Summary
Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.
Protocol
Hinweis: Der Text beschreibt ausführlich ein Verfahren zur PtdInsPs in Hefe zu messen. Es stellt die experimentellen Einzelheiten für die Kennzeichnung Hefezellen mit 3 H- myo-Inositol, Extrahieren und Deacylieren Lipiden und einer HPLC-Elution Protokoll zu fraktionieren und zu quantifizieren deacylierten PtdInsPs. Bitte beachten Sie, dass Kennzeichnung, Deacylierung, Auflösung und Quantifizierung von PtdInsPs in Säugerzellen erfordern Optimierung und mehr HPLC-Elutionsprofile. Diese Details können an anderer Stelle gefunden werden kann, obwohl wir einige Aspekte in der Diskussion zu diskutieren. Insgesamt ist die Methodik, um Lipide zu deacylieren extrahieren und Extrahieren der wasserlöslichen Gro-InsPs aus Hefe gegeben und ist in Figur 1 dargestellt ist.
1. Protokoll zur Markierung und Analyse PtdInsPs in Hefe
- Zellkultur und die Radiomarkierung
- Wachsen Sie eine 20 ml Flüssigkultur der Hefestamm SEY6210 bei 30 ° C unter ständigem Schütteln in komplette KunstMedium bis zur mittleren log-Phase oder einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von ca. 0,6-0,7.
Hinweis: Verwenden Sie keine Medien YPD da dies 3 H- myo-Inositol Einbau beeinflussen. Diese Kultur Größe sollte ausreichend Material für 2-3 HPLC Läufe bereitzustellen. - Pelle insgesamt 10-14 OD der Hefezellen (beachte, dass 1 ml Kultur mit einer OD600 = 1 enthält ~ 1x10 7 Zellen) für 5 min in einem 12 ml-Rundrohr durch Zentrifugation bei 800 xg. Resuspendieren mit 2 ml Inosit freien Medien (IFM) (siehe Tabelle 1 für die IFM-Zusammensetzung).
- Wiederholen der Zentrifugation und saugen Sie den Medien. Das Pellet mit 440 & mgr; l der IFM und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
- Mit 60 & mgr; l 3 H- myo-Inositol (1 ul = 1 & mgr; Ci) zu jeder Probe und inkubiere bei der Wachstumstemperatur von 30 ° C für 1 bis 3 h unter ständigem Schütteln.
Achtung: 3 H- myo-Inositol ist ein radioaktives Kollegenrial, die nach entsprechender Schulung behandelt werden sollte. Darüber hinaus sollten alle Verbrauchsmaterialien, die Kontakt mit 3 H-haltige Material zu machen und entsprechend entsorgt werden als radioaktiver Abfall bezeichnet.
Anmerkung: Die Wachstumstemperatur kann geändert werden, wie gewünscht, solange alle Stämme, verglichen bei der gleichen Temperatur gehalten werden. - Übertragen der Zellsuspension (500 ul) in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 ul 9% iger Perchlorsäure und 200 & mgr; l säuregewaschene Glasperlen. Mischen durch Umdrehen und inkubiert auf Eis für 5 min.
- Vortex die Probe bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min und den Transfer der Lysate in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Gel-Ladespitze um die Glasperlen zu vermeiden.
- Pellet die Probe bei 12000 × g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
- Das Pellet von Bad Ultraschall in 1 ml eiskaltem 100 mM EDTA. Wieder Pellet wie zuvor.
- Wachsen Sie eine 20 ml Flüssigkultur der Hefestamm SEY6210 bei 30 ° C unter ständigem Schütteln in komplette KunstMedium bis zur mittleren log-Phase oder einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von ca. 0,6-0,7.
- Deacylierung und Extraktion
- Saugen Sie das EDTA und beschallen das Pellet in 50 ul Wasser.
- Fügen Sie 500 ul der Deacylierung Reagenz und beschallen zu mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
- Wärme Lipide 50 min bei 53 ° C in einem Heizblock. Trocknen Sie die Proben vollständig durch Vakuumzentrifugation über 3 h oder O / N.
- Sicherzustellen, dass eine chemische Falle ist zwischen der Vakuumzentrifuge und der Vakuumpumpe, um Dämpfe in die Luft zu verhindern, eingebaut.
- Das Pellet mit 300 ul Wasser von Bad Beschallung und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Trockne die Proben durch Vakuumzentrifugation 3 h oder O / N. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Beschallen das Pellet mit 450 ul Wasser. Dies ist die wässrige Phase während der Extraktion.
- Frisch Herstellung von 10 ml der Extraction Reagenz durch Zugabe von 8,0 ml 1-Butanol, 1,6 ml Ethylether und 0,40 ml Ethylformiat. Kehren Sie zu mischen.
- Werden 300 ul des Extraktionsreagens zu der wässrigen Phase. Vortex die Mischung bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min und trenne die Schichten durch Zentrifugieren bei Höchstgeschwindigkeit (18.000 xg) für 2 min.
- Sammeln die untere wässrige Schicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen unter Vermeidung der obere organische Schicht, die Schnittstelle und das Pellet. Wiederholen Extraktion der wässrigen Phase noch zweimal mit frischem Extraktionsreagens.
- Vollständig trocknen die gesammelte wässrige Schicht durch Vakuumzentrifugation. Dispergieren des Pellet in 50 ul Wasser durch Behandlung in einem Ultraschallbad.
- Add 2 ul jeder Probe zu 4 ml Szintillationsflüssigkeit in einem 6 ml-Polyethylen Szintillationsfläschchen. Bestimmung der Anzahl der Zählungen (in CPM) in jeder Probe durch Flüssigszintillationszählung unter Verwendung eines offenen Fensters.
- Bewahren Sie die Proben bei -20 ° C, bis sie für HPLC.
- Bereiten Puffer A durch Filterung 1 l Reinstwasser mit einer Flasche top 0,22 um Vakuumfilter, gefolgt von Entgasung.
- Bereiten Puffer B, indem eine 1 L Lösung von 1 M Ammoniumhydrogenphosphat (APS, MW 132,06) in Wasser und stellen Sie mit Phosphorsäure den pH-Wert auf 3,8. Filtern Sie die Ammoniumphosphat mit einer Flasche top 0,22 um Vakuumfilter, gefolgt von Entgasung.
- Montieren Sie den Durchstechflaschen von Ausbau ein 2 ml mit einer federbelasteten 250 ul kleines Volumen Einsatz Fläschchen. Laden 10 Millionen CPM und fügen Sie Wasser für ein Gesamtvolumen von 55 ul. Bereiten Sie eine leere Flasche mit 55 ul Wasser.
- Verschließen Sie die Fläschchen mit Schraubverschluss mit einer PTFE / Silikon-Septum ausgestattet (rote Seite mit Blick auf das Innere der Flasche). Legen Sie jedes Fläschchen in der Auto-Sampling Fach des HPLC, beginnend mit der leeren Durchstechflasche.
- Verwenden Sie ein HPLC und zugehörige Software, Pufferfluss steuert, entgast Puffer und Kontrollen Probe INJEKTIERTam. Verwendung eines Online-Strömungs Szintillator und der zugehörigen Software, um den Szintillator Flußrate zu regulieren und die 3 H-Abfallsignal zu überwachen.
- Verwenden Sie einen SAX Flüssigkeitschromatographiesäule mit Abmessungen von 250 mm x 4,6 mm und mit 5 & mgr; m Silika-Harz in der HPLC. Statten Sie die Spalte mit einer Spalte Wache Injektion von Verunreinigungen zu verhindern.
- Installieren Sie eine 3 H-kompatiblen 500 ul Flusszelle in der Strömung Szintillator.
HINWEIS: Die Fraktionierung kann mit einem Agilent 1200 Infinity-Serie-HPLC-System von ChemStation-Software oder mit anderen handelsüblichen HPLC-Systeme gesteuert erfolgen. Flow Scintillation der HPLC-Eluent kann mit einem β-RAM Strömungs Szintillator vom Laura Software oder anderen kommerziell erhältlichen Strömungs Szintillator oder kompatible Software gesteuert erfolgen.
- Initialisieren der quaternären Pumpe bei einer Fließrate von 1,0 ml / min mit 100% Puffer A.
- Einrichtung eines Ausgleichsprofil auf der HPLC1% Puffer B für 5 min, 1-100% B für 5 min, 100% B für 5 Minuten, 100-1% B 5: um die Steigung der Puffer A und B (nennen das "Protokoll Ein Gleichgewichtseinstellung") steuern min, 1% B für 20 min. Stellen Sie die Druckgrenze bei 400 bar, 1,0 ml / min Strömungsgeschwindigkeit und 30 Minuten Laufzeit.
- Richten Sie ein Elutionsprofil (Abbildung 2) auf der HPLC, um die Steigung der Puffer A und B (nennen das "Protokoll A") zu steuern: 1% B für 5 Minuten, 1-20% B für 40 min, 20-100% B für 10 min, 100% B für 5 min 100-1% B für 20 min, 1% B für 10 min. Stellen Sie die Druckgrenze bei 400 bar, 1,0 ml / min Strömungsgeschwindigkeit und 90 Minuten Laufzeit.
- Einrichten einer Erfassungsprotokoll auf die Strömung Szintillator (nennen das "Protokoll A detection"), die für 60 min laufen, mit einer Szintillationsflüssigkeit Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min und einer 8,57 sec Verweilzeit.
- Programmieren Sie eine automatisierte Einspritzfolge auf der HPLC mit dem Wasser leer in "Protokoll Ein Gleichgewichtseinstellung" beginnen, gefolgt von each radioaktiv markierte Probe auf "Protokoll A". Initialisieren Sie die Reihenfolge, wenn Sie fertig.
- Während der Lauf noch auf dem Gleichgewichtsprotokoll, eine Batch auf die Strömung Szintillator, um alle Proben mit Maß "A Protocol Erkennung." Die Injektion von jedem neuen Abtastwert wird "Protokoll A" auf der HPLC zu initialisieren, während die Auslösung der Strömungs Szintillator zu beginnen "Protokoll einer Detektions."
- Bei Beendigung aller Läufe, spülen Sie die HPLC, die Säule und Durchfluss Szintillator mit 100% Puffer A für 30 min bei 1,0 ml / min Durchflussmenge.
- Verwenden Laura Software oder andere Software, die den Chromatographie-Spektren zu quantifizieren kann. Die in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte sind in Abbildung 3 dargestellt.
- Öffnen Sie die Dateien, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" und wählen Sie die Rohdatendatei für jede Probe.
- Im Register "Chromatogramme", zoom in jedem der kleineren Peaks (etwa 1000 Zählungen [y-Achse]) unter Beibehaltung der Zeitauflösung zu dehnen. Untersuche jeden einzelnen Peak, wenn nötig.
- Markieren Sie jede der Spitzen für die Analyse unter Verwendung des "Add ROI" Werkzeug. Identifizieren Spitzen durch die Elutionszeit: Parental Gro-Ins bei 10 min, Gro-Ins3P bei 18 min, Gro-Ins4P bei 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 bei 29 min und Gro-Ins (4,5 ) P 2 bei 32 min.
- Im Register "Bereiche Tabellen", notieren Sie die "Bereich (Counts)" jeder Spitze. Beachten Sie die "Start (mm: ss)" Zeit und "Ende (mm: ss)" Zeit jeder Spitze.
- Zum Abzug des Hintergrunds, markieren einen Bereich benachbart zu dem Peak überspannt dieselbe Menge an Zeit. Subtrahieren der Anzahl von Zählungen von dem entsprechenden Peak.
- Normalisieren die Fläche von jeder Spitze gegen elterliche Gro-Ins (wie "% of total PtdIns" ausgedrückt). Dann normalisiert jede der Spitzen in jeder Versuchsbedingung gegen den Steuerzustand (als "n ausgedrücktfache Steigerung im Vergleich zur Kontrolle ").
HINWEIS: Die Normalisierung jeder Spitze kann auch gegen Gesamtzählungen durchgeführt werden, aber da die elterliche Gro-Ins ist viel häufiger als alle anderen PtdInsPs die Ergebnisse sind in der Regel ähnlich. - Exportieren Sie die Daten für den Chromatographen, indem Sie auf "Datei", "Speichern unter ..." und wählen Sie die "CSV (Komma getrennt)" Dateiformat. Zeichnen Sie die Daten in einer Tabellenkalkulation und zu präsentieren wie nötig.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Hefe PtdInsPs metabolisch mit 3 H-myo-Inositol-markiert. Nach der Markierung wurden die Phospholipide mit Perchlorsäure ausgefällt, gefolgt von Deacylierung Phospholipid und die Extraktion der wasserlöslichen Gro-InsPs (Abbildung 1). In dieser Phase ist es wichtig, die gesamte radioaktives Signal mit dem extrahierten Gro-InsPs durch Flüssigszintillationszählung zu quantifizieren, um eine ausreichende Signal-zu-Rausch-Verhältnis, um die Low-Fülle PtdInsPs wie PtdIns gewährleisten (3,5) P 2; insgesamt 5-10000000 CPMs sollte injiziert werden. Da Hefezellen zeigen nur vier PtdInsPs kann die Auflösung mit einem 1 h-Elution, wie beschrieben (Abbildung 2) erreicht werden.
Hier Wildtyp, atg18 Δ und Δ vac14 Hefe-Mutanten wurden markiert und verarbeitet werden, um Veränderungen in der PtdIns (3,5) P2, th analysierene dest reichlich der PtdInsPs in Hefe 16,19,27. Wie in 4A-C, Elutionsprofil für alle drei zu 3 H-assoziierten Signalspitzen Stämme beobachtet. Die parentale Gro-Ins Peak eluiert ersten (8-9 min; in Figur 3 gezeigt, jedoch in Figur 4 nicht, da Gro-Ins überschattet das Signal der phosphorylierten Spezies), gefolgt von Gro-Ins3P (~ 18 min), Gro- Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P 2 (~ 29 min) und Gro-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 min), die jeweils dem acylierten Phospholipiden PtdIns, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P2 und PtdIns (4,5) P2. Es gibt ein paar zusätzliche kleinere Peaks bei 4 min und eine, die unmittelbar auf die Mutter Gro-Ins (10 min) neigt; Diese stellen wahrscheinlich Inositol und eine nicht glycerated inositide Phosphate (Abbildung 3). Das Elutionsmuster ist konsistent und charakteristische, wenn auch der genaue Zeitpunkt kann bei Verwendung eines verschie variierenmieten HPLC-System und / oder eine neue Spalte.
Der Peak mit PtdIns (3,5) P2 (Abbildung 4, roter Pfeil) zugeordnet erfährt die dramatischste Veränderung zwischen Wildtyp, atg18 Δ und Δ vac14 Hefestämme. Relativ zu Wildtyp-Zellen (A), gibt es eine sehr große Gro-Ins (3,5) P 2 assoziierte Signal atg18 Δ Zellen und ein kleinerer Peak in vac14 Δ Hefezellen. Um die gesamten radioaktiven Signals mit jedem Peak zu quantifizieren, wurden die Zählungen unter dem Bereich der Spitze (3) integriert ist. Darüber hinaus, da absolute radioaktives Signal variiert zwischen den Proben, die Kinder Gro-Ins Spezies wurde als interne Kontrolle durch die Normalisierung gegen sie (man kann auch wählen, um gegen die Gesamtaktivität zu normalisieren) verwendet. Auf diese Weise legen die Daten nahe, dass PtdIns (3,5) P2 macht nur 0,07% von PtdIns in Wildtyp-Hefezellen, während PtdIns (3,5) P 2 entspricht 1,2% der parentalen PtdIns in atg18 Δ Zellen oder einer dramatischen 17-fache Steigerung der PtdIns (3,5) P 2 in Bezug auf Wildtyp-Zellen (4A, B und D). Im Vergleich dazu war PtdIns (3,5) P 2 Ebenen nur 0,01% des PtdIns Signal in VAC14 -deleted Hefezellen, eine 85% Verlust in PtdIns (3,5) P 2 (4C und D). Insgesamt sind diese Messungen in Übereinstimmung mit veröffentlichten Ergebnisse zeigen, dass PtdIns (3,5) P 2 bei etwa 0,1% der PtdIns in Wildtyp-Zellen, in vac14 D 90% reduziert, und 10 bis 20-mal höher in atg18 D-Zellen relativ zu Wildtyp-Zellen 27,29.
Abbildung 1. Die Deacylierung und Extraktion von 3 H-Gro-Insp. Radioaktiv markierte lipid Niederschlag in Perchlorsäure mit wässriger EDTA-Lösung gewaschen. Diese wird dann abgesaugt, und die Deacylierung Reagenz zugegeben und bei 53 ° C inkubiert. Deacylierung Reaktionsmischung wird dann getrocknet und mit Wasser zweimal gewaschen, im Vakuum, gefolgt von der Zugabe von Extraktionsreagenz. Diese wird dann gevortext, zentrifugiert und die wässrige Phase gesammelt. Der Extraktionsschritt wird dreimal wiederholt, um gesamt organische und unlösliche Verunreinigungen zu entfernen. Die wasserlösliche Fraktion (blau), die 3 H-Gro-InsP umfasst, wird dann getrocknet und mit 60 ul Wasser rehydriert vakuumfiltriert. Die Menge an Radioaktivität wird durch Flüssigszintillationszählung (CPM) und gleiche gilt für Proben werden in die HPLC geladen bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
<br /> Abbildung 2. Gradient von Ammoniumphosphat-Puffer für die Elution von 3 H-Gro-InsP. Auflösung Gro-InsP durch starke Anionenaustauschchromatographie hängt von der Anwendung von Ammoniumhydrogenphosphat, pH 3,8 (Puffer B). Die Wahl des Gradienten hängt von der Mischung von Gro-InsP Spezies für die Trennung zur Verfügung. Ein Protokoll ist für Hefe-Proben, die nur vier PtdInsPs besitzen eingesetzt. Auflösung von jeder der vier Gipfel reicht mit einem raschen Anstieg der (NH 4) 2 HPO 4 Konzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Geführte Anweisung für die Datenanalyse der PtdInsP Hülle und Fülle. Die Dateien werden auf dem Laura s geladenoftware und ausgewertet visuell mit den Chromatographen (standardmäßig geöffnet). Mit Hilfe der "zoom in" Werkzeug (a), vergrößern Sie das Peaks (b). Wählen deutliche Spitzen am Chromatographen mit dem "Add ROI" Tool (c). In der Registerkarte "Bereichstabelle" (d), werden alle resultierenden Informationen aus den hervorgehobenen Bereichen von Interesse, wie eine einzelne Tabelle (e) angezeigt. Exportieren Sie die raw zählt jeder Spitze (f) und Normalisierung jeweils PtdInsP Spezies gegen die elterliche Phosphatidylinositol (g) oder gegen die Gesamtaktivität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. PtdIns (3,5) P 2 Ebenen in Wildtyp und mutierten Hefezellen. Repräsentative Chromatographen sind für den Fluss Scintillation des Extrakts gezeigted 3 H-Gro-InsPs aus Wildtyp (A), atg18 Δ (B), und vac14Δ (C) Hefestämme mit Protokoll A. Die Ausgangszahlen aus den Regionen von Interesse entspricht, GRO-Ins (3,5) P 2 (Pfeil) aus dem Chromatographen und Hinter subtrahiert extrahiert. Die erhaltenen Werte werden mit Wildtyp verglichen und als fold change in Gro-Ins (3,5) P 2 Ebenen (D) ausgedrückt. Die Ebenen und Veränderungen in der Gro-Ins (3,5) P 2 werden so interpretiert, und Veränderungen in den ursprünglichen PtdIns (3,5) P2 zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Inositol freien Medien (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% Glucose |
| 0,01 mM KH2PO4 |
| 1X Aminosäuren |
| 1X LPSM |
| 1X Spurenelemente |
| 5X Vitamine |
| 10X Low Phosphat und Sulfat Medien (LPSM) |
| 9 mM CaCl 2 |
| 17 mM NaCl |
| 67 mM KCl |
| 1,000x Spurenelemente |
| 8 mM Borsäure |
| 250 & mgr; M CuSO 4 |
| 602 & mgr; M KI |
| 1,23 mM FeCl3 |
| 2.65 mM MnSO4 |
| 971 & mgr; M Na-Molybdat |
| 2,48 mM ZnSO4 |
| 500X Vitamine |
| 4 & mgr; M Biotin |
| 2,27 uM Folsäure |
| 1,62 mM Niacin |
| 729 uM p-Aminobenzoesäure |
| 973 & mgr; M Pryidoxine-HCl |
| 266 & mgr; M Riboflavin |
| 593 & mgr; M Thiamin-HCl |
Tabelle 1. Zusammensetzung der Hefe-inositol-freien Medien. Die Hefezellen werden mit radioaktiv markiertem IFM als Basismedium mit 3 H- myo-Inositol, ergänzt werden. Bereiten Sie eine 100-ml-Lösung von IFM unter Verwendung der Lösungen angegeben, Filter zu sterilisieren mit einem Flaschenkopf 0,22 um Vakuumfilter und lagern bei RT. Um niedrige Phosphat und Sulfat Medien (LPSM) vorzubereiten, erzeugen eine 100 ml-Lösung unter Verwendung der angegebenen Salze, Filter zu sterilisieren mit einem Flaschenkopf 0,22 um Vakuumfilter und lagern bei RT. Lösen Sie den angegebenen Salzen zu einem 1 L 1,000x Lösung von Spurenelementen vorzubereiten. Vor Gebrauch gründlich mischen und / oder zu speichern Aliquots bei -20 ° C. Man löst die angegebenen Vitaminen, um einen 1 L 500x Vitamin-Lösung herzustellen. Vor Gebrauch gründlich mischen und speichern Aliquots bei -20 ° C.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt die experimentelle Protokoll erforderlich, um Zellebenen PtdnsPs durch HPLC-gekoppelten Strömungs Szintillations aus Hefe zu quantifizieren. Die Methodik ermöglicht die metabolische Markierung von PtdInsPs mit 3 H- myo-Inositol, gefolgt von Lipid Aufarbeitung und Extraktion von wasserlöslichen 3 H-Gro-InsPs, HPLC-Fraktionierung und Analyse. Mit dieser Methode können die relativen Mengen an PtdInsPs in Zellen unter verschiedenen Bedingungen quantifiziert werden, wie für PtdIns (3,5) P2 in Wildtyp, vac14 D und D atg18 Hefezellen (Abbildung 4) dargestellt ist.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte und Modifikationen, die getan werden, um Ergebnisse zu optimieren und / oder beheben werden. Einer der wichtigsten Parameter, um eine zuverlässige Quantifizierung PtdInsPs erreichen, ist die gesamten radioaktiven Signals. Typischerweise Injektion 3-5 Millionen Pulse in die HPLC ist oft ausreichend, um Änderungen in der Hallo zuverlässig zu quantifizierengher Fluss PtdInsP Arten wie PtdIns (4,5) P2. Jedoch kann die Injektion von bis zu 10 Millionen Pulse zur Quantifizierung geringer Abundanz Arten erforderlich sein, wie beispielsweise PtdIns (3,5) P2. Es gibt verschiedene Parameter, die beeinflussen könnten das Ausmaß der radioaktiven Signals erreicht, einschließlich der Gesamtzahl der Zellen verwendet werden, um die Probe, die Kennzeichnung Zeit und Temperatur, die Konzentration von 3 H-myo-Inositol, die Fluktuationsrate von PtdInsPs vorzubereiten und die endogene Synthese von Inositol, das mit den radioaktiv markierten Inosit konkurrieren. B. Radiomarkierung Hefezellen für mindestens eine Verdopplungszeit ermöglicht metabolischen Einbau von 3 H-myo-Inosit in PtdInsPs aber Verlängerung des Etikettierzeit für Hefemutanten, die langsamer wachsen oder langsamere metabolische Aktivität notwendig sein kann. Darüber hinaus ist das hier beschriebene Protokoll verwendet eine diauxischen Verschiebung der Hefekultur, wobei Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet werden dann fo engtr Kennzeichnung über eine Verdopplungszeit. Allerdings kann man die diauxischen Verschiebung durch Markierung von Zellen während der frühen und mittleren logarithmischen Phase und für längere-Zeit zu reduzieren wie bisher 32. Dabei beobachtet diese Autoren höhere PtdIns (3) P, PtdIns (4) P und PtdIns (4,5) P 2 als Zellen, die eine Verschiebung diauxischen 32.
Ähnlich kann der Markierungsperiode von Säugerzellen Optimierung erforderlich, da einige Säugerzellen wie die RAW 264.7-Makrophagenlinie verdoppelt sich alle 12 Stunden, während andere unterteilen viel langsamer, oder wie im Falle von Neuronen, überhaupt nicht 20,35,39. Außerdem kann man die Konzentration von 3 H-myo-Inositol zu erhöhen, um eine ideale radioaktiven Signalpegel zu erreichen. Beachten Sie jedoch, dass einige 3 H- myo-Inositol wird in 90% Ethanol gepackt; Zugabe von übermäßigen 3 H- myo-Inositol wird den Ethanolgehalt in den Medien erhöhen und eine unbeabsichtigte effe habenct auf die Zellen. Schließlich verlängert die Radiomarkierung auch hungern die Zellen von Inositol. Besonders deutlich wird dies in Säugerzellkultur, in komplettem DMEM enthält 40 uM myo-Inositol, verglichen mit 0,5 & mgr; M 3 H-myo-Inositol, wenn sie mit 10 uCi / ml markiert. Damit, wenn nötig, einfach die Anzahl von Säugerzellen während der Markierung wird empfohlen.
Die zelluläre Lyse und Lipid-Verarbeitungsschritte sind auch für den Erhalt einer optimalen Ausbeute, sowie die Erhaltung der Gesundheit der HPLC-Säule. Lyse mit Perchlorsäure ermöglicht Ausfällung von Lipiden und anderen Makromolekülen, ein Verfahren zunächst für die Gewebekultur verwendet und später für Hefe 28,33 eingesetzt. Im Vergleich zu der Gewinnung von Gesamtlipide mit der herkömmlichen Methanol / HCl / Chloroform-Methode, die Verwendung von Perchlorsäure verbessert die Rückgewinnung von PtdInsPs einschließlich PtdIns (3,5) P 2 mit einer geringeren Abweichung zwischen den Experimenten 28. SubFolge Anwendung von Methylamin bricht Esterbindungen zwischen dem Glyceringerüst und die beiden hydrophoben Acylketten, die wasserlöslichen Gro-InsP verlassen, um mit getrennten Phasen von freien Fettsäuren und Lipiden 28,34 intakt sein. Muss insbesondere darauf geachtet werden, um zu vermeiden, Vortragen unerwünschte organische Lösungsmittel und unlösliche Material während des Extraktionsschritt. Dies kann das System zu verstopfen, zu Druckspitzen und / oder die Spalten chemisch schädigen. Zusätzlich muss die Spalte zu Beginn jeden Tages, indem die Säule mit einer hohen Konzentration an Ammoniumphosphat (Puffer B) vor der Verwendung zu konditionieren; Somit ist eine kurze "Äquilibrierung" Protokoll vor dem Ausführen von experimentellen Proben eingesetzt. Die Nichtbeachtung dieser Konditionierungsschritt führt zu einer verzögerten Elutionsprofil der Gro-InsPs Peaks in der ersten Versuchsprobe, die ausgeführt wird machen.
Es gibt einige wichtige Punkte, die Analyse und Quantifizierung an Seiten, wie gut. Zuerst wird die quantification selbst sollte eine Integration des Signals und des jeweiligen Peak, nicht nur die Spitzenhöhe ist. Darüber hinaus ist eine interne Kontrolle in der Regel notwendig, da die absolute Signalintegration für jeden Peak signifikant zwischen den Proben und Experimente zu variieren, ohne was eine Änderung in PtdInsP Fluss in einer Zelle. Die Eltern Gro-Ins Peak wird in der Regel als die interne Kontrolle durch Normalisieren jeder Gro-InsP Spitzen gegen sie eingesetzt. Die Gro-Ins Spitzen hält in der Regel fast 90% des radioaktiven Signals und nicht dazu neigt, zwischen den Bedingungen zu ändern. Alternativ kann man wählen, um gegen die Gesamtaktivität zu normalisieren, vor allem wenn man vermutet, dass die elterliche PtdIns erleidet eine wesentliche Änderung der Versuchsbedingungen. Schließlich ist für geringe Häufigkeit PtdInsPs, Hintergrund-Subtraktion wird durch die Definition eines nahe gelegenen nicht-Peak-Fläche mit der gleichen "Zeitskala" als Höhepunkt von Interesse (3D) empfohlen.
Eine letzte Überlegung bezieht sich aufdie Analyse von Säugetierproben, die sieben PtdInsP Spezies, einschließlich drei Mono phosphoryliert und drei bisphosphorylierten Spezies besitzen. Leider ist es schwierig, vollständig aufzulösen PtdIns4P aus PtdIns5P und PtdIns (3,5) P 2 von PtdIns (3,4) P 2 in Säugetierproben, was verbundene Doppelspitzen. Es gibt mehrere Methoden bisher veröffentlichten, die die Auflösung dieser Spitzen zu erhöhen. Dies beinhaltet typischerweise Verändern der Länge der Elution der Ausgangskonzentration an Ammoniumphosphatpuffer, die Geschwindigkeit und die Schritte, die von dem die Ammoniumphosphat-Pufferkonzentration ändert sich während des Elutionsprofil und der pH der Ammoniumphosphatpuffer 33,35-38. Vielleicht die erfolgreichste Methode zur Trennung entwickelt PtdIns (4) P und PtdIns (5) P wurde kürzlich von Sarkes und Rameh 39, die zwei Tandem-SAX Spalten und eine Ammoniumphosphatpuffer bei pH 6,0 eingesetzt beschrieben.
Wie bei den meisten Verfahren, unter Verwendung von HPLC-coupled fließen Szintillation zu PtdInsPs in Zellen zu quantifizieren, hat Vor- und Nachteile im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden. Zum Beispiel Online-Flow-Szintillations-HPLC gekoppelt bietet Live-Erkennung von Gro-InsPs aber begrenzt die Szintillationszählung Zeit, die Verringerung der Empfindlichkeit dieser Methode. Alternativ kann die HPLC Elutionsmittel Fraktion gesammelte mit einem Autosampler, anstatt der Zuführung in einen Strömungs Szintillator sein. Die manuellen Fraktionen kann dann durch einen Offline-Flüssigszintillationszähler für längere Zeiträume, und bietet somit eine höhere Empfindlichkeit gelesen werden - jedoch ist dieser Ansatz zeitaufwendig und arbeitsintensiv und verringert die Auflösung abhängig von der Anzahl von Fraktionen gesammelt 38,40 . Zusätzlich Analyse ganzer Zellen eindeutig misst die Höhe eines spezifischen PtdInsP, aber es wird nicht zu Änderungen an der subzellulären Verteilung dieser PtdInsP informieren, wenn man könnte Paar Strömungs Szintillation auf subzellulärer Fraktionierung Methoden früschlauen getan 39. Im Vergleich dazu FP-basierte PtdInsP-bindenden Domänen sind nützlich, um den Ort und die Dynamik einer PtdInsP Spezies in einer Zelle zu untersuchen, sondern kann auch auf andere als die Ziel PtdInsP Faktoren binden. Auch das hier beschriebene Verfahren vereinfacht die Analyse PtdInsP Ebenen durch den Wegfall der Acylketten, welche die molekulare Vielfalt PtdInsPs stark erhöht. Aber aus dem gleichen Grund, ist dies auch ein wesentlicher Nachteil, da die Deacylierung von Lipiden führt zu einem Verlust der strukturellen Informationen über die Acylkette eine unterschätzte Aspekt PtdInsP Signalisierungs 41,42. Wenn dies von großer Bedeutung ist, dann Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie (LC-MS) sollte verwendet werden 14,17 gekoppelt. Allerdings ist es derzeit schwierig, gleichzeitig analysieren alle PtdInsPs Arten von LC-MS 43. Somit ist eine Kombination von Methoden der beste Ansatz, um den Standort, Dynamik, molekulare Vielfalt und Menge aller sieben PtdInsPs Arten zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
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