Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Published: January 6, 2016 doi: 10.3791/53529
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University
* These authors contributed equally

Summary

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Protocol

הערה: הטקסט למטה מתאר בפירוט שיטה למדידת PtdInsPs בשמרים. הוא מספק את הפרטים הניסיוניים לתאי תיוג שמרים עם -inositol מיו 3 H-, שומני חילוץ וdeacylating ופרוטוקול HPLC-elution לfractionate ולכמת PtdInsPs deacylated. שים לב שתיוג, deacylation, רזולוציה וכימות של PtdInsPs בתאי יונקים דורש אופטימיזציה ופרופילי HPLC-elution עוד. ניתן למצוא את הפרטים הללו במקום אחר, אם כי אנו דנים בחלק מהיבטים בדיון. בסך הכל, המתודולוגיה לחלץ שומנים, deacylate ולחלץ את מסיסים במים Gro-InsPs משמרים ניתן ומאויר באיור 1.

1. פרוטוקול PtdInsPs תיוג והניתוח בשמרים

  1. תרבית תאים וradiolabeling
    1. לגדול תרבות נוזלית 20 מיליליטר של SEY6210 זן שמרים על 30 מעלות צלזיוס עם קבוע רועד בסינטטי מלאהתקשורת לשלב אמצע יומן-או צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) בסך של כ 0.6-0.7.
      הערה: אל תשתמש בתקשורת YPD זה עלול להשפיע 3 H- התאגדות מיו -inositol. גודל תרבות זה אמור לספק מספיק חומר במשך 2-3 ריצות HPLC.
    2. גלולה כוללת של 10-14 OD של תאי השמרים (שים לב שתרבות 1 מיליליטר עם OD 600 = 1 מכילה ~ 1x10 7 תאים) על ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות בצינור 12 מיליליטר מסביב לתחתית. Resuspend עם 2 מיליליטר של תקשורת חופשית אינוסיטול (IFM) (ראה טבלה 1 להרכב IFM).
    3. חזור צנטריפוגה ולשאוב את התקשורת. Resuspend גלולה עם 440 μl של IFM ולדגור על RT במשך 15 דקות.
    4. הוסף 60 μl של 3 H- מיו -inositol (μl 1 = μCi 1) לכל דגימה ודגירה בטמפרטורה הולך וגדל של 30 מעלות צלזיוס במשך 1-3 שעות עם רעד קבוע.
      זהירות: 3 -inositol מיו H- היא בן זוג רדיואקטיבייםריאל שצריך להיות מטופלים לאחר הכשרה מתאימה. בנוסף, כל החומרים המתכלים שליצור קשר עם 3 חומרים המכיל H צריכים להיות מסולקים כראוי ומיועדים כפסולת רדיואקטיבית.
      הערה: טמפרטורת הצמיחה ניתן לשנות בהתאם לצורך, כל עוד כל הזנים שגדלים בהשוואה באותה הטמפרטורה.
    5. מעבירים את ההשעיה התא (500 μl) לצינור microcentrifuge המכיל 500 μl של 9% חומצת perchloric ו -200 μl של חומצה שטף חרוזי זכוכית. מערבבים על ידי היפוך ודגירה על קרח למשך 5 דקות.
    6. מערבולת המדגם במהירות שיא במשך 10 דקות ולהעביר את lysates לצינור microcentrifuge חדש באמצעות קצה ג'ל טעינה כדי למנוע את חרוזי הזכוכית.
    7. גלולה המדגם ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant.
    8. Resuspend גלולה ידי sonication אמבטיה ב 1 מיליליטר של קר כקרח 100 מ"מ EDTA. גלולה שוב כמו קודם.
  2. Deacylation וחילוץ טרי להכין 5.0 מיליליטר של מגיב deacylation על ידי שילוב של 2.3 מיליליטר של מתנול, 1.3 מיליליטר של methylamine 40%, 0.55 מיליליטר של 1-butanol ו0.80 מיליליטר של מים. הפוך לערבב.
  3. לשאוב EDTA וsonicate גלולה ב -50 μl של מים.
  4. הוסף 500 μl של מגיב deacylation וsonicate לערבב. לדגור על RT במשך 20 דקות.
  5. שומני חום במשך 50 דקות ב 53 מעלות צלזיוס בגוש חום. ייבש את הדגימות לחלוטין על ידי צנטריפוגה ואקום מעל 3 שעות או O / N.
    1. ודא שמלכודת כימית מותקנת בין הוואקום-צנטריפוגה ומשאבת הוואקום כדי למנוע אדים מלהיכנס לאוויר.
  6. Resuspend גלולה עם 300 μl של מים על ידי sonication אמבטיה ולדגור על RT במשך 20 דקות. ייבש את הדגימות על ידי צנטריפוגה ואקום במשך 3 שעות או O / N. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
  7. Sonicate גלולה עם 450 μl של מים. זהו השלב המימי במהלך חילוץ.
  8. טרי להכין 10 מיליליטר של extractioמגיב n על ידי הוספת 8.0 מיליליטר של 1-butanol, 1.6 מיליליטר של אתר אתיל ו0.40 מיליליטר של formate אתיל. הפוך לערבב.
  9. להוסיף 300 μl של מגיב החילוץ לשלב המימי. מערבולת את התערובת במהירות שיא במשך 5 דקות ולהפריד את השכבות על ידי צנטריפוגה במהירות שיא (18,000 XG) במשך 2 דקות.
  10. לאסוף את השכבה המימית התחתונה לתוך צינור microfuge חדש, תוך הימנעות את השכבה העליונה אורגנית, הממשק, וגלול. חזור על חילוץ של השלב המימי עוד פעמיים עם מגיב חילוץ טרי.
  11. יבש לחלוטין את השכבה מימית שנאסף על ידי צנטריפוגה ואקום. לפזר את גלולה ב -50 μl של מים על ידי sonication אמבטיה.
  12. הוסף 2 μl של כל דגימה 4 מיליליטר של נוזל נצנץ בבקבוקון נצנץ 6 מיליליטר פוליאתילן. לקבוע את מספר הספירות (בCPM) בכל דגימה על ידי נצנץ נוזלי באמצעות חלון פתוח.
  13. אחסן את הדגימות ב -20 ° C עד מוכן לHPLC.
  • הפרדה3 H-glycero-inositides ידי HPLC
    1. הכן חיץ ידי סינון 1 ליטר של מים ultrapure עם בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום עליון, ואחרי סילוק גזים.
    2. הכן חיץ B על ידי ביצוע פתרון 1 ליטר של פוספט dibasic M אמוניום 1 (APS, MW 132.06) במים ולהתאים את ה- pH 3.8 עם חומצה זרחתית. סנן פוספט אמוניום עם בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום עליון, ואחרי סילוק גזים.
    3. להרכיב את הבקבוקון על ידי הזרקת זיווד 2 מיליליטר בקבוקון עם הוספת נפח קטן 250 μl קפיץ. לטעון 10 מיליון CPM ולהוסיף מים להיקף כולל של 55 μl. הכן בקבוקון ריק עם 55 μl של מים.
    4. מכסה את צלוחיות עם כובעי בורג לבוש עם septa PTFE / סיליקון (צד אדום מול בתוך הבקבוקון). מניחים כל בקבוקון במגש דגימה האוטומטי של HPLC, החל בבקבוקון הריק.
    5. השתמש HPLC ותוכנה הקשורים השולט זרימת חיץ, degasses מאגרים ובקרות להזריק מדגםעַל. השתמש בזרימת scintillator מקוון ותוכנה הקשורים אליו להסדיר את קצב זרימת הזוהרים ולפקח על אות H-3 הריקבון.
      1. השתמש בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית SAX עם ממדים של 250 מ"מ x 4.6 מ"מ ומכיל 5 מיקרומטר שרף סיליקה בHPLC. לצייד את הטור עם שומר עמודה כדי למנוע הזרקה של חומרים מזהמים.
      2. התקן תא זרימה 500 μl 3 H-תואם בזרימת scintillator.
        הערה: פלזמה ניתן לעשות עם מערכת HPLC סדרת אינסוף Agilent 1,200 נשלטת על ידי תוכנת Chemstation או עם מערכות HPLC זמינות מסחרי אחרות. נצנץ זרימת eluent HPLC ניתן לעשות עם זרימת scintillator β-RAM נשלט על ידי תוכנת לורה או אחר זרימת scintillator זמין מסחרי או תוכנה תואמת.
    6. לאתחל את משאבת רבעוני בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר / דקה עם 100% א חיץ
    7. הגדרת פרופיל איזון על HPLCכדי לשלוט בצבע של חוצצים ו- B (לקרוא "פרוטוקול איזון" זה): 1% הצפת B ל5 דקות, 1-100% B ל5 דקות, 100% B דקות 5, 100-1% B ל5 דקות, 1% B במשך 20 דקות. להגדיר את מגבלת הלחץ ב -400 בר, 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק ', ו -30 דקות זמן לרוץ.
    8. הגדרת פרופיל elution (איור 2) על HPLC לשלוט השיפוע של חוצצים ו- B (קורא לזה "פרוטוקול"): 1% ב 5 דקות ל, 1-20% ב 40 דקות, 20-100% B במשך 10 דקות, 100% B דקות 5, 100-1% B עבור 20 דקות, 1% ב 10 דקות. להגדיר את מגבלת הלחץ ב -400 בר, 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק ', ו -90 דקות זמן לרוץ.
    9. הגדר את פרוטוקול זיהוי על זרימת scintillator (קורא לזה "פרוטוקול זיהוי") לרוץ במשך 60 דקות, עם קצב זרימת נוזל נצנץ של 2.5 מיליליטר / דקה ולהתעכב זמן 8.57 שניות.
    10. לתכנת רצף הזרקה אוטומטית על HPLC להתחיל עם ריק מים על "פרוטוקול איזון", ואחריו בדואראח radiolabelled מדגם על "פרוטוקול". לאתחל את הרצף כאשר מוכן.
    11. בעוד הטווח הוא עדיין בפרוטוקול האיזון, ליצור אצווה על זרימת scintillator למדוד כל הדגימות עם "פרוטוקול זיהוי." ההזרקה של כל דגימה חדשה תהיה לאתחל "פרוטוקול" על HPLC תוך מפעילה את הזרימה scintillator להתחיל "פרוטוקול זיהוי."
    12. בסיום כל הריצות, לשטוף את HPLC, העמודה ולזרום scintillator עם 100% הצפת למשך 30 דקות ב 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק '.
  • ניתוח נתונים
    1. השתמש בתוכנת לורה או כל תוכנה אחרת שיכול לכמת את ספקטרום כרומטוגרפיה. השלבים מתוארים בסעיף זה מתוארים באיור 3.
    2. לפתוח את הקבצים על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח", ובחר את קובץ הנתונים הגולמי עבור כל דגימה.
    3. בכרטיסייה "chromatograms", zoאום בלמתוח כל אחת מהפסגות פחותות (כ 1000 ספירה [ציר y]) תוך השמירה על הרזולוציה הזמן. זום לשיא כל פרט במידת צורך.
    4. סמן כל אחד מהפסגות לניתוח שימוש באפשרות "הוסף את ההחזר על ההשקעה". לזהות פסגות על ידי זמן של elution: Gro-Ins הורים ב 10 דקות, Gro-Ins3P ב 18 דקות, Gro-Ins4P ב 20 דקות, Gro-Ins P (3,5) 2 ב -29 דקות וGro-Ins (4,5 P) 2 ב 32 דקות.
    5. בכרטיסייה "שולחנות אזורים", להקליט "האזור (ספירות)" של כל שיא. הערה "להתחיל (mm: ss)" זמן ו: זמן של כל שיא "הסוף (מ"מ SS)".
    6. לחיסור רקע, להדגיש אזור סמוך לשיא פורש את אותה הכמות של זמן. הפחת את מספר הסעיפים מהשיא המקביל.
    7. לנרמל את השטח של כל שיא נגד Gro-Ins של הורים (המבוטא "% מPtdIns הכולל"). לאחר מכן, לנרמל כל אחד מהשיאים בכל תנאי ניסוי נגד מצב השליטה (המבוטא "nעליית -fold לעומת שליטה ").
      הערה: נורמליזציה של שיא כל יכולה להיעשות גם נגד ספירה כוללת אבל מאז Gro-Ins של ההורים הוא הרבה יותר עשיר מכל PtdInsPs האחר התוצאות נוטות להיות דומה.
    8. לייצא את הנתונים לchromatographs ידי לחיצה על "קובץ", "שמור בשם ...", ולבחור את "CSV (מופרד בפסיקים)" פורמט קובץ. העלילה נתונים על גיליון אלקטרוני ולהציג במידת צורך.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    באמצעות שיטה זו, שמרי PtdInsPs תויגו מטבולית עם -inositol מיו 3 H-. לאחר תיוג, פוספוליפידים היו זירז עם חומצת perchloric, ואחריו deacylation וחילוץ של מסיסים במים Gro-InsPs (איור 1) פוספוליפידים. בשלב זה, חשוב לכמת את האות רדיואקטיבי הכוללת הקשורים Gro-InsPs שחולץ על ידי נצנץ נוזלי על מנת להבטיח יחס אות לרעש מספיק לPtdInsPs מאוד נמוך השפע כמו PtdIns (3,5) P 2; בסך הכל 5-10 מ'עלויות לאלף הופעות צריך להיות מוזרק. מאז תאי שמרים להציג רק ארבע PtdInsPs, רזולוציה ניתן להשיג עם שיטת elution שעה 1 כפי שתואר (איור 2).

    כאן, wild-type, atg18 שמרי מוטציות Δ Δ וvac14 תויגו ומעובד לנתח שינויים בPtdIns P (3,5) 2, הדואר לפחות בשפע של PtdInsPs בשמרי 16,19,27. כפי שנצפה באיור 4 א-ג, פרופיל elution עבור כל שלושת זנים המיוצרים על 3 פסגות אות H קשורות. שיא Gro-Ins ההורים elutes הראשון (דקות 8-9; שמוצגים באיור 3, אבל לא באיור 4 מאז Gro-Ins מאפיל על האות של מיני פוספורילציה), ואחריו Gro-Ins3P (~ דק '18), Gro- Ins4P (~ 20 דקות), Gro-Ins (3,5) P 2 (~ 29 דקות) וGro-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 דק '), שבהתאמה תואם את PtdIns פוספוליפידים acylated, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns P (3,5) 2 וPtdIns (4,5) P 2. יש כמה פסגות קטין נוספות ב 4 דקות ואחד שנוטה ללכת בעקבות האב Gro-Ins (10 דקות) באופן מיידי; אלה עשויים לייצג אינוסיטול וinositide פוספטים-glycerated שאינו (איור 3). דפוס elution הוא עקבי ואופייני, אם כי הזמן המדויק עשוי להשתנות כאשר העסקת diffeלשכור מערכת HPLC ו / או עמודה חדשה.

    השיא הקשורים PtdIns (3,5) P 2 (איור 4, חץ אדום) עובר שינוי הדרמטי ביותר בין wild-type, atg18 Δ ושמרי זני Δ vac14. ביחס לתאים פרא-סוג (), יש Gro-Ins גדול מאוד P (3,5) 2 אות -associated בתאי Δ atg18 ושיא קטן יותר בתאי שמרי Δ vac14. על מנת לכמת את האות רדיואקטיבי הכוללת משויכת לכל שיא, הספירה שולבה מתחת לאזור של השיא (איור 3). בנוסף, מאז אות רדיואקטיבי מוחלטת משתנה בין דגימות, מיני Gro-Ins ההורים שימשו כבקרה פנימית על ידי נרמול נגדה (אפשר גם לבחור לנרמל נגד ספירה כוללת). בדרך זו, הנתונים מצביעים על כך שPtdIns (3,5) P 2 מהווה רק 0.07% מPtdIns בתאי שמרי סוג בר, בעוד PtdIns (3,5) P 2 תואם 1.2% מPtdIns ההורים בתאי Δ atg18, או עלייה דרמטית של 17 לקפל בPtdIns () P 3.5 2 ביחס לתאים פרא-סוג (איור 4 א, ​​B ו- D). לשם השוואה, PtdIns (3,5) P 2 רמות היו רק 0.01% מאות PtdIns בVAC14 -deleted תאי שמרים, אובדן 85% בPtdIns (3,5) P 2 (איור 4C ו- D). בסך הכל, מדידות אלה בהסכם עם תוצאות שפורסמו מראים כי PtdIns (3,5) P 2 הוא על 0.1% מPtdIns בתאים פרא-סוג, מופחת של 90% בvac14 D, ו -10 עד 20 פעמים גבוהות יותר בתאי atg18 D ביחס לתאים פרא-סוג 27,29.

    איור 1
    איור 1. Deacylation וחילוץ של 3 H-Gro-Insp. Radiolabeled lipiמשקע ד בחומצה perchloric נשטף עם תמיסה מימית של EDTA. זה אז להישאף ומגיב deacylation הוסיפו וטופחו על 53 מעלות צלזיוס. תערובת תגובת deacylation אז ואקום יבש ורחצה במים פעמיים, ואחריו התוספת של מגיב חילוץ. זה אז vortexed, centrifuged ואת השלב המימי נאסף. צעד החילוץ חוזר על עצמו שלוש פעמים תסתכמנה להסרת מזהמים אורגניים ובלתי מסיסים. החלק מסיס במים (הכחולה), הכולל 3 H-Gro-Insp, אז ואקום מיובש וrehydrated עם 60 μl של מים. כמות הרדיואקטיביות נקבעה על ידי נצנץ נוזלי (CPM) וספירה שווה על פני דגימות נטענות לתוך HPLC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2 <br /> איור 2. צבע של חיץ פוספט אמוניום לelution של 3 H-Gro-Insp. החלטה של Gro-Insp ידי כרומטוגרפיה אניוני חזקה תלוי ביישום של dibasic פוספט אמוניום, pH 3.8 (מאגר ב '). הבחירה של צבע תלוי בתערובת של מיני Gro-Insp זמינים להפרדה. הפרוטוקול משמש לדגימות שמרים, שמחזיקות רק בארבע PtdInsPs. החלטה של כל אחד מארבע הפסגות די עם גידול מהיר ב( NH 4) 2 ריכוז HPO 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3. מודרך הוראה לניתוח נתונים של שפע PtdInsP. קבצי הנתונים הם העמיסו על של לורהoftware והערכה ויזואלית באמצעות כרומטוגרף (פתוח כברירת מחדל). באמצעות "זום ב" כלי (א), להגדיל את הפסגות (ב). בחר פסגות שונות בכרומטוגרף שימוש באפשרות "הוסף את ההחזר על ההשקעה" (ג). בכרטיסיית "אזור שולחן" (ד), כל מידע הנובע מהאזורים המודגשים עניין מוצג כשולחן אחד (ה). לייצא את ספירת הגלם של כל שיא (ו) ולנרמל את כל מין PtdInsP נגד phosphatidylinositol ההורים (ז) או נגד ספירה כוללת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 4
    4. PtdIns איור (3,5) P 2 רמות בwild-type ותאי שמרי מוטציה. Chromatographs הנציג מוצג לזרימת הנצנץ של התמציתאד 3 H-Gro-InsPs מבר-סוג (), atg18 Δ (ב '), וvac14Δ (C) זני שמרים באמצעות פרוטוקול. ספירת גלם מהאזורים של עניין המקביל לGro-Ins (3,5) P 2 (חץ) מופקים מכרומטוגרף והרקע המופחת. הערכים וכתוצאה מכך הם בהשוואה לפרא-סוג והביעו כמתקפלים שינוי בGro-Ins P (3,5) 2 רמות (ד '). הרמות והשינויים בGro-Ins (3,5) P 2 מתפרשים להראות רמות ושינויים בPtdIns המקורי (3,5) P 2. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    63 מ"מ MgCl2 839 מיקרומטר Ca-pantothenate
    ללא מדיה אינוזיטול (IFM)
    27.8 מ"מ (NH4) 2SO4
    גלוקוז 2%
    0.01 מ"מ KH2PO4
    חומצות אמינו 1X
    1X LPSM
    יסודות קורט 1X
    ויטמינים 5X
    10X תקשורתי נמוך פוספט וסולפט (LPSM)
    9 מ"מ CaCl2
    17 מ"מ NaCl
    67 מ"מ KCl
    אלמנטי 1,000X Trace
    חומצת 8 מ"מ בור
    250 מיקרומטר CuSO4
    602 מיקרומטר KI
    1.23 מ"מ FeCl3
    2.65 מ"מ MnSO4
    971 מיקרומטר Na-molybdate
    2.48 מ"מ ZnSO4
    ויטמינים 500X
    4 מיקרומטר ביוטין
    2.27 מיקרומטר חומצה פולית
    1.62 מ"מ ניאצין
    חומצת 729 מיקרומטר p-aminobenzoic
    973 מיקרומטר Pryidoxine-HCl
    266 מיקרומטר ריבופלבין
    593 מיקרומטר תיאמין-HCl

    הרכב הטבלה 1. של שמרים ללא אינוסיטול תקשורת. תאי שמריהם radiolabelled עם IFM כבסיס לתקשורת להיות בתוספת 3 H- מיו -inositol. הכן של IFM באמצעות פתרונות פתרון 100 מיליליטר מצויינים, מסנן לעקר באמצעות בקבוק מסנן אבק עליון 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב RT. כדי להכין פוספט נמוך ותקשורת סולפט (LPSM), ליצור פתרון 100 מיליליטר באמצעות מלחים מצויינים, מסנן לעקר באמצעות בקבוק מסנן אבק עליון 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב RT. ממיסים את מלחים מצויינים להכין פתרון 1 ליטר 1,000x של יסודות קורט. מערבבים היטב לפני שימוש ו / או aliquots חנות ב -20 ° C. ממיסים את הוויטמינים הצביעו להכין פתרון ויטמין 500x 1 ליטר. מערבבים היטב לפני השימוש aliquots ולאחסן ב -20 ° C.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    מאמר זה מפרט את פרוטוקול הניסוי נדרש לכמת רמות סלולריות של PtdnsPs ידי זרימת נצנץ מצמידים HPLC משמרים. המתודולוגיה מאפשרת תיוג המטבולית של PtdInsPs עם -inositol מיו 3 H-, ואחריו עיבוד שומנים והפקה של 3 H-Gro-InsPs, חלוקה HPLC מסיס במים וניתוח. באמצעות שיטה זו, הרמות יחסי של PtdInsPs בתאים בתנאים שונים ניתן לכמת, כפי שמוצג לPtdIns (3,5) P 2 בפרא-סוג, vac14 D ותאי atg18 D שמרים (איור 4).

    ישנם מספר צעדים קריטיים ושינויים שניתן לעשות על מנת לייעל את התוצאות ו / או לפתור. אחד הפרמטרים החשובים ביותר להשגת כימות אמין של PtdInsPs הוא רמת האות רדיואקטיבי הכוללת. בדרך כלל, הזרקת 3-5 מ'ספירה לHPLC היא לעתים קרובות מספיק כדי לכמת באופן מהימן את השינויים בהיימיניהן גרו שפע PtdInsP כגון PtdIns P (4,5) 2. עם זאת, ההזרקה של עד 10 מ'ספירה ייתכן שתהיה צורך לכימות של מיני שפע נמוכים כגון PtdIns P (3,5) 2. יש פרמטרים שונים שעשויים להשפיע על הרמה של אות רדיואקטיבי השיגה כוללים המספר הכולל של תאים המשמשים להכנת המדגם, זמן התיוג וטמפרטורה, הריכוז של -inositol מיו 3 H-, התחלופה של PtdInsPs וסינתזת אנדוגני של אינוזיטול, שיתחרה עם אינוסיטול רדיואקטיבי. לדוגמא, תאי שמרי radiolabeling לפחות אחד הכפלת זמן מאפשר להתאגדות חילוף חומרים של 3 H- אינוסיטול myo- לPtdInsPs, אבל סיומת של זמן התיוג למוטציות שמרים שגדלים לאט יותר או שיש לי פעילות המטבולית איטית יותר עשוי להיות נחוץ. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במשמרת diauxic של תרבות השמרים, שבו תאים גדלו שלב אמצע יומן-מכן התרכזו FOתיוג r לאורך זמן הכפלה אחד. עם זאת, ניתן להפחית את משמרת diauxic ידי תאי תיוג במהלך מוקדם ושלב אמצע יומן-ולעוד-פרקי זמן כפי שנעשה בעבר 32. בכך, מחברים אלה נצפו רמות גבוהות יותר של PtdIns (3) P, PtdIns (4) P ו- P PtdIns (4,5) 2 מאשר תאים עוברים שינוי diauxic 32.

    כמו כן, בתקופה התיוג של תאי יונקים עשויה לדרוש אופטימיזציה מאז כמה תאי יונקים כמו קו מקרופאג RAW 264.7 מוכפלת מדי 12 שעות, ואילו אחרים עשויים לחלק הרבה יותר איטיים, או כמו במקרה של תאי עצב, לא בכל 20,35,39. בנוסף, ניתן להגדיל את הריכוז של -inositol מיו 3 H- להשיג רמת אות רדיואקטיבי אידיאלית. עם זאת, יש לציין כי חלק -inositol מיו 3 H- ארוז ב 90% אתנול; הוספה מוגזמת 3 H- מיו -inositol יגדיל את תוכן אתנול בתקשורת וייתכן שיש לי effe לא מכווןCT בתאים. לבסוף, radiolabeling הממושך יכול גם להרעיב את התאים של אינוזיטול. הדבר בולט במיוחד בתרבית תאים של יונקים שבי DMEM מלא מכיל -inositol מיו 40 מיקרומטר, לעומת 0.5 מיקרומטר 3 -inositol מיו H- כאשר כותרתו עם 10 μCi / מיליליטר. לפיכך, במידת צורך, פשוט להגדיל את מספר תאי יונקים במהלך התיוג מומלץ.

    צעדי תמוגה ועיבוד שומנים הסלולריים גם קריטיים להשגת תשואה אופטימלית, כמו גם שמירה על הבריאות של טור HPLC. תמוגה עם חומצת perchloric מאפשרת למשקעים של שומנים ומקרו-מולקולות אחרות, שיטה מועסק הראשון לתרבית רקמה, ומאוחר יותר שימשה לשמרים 28,33. בהשוואה למיצוי של שומנים כולל באמצעות מתנול המסורתי / שיטה / כלורופורם HCl, שימוש בחומצת perchloric משפרת את ההתאוששות של PtdInsPs, כולל PtdIns P (3,5) 2, עם פחות וריאציה בין ניסויי 28. תַתיישום שלאחר מכן של methylamine שובר אג"ח אסתר בין עמוד השדרה גליצרול ושתי רשתות acyl הידרופובי, עוזב את המים Gro-Insp המסיס להיות מחומצות שומן חופשיות ושומנים ללא פגע 28,34 מופרד שלב. יש להקפיד במיוחד להימנע מביצוע ממסים אורגניים קדימה לא רצויים וחומרים מסיסים במהלך שלב החילוץ. זה עלול לסתום את המערכת, לגרום קוצים לחץ ו / או כימי נזק העמודה. בנוסף העמודה חייבת להיות מותנית בתחילתו של כל יום על ידי חשיפת הטור לריכוז גבוה של פוספט אמוניום (חיץ B) לפני השימוש; כך, פרוטוקול "איזון" קצר מועסק לפני הפעלת דגימות ניסוי. אם לא יעשה צעד תוצאות אוויר זה בפרופיל elution עיכוב של פסגות Gro-InsPs במדגם הניסיוני הראשון שמנוהלת.

    ישנן מספר נקודות מפתח הקשורות לניתוח והכימות לשקול גם כן. ראשית, quantification עצמו צריך להיות שילוב של אות ושטח של שיא כל, לא רק את גובה השיא. יתר על כן, בקרה פנימית היא בדרך כלל יש צורך כי שילוב האות המוחלט לשיא כל יכול להשתנות באופן משמעותי בין דגימות וניסויים ללא משקף שינוי בשפע PtdInsP בתא. שיא Gro-Ins ההורים מועסק בדרך כלל כבקרה הפנימית על ידי נרמול שיא כל Gro-Insp נגדה. שיא Gro-Ins בדרך כלל מחזיק כמעט 90% של האות רדיואקטיבי ואינו נוטה לשנות בין תנאים. לחלופין, אפשר לבחור לנרמל נגד ספירה כוללת, במיוחד אם אחד חשודים כי PtdIns ההורים סובל שינוי משמעותי בתנאי הניסוי. לבסוף, לPtdInsPs שפע נמוך, חיסור רקע מומלץ על ידי הגדרת אזור שאינו שיא סמוך עם אותו "ציר הזמן", כשיאו של העניין (איור 3D).

    שיקול אחד סופי מתייחס להניתוח של דגימות יונקים, אשר מחזיקות שבעה מיני PtdInsP, כולל מיני שלוש מונו-פוספורילציה ושלוש BIS-פוספורילציה. למרבה הצער, קשה לפתור באופן מלא PtdIns4P מPtdIns5P, וPtdIns (3,5) P 2 מPtdIns (3,4) P 2 בדגימות של יונקים, וכתוצאה מכך כפולות פסגות סיאמיות. ישנן מספר שיטות שפורסמו בעבר כי להגדיל את הרזולוציה של פסגות אלה. בדרך כלל, זה כרוך בשינוי האורך של elution, הריכוז התחלתי של חיץ פוספט אמוניום, השיעור וצעדים שבי פוספט אמוניום ריכוז חיץ השינויים בפרופיל elution ואת ה- pH של חיץ פוספט אמוניום 33,35-38. אולי, השיטה המוצלחת ביותר שפותחה לPtdIns הנפרד (4) P וPtdIns (5) P תואר לאחרונה על ידי Sarkes וראמה 39, שהועסק עמודות SAX שני טנדם וחיץ פוספט אמוניום ב- pH 6.0.

    כמו במרבית השיטות, באמצעות HPLC-גיש oupled לזרום נצנץ לכמת PtdInsPs בתאי יתרונות וחסרונות בהשוואה לשיטות אחרות זמינות. לדוגמא, זרימת נצנץ מקוון מצמידים HPLC מציע חי-זיהוי של Gro-InsPs אבל מגביל את זמן ספירת נצנץ, צמצום הרגישות של שיטה זו. לחלופין, eluent HPLC יכול להיות עם-סמפלר אוטומטי במקום האכלה לזרימת scintillator-אסף חלק. לאחר מכן ניתן לקרוא השברים ידניים על ידי מונה נצנץ נוזלי לא-מקוון לתקופות זמן ארוכות יותר, ובכך להציע רגישות גבוהה יותר - ובכל זאת, גישה זו היא יותר זמן רב ועבודה אינטנסיבית ומפחיתה רזולוציה בהתאם למספר השברים שנאספו 38,40 . בנוסף, ניתוח של כל תאים באופן חד משמעי מודד את הרמות של PtdInsP ספציפי, אבל זה לא יהיה להודיע ​​על שינויים בחלוקת subcellular של PtdInsP ש, אם כי אחד יכול לזרום זוג נצנץ לשיטות חלוקה תת-תאיות כמו previouערמומי עשה 39. לשם השוואה, המבוסס FP-תחומים PtdInsP מחייבים הם שימושיים כדי לחקור את המיקום ואת הדינמיקה של מיני PtdInsP בתא, אלא גם עשויה להיקשר לגורמים אחרים מהיעד PtdInsP. כמו כן, בשיטה המתוארת כאן מפשטת את הניתוח של רמות PtdInsP ידי ביטול רשתות acyl, אשר מגדילה מאוד את המגוון המולקולרי של PtdInsPs. אבל באותה המידה, זה גם חסרון מרכזי, מאז deacylation של שומנים מוביל לאובדן של מידע מבני בנוגע לשרשרת acyl, היבט אינו מוערך של PtdInsP איתות 41,42. אם זה מקור לדאגה רבה, אז כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לספקטרומטר מסה (LC-MS) צריך להיות מועסק 14,17. עם זאת, קשה כיום לנתח במקביל כל מיני PtdInsPs על ידי LC-MS 43. לפיכך, שילוב של שיטות היא הגישה הטובה ביותר כדי לחקור את המיקום, דינמיקה, הגיוון והרמות מולקולריים של כל שבעת מיני PtdInsPs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1-Butanol Biobasic BC1800 Reagent grade
    Ammonium phosphate dibasic Bioshop APD001 ACS grade
    Ammonium sulfate Biobasic ADB0060 Ultra Pure grade
    Autosampler Agilent G1329B Agilent 1260 infinity series
    Biotin Sigma B4501
    Boric acid Biobasic BB0044 Molecular biology grade
    Calcium Chloride Biobasic CT1330 Ahydrous, industrial grade
    Calcium pantothenate Sigma C8731
    Copper(II) sulfate Sigma 451657 Anhydrous
    D-Glucose Biobasic GB0219 Anhydrous, biotech grade
    Dulbecco's modification of Eagle's Medium Life 11995-065 With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
    Dulbecco's modification of Eagle's Medium MP biomedicals 0916429  With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
    EDTA Biobasic EB0107 Acid free, ultra pure grade
    Ethyl ether Caledon labs 1/10/4700 Anhydrous, reagent grade
    Ethyl formate Sigma 112682 Reagent grade
    Fetal bovine serum Wisent 080-450 US origin, premium quality, heat inactivated
    Fetal Bovine Serum, Dialyzed Life 26400044 US origin
    FlowLogic U LabLogic Systems Ltd SG-BXX-05 Scintillation fluid for flow scintillation 
    Folic acid Biobasic FB0466 USP grade
    HEPES buffer solution Life 15630080 1 M solution
    Inositol, Myo-[2-3H(N)] Perkin Elmer NET114005MC 9:1 ethanol to water
    Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Life 51500056 100x solution
    Iron(III) chloride Sigma 157740 Reagent grade
    Laura - Chromatography data collection and analysis software LabLogic Systems Ltd Version 4.2.1.18 Flow scintillator software
    L-glutamine Sigma G7513 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
    Magnesium Chloride Sigma M8266 Anhydrous
    Manganese sulfate Biobasic MB0334 Monohydrate, ACS grade
    Methanol Caledon labs 6701-7-40 HPLC Grade
    Methylamine solution Sigma 426466 40% (v/v)
    Monopotassium phosphate Biobasic PB0445 Anhydrous, ACS grade
    Nicotinic acid Biobasic NB0660 Reagent grade
    OpenLAB CSD ChemStation  Agilent Rev. C.01.03  HPLC software
    p-aminobenzoic acid (PABA) Bioshop PAB001.100 Free acid
    Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
    Perchloric acid Sigma 244252 ACS reagent, 70%
    PhenoSpher SAX column Phenomenex 00G-315-E0 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
    Phosphoric acid Caledon labs 1/29/8425 Reagent grade
    Potassium Chloride Biobasic PB0440 ACS grade
    Potassium iodide Biobasic PB0443 ACS grade
    Pyridoxine hydrochloride Sigma P9755
    Quaternary pump Agilent G1311C Agilent 1260 infinity series
    Riboflavin Bioshop RIB333.100 USP grade
    Sodium Chloride Biobasic DB0483 Biotech grade
    Sodium molybdate Sigma 243655
    Thermostatted Column Compartment Agilent G1316A Agilent 1260 infinity series
    Thiamine hydrochloride Sigma T4625 Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
    Ultima Gold Perkin Elmer 6013321 Scintillation coctail for liquid scintillation counting
    Zinc sulfate Biobasic ZB2906 Heptahydrate, reagent grade
    β-RAM 4 IN/US systems Model 4 Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
    2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
    3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
    4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
    5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
    6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
    7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
    8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
    9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
    10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
    11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
    12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
    13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
    14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
    15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
    16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
    17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
    18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
    19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
    20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
    21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
    22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
    23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
    24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
    25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
    26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
    27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
    28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
    29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
    30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
    31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
    32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
    33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
    34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
    35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
    36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
    37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
    38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
    39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
    40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
    41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
    42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
    43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

    Tags

    כימיה גיליון 107 Phosphoinositides שומנים סחר בקרום זרימת נצנץ הולך אותות radiolabeling כרומטוגרפיה נוזלית
    Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ho, C. Y., Choy, C. H., Botelho, R.… More

    Ho, C. Y., Choy, C. H., Botelho, R. J. Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation. J. Vis. Exp. (107), e53529, doi:10.3791/53529 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter