Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

Published: January 6, 2016 doi: 10.3791/53529
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University
* These authors contributed equally

Summary

Phosphoinositides محت الدهون التي تتغير بسرعة استجابة للمؤثرات المختلفة وفرة نسبية. توضح هذه المقالة طريقة لقياس وفرة phosphoinositides التي وصفها أيضي الخلايا مع 3 H- ميو -inositol، تليها استخراج وdeacylation. ثم يتم فصل استخراج glycero-inositides بواسطة عالية الأداء اللوني السائل وكميا بواسطة التلألؤ التدفق.

Protocol

ملاحظة: يصف النص أدناه بالتفصيل طريقة لقياس PtdInsPs في الخميرة. لأنها توفر تفاصيل التجريبية لخلايا وضع العلامات الخميرة مع 3 H- ميو -inositol، واستخراج وdeacylating الدهون وبروتوكول HPLC-شطف إلى يجزئ وتحديد PtdInsPs deacylated. يرجى ملاحظة أن وضع العلامات، وdeacylation، القرار النوعي والكمي لPtdInsPs في خلايا الثدييات تتطلب التحسين وأطول ملامح HPLC-شطف. هذه التفاصيل يمكن العثور عليها في أي مكان آخر، على الرغم من أننا نناقش بعض الجوانب في مناقشة. وعموما، فإن منهجية لاستخراج الدهون، deacylate واستخراج للذوبان في الماء غرو-InsPs من تعطى الخميرة وهو موضح في الشكل 1.

1. بروتوكول لوصفها وتحليل PtdInsPs في الخميرة

  1. زراعة الخلايا وradiolabeling
    1. تنمو 20 مل ثقافة السائل من SEY6210 سلالة الخميرة في 30 درجة مئوية مع الهز المستمر في تركيبية كاملةوسائل الإعلام إلى مرحلة سجل منتصف أو الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من حوالي 0،6-0،7.
      ملاحظة: لا تستخدم وسائل الإعلام YPD لأن هذا قد يؤثر على 3 H- ميو -inositol التأسيس. يجب أن هذا الحجم ثقافة توفر مادة كافية لمدة 2-3 أشواط HPLC.
    2. بيليه ما مجموعه 10-14 OD من خلايا الخميرة (لاحظ أن 1 مل الثقافة مع OD 600 = 1 يحتوي ~ 1X10 7 الخلايا) بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق في 12 مل أنبوب الجولة القاع. و resuspend مع 2 مل خالية من إينوزيتول الوسائط (IFM) (انظر الجدول رقم 1 لتكوين IFM).
    3. كرر الطرد المركزي ونضح وسائل الإعلام. resuspend الكرية مع 440 ميكرولتر من IFM واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. إضافة 60 ميكرولتر من 3 H- ميو -inositol (1 ميكرولتر = 1 μCi) لكل عينة ويحضن في درجة حرارة متزايدة من 30 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعة مع الهز المستمر.
      الحذر: 3 H- ميو -inositol هي رفيقة المشعالريال التي ينبغي التعامل معها بعد التدريب المناسب. بالإضافة إلى ذلك، جميع المواد الاستهلاكية التي تجعل الاتصال مع 3-H التي تحتوي على مواد يجب التخلص بشكل مناسب وتعيين كنفايات مشعة.
      ملاحظة: يمكن تغيير درجة حرارة النمو كما هو مطلوب طالما كل سلالات يمكن مقارنة تزرع في نفس درجة الحرارة.
    5. نقل تعليق الخلية (500 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 500 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 9٪ و 200 ميكرولتر من حمض غسلها الخرز الزجاجي. مزيج من قبل قلب واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    6. دوامة العينة في سرعة قصوى لمدة 10 دقيقة ونقل لست] إلى أنبوب microcentrifuge جديدة باستخدام طرف جل التحميل لتجنب الخرز الزجاجي.
    7. بيليه العينة في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونضح طاف.
    8. resuspend الكرية التي كتبها حمام صوتنة في 1 مل من الجليد الباردة 100 ملم EDTA. بيليه مرة أخرى كما كان من قبل.
  2. Deacylation واستخراج طازجة إعداد 5.0 مل من كاشف deacylation من خلال الجمع بين 2.3 مل من الميثانول، 1.3 مل من 40٪ ميثيل، 0.55 مل من 1-بيوتانول و0.80 مل من الماء. عكس إلى المزيج.
  3. نضح EDTA ويصوتن بيليه في 50 ميكرولتر من الماء.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من كاشف deacylation ويصوتن لخلط. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
  5. الدهون الحرارة لمدة 50 دقيقة في 53 درجة مئوية في كتلة الحرارة. تجفيف العينات تماما من فراغ الطرد المركزي أكثر من 3 ساعات أو O / N.
    1. تأكد من تركيب مصيدة الكيميائية بين فراغ الطرد المركزي ومضخة فراغ لمنع الأبخرة من دخول الهواء.
  6. resuspend الكرية مع 300 ميكرولتر من الماء عن طريق حمام صوتنة واحتضانها في RT لمدة 20 دقيقة. تجفيف العينات التي كتبها فراغ الطرد المركزي لمدة 3 ساعات أو O / N. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  7. يصوتن بيليه مع 450 ميكرولتر من الماء. هذه هي المرحلة المائية أثناء الاستخراج.
  8. طازجة إعداد 10 مل من extractioن كاشف عن طريق إضافة 8.0 مل من 1-بيوتانول، 1.6 مل من الأثير إيثيل و 0.40 مل من اثيل فورمات. عكس إلى المزيج.
  9. إضافة 300 ميكرولتر من كاشف استخراج إلى المرحلة المائية. دوامة الخليط في سرعة قصوى لمدة 5 دقائق وفصل طبقات بواسطة الطرد المركزي في سرعة قصوى (18000 x ج) لمدة 2 دقيقة.
  10. جمع طبقة مائية أسفل في أنبوب microfuge جديدة مع تجنب الطبقة العليا العضوية، واجهة، وبيليه. كرر استخراج المرحلة المائية مرتين أكثر مع كاشف استخراج الطازجة.
  11. تماما تجف الطبقة المائية التي جمعتها فراغ الطرد المركزي. تفريق بيليه في 50 ميكرولتر من الماء عن طريق حمام صوتنة.
  12. إضافة 2 ميكرولتر من كل عينة إلى 4 مل من السائل التلألؤ في 6 مل البولي ايثيلين التلألؤ القارورة. تحديد عدد من التهم (في CPM) في كل عينة عن طريق التلألؤ السائل باستخدام نافذة مفتوحة.
  13. تخزين العينات في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للHPLC.
  • فصل3 H-glycero inositides من قبل HPLC
    1. إعداد العازلة A من خلال تصفية 1 لتر من الماء عالى النقاء مع زجاجة كبار مرشح 0.22 ميكرون فراغ، تليها التفريغ.
    2. إعداد العازلة B بجعل حل 1 لتر من 1 M فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة (APS، MW 132.06) في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 3.8 مع حمض الفوسفوريك. تصفية فوسفات الأمونيوم مع زجاجة كبار مرشح 0.22 ميكرون فراغ، تليها التفريغ.
    3. تجميع قنينة حقن عن طريق تجهيز 2 مل قارورة مع 250 ميكرولتر حجم صغير إدراج بنابض. تحميل 10 ملايين CPM وإضافة الماء لإجمالي حجم 55 ميكرولتر. إعداد قارورة فارغة مع 55 ميكرولتر من الماء.
    4. سقف قارورة مع قبعات المسمار تجهيزه مع حواجز PTFE / سيليكون (تواجه الجانب الأحمر داخل القارورة). وضع كل قارورة في صينية أخذ العينات السيارات من HPLC، بدءا من قارورة فارغة.
    5. استخدام HPLC والبرامج المرتبطة بها والتي تسيطر على تدفق العازلة، degasses مخازن والضوابط عينة injectiعلى. استخدام ماض تدفق الانترنت والبرامج المرتبطة به لتنظيم معدل التدفق scintillant ورصد إشارة 3 H-الاضمحلال.
      1. استخدام ساكس العمود اللوني السائل مع أبعاد 250 ملم × 4.6 ملم وتحتوي على 5 ميكرون الراتنج السيليكا في HPLC. تجهيز العمود مع حارس عمود لمنع حقن من الملوثات.
      2. تثبيت 3 H-متوافقة 500 ميكرولتر خلية تدفق في ماض التدفق.
        ويمكن أن يتم تجزئة مع نظام سلسلة لا نهاية HPLC اجيلنت 1200 التي تسيطر عليها البرنامج لل ChemStation أو مع غيرها من نظم HPLC المتاحة تجاريا: ملاحظة. ويمكن أن يتم التلألؤ تدفق شاطف HPLC مع ماض تدفق β-RAM التي تسيطر عليها البرنامج لورا أو ماض تدفق المتاحة تجاريا آخر أو برنامج متوافق.
    6. تهيئة المضخة الرباعية بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة مع 100٪ عازلة A.
    7. إعداد ملف تعريف موازنة على HPLCللسيطرة على التدرج من المخازن A و B (نسمي هذا "البروتوكول موازنة"): 1٪ B الاحتياطي لمدة 5 دقائق، 1-100٪ B لمدة 5 دقائق، و 100٪ B لمدة 5 دقائق، 100-1٪ B لمدة 5 دقيقة، 1٪ B لمدة 20 دقيقة. تعيين الحد ضغط 400 بار، 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق، و 30 دقيقة وقت التشغيل.
    8. إعداد ملف تعريف شطف (الشكل 2) على HPLC للسيطرة على التدرج من المخازن A و B (نسمي هذا "البروتوكول A"): 1٪ B لمدة 5 دقائق، 1-20٪ B لمدة 40 دقيقة، 20-100٪ B لمدة 10 دقيقة، و 100٪ B لمدة 5 دقائق، 100-1٪ B لمدة 20 دقيقة، 1٪ B لمدة 10 دقيقة. تعيين الحد ضغط 400 بار، 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق، و 90 دقيقة وقت التشغيل.
    9. إعداد بروتوكول الكشف على ماض تدفق (نسمي هذا "البروتوكول كشف") لتشغيل لمدة 60 دقيقة، مع التلألؤ السائل معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة وزمن السكون 8.57 ثانية.
    10. برنامج تسلسل حقن الآلي على HPLC لتبدأ المياه فارغة على "بروتوكول A موازنة"، ثم عن طريق البريدمنظمة العمل ضد الجوع radiolabelled العينة على "البروتوكول". تهيئة تسلسل عندما تصبح جاهزة.
    11. في حين المدى لا يزال على بروتوكول موازنة، وخلق دفعة على ماض تدفق لقياس كل من العينات مع "بروتوكول A الكشف." فإن حقن كل عينة جديدة تهيئة "بروتوكول A" على HPLC في حين اثار على ماض تدفق لبدء "بروتوكول A الكشف."
    12. عند الانتهاء من جميع أشواط، تدفق HPLC، العمود وتدفق ماض مع 100٪ العازلة A لمدة 30 دقيقة في 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق.
  • تحليل البيانات
    1. استخدام البرمجيات لورا أو أي برامج أخرى التي يمكن قياس أطياف اللوني. وصفت الخطوات الموضحة في هذا القسم في الشكل (3).
    2. فتح الملفات عن طريق النقر على "ملف"، "فتح"، وحدد ملف البيانات الخام لكل عينة.
    3. في "الاستشرابية" علامة التبويب، زويام في لتمتد كل واحدة من قمم أقل (حوالي 1000 التهم [المحور ص]) مع الإبقاء على قرار الوقت. التكبير في كل قمة الفردية إذا لزم الأمر.
    4. تسليط الضوء على كل من قمم للتحليل باستخدام "إضافة ROI" أداة. تحديد القمم التي كتبها وقت شطف: الأبوية غرو الإضافية في 10 دقيقة، وغرو-Ins3P في 18 دقيقة، وغرو-Ins4P في 20 دقيقة، وغرو الإضافية (3،5) P 2 في 29 دقيقة، وغرو الإضافية (4،5 ) P 2 في 32 دقيقة.
    5. في "المناطق الجداول" علامة التبويب، تسجيل "منطقة (التهم)" كل الذروة. لاحظ "بدء (MM: SS)" مرة و "النهاية (MM: SS)" الوقت من كل الذروة.
    6. لالطرح الخلفية، تسليط الضوء على المنطقة المحاذية للالذروة التي تمتد على نفس المقدار من الوقت. طرح عدد من التهم من ذروة المقابلة.
    7. تطبيع مساحة كل ذروة ضد الأبوية غرو الإضافية (التعبير عن "٪ من إجمالي PtdIns"). ثم، وتطبيع كل من قمم في كل حالة تجريبية ضد حالة التحكم (معبرا عنها "نزيادة أضعاف مقارنة للسيطرة على ").
      ملاحظة: يمكن أيضا تطبيع كل قمة أن يتم مقابل مجموع التهم ولكن منذ الأبوية غرو الإضافية هو أكثر وفرة من كل PtdInsPs البعض النتائج تميل إلى أن تكون مماثلة.
    8. تصدير البيانات لتحليل اللون عن طريق الضغط على "ملف"، "حفظ باسم ..."، ثم اختر "CSV (مفصولة بفواصل)" تنسيق الملف. رسم البيانات في جدول وتقديم الضرورة.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    باستخدام هذا الأسلوب، وصفت PtdInsPs الخميرة عملية الأيض مع 3 H- ميو -inositol. بعد وضع العلامات، وعجلت الدهون الفوسفاتية مع حمض البيركلوريك، تليها deacylation فوسفورية واستخراج غرو-InsPs للذوبان في الماء (الشكل 1). في هذه المرحلة، فمن الأهمية بمكان تقدير مجموع إشارة المشعة المرتبطة استخراج غرو-InsPs التي كتبها التلألؤ السائل لضمان نسبة كافية لPtdInsPs المنخفضة جدا وفرة مثل PtdIns إشارة إلى الضوضاء (3،5) P 2. ينبغي حقن ما مجموعه 5-10٬000٬000 لكل ألف ظهور. منذ خلايا الخميرة يحمل PtdInsPs أربعة فقط، لا يمكن أن يتحقق القرار مع طريقة شطف 1 ساعة كما هو موضح (الشكل 2).

    هنا، من النوع البري، atg18 وصفت Δ Δ وvac14 المسوخ الخميرة ومعالجتها لتحليل التغيرات في PtdIns (3،5) P 2، الالبريد الأقل وفرة من PtdInsPs في الخميرة 16،19،27. كما لوحظ في الشكل 4A-C، والوضع شطف لجميع السلالات الثلاث تنتج 3-H المرتبطة قمم إشارة. على الوالدين غرو الإضافية الذروة elutes الأولى (8-9 دقيقة، هو مبين في الشكل (3)، ولكن ليس في الشكل 4 منذ غرو الإضافية يلقي بظلاله على إشارة من الأنواع فسفرته)، تليها غرو-Ins3P (~ 18 دقيقة)، Gro- Ins4P (~ 20 دقيقة)، وغرو الإضافية (3،5) P 2 (~ 29 دقيقة) وغرو الإضافية (4،5) P 2 (~ 32: 00 دقيقة)، والتي تتطابق على التوالي إلى الدهون الفوسفاتية PtdIns acylated، PtdIns3P، PtdIns4P، PtdIns (3،5) P 2 وPtdIns (4،5) P 2. هناك اثنين من قمم صغيرة إضافية في 4 دقيقة واحدة أن يميل إلى اتباع فورا الوالد غرو الإضافية (10 دقيقة). هذه على الأرجح تمثل اينوزيتول وغير glycerated inositide الفوسفات (الشكل 3). نمط شطف ثابت ومميز، على الرغم من أن الوقت المحدد قد تختلف عند توظيف زراعية مختلفةاستئجار نظام HPLC و / أو عمود جديد.

    ذروة المرتبطة PtdIns (3،5) P 2 (الشكل 4، السهم الأحمر) يخضع التغيير الأكثر دراماتيكية بين النوع البري، atg18 Δ وسلالات الخميرة vac14 Δ. بالنسبة لخلايا من النوع البري (A)، وهناك كبيرة جدا غرو الإضافية (3،5) P 2 إشارة -associated في الخلايا Δ atg18 وذروة أصغر في خلايا الخميرة vac14 Δ. من أجل تحديد مجموع إشارة المشعة المرتبطة بكل الذروة، تم دمج التهم تحت منطقة الذروة (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، منذ إشارة المشعة المطلقة تختلف بين العينات، تم استخدام الوالدين الأنواع غرو الإضافية بمثابة الرقابة الداخلية عن طريق تطبيع ضدها (واحد ويمكن أيضا اختيار لتطبيع ضد العد الكلي). من خلال ذلك، تشير البيانات إلى أن PtdIns (3،5) P 2 تشكل٪ فقط من 0.07 PtdIns في نوع خلايا الخميرة البرية، في حين PtdIns (3،5) P 2 يتوافق مع 1.2٪ من PtdIns الوالدين في الخلايا atg18 Δ، أو زيادة 17 أضعاف كبيرة في PtdIns (3،5) P 2 نسبة إلى البرية من نوع الخلايا (الشكل 4A، B و D). في المقابل، كانت مستويات PtdIns (3،5) P 2٪ فقط 0.01 للإشارة PtdIns في VAC14 -deleted خلايا الخميرة، خسارة 85٪ في PtdIns (3،5) P 2 (الشكل 4C وD). عموما، هذه القياسات هي في الاتفاق مع النتائج المنشورة تبين أن PtdIns (3،5) P 2 حوالي 0.1٪ من PtdIns في الخلايا من النوع البري، و 90٪ تخفيض في vac14 D، ومن 10 إلى 20 أضعاف في خلايا atg18 D نسبة إلى البرية من نوع الخلايا 27،29.

    الشكل 1
    الشكل 1. Deacylation واستخراج 3 H-غرو-المفتش. رديولبلد معهد العلوم الإندونيسييتم غسلها د راسب في حمض البيركلوريك مع محلول مائي من EDTA. ثم يستنشق هذا، وأضاف deacylation كاشف وحضنت في 53 ° C. خليط التفاعل deacylation بعد ذلك الفراغ التي جفت وغسلها بالماء مرتين، تليها إضافة لاستخراج كاشف. ثم يتم vortexed هذا، طرد ويتم جمع المرحلة المائية. ويتكرر الخطوة استخراج مجموع ثلاث مرات لإزالة الملوثات العضوية وغير القابلة للذوبان. الكسر للذوبان في الماء (الأزرق)، والذي يتضمن 3 H-غرو-المفتش، بعد ذلك الفراغ التي جفت وممهى مع 60 ميكرولتر من الماء. يتم تحديد مقدار النشاط الإشعاعي من قبل التلألؤ السائل (CPM) ويتم تحميل التهم متساوية عبر عينات في HPLC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 2 <يعتمد ر /> الشكل 2. التدرج من العازلة فوسفات الأمونيوم لشطف من 3 H-غرو-المفتش. قرار غرو-المفتش من قبل قوي اللوني تبادل شاردي على تطبيق ثنائي القاعدة فوسفات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 3.8 (الاحتياطي B). اختيار التدرج يعتمد على مزيج من الأنواع غرو-المفتش المتاحة للانفصال. يتم استخدام بروتوكول A لعينات الخميرة، التي تمتلك PtdInsPs أربعة فقط. حل كل من قمم أربعة يكفي مع الزيادة السريعة في (NH 4) 2 هبو 4 التركيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل 3. تسترشد تعليمات لتحليل البيانات وفرة PtdInsP. يتم تحميل ملفات البيانات على لورا الصورةتقييم oftware وبصريا باستخدام الكروماتوجرافي (فتح افتراضيا). باستخدام "تكبير" أداة (أ)، فكبر القمم (ب). تحديد قمم متميزة على الكروماتوجرافي باستخدام "إضافة ROI" أداة (ج). في "المنطقة الطاولة" علامة التبويب (د)، يتم عرض جميع المعلومات الناتجة عن المناطق أبرزت الاهتمام كجدول واحد (ه). تصدير التهم الخام من كل الذروة (و) و تطبيع كل الأنواع PtdInsP ضد فوسفتيدلينوستول الوالدين (ز) أو ضد مجموع التهم الموجهة إليه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 4
    الرقم 4. PtdIns (3،5) P 2 المستويات في البرية من نوع وخلايا الخميرة متحولة. ويبين تحليل اللون التمثيلية للالتلألؤ تدفق استخراجإد 3 H-غرو-InsPs من النوع البري (A)، atg18 Δ (B)، وvac14Δ (C) سلالات الخميرة باستخدام بروتوكول A. إن التهم الخام من المناطق ذات الاهتمام الموافق غرو الإضافية (3،5) يتم استخراج P 2 (السهم) من الكروماتوجرافي والخلفية تطرح. تتم مقارنة القيم الناتجة لمن النوع البري والمعبر عنها أضعاف تغيير في غرو الإضافية (3،5) P مستويات 2 (D). وظائف إضافية غرو (3،5) P 2 يتم تفسير المستويات والتغيرات في إظهار المستويات والتغيرات في PtdIns الأصلي (3،5) P 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    63 ملي MgCl2 839 ميكرومتر كا-بانتوثينات
    وسائل الإعلام الحرة إينوزيتول (IFM)
    27.8 ملم (NH4) 2SO4
    2٪ الجلوكوز
    0.01 ملي KH2PO4
    الأحماض الأمينية 1X
    1X LPSM
    عناصر تتبع 1X
    الفيتامينات 5X
    10X وسائل الإعلام الفوسفات والكبريتات منخفضة (LPSM)
    9 ملي CaCl2
    17 ملي كلوريد الصوديوم
    67 ملي بوكل
    عناصر تتبع 1،000X
    حمض البوريك 8 ملي
    250 ميكرومتر CuSO4
    602 ميكرومتر KI
    1.23 ملي FeCl3
    2.65 ملي MnSO4
    971 ميكرومتر نا مولبيدات
    2.48 ملي ZnSO4
    الفيتامينات 500X
    4 ميكرومتر البيوتين
    2.27 ميكرومتر حمض الفوليك
    1.62 ملي النياسين
    حمض 729 ميكرومتر ف أمينو
    973 ميكرومتر Pryidoxine، حمض الهيدروكلوريك
    266 ميكرومتر ريبوفلافين
    593 ميكرومتر الثيامين، حمض الهيدروكلوريك

    وradiolabelled الجدول 1. تكوين خميرة خالية من إينوزيتول وسائل الإعلام. خلايا الخميرة مع IFM وسائط الإعلام قاعدة أن تستكمل مع 3 H- ميو -inositol. إعداد 100 مل من محلول من IFM باستخدام حلول أشار، فلتر تعقيم باستخدام زجاجة كبار 0،22 ميكرون تصفية فراغ وتخزينها في RT. لإعداد منخفض الفوسفات والكبريتات وسائل الإعلام (LPSM)، وتوليد 100 مل من محلول باستخدام أملاح المشار إليها، تصفية تعقيم باستخدام زجاجة كبار 0،22 ميكرون تصفية فراغ وتخزينها في RT. حل الأملاح اشارت الى إعداد 1 L 1،000x حل من العناصر النزرة. تخلط جيدا قبل الاستعمال و / أو تخزين aliquots في -20 ° C. حل الفيتامينات اشارت الى إعداد 1 L 500X فيتامين الحل. تخلط جيدا قبل استخدام قسامات وتخزينها في -20 ° C.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    تفاصيل هذه المقالة بروتوكول تجريبي اللازمة لقياس مستويات الخلايا من PtdnsPs كل جانب HPLC تدفق التلألؤ من الخميرة. منهجية تمكن من وضع العلامات الأيضية من PtdInsPs مع 3 H- ميو -inositol، تليها معالجة الدهون واستخراج للذوبان في الماء 3 H-غرو-InsPs، تجزئة HPLC والتحليل. باستخدام هذا الأسلوب، والمستويات النسبية للPtdInsPs في الخلايا تحت مختلف الظروف يمكن كميا، كما هو مبين لPtdIns (3،5) P 2 في البرية من نوع، vac14 D وatg18 D خلايا الخميرة (الشكل 4).

    وهناك عدد من الخطوات والتعديلات الهامة التي يمكن القيام به لتحسين النتائج و / أو استكشاف. واحدة من أهم المعايير لتحقيق الكمي يمكن الاعتماد عليها من PtdInsPs هو مجموع مستوى إشارة المشعة. عادة، عن طريق الحقن 3-5٬000٬000 التهم في HPLC غالبا ما يكون كافيا ل quantitate موثوق التغييرات في مرحباgher فرة الأنواع PtdInsP مثل PtdIns (4،5) P 2. ومع ذلك، حقن تصل إلى 10 ملايين التهم قد تكون ضرورية لتقدير حجم الأنواع وفرة أقل مثل PtdIns (3،5) P 2. هناك معايير مختلفة التي قد تؤثر على مستوى إشارة المشعة يتحقق بما في ذلك العدد الكلي للخلايا المستخدمة في إعداد العينة، وهي المرة وضع العلامات ودرجة الحرارة، وتركيز 3 H- ميو -inositol، ومعدل دوران PtdInsPs والتوليف الذاتية من اينوزيتول، والتي سوف تتنافس مع إينوزيتول رديولبلد. على سبيل المثال، الخلايا radiolabeling الخميرة واحد على الأقل مضاعفة الوقت يسمح لإدراجها الأيض من 3 H- إينوزيتول myo- إلى PtdInsPs، ولكن تمديد الوقت لوضع العلامات المسوخ الخميرة التي تنمو أبطأ أو أن يكون النشاط الأيضي أبطأ قد تكون ضرورية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم التحول ثنائي خطوات النمو الثقافة الخميرة، حيث نمت الخلايا إلى مرحلة سجل منتصف ثم تتركز FOوضع العلامات ص أكثر من مرة واحدة مضاعفة. ومع ذلك، يمكن للمرء أن يقلل من التحول ثنائي خطوات النمو من الخلايا وصفها خلال وقت مبكر، ومرحلة سجل منتصف ولفترات أطول من الوقت كما فعلت سابقا 32. في القيام بذلك، لاحظ هؤلاء المؤلفين مستويات أعلى من PtdIns (3) P، PtdIns (4) P وPtdIns (4،5) P 2 من الخلايا التي تمر التحول ثنائي خطوات النمو 32.

    وبالمثل، فإن فترة الوسم من خلايا الثدييات قد تتطلب التحسين منذ بعض خلايا الثدييات مثل خط بلعم RAW 264.7 يتضاعف كل 12 ساعة، في حين أن البعض الآخر قد يقسم أبطأ بكثير، أو كما في حالة الخلايا العصبية، وليس في كل 20،35،39. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن زيادة تركيز 3 H- ميو -inositol لتحقيق مستوى مثالي إشارة المشعة. ومع ذلك، يرجى ملاحظة أن بعض 3 H- ميو -inositol يتم تعبئتها في 90٪ من الإيثانول، مضيفا مفرطة 3 H- ميو -inositol سوف تزيد من محتوى الإيثانول في وسائل الإعلام ويمكن أن يكون لها EFFE غير مقصودط م على الخلايا. وأخيرا، يمكن radiolabeling لفترات طويلة أيضا تجويع خلايا إينوزيتول. هذا واضح بشكل خاص في الثقافة خلايا الثدييات حيث يحتوي على كامل DMEM 40 ميكرومتر ميو -inositol، مقارنة مع 0.5 ميكرومتر 3 H- ميو -inositol عندما وصفت مع 10 μCi / مل. وبالتالي، إذا لزم الأمر، ببساطة زيادة عدد خلايا الثدييات خلال وضع العلامات ويوصى.

    تحلل ومعالجة الدهون الخطوات الخلوية حاسمة للحصول على عائد الأمثل، وكذلك المحافظة على صحة العمود HPLC أيضا. تحلل مع حامض البيركلوريك يسمح لترسيب الدهون والجزيئات الأخرى، وهي طريقة استخدمت لأول مرة عن زراعة الأنسجة واستخدامها لاحقا لالخميرة 28،33. مقارنة مع استخراج الدهون الكلية باستخدام الميثانول التقليدي / حمض الهيدروكلوريك طريقة / الكلوروفورم، واستخدام حمض البيركلوريك يعزز التعافي من PtdInsPs، بما في ذلك PtdIns (3،5) P 2، مع أقل الاختلاف بين التجارب 28. الفرعيةتطبيق متتالية من ميثيل فواصل السندات استر بين العمود الفقري الجلسرين واثنين من سلاسل أسيل مسعور، وترك للذوبان في الماء غرو-المفتش أن يكون من الأحماض الدهنية الحرة والدهون سليمة 28،34 مفصولة المرحلة. يجب توخي الحذر خاصة لتجنب تحمل المذيبات العضوية غير المرغوب فيها إلى الأمام والمواد غير القابلة للذوبان خلال خطوة الاستخراج. هذا قد تسد النظام، تسبب ارتفاع الضغط و / أو تلف كيميائيا العمود. وبالإضافة إلى ذلك يجب أن تكون مشروطة العمود في بداية كل يوم من خلال تعريض العمود إلى تركيز عال من فوسفات الأمونيوم (العازلة B) قبل الاستخدام. وبالتالي، يتم توظيف بروتوكول القصير "موازنة" قبل تشغيل العينات التجريبية. الفشل في القيام بهذه الخطوة تكييف النتائج في ملف تعريف شطف تأخر القمم غرو-InsPs في أول العينة التجريبية التي يتم تشغيلها.

    هناك عدة نقاط رئيسية تتعلق التحليل النوعي والكمي للنظر أيضا. أولا، فuantification نفسه ينبغي أن يكون التكامل بين الإشارة ومساحة كل الذروة، وليس فقط ارتفاع الذروة. وعلاوة على ذلك، الرقابة الداخلية عادة ما تكون ضرورية لأن التكامل إشارة المطلق لكل الذروة يمكن أن تختلف بشكل كبير بين العينات والتجارب دون أن يعكس تغييرا في وفرة PtdInsP في خلية. وعادة ما يعمل على الوالدين غرو الإضافية الذروة مثل الرقابة الداخلية عن طريق تطبيع كل الذروة غرو-المفتش ضدها. ذروة غرو الإضافية يحمل عادة ما يقرب من 90٪ من إشارة المشعة ولا تميل الى تغيير بين الظروف. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يختار لتطبيع مقابل مجموع التهم، وخاصة إذا كان أحد يشك في أن PtdIns الوالدين يعاني من تغير كبير في الظروف التجريبية. وأخيرا، لPtdInsPs فرة منخفضة، ويوصى خلفية الطرح عن طريق تحديد منطقة غير الذروة المجاورة مع نفس "جدول زمني"، كما ذروة الفائدة (الشكل 3D).

    ويتعلق أحد الاعتبارات النهائي لتحليل عينات من الثدييات، التي تمتلك سبعة أنواع PtdInsP، بما في ذلك الأنواع الثلاثة أحادية فسفرته وثلاثة مكرر فسفرته. لسوء الحظ، فإنه من الصعب حل تماما PtdIns4P من PtdIns5P، وPtdIns (3،5) P 2 من PtdIns (3،4) P 2 في عينات من الثدييات، مما أدى إلى الملتصقة قمم مزدوجة. هناك العديد من الطرق التي نشرت في وقت سابق ان زيادة دقة من هذه القمم. عادة، وهذا ينطوي على تعديل طول شطف، وتركيز بدءا من العازلة فوسفات الأمونيوم، ومعدل والخطوات التي التغييرات تركيز العازلة فوسفات الأمونيوم خلال الملف الشخصي شطف والرقم الهيدروجيني للالعازلة فوسفات الأمونيوم 33،35-38. ولعل الطريقة الأكثر نجاحا تطويرها لPtdIns منفصل (4) P وPtdIns (5) وقد وصفت P مؤخرا Sarkes ورامح 39، التي استخدمت أعمدة SAX اثنين، جنبا إلى جنب وجود مخزن مؤقت فوسفات الأمونيوم عند درجة الحموضة 6.0.

    كما هو الحال مع معظم الطرق، وذلك باستخدام HPLC-جoupled تدفق التلألؤ لتحديد PtdInsPs في الخلايا لديها مزايا وعيوب مقارنة مع الطرق الأخرى المتاحة. على سبيل المثال، على شبكة الإنترنت التلألؤ تدفق بالإضافة إلى HPLC يقدم الحية كشف من غرو-InsPs ولكن يحد من الوقت التلألؤ العد، والحد من حساسية هذا الأسلوب. بدلا من ذلك، يمكن للشاطف HPLC يكون مع لصناعة السيارات في العينات بدلا من تغذية إلى ماض تدفق جمعت الكسر. ويمكن بعد ذلك الكسور يدوية يتم قراءتها من قبل خارج خط التلألؤ السائل المضاد لفترات أطول من الوقت، مما يتيح حساسية أعلى - ومع ذلك، فإن هذا النهج هو أكثر استهلاكا للوقت وكثيفة العمالة، ويقلل من قرار اعتمادا على عدد من الكسور التي تم جمعها 38،40 . بالإضافة إلى ذلك، تحليل الخلايا الكاملة يقيس بشكل لا لبس فيه مستويات من PtdInsP محددة، لكنها لن إبلاغ عن تغييرات في توزيع التحت خلوية من أن PtdInsP، على الرغم من واحد يمكن التلألؤ تدفق الزوجين لطرق تجزئة الفرعية الخلوية كما بريفيوفعل خبيث 39. في المقابل، المجالات PtdInsP ملزم مفيدة للتحقيق في الموقع وديناميات الأنواع PtdInsP في خلية FP المستندة، ولكن قد ربط أيضا إلى عوامل أخرى من PtdInsP الهدف. أيضا، فإن الطريقة الموصوفة هنا يبسط تحليل مستويات PtdInsP من خلال القضاء على سلاسل أسيل، مما يزيد بشكل كبير من التنوع الجزيئي للPtdInsPs. ولكن على نفس المنوال، وهذا هو أيضا وضع غير مؤات الرئيسيين، منذ deacylation الدهون يؤدي إلى فقدان المعلومات الهيكلية بشأن سلسلة أسيل، وهو جانب بالتقدير من PtdInsP يشير 41،42. إذا كان هذا هو مصدر قلق كبير، ثم اللوني السائل يقترن لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) وينبغي استخدام 14،17. ومع ذلك، فإنه من الصعب حاليا لتحليل بالتزامن جميع الأنواع PtdInsPs من قبل LC-MS 43. وهكذا، وهو مزيج من الأساليب هو أفضل نهج من أجل التحقيق في الموقع، وديناميات والتنوع ومستويات الجزيئي للجميع PtdInsPs الأنواع السبعة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1-Butanol Biobasic BC1800 Reagent grade
    Ammonium phosphate dibasic Bioshop APD001 ACS grade
    Ammonium sulfate Biobasic ADB0060 Ultra Pure grade
    Autosampler Agilent G1329B Agilent 1260 infinity series
    Biotin Sigma B4501
    Boric acid Biobasic BB0044 Molecular biology grade
    Calcium Chloride Biobasic CT1330 Ahydrous, industrial grade
    Calcium pantothenate Sigma C8731
    Copper(II) sulfate Sigma 451657 Anhydrous
    D-Glucose Biobasic GB0219 Anhydrous, biotech grade
    Dulbecco's modification of Eagle's Medium Life 11995-065 With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
    Dulbecco's modification of Eagle's Medium MP biomedicals 0916429  With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
    EDTA Biobasic EB0107 Acid free, ultra pure grade
    Ethyl ether Caledon labs 1/10/4700 Anhydrous, reagent grade
    Ethyl formate Sigma 112682 Reagent grade
    Fetal bovine serum Wisent 080-450 US origin, premium quality, heat inactivated
    Fetal Bovine Serum, Dialyzed Life 26400044 US origin
    FlowLogic U LabLogic Systems Ltd SG-BXX-05 Scintillation fluid for flow scintillation 
    Folic acid Biobasic FB0466 USP grade
    HEPES buffer solution Life 15630080 1 M solution
    Inositol, Myo-[2-3H(N)] Perkin Elmer NET114005MC 9:1 ethanol to water
    Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Life 51500056 100x solution
    Iron(III) chloride Sigma 157740 Reagent grade
    Laura - Chromatography data collection and analysis software LabLogic Systems Ltd Version 4.2.1.18 Flow scintillator software
    L-glutamine Sigma G7513 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
    Magnesium Chloride Sigma M8266 Anhydrous
    Manganese sulfate Biobasic MB0334 Monohydrate, ACS grade
    Methanol Caledon labs 6701-7-40 HPLC Grade
    Methylamine solution Sigma 426466 40% (v/v)
    Monopotassium phosphate Biobasic PB0445 Anhydrous, ACS grade
    Nicotinic acid Biobasic NB0660 Reagent grade
    OpenLAB CSD ChemStation  Agilent Rev. C.01.03  HPLC software
    p-aminobenzoic acid (PABA) Bioshop PAB001.100 Free acid
    Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
    Perchloric acid Sigma 244252 ACS reagent, 70%
    PhenoSpher SAX column Phenomenex 00G-315-E0 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
    Phosphoric acid Caledon labs 1/29/8425 Reagent grade
    Potassium Chloride Biobasic PB0440 ACS grade
    Potassium iodide Biobasic PB0443 ACS grade
    Pyridoxine hydrochloride Sigma P9755
    Quaternary pump Agilent G1311C Agilent 1260 infinity series
    Riboflavin Bioshop RIB333.100 USP grade
    Sodium Chloride Biobasic DB0483 Biotech grade
    Sodium molybdate Sigma 243655
    Thermostatted Column Compartment Agilent G1316A Agilent 1260 infinity series
    Thiamine hydrochloride Sigma T4625 Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
    Ultima Gold Perkin Elmer 6013321 Scintillation coctail for liquid scintillation counting
    Zinc sulfate Biobasic ZB2906 Heptahydrate, reagent grade
    β-RAM 4 IN/US systems Model 4 Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
    2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
    3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
    4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
    5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
    6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
    7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
    8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
    9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
    10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
    11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
    12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
    13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
    14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
    15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
    16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
    17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
    18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
    19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
    20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
    21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
    22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
    23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
    24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
    25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
    26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
    27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
    28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
    29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
    30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
    31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
    32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
    33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
    34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
    35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
    36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
    37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
    38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
    39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
    40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
    41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
    42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
    43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

    Tags

    الكيمياء، العدد 107، Phosphoinositides، والدهون، والاتجار الغشاء، التلألؤ التدفق، ونقل الإشارة، radiolabeling، اللوني السائل
    Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ho, C. Y., Choy, C. H., Botelho, R.… More

    Ho, C. Y., Choy, C. H., Botelho, R. J. Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation. J. Vis. Exp. (107), e53529, doi:10.3791/53529 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter