Summary
Fosfoinositidi stanno segnalando lipidi la cui abbondanza relativa cambia rapidamente in risposta a vari stimoli. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'abbondanza di fosfoinositidi dalle cellule metabolicamente marcatura con 3 H- myo-inositolo, seguita da estrazione e deacilazione. Estratti glycero-inositides sono quindi separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione e quantificati dal flusso scintillazione.
Protocol
Nota: Il testo seguente descrive in dettaglio un metodo per misurare PtdInsPs in lievito. Esso fornisce i dettagli sperimentali per l'etichettatura cellule di lievito con 3 H- myo inositolo, estrazione e deacilante lipidi e un protocollo HPLC-eluizione di frazionare e quantificare PtdInsPs deacilati. Si prega di notare che l'etichettatura, deacilazione, la risoluzione e la quantificazione di PtdInsPs in cellule di mammifero richiedono ottimizzazione e più profili HPLC-eluizione. Questi dettagli possono essere trovati altrove, anche se si discute alcuni aspetti nella discussione. In generale, il metodo per estrarre lipidi, deacylate ed estrarre il idrosolubile Gro-InsPs dal lievito è dato ed è illustrato in figura 1.
1. Il protocollo per l'etichettatura e Analizzare PtdInsPs in lievito
- Colture cellulari e radiomarcatura
- Crescere un 20 ml coltura liquida del SEY6210 ceppo di lievito a 30 ° C con costante agitazione in completo sinteticomezzi di fase metà log o densità ottica a 600 nm (OD 600) di circa 0,6-0,7.
Nota: Non utilizzare supporti YPD come questo può influenzare 3 H- myo-inositolo incorporazione. Questa dimensione culturale dovrebbe fornire materiale sufficiente per 2-3 corse HPLC. - Pellet un totale di 10-14 OD delle cellule di lievito (notare che 1 ml di coltura con un OD 600 = 1 contiene ~ 1x10 7 cellule) mediante centrifugazione a 800 xg per 5 min in 12 ml a fondo rotondo tubo. Risospendere con 2 ml di media liberi-inositolo (IFM) (vedi Tabella 1 per la composizione IFM).
- Ripetere la centrifugazione e aspirare i media. Risospendere il pellet con 440 microlitri di IFM e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere 60 ml di 3 H- myo-inositolo (1 ml = 1 pCi) per ogni campione e incubare alla crescente temperatura di 30 ° C per 1 a 3 ore con agitazione costante.
Attenzione: 3 H- myo-inositolo è un compagno radioattivoriale che deve essere maneggiato dopo una formazione adeguata. Inoltre, tutti i materiali di consumo che fanno contatto con il materiale 3-H contenente devono essere smaltiti in modo appropriato e designati come rifiuti radioattivi.
Nota: La temperatura di crescita può essere modificata secondo necessità finché tutti i ceppi da confrontare sono cresciuti alla stessa temperatura. - Trasferire la sospensione cellulare (500 microlitri) in una provetta contenente 500 ml di 9% di acido perclorico e 200 ml di acido lavato perline di vetro. Mescolare per capovolgimento e incubare in ghiaccio per 5 min.
- Agitare il campione alla massima velocità per 10 minuti e trasferire i lisati di una nuova provetta con una punta gel loading evitare le perline di vetro.
- Agglomerare il campione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet da bagno sonicazione in 1 ml di EDTA mM ghiacciato 100. Pellet di nuovo come prima.
- Crescere un 20 ml coltura liquida del SEY6210 ceppo di lievito a 30 ° C con costante agitazione in completo sinteticomezzi di fase metà log o densità ottica a 600 nm (OD 600) di circa 0,6-0,7.
- Deacilazione ed estrazione
- Aspirare il EDTA e sonicare il pellet in 50 ml di acqua.
- Aggiungere 500 ml di reagente deacilazione e sonicare per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Lipidi calore per 50 min a 53 ° C in un blocco di calore. Asciugare i campioni mediante centrifugazione completamente vuoto su 3 ore o O / N.
- Assicurarsi che una trappola chimica viene installato tra il vuoto-centrifuga e la pompa del vuoto per evitare il rilascio di vapori nell'aria.
- Risospendere il pellet con 300 ml di acqua da bagno sonicazione e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Asciugare i campioni per centrifugazione vuoto per 3 ore o O / N. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Sonicare il pellet con 450 ml di acqua. Questa è la fase acquosa durante l'estrazione.
- Appena preparare 10 ml di extraction reagente aggiungendo 8,0 ml di 1-butanolo, 1,6 ml di etere etilico e 0,40 ml di etile formiato. Miscelarlo.
- Aggiungere 300 ml di reagente di estrazione alla fase acquosa. Vortex la miscela alla massima velocità per 5 minuti e separare gli strati per centrifugazione a velocità massima (18.000 xg) per 2 min.
- Raccogliere la fase acquosa inferiore in un nuovo tubo per microcentrifuga evitando lo strato superiore organico, l'interfaccia, ed il pellet. Ripetere l'estrazione della fase acquosa due volte con il reagente di estrazione fresca.
- Completamente asciugare lo strato acquoso raccolte mediante centrifugazione sotto vuoto. Disperdere il pellet in 50 ml di acqua per il bagno ultrasuoni.
- Aggiungere 2 ml di ogni campione 4 ml di liquido di scintillazione in 6 ml di polietilene scintillazione flaconcino. Determinare il numero di conteggi (in CPM) in ogni campione da scintillazione liquida utilizzando una finestra aperta.
- Conservare i campioni a -20 ° C fino al momento HPLC.
- Preparare tampone A filtrando 1 L di acqua ultrapura con una bottiglia superiore del filtro 0,22 micron di vuoto, seguita da degassaggio.
- Preparare tampone B facendo una soluzione di 1 L di 1 M di ammonio fosfato bibasico (APS, MW 132.06) in acqua e regolare il pH a 3,8 con acido fosforico. Filtrare il fosfato di ammonio con una bottiglia superiore del filtro 0,22 micron di vuoto, seguita da degassaggio.
- Montare il flaconcino da allestimento un flaconcino da 2 ml con una 250 microlitri inserto piccolo volume a molla. Caricare 10 milioni CPM e aggiungere acqua per un volume totale di 55 microlitri. Preparare una fiala vuota con 55 ml di acqua.
- Tappare le fiale con tappi a vite attrezzati con setti in PTFE / silicone (lato rosso rivolto verso l'interno del flaconcino). Mettete ogni fiala nel vassoio di auto-campionamento della HPLC, iniziando con il flaconcino vuoto.
- Utilizzare un HPLC e software associato che controlla il flusso di buffer, degassa tamponi e controlli campione iniezin data. Utilizzare un scintillatore flusso in linea e il suo software associato per regolare la portata scintillante e monitorare il segnale 3 H-decadimento.
- Utilizzare una colonna SAX cromatografia liquida con dimensioni di 250 mm x 4.6 mm e contenenti 5 micron resina silice nella HPLC. Allestire la colonna con una guardia colonna per evitare l'iniezione di contaminanti.
- Installare una cella di flusso 500 microlitri compatibile-H 3 in scintillatore flusso.
NOTA: Il frazionamento può essere fatto con un sistema della serie 1200 Agilent sfioro HPLC controllato dal software Chemstation o con altri sistemi HPLC disponibili commercialmente. Scintillazione flusso dell'eluente HPLC può essere fatto con un flusso scintillatore β-RAM controllato dal software Laura o un'altra scintillatore flusso disponibile in commercio o software compatibile.
- Inizializzare la pompa quaternaria a una portata di 1,0 ml / min con 100% tampone A.
- Impostare un profilo di equilibrio in HPLCper controllare il gradiente di buffer A e B (chiamare questo "Protocollo A equilibrazione"): 1% Tampone B per 5 min, 1-100% B per 5 min, 100% B per 5 min, 100-1% B per 5 min, 1% B per 20 min. Impostare il limite di pressione di 400 bar, 1,0 ml / min, e 30 minuti il tempo di esecuzione.
- Impostazione di un profilo di eluizione (figura 2) sulla HPLC per controllare il gradiente di buffer A e B (chiamare questo "Protocollo A"): 1% B per 5 min, 1-20% B per 40 min, 20-100% B per 10 min, 100% B per 5 min, 100-1% B per 20 minuti, 1% B per 10 min. Impostare il limite di pressione di 400 bar, 1,0 ml / min, e 90 minuti il tempo di esecuzione.
- Impostare un protocollo di rilevazione sul flusso di scintillatore (chiamare questo "Protocollo A rilevamento") a correre per 60 minuti, con una portata di fluido di scintillazione di 2,5 ml / min e un tempo di sosta 8.57 sec.
- Programmare una sequenza di iniezione automatizzato sul HPLC per iniziare con il bianco acqua sul "Protocollo Un equilibrio", seguito da each radiomarcato campione sul "Protocollo A". Inizializzare la sequenza quando è pronto.
- Mentre la marcia è sempre sul protocollo equilibrazione, creare un lotto sulla scintillatore flusso per misurare tutti i campioni con "protocollo di rivelazione." L'iniezione di ogni nuovo campione verrà inizializzato "Protocollo A" sul HPLC mentre scattare l'scintillatore flusso per iniziare "Protocollo di rivelazione."
- Al completamento di tutte le corse, lavare l'HPLC, la colonna e il flusso scintillatore con 100% tampone A per 30 minuti a 1,0 ml / min di portata.
- Utilizzare il software Laura o qualsiasi altro software in grado di quantificare gli spettri cromatografia. I passaggi descritti in questa sezione sono descritte nella Figura 3.
- Aprire i file facendo clic su "File", "Apri", e selezionare il file di dati grezzi per ogni campione.
- Nella scheda "cromatogrammi", zoom per allungare ciascuno dei picchi minori (circa 1000 conteggi [y]) pur mantenendo la risoluzione temporale. Zoom in ogni singolo picco se necessario.
- Evidenziare ciascuno dei picchi per l'analisi tramite funzione "Aggiungi ROI". Identificare i picchi dal tempo di eluizione: Parental Gro-Ins a 10 min, Gro-Ins3P a 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 a 29 min e Gro-Ins (4,5 ) P 2 a 32 min.
- Nella scheda "tabelle regioni", registrare la "zona (conta)" di ogni picco. Notare la "start (mm: ss)" il tempo e "finale (mm: ss)" tempo di ogni picco.
- Per sottrazione dello sfondo, evidenziare una regione adiacente al picco attraversa la stessa quantità di tempo. Sottrarre il numero di conteggi del picco corrispondente.
- Normalizzare l'area di ogni picco contro genitori Gro-Ins (espresso come "% del totale PtdIns"). Poi, normalizzare ciascuno dei picchi in ogni condizione sperimentale contro la condizione di controllo (espresso come "naumento -fold confrontato con il controllo ").
NOTA: La normalizzazione di ogni picco può essere effettuata anche contro conteggi totali, ma dal momento che la genitori Gro-Ins è molto più abbondante di tutti gli altri PtdInsPs i risultati tendono ad essere simili. - Esportare i dati per la cromatografia premendo il tasto "File", "Salva con nome ..." e scegliere il "CSV (separati da virgola)" formato di file. Tracciare i dati su un foglio di calcolo e presentare come necessario.
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Representative Results
Utilizzando questo metodo, PtdInsPs lievito sono state metabolicamente etichettati con 3 H- myo-inositolo. Dopo etichettatura, i fosfolipidi sono stati precipitati con acido perclorico, seguita da deacilazione fosfolipidi ed estrazione del Gro-InsPs idrosolubile (Figura 1). In questa fase, è importante quantificare il totale del segnale radioattivo associato al estratta Gro-InsPs scintillazione liquida per garantire una sufficiente rapporto segnale-rumore per le PtdInsPs molto bassa abbondanza come PtdIns (3,5) P 2; per un totale di 5-10 milioni di CPM deve essere iniettato. Poiché le cellule di lievito mostrano solo quattro PtdInsPs, la risoluzione può essere ottenuto con un metodo di eluizione 1 ora come descritto (Figura 2).
Qui, wild-type, atg18 Δ e Δ vac14 mutanti di lievito sono stati etichettati ed elaborati per analizzare i cambiamenti in PtdIns (3,5) P 2, the meno abbondante degli PtdInsPs nel lievito 16,19,27. Come osservato in Figura 4A-C, il profilo di eluizione per tutti e tre i ceppi prodotte 3 picchi di segnale H-associato. Il picco parentale Gro-Ins eluisce prima (8-9 min; illustrato nella figura 3, ma non in figura 4 in quanto Gro-Ins oscura il segnale della specie fosforilati), seguita da Gro-Ins3P (~ 18 min), Gro- Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P 2 (~ 29 min) e Gro-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 min), che corrisponde rispettivamente ai fosfolipidi PtdIns acilati, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P 2 e PtdIns (4,5) P 2. Ci sono un paio di ulteriori picchi minori a 4 min e una che tende a seguire immediatamente il genitore Gro-Ins (10 min); Questi rappresentano probabilmente inositolo e non glycerated inositide fosfati (Figura 3). Il modello di eluizione è coerente e caratteristico, se il tempo esatto può variare quando si impiega un diffenoleggiare sistema HPLC e / o una nuova colonna.
Il picco associata a PtdIns (3,5) P 2 (Figura 4, freccia rossa) subisce il più drammatico cambiamento tra wild-type, atg18 Δ e ceppi di lievito vac14 Δ. Rispetto alle cellule wild-type (A), vi è un grande Gro-Ins (3,5) P2 segnale -associated nelle cellule Δ atg18 e un picco più piccolo in cellule di lievito vac14 Δ. Per quantificare il segnale totale radioattivi associati con ogni picco, i conteggi sono stati integrati sotto l'area del picco (figura 3). Inoltre, dal momento che il segnale radioattivo assoluta varia tra i campioni, il parental specie Gro-in è stato utilizzato come controllo interno normalizzando contro di esso (si può anche scegliere di normalizzare contro conteggi totali). In questo modo, i dati suggeriscono che PtdIns (3,5) P 2 costituisce solo lo 0,07% del PtdIns in cellule di lievito wild type, mentre PtdIns (3,5) P 2 corrisponde al 1,2% dei PtdIns parentali nelle cellule atg18 Í caratteristica o un drammatico aumento di 17 volte in PtdIns (3,5) P 2 rispetto alle cellule wild-type (Figura 4A, B e D). In confronto, PtdIns (3,5) P 2 livelli era solo 0,01% del segnale in PtdIns VAC14 -deleted cellule di lievito, una perdita dell'85% PtdIns (3,5) P 2 (Figura 4C e D). Complessivamente, queste misure sono in accordo con i risultati pubblicati dimostrano che PtdIns (3,5) P 2 è di circa lo 0,1% del PtdIns nelle cellule wild-type, il 90% ha ridotto in vac14 D, e da 10 a 20 volte più elevati nelle cellule atg18 D rispetto alle cellule wild-type 27,29.
Figura 1. deacilazione e l'estrazione di 3 H-Gro-InsP. Marcata radioattivamente lipid precipitato in acido perclorico viene lavata con una soluzione acquosa di EDTA. Questo viene poi aspirato e il reagente deacilazione aggiunto e incubato a 53 ° C. La miscela di reazione viene quindi deacilazione essiccato nel vuoto e lavato con acqua due volte, seguito dall'aggiunta di reagente di estrazione. Questo viene poi in agitazione, centrifugata e la fase acquosa viene raccolta. La fase di estrazione viene ripetuta tre volte in totale per rimuovere i contaminanti organici e insolubili. La frazione solubile in acqua (blu), che comprende 3 H-Gro-InsP, viene poi essiccato sotto vuoto e reidratato con 60 ml di acqua. La quantità di radioattività è determinato da scintillazione liquida (CPM) e conta in tutto uguali campioni vengono caricati nel HPLC. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
<br /> Figura 2. gradiente di tampone fosfato di ammonio per eluizione di 3 H-Gro-InsP. Risoluzione di Gro-InsP da cromatografia a scambio anionico forte dipende dall'applicazione di ammonio fosfato bibasico, pH 3,8 (tampone B). La scelta della sfumatura dipende dalla miscela di specie Gro-INSP disponibili per la separazione. Un protocollo viene utilizzato per i campioni di lievito, che possiedono solo quattro PtdInsPs. Risoluzione di ciascuno dei quattro picchi è sufficiente con un rapido aumento (NH 4) 2 HPO 4 concentrazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Visite istruzioni per l'analisi dei dati di PtdInsP abbondanza. I file di dati vengono caricati nel Laura software e valutato visivamente con il cromatografo (aperto per impostazione predefinita). Utilizzando il "zoom in" Strumento (a), ingrandire i picchi (b). Selezionare cime distinte su cromatografo tramite funzione "aggiungi ROI" (c). Nella scheda "tavolo regione" (d), tutte le informazioni derivanti dalle aree evidenziate di interesse viene visualizzato come una singola tabella (e). Esportare i conteggi di ogni picco (f) e normalizzare ogni specie PtdInsP contro il fosfatidilinositolo genitoriale (g) o contro conteggi totali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. PtdIns (3,5) P 2 livelli a wild-type e le cellule di lievito mutanti. Cromatografi rappresentativi sono indicati per la scintillazione flusso dell'estrattoEd 3 H-Gro-InsPs da wild-type (A), atg18 Δ (B), e vac14Δ (C) ceppi di lievito utilizzando un protocollo. I conteggi prime dalle regioni di interesse corrispondenti a GRO-Ins (3,5) P 2 (freccia) vengono estratti dal cromatografo e sfondo sottratto. I valori risultanti sono confrontati a wild-type ed espressi come pieghevole variazione Gro-Ins (3,5) P 2 livelli (D). I livelli e le variazioni Gro-Ins (3,5) P 2 vengono interpretati per mostrare i livelli e le variazioni dei PtdIns originali (3,5) P 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Media liberi-inositolo (IFM) |
| 27,8 mm (NH4) 2SO4 |
| 2% glucosio |
| 0.01 mM KH2PO4 |
| Acidi 1X Amino |
| 1X LPSM |
| Oligoelementi 1X |
| 5X Vitamine |
| 10X mezzi di fosfato e solfato Basso (LPSM) |
| 9 CaCl2 mM |
| NaCl 17 mm |
| 67 mM KCl |
| Elementi 1,000X traccia |
| L'acido borico 8 mM |
| 250 micron CuSO4 |
| 602 micron KI |
| 1.23 FeCl3 mM |
| 2.65 MnSO4 mM |
| 971 mM Na-molibdato |
| 2.48 ZnSO4 mM |
| 500X Vitamine |
| 4 micron biotina |
| 2.27 micron acido folico |
| 1.62 Niacina mM |
| L'acido 729 mM p-amminobenzoico |
| 973 micron Pryidoxine-HCl |
| 266 micron Riboflavina |
| 593 micron tiamina-HCl |
Tabella 1. Composizione delle cellule di lievito lievito libera-inositolo media. Sono radiomarcato con IFM come i media di base per essere integrati con 3 H- myo-inositolo. Preparare una soluzione di 100 ml di IFM utilizzando le soluzioni indicate, Filtro sterilizzare utilizzando una bottiglia top 0,22 micron filtro a vuoto e conservare a temperatura ambiente. Per preparare basso fosfato e supporti solfato (LPSM), generare una soluzione di 100 ml con i sali indicate, filtro sterilizzare utilizzando una bottiglia top 0,22 micron filtro a vuoto e conservare a temperatura ambiente. Sciogliere i sali indicati per preparare una soluzione di 1,000x 1 L di oligoelementi. Mescolare accuratamente prima dell'uso e / o conservare aliquote a -20 ° C. Sciogliere le vitamine indicate per preparare una soluzione 500x vitamina 1 L. Mescolare accuratamente prima dell'uso e conservare aliquote a -20 ° C.
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Discussion
Questo articolo descrive il protocollo sperimentale richiesta per quantificare i livelli cellulari di PtdnsPs mediante HPLC accoppiata flusso scintillazione dal lievito. La metodologia consente di marcatura metabolica di PtdInsPs con 3 H- myo-inositolo, seguite da trattamento di lipidi ed estrazione di solubile in acqua 3 H-Gro-InsPs, HPLC frazionamento e analisi. Utilizzando questo metodo, i relativi livelli di PtdInsPs nelle cellule in varie condizioni sono quantificabili, come dimostra per PtdIns (3,5) P 2 nel wild-type, vac14 D e cellule di lievito atg18 D (Figura 4).
Ci sono una serie di passaggi critici e modifiche che possono essere fatte per ottimizzare i risultati e / o risolvere i problemi. Uno dei parametri più importanti per ottenere una quantificazione affidabile PtdInsPs è il livello del segnale radioattivo totale. In genere, l'iniezione di 3-5 milioni di conteggi in HPLC è spesso sufficiente per quantificare in modo affidabile cambiamenti nel hiGher abbondanza di specie PtdInsP quali PtdIns (4,5) P 2. Tuttavia, l'iniezione fino a 10 milioni di impulsi può essere necessario per la quantificazione di specie scarsa abbondanza come PtdIns (3,5) P 2. Ci sono vari parametri che potrebbero influire sul livello del segnale radioattivo raggiunto incluso il numero totale di cellule usate per preparare il campione, il tempo di etichettatura e la temperatura, la concentrazione di 3 H- myo-inositolo, il tasso di rotazione del PtdInsPs e la sintesi endogena di inositolo, che gareggeranno con il inositolo radioattivo. Ad esempio, le cellule di lievito radiomarcatura per almeno un tempo di raddoppio consente per l'incorporazione di 3 H- metabolica inositolo mio- in PtdInsPs, ma l'estensione del tempo di etichettatura per i mutanti di lievito che crescono più lentamente o che hanno più lento attività metabolica può essere necessario. Inoltre, il protocollo qui descritto prevede la spaziatura diauxic della coltura di lievito, in cui le cellule coltivate a metà fase log vengono poi concentrati foetichettatura r più di un tempo di raddoppio. Tuttavia, si può ridurre il passaggio diauxic dalle cellule etichettatura durante le prime fasi e la fase di mid-log e per di più lungo periodo di tempo, come già fatto in precedenza 32. In questo modo, questi autori hanno osservato livelli elevati di PtdIns (3) P, PtdIns (4) P e PtdIns (4,5) P 2 di cellule in fase di spostamento diauxic 32.
Analogamente, il termine etichettatura di cellule di mammifero può richiedere ottimizzazione poiché alcune cellule di mammifero come la linea macrofagi RAW 264.7 raddoppia ogni 12 ore, mentre altri possono dividere molto più lento, o come nel caso dei neuroni, per niente 20,35,39. Inoltre, si può aumentare la concentrazione di 3 H- myo-inositolo per raggiungere un livello di segnale radioattivo ideale. Tuttavia, si ricorda che circa 3 H- Myo-inositolo è confezionato in etanolo al 90%; l'aggiunta eccessiva 3 H- myo-inositolo aumenta il contenuto di etanolo nei media e possono avere un effe non intenzionalect sulle cellule. Infine, radiomarcatura prolungata può anche morire di fame le cellule di inositolo. Ciò è particolarmente evidente in colture cellulari di mammifero, dove completa DMEM contenente 40 mM myo-inositolo, rispetto a 0,5 mM 3 H- myo-inositolo quando marcato con 10 uCi / ml. Così, se necessario, semplicemente aumentando il numero di cellule di mammifero durante etichettatura è raccomandato.
La lisi e di trasformazione dei lipidi cellulari passaggi sono anche essenziale per ottenere un rendimento ottimale, oltre a mantenere la salute della colonna HPLC. Lysis con acido perclorico permette precipitazione di lipidi e di altre macromolecole, un primo metodo impiegato per coltura di tessuti e successivamente utilizzato per il lievito 28,33. Rispetto alla estrazione dei lipidi totali utilizzando il metanolo tradizionale / HCl metodo / cloroformio, uso di acido perclorico migliora il recupero di PtdInsPs, compresi PtdIns (3,5) P 2, con meno variazione tra 28 esperimenti. Subapplicazione sequent di metilammina rompe i legami esterei tra il glicerolo e le due catene idrofobiche acilici, lasciando il idrosolubile Gro-InsP essere a fasi separate da acidi grassi liberi e lipidi intatti 28,34. Particolare cura deve essere presa per evitare di portare avanti solventi organici indesiderati e materiale insolubile durante la fase di estrazione. Ciò potrebbe intasare il sistema, causare picchi di pressione e / o danneggiare chimicamente colonna. Inoltre la colonna deve essere condizionata all'inizio di ogni giorno esponendo la colonna ad alta concentrazione di fosfato di ammonio (tampone B) prima dell'uso; in tal modo, un protocollo breve "Equilibration" viene impiegato prima di eseguire campioni sperimentali. Il mancato rispetto di questo risultato condizionata passo in un profilo di eluizione ritardato delle vette Gro-InsPs nel primo campione sperimentale che viene eseguito.
Ci sono diversi punti chiave relativi all'analisi e quantificazione da considerare pure. Innanzitutto, la quantification stesso dovrebbe essere un'integrazione di segnale e di area dei picchi, non solo l'altezza di picco. Inoltre, un controllo interno è di solito necessario perché l'integrazione del segnale assoluto per ogni picco può variare notevolmente tra i campioni ed esperimenti senza riflettere una variazione PtdInsP abbondanza in una cella. Il picco dei genitori Gro-Ins è tipicamente impiegato come controllo interno normalizzando ogni picco Gro-InsP contro di esso. Il picco Gro-Ins tiene in genere quasi il 90% del segnale radioattivo e non tende a passare da condizioni. In alternativa, si può scegliere di normalizzare contro conteggi totali, soprattutto se si sospetta che i genitori PtdIns subisce un cambiamento significativo nelle condizioni sperimentali. Infine, per PtdInsPs bassa abbondanza, sfondo sottrazione è raccomandato definendo una zona non di picco nelle vicinanze con la stessa "scala dei tempi", come il picco di interesse (Figura 3D).
Un'ultima considerazione si riferisce al'analisi di campioni di mammifero, che possiedono sette specie PtdInsP, comprese le specie tre mono-fosforilate e tre bis-fosforilate. Purtroppo, è difficile da risolvere completamente PtdIns4P PtdIns5P e PtdIns (3,5) P 2 da PtdIns (3,4) P 2 in campioni di mammifero, conseguente siamesi doppi picchi. Ci sono diversi metodi precedentemente pubblicati che aumentano la risoluzione di questi picchi. Tipicamente, si tratta di modificare la lunghezza di eluizione, la concentrazione iniziale di tampone fosfato di ammonio, il tasso e fasi quali i fosfati di ammonio modifiche concentrazione del tampone durante il profilo di eluizione e il pH del tampone fosfato di ammonio 33,35-38. Forse, il metodo più efficace sviluppato per PtdIns separati (4) P e PtdIns (5) P è stato recentemente descritto da Sarkes e Rameh 39, che impiegava colonne SAX due tandem e un tampone fosfato di ammonio a pH 6.0.
Come con la maggior parte dei metodi, mediante HPLC-coupled flusso scintillazione quantificare PtdInsPs nelle cellule ha vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi disponibili. Per esempio, scintillazione flusso linea accoppiato HPLC offre live-rilevamento di Gro-InsPs ma limita il tempo di conteggio a scintillazione, riducendo la sensibilità del metodo. In alternativa, l'eluente HPLC può essere frazione raccolti con un autocampionatore invece di alimentare in uno scintillatore flusso. Le frazioni manuali possono essere letti da un contatore a scintillazione liquida fuori linea per lunghi periodi di tempo, offrendo così maggiore sensibilità - tuttavia, questo approccio è più tempo e manodopera e riduce la risoluzione a seconda del numero di frazioni collezionati 38,40 . Inoltre, l'analisi di cellule intere misura senza ambiguità i livelli di un determinato PtdInsP, ma non informa sulle modifiche alla distribuzione subcellulare di tale PtdInsP, anche se si potrebbe flusso paio scintillazione ai metodi di frazionamento sub-cellulari, come Precesornione fatto 39. In confronto, FP-based domini PtdInsP vincolanti sono utili per studiare la posizione e la dinamica di una specie PtdInsP in una cella, ma può anche legarsi a fattori diversi rispetto al target PtdInsP. Inoltre, il metodo qui descritto semplifica l'analisi dei livelli PtdInsP eliminando le catene acile, che aumenta notevolmente la diversità molecolare di PtdInsPs. Ma per la stessa ragione, è anche uno svantaggio fondamentale, poiché deacilazione di lipidi porta ad una perdita di informazioni strutturali riguardanti la catena acile, un aspetto sottovalutato di PtdInsP segnalazione 41,42. Se questo è di grande preoccupazione, quindi cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) dovrebbe essere impiegato 14,17. Tuttavia, è attualmente difficile analizzare contemporaneamente tutte le specie PtdInsPs mediante LC-MS 43. Quindi, una combinazione di metodi è l'approccio migliore per indagare la posizione, la dinamica, la diversità molecolare e livelli di tutte le sette specie PtdInsPs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
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