラーとすることができます。手動の画分は、その後、より高い感度を提供し、より長い期間にわたってオフライン液体シンチレーションカウンターで読み取ることができる-それにもかかわらず、このアプローチは多くの時間がかかり、労働集約的であり、画分の数に応じて解像度を低減38,40を収集しました。さらに、全細胞の分析は明確に特定PtdInsPのレベルを測定しますが、それは、そのPtdInsPの細胞内分布の変化について通知しませんが1でしpreviouのサブセルラー分画法に結合フローシンチレーションずるい39を行います。比較では、FPベースPtdInsP結合ドメインは、細胞内でPtdInsP種の位置及び動態を研究するのに有用であるだけでなく、目標PtdInsP以外の要素に結合してもよいです。また、ここで説明する方法は、大幅にPtdInsPsの分子多様性を増大させるアシル鎖を除去することにより、PtdInsPレベルの分析を簡素化します。脂質の脱アシル化は、アシル鎖、41,42シグナリング PtdInsPの過小評価の側面に関する構造情報の損失につながるため、しかし、同じ理由により、これは、また、主要な欠点です。これは大きな問題である場合には、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）は14,17を採用しなければならないに結合されます。しかし、同時に、LC-MSにより、全43 PtdInsPs種を分析するために、現在は困難です。このように、方法の組み合わせは、すべて7 PtdInsPs種の位置、ダイナミクス、分子の多様性とレベルを調査するために、最善のアプローチです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
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