Abstract
लवणता जलीय पर्यावरण का एक महत्वपूर्ण विशेषता है। जलीय जीवों के लिए यह मीठे पानी, खारा पानी, और समुद्री जल के निवास को परिभाषित करता है। रसायन और जलीय जीवों के लिए उनके पारिस्थितिक जोखिम के आकलन की विषाक्तता के टेस्ट अक्सर मीठे पानी में प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन जलीय जीवों के लिए रसायनों की विषाक्तता पर पीएच, तापमान, लवणता और निर्भर करता है। वहाँ जलीय जीवों के लिए विषाक्तता की लवणता निर्भरता के परीक्षण के लिए, कोई विधि है लेकिन है। यहाँ, हम medaka (Oryzias latipes) का इस्तेमाल किया क्योंकि वे मीठे पानी, खारा पानी, और समुद्री जल के लिए अनुकूलित कर सकते हैं। भ्रूण के पालन मध्यम (ईआरएम) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, और 30x) अंडे (1x ईआरएम और 30x ईआरएम Medaka को चांदी nanocolloidal कणों (SNCs) की विषाक्तता परीक्षण करने के लिए कार्यरत थे आसमाटिक दबाव के बराबर राशि के विभिन्न सांद्रता मीठे पानी और समुद्री जल, क्रमशः)। छह अच्छी तरह से प्लास्टिक की प्लेट में, तीन प्रतियों में 15 medaka अंडे में 10 मिलीग्राम / एल एंड SNCs से अवगत कराया गया# 8722; 1 पीएच 7 और अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर ईआरएम के विभिन्न सांद्रता में।
हम दिन 6 और अंडे सेने के दिन (धारा 4) पर लार्वा के पूरे शरीर की लंबाई पर प्रति 15 सेकंड और आंख व्यास दिल की दर को मापने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप और एक माइक्रोमीटर इस्तेमाल किया। भ्रूण सेने या 14 दिन तक मनाया गया; हम तो 14 दिन (धारा 4) के लिए अंडे सेने दर हर दिन गिना। भ्रूण में चांदी संचय देखने के लिए, हम उपपादन परीक्षण समाधान की चांदी एकाग्रता (धारा 5) और dechorionated भ्रूण (धारा 6) medaka भ्रूण को SNCs की व्याप्ति विषाक्तता जाहिर लवणता में वृद्धि के साथ वृद्धि हुई मापने के लिए प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री मिलकर करते थे। इस नई विधि हमें अलग salinities में रसायनों की विषाक्तता परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है।
Introduction
1979 में परीक्षण के रसायनों के लिए आर्थिक सहयोग और विकास (ओईसीडी) की परीक्षा के दिशा-निर्देशों के लिए संगठन की स्थापना के बाद से, 38 की परीक्षा के दिशा निर्देशों के दिशा-निर्देशों के प्रभाव जैविक प्रणाली पर 1 की धारा 2 में प्रकाशित किया गया है। परीक्षण किया मीठे पानी के निवास, अर्थात् मीठे पानी पौधों से किया गया है जलीय जीवों के सभी; शैवाल; ऐसे daphnia और chironomids के रूप में अकशेरुकी; और इस तरह medaka, zebrafish, और इंद्रधनुष के रूप में मछलियों। खारे पानी के वातावरण की तुलना में, मीठे पानी वातावरण अधिक सीधे मानव आर्थिक और औद्योगिक गतिविधियों से प्रभावित हैं। इसलिए, मीठे पानी वातावरण क्योंकि वे प्रदूषण से खतरा अधिक होता है परीक्षण के लिए प्राथमिकता के आधार पर किया गया है।
ज्वारनदमुख सहित तटीय क्षेत्रों में, salinities खारे पानी और समुद्री जल की स्थिति के बीच भिन्नता है, और इन क्षेत्रों में अक्सर औद्योगिक गतिविधि 2 से प्रदूषित कर रहे हैं। तटीय क्षेत्रों और उनके संबद्ध झीलों ज की विशेषता हैigh पारिस्थितिक जैव विविधता और उत्पादकता। तटीय पारिस्थितिकी इसलिए रासायनिक प्रदूषण से संरक्षित किया जाना चाहिए। हालांकि, वहाँ खारे पानी और समुद्री जल में निवास ecotoxicological अनुसंधान सीमित किया गया है।
Sakaizumi 3 जापानी medaka अंडे में मिथाइल पारा और लवणता के बीच विषाक्त बातचीत का अध्ययन किया और पाया परीक्षण समाधान के आसमाटिक दबाव बढ़ बढ़ाया कि मिथाइल पारा की विषाक्तता। । Sumitani एट अल 4 लैंडफिल leachate की विषाक्तता की जांच करने के medaka अंडे का इस्तेमाल किया; उन्होंने पाया कि अंडे को leachate के आसमाटिक समानक embryogenesis दौरान असामान्यताएं उत्प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण था। इसके अलावा, Kashiwada 5 खबर दी है कि प्लास्टिक नैनोकणों (व्यास में 39.4 एनएम) आसानी से खारा की शर्तों के तहत medaka अंडा जरायु (15x भ्रूण पालन मध्यम (ईआरएम)) के माध्यम से रिस चुका है।
एक ठेठ छोटी मछली मॉडल, जापानी medaka (Oryzias latipes 6 में इस्तेमाल किया गया है। जापानी medaka समुद्री जल के लिए मीठे पानी से अपने अत्यधिक विकसित क्लोराइड कोशिकाओं 7 की वजह लेकर की स्थिति में रह सकते हैं। वे इसलिए salinities की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ की स्थिति में परीक्षण के लिए उपयोगी होने की संभावना है।
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Protocol
जापानी इस अध्ययन में इस्तेमाल medaka संकट और परेशानी के उन्मूलन के लिए कारण पर विचार के साथ नम्रता से Toyo विश्वविद्यालय की संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया गया।
1. रजत Nanocolloids (SNCs)
- शुद्ध SNCs खरीद (20 मिलीग्राम / एल -1, 99.99% शुद्धता, कण के बारे में 28.4 ± 8.5 एनएम आसुत जल में निलंबित व्यास मतलब है)।
- उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पवित्रता और चांदी की एकाग्रता का सत्यापन (आईसीपी एमएस) ऑपरेटिंग मैनुअल 8 के अनुसार विश्लेषण करती है। आईसीपी एमएस के लिए pretreatment विधि धारा 7 में वर्णित विश्लेषण करती है।
2. एस एन समाधान विभिन्न Salinities साथ (रजत Colloids और एजी + का मिश्रण) की तैयारी
- 60 × 60 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 1.8 जी KCl, 2.4 जी 2 CaCl · 2H 2 हे, और 9.78 छ MgSO 4 · 7H 1 में 2 हे ULT के एल से मिलकर ईआरएम तैयारrapure पानी; ultrapure पानी में 3 NaHCO 1.25% के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें।
- रात भर 25 डिग्री सेल्सियस पर ईआरएम समाधान हलचल।
- पतला ईआरएम साथ SNCs मिक्स। प्रत्येक एन सी-ईआरएम मिश्रित समाधान के 40 मिलीलीटर की तैयारी। अंतिम एकाग्रता ईआरएम के विभिन्न सांद्रता में 10 मिलीग्राम / एल -1 SNCs की है (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x या)।
- एस एन सी-ईआरएम मिश्रित 7.0 करने के लिए 0.625% के साथ 3 NaHCO ultrapure पानी में समाधान के पीएच को समायोजित करें। क्योंकि एजी + रिहाई अम्लीय परिस्थितियों 9 से मदद की है पीएच समायोजन, दक्षिणी नौसेना कमान समाधान तैयार करने में बहुत महत्वपूर्ण है।
- SNCs के लिए एक संदर्भ के रूप में यौगिक AGNO 3 का प्रयोग करें।
- पतला ईआरएम साथ AGNO 3 मिक्स। के 15.7 मिलीग्राम / एल एक AGNO 3 एकाग्रता में Agno 3 -ERM मिश्रित समाधान के 40 मिलीलीटर की तैयारी -1 ईआरएम के विभिन्न सांद्रता में (10 मिलीग्राम / एल -1 चांदी) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, या 30x) ।
नोट: चांदी कोलाइड विषाक्तता की जांच करने के लिए, AGNO 3समाधान है, जो घुलनशील चांदी का एक स्रोत है, SNCs, जो चांदी कोलाइड और घुलनशील चांदी का मिश्रण हैं के लिए एक संदर्भ यौगिक के रूप में प्रयोग किया जाता है।
- पतला ईआरएम साथ AGNO 3 मिक्स। के 15.7 मिलीग्राम / एल एक AGNO 3 एकाग्रता में Agno 3 -ERM मिश्रित समाधान के 40 मिलीलीटर की तैयारी -1 ईआरएम के विभिन्न सांद्रता में (10 मिलीग्राम / एल -1 चांदी) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, या 30x) ।
3. Medaka संस्कृति और अंडे की कटाई
- Medaka (ओ latipes) (नारंगी-लाल तनाव) (60 पुरुषों और 60 महिलाओं) प्राप्त करते हैं।
- समूहों के रूप में संस्कृति medaka (20 पुरुषों और 20 एक समूह के रूप में महिलाओं) एक medaka प्रवाह के माध्यम से संवर्धन प्रणाली का उपयोग करके 3 एल टैंक में 1x ईआरएम में।
- निम्न शर्तों पर संस्कृति:
संस्कृति के माध्यम से पीएच रेंज: 6.2 6.5 करने के लिए
प्रकाश: अंधेरे चक्र: 16: 8 घंटा
संस्कृति के माध्यम से तापमान: 24 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस
संस्कृति के माध्यम से आसमाटिक दबाव: 257 mOsm
- निम्न शर्तों पर संस्कृति:
- 10:00 पर (एक बार एक दिन) Artemia सलीना nauplii पर medaka फ़ीड और 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, और 17:00 पर एक कृत्रिम सूखी मछली आहार फ़ीड (एक दिन में पांच बार)।
- ए प्राप्त सलीना nauplii। <li> एक प्लास्टिक बीकर में 3.0% नमक समाधान के 5 एल तैयार करें।
- नमकीन चिंराट अंडे की 30 ग्राम बीकर में नमक के घोल में जोड़े।
- बुदबुदाती (4 एल / मिनट -1) एक वातन पंप का उपयोग कर के साथ 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंडे सेते हैं।
- 48 घंटे के बाद, बुदबुदाती बंद करो।
- 5 से 10 मिनट रची ए को अलग करने के लिए समाधान खड़े करने की अनुमति unhatched अंडे और अनावश्यक कार्य से सलीना nauplii (समाधान के निचले हिस्से) (समाधान के ऊपरी भाग)।
- निस्तारण द्वारा समाधान की ऊपरी परत को हटा दें।
- 283 माइक्रोन के खुलने के साथ एक चलनी के माध्यम से समाधान के निचले हिस्से फिल्टर, और nauplii कि 198 माइक्रोन के खुलने के साथ एक नेट पर के माध्यम से पारित इकट्ठा।
- 6 घंटा के भीतर medaka को nauplii फ़ीड।
4. SNCs की विषाक्तता परीक्षण या AGNO 3
- Medaka अंडे कुल्ला (चरण 21) परीक्षण समाधान [SNCs (10 मिलीग्राम / एल -1) या Agno 3 के साथ तीन बार ईआरएम के प्रत्येक एकाग्रता (1x, 5x पर (15.7 मिलीग्राम / एल -1 10 मिलीग्राम / एल -1 चांदी के रूप में) , 10x, 15x, 20x, 30x या) 7 पीएच पर]। नियंत्रण के रूप में, 7 पीएच 1 30 × × ईआरएम करने में अंडे का उपयोग करें।
- छह अच्छी तरह से प्लास्टिक की प्लेटें में प्रत्येक परीक्षा के समाधान के 5 मिलीलीटर के 15 rinsed अंडे जोड़ें। (दक्षिणी नौसेना कमान के लिए जोखिम प्रयोगों तीन बार प्रदर्शन या AGNO 3 विषाक्तता प्रत्येक परीक्षा के समाधान का उपयोग कर परीक्षण।)
- लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेटें।
- अंडे सेने तक या 14 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर लिपटे प्लेटें सेते हैं।
- जैविक परिवर्तन और मृत अंडे के लिए निरीक्षण उजागर अंडे हर 24 घंटा (आंकड़े 1 और 2)।
- परीक्षण समाधान का आदान-प्रदान हर 24 घंटा।
- इस प्रकार के रूप टिप्पणियों को पूरा करें।
- जोखिम के 6 दिन, दिल की दर (प्रति 15 सेकंड) गिनती ओएक स्टॉपवॉच (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एफ medaka भ्रूण।
- जोखिम के 6 दिन, एक माइक्रोमीटर (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत medaka भ्रूण की आंख का आकार (व्यास) को मापने।
- अंडे सेने के दिन, एक माइक्रोमीटर (चित्रा 3 सी) का उपयोग करके एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा के पूरे शरीर की लंबाई मापने।
- उजागर अंडे कि 14 दिन (चित्रा 3 डी) पर पक्षियों के बच्चे की कुल संख्या की गणना।
5. रजत विश्लेषण दक्षिणी नौसेना कमान समाधान से घुलनशील रजत, और अलगाव
- पर 14,000 एक्स 3 केडीए झिल्ली फिल्टर के माध्यम से छान कर प्रत्येक दक्षिणी नौसेना कमान समाधान (चांदी कोलाइड और घुलनशील चांदी का मिश्रण) से घुलनशील चांदी पृथक जी और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। , SNCs से घुलनशील चांदी को अलग-थलग करने के लिए एक 3 केडीए झिल्ली फिल्टर का प्रयोग करें क्योंकि 1x ईआरएम में एकत्रित SNCs की सूचना मतलब व्यास 67.8 एनएम 11 एक हैएन डी एजी + की है कि 0.162 एनएम 12 है; 3 केडीए झिल्ली 2 एनएम या 13 अधिक व्यास के साथ कणों शामिल नहीं है।
- समाधान फ़िल्टर (= घुलनशील चांदी एकाग्रता) आईसीपी एमएस विश्लेषण (चित्रा 3E) द्वारा की 50 μl में चांदी एकाग्रता उपाय आईसीपी एमएस ऑपरेटिंग मैनुअल 8 के अनुसार। आईसीपी एमएस के लिए pretreatment विधि धारा 7 में वर्णित विश्लेषण करती है।
6. Medaka भ्रूण में रजत Bioaccumulation का मापन
- धारा 4 में वर्णित के रूप में SNCs को medaka अंडे (चरण 21) या AGNO 3 बेनकाब।
- जोखिम के 6 दिन, प्रोटोकॉल में Medaka बुक 14 में वर्णित के अनुसार एंजाइम सेने medaka का उपयोग करके अंडा (यानी, dechorion) से जरायु हटा दें।
- आईसीपी एमएस ऑपरेटिंग मैनुअल 8 (चित्रा 3F) के अनुसार आईसीपी एमएस विश्लेषण द्वारा dechorioned अंडे की चांदी एकाग्रता उपाय। pretreatmentआईसीपी एमएस के लिए विधि धारा 7 में वर्णित विश्लेषण करती है।
आईसीपी एमएस विश्लेषण द्वारा रजत एकाग्रता का मापन 7.
- (; खंड 1 रजत एकाग्रता के सत्यापन के लिए) नमूने [चांदी समाधान के 50 μl जोड़ें; तीन dechorionated भ्रूण (धारा 5); या फ़िल्टर समाधान (धारा 5)] एक 50 मिलीलीटर Teflon बीकर के 50 μl।
- 50 मिलीलीटर बीकर ultrapure नाइट्रिक एसिड के 2.0 मिलीलीटर जोड़ें।
- बस से पहले यह (लगभग 3 घंटा) बाहर सूख जाता है जब तक 110 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर मिश्रण गर्मी।
- कार्बनिक पदार्थ पूरी तरह से भंग करने के लिए, बीकर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 0.5 मिलीलीटर 2.0 ultrapure नाइट्रिक एसिड की मिलीग्राम और जोड़ें।
- बस से पहले यह (लगभग 3 घंटा) बाहर सूख जाता है जब तक गर्म थाली पर फिर मिश्रण गर्मी।
- 1.0% ultrapure नाइट्रिक एसिड समाधान के 4 मिलीलीटर में छाछ भंग।
- स्थानांतरण एक अपकेंद्रित्र ट्यूब समाधान के 4 मिलीलीटर।
- : 7.7 करने के लिए दो बार दोहराएँ: 7.6 (तीन बार की कुल)। अंतिम मात्रा 12.0 हैमिलीलीटर।
- नमूना (1.0% ultrapure नाइट्रिक एसिड में भंग) ऑपरेटिंग मैनुअल के अनुसार 8 आईसीपी एमएस विश्लेषण का उपयोग करके की चांदी एकाग्रता उपाय।
- एक आंतरिक और एक बाहरी मानक समाधान का प्रयोग चांदी एकाग्रता यों तो (सामग्री सूची देखें)। आंतरिक और बाहरी मानक समाधान प्रयोगशाला प्रत्यायन के लिए अमेरिकन एसोसिएशन (A2LA) द्वारा मान्यता प्राप्त है। चांदी का पता लगाने सीमा .0018 / एनजी मिलीलीटर -1 (समाधान) और 0.016 मिलीग्राम एनजी वजन -1 (भ्रूण शरीर) थे।
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Representative Results
दक्षिणी नौसेना कमान विषाक्तता पर लवणता का प्रभाव बहुत स्पष्ट था: विकृति या मौत की प्रेरण लवणता निर्भर (आंकड़े 1 और 2) था। हम दक्षिणी नौसेना कमान में प्ररूपी बायोमार्कर (हृदय गति, आंख के आकार, पूरे शरीर की लंबाई, और अंडे सेने की दर) मापा (10 मिलीग्राम / एल -1) -exposed भ्रूण। ये प्ररूपी बायोमार्कर लवणता निर्भर दक्षिणी नौसेना कमान विषाक्तता का पता चला।
दिल की दर 29.6 32.2 के लिए धड़क रहा है / नियंत्रण में 30x ईआरएम करने के लिए 1x भर में 15 सेकंड से लेकर। हालांकि, वे काफी दक्षिणी नौसेना कमान या 30x ईआरएम (चित्रा 3 ए) में Agno 3 जोखिम के साथ (पी <0.01) में कमी आई है। हृदय की दर को घटाना स्वास्थ्य बिगड़ती इंगित करता है। वहाँ नियंत्रण में लार्वा या साथ संबंधित 1x ईआरएम रों तुलना 5x से 30x ईआरएम को लेकर salinities पर AGNO 3 जोखिम के पूरे शरीर की लंबाई में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थेolutions। शरीर की लंबाई 4.69 मिमी के लिए लगातार 4.55 था। हालांकि, शरीर की लंबाई काफी कम (पी <0.01) 4.33 और 3.77 मिमी, के लिए 15x और 20x ईआरएम संबंधित 1x ईआरएम समाधान के साथ तुलना में दक्षिणी नौसेना कमान संपर्क का एक परिणाम के रूप में; इसके अलावा, यह 30x ईआरएम में 3.75 मिमी की कमी हुई (चित्रा -3 सी) (सांख्यिकीय विश्लेषण 30x ईआरएम क्योंकि केवल एक ही रची पर उपलब्ध नहीं था)। पूरे शरीर की लंबाई घटाना विकास निषेध इंगित करता है। वहाँ कोई महत्वपूर्ण 1x से 30x ईआरएम 1x ईआरएम के साथ तुलना को लेकर salinities पर नियंत्रण में आंख व्यास में मतभेद थे; आंख व्यास 0.366 मिमी के लिए लगातार 0.357 था। हालांकि, यह काफी दक्षिणी नौसेना कमान या AGNO 3 जोखिम पर 20x या 30x ईआरएम में संबंधित 1x ईआरएम समाधान में (चित्रा 3 बी) के साथ तुलना में कमी आई है। आंख व्यास घटाना तंत्रिका तंत्र के विकास के अवरोध को इंगित करता है। सभी नियंत्रण अंडे 14 दिनों के भीतर रची। हालांकि, 20x और 30x में दक्षिणी नौसेना कमान जोखिम पर ईआरएम अंडे सेने की दर काफी 71% और 2% करने के लिए क्रमश: 1x ईआरएम (पी <0.01) (चित्रा 3 डी) में दर की कमी आई है। इसके अलावा, AGNO 3 जोखिम पर यह 30x ईआरएम (पी <0.01) में काफी कमी आई है। कम दर अंडे सेने SNCs या AGNO 3 की उपस्थिति के जहरीले प्रभाव को दर्शाता है। इन चार प्ररूपी बायोमार्कर इसलिए लवणता निर्भर दक्षिणी नौसेना कमान विषाक्तता दिखा।
लवणता पानी में घुलनशील धातु जटिल गठन बढ़ जाती है, और इन परिसरों विषाक्त प्रभाव 3,8 हो सकता है। हमारे अध्ययन में, आईसीपी एमएस चांदी के विश्लेषण से पता चला है कि परीक्षण के समाधान में घुलनशील चांदी सांद्रता वृद्धि के रूप में लवणता की वृद्धि हुई; भ्रूण में चांदी एकाग्रता भी वृद्धि हुई है (आंकड़े 3E, 3F)।
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चित्रा 1: लवणता बढ़ाने से दक्षिणी नौसेना कमान विषाक्तता बढ़ जाती है। मृत्यु दर और असामान्य रूप से विकसित भ्रूण की संख्या एस एन जोखिम के तहत लवणता में वृद्धि के साथ वृद्धि हुई है। (क) के लिए 10 मिलीग्राम / एल -1 अलग ईआरएम सांद्रता में दक्षिणी नौसेना कमान समाधान उजागर medaka अंडे की छवि सरणी। छवियाँ medaka अंडे SNCs से अवगत कराया और एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा के प्रतीक हैं। नियंत्रण medaka अंडे अच्छी तरह से विकसित किया गया है, और उन सभी को 30x ईआरएम करने के लिए 1x में रची। 10 मिलीग्राम / एल -1 एन सी जोखिम, 1x में रची medaka अंडे के सभी हालांकि 15x एर्म, विकास की विकृति (लाल उल्लिखित आयत, unhatched) और भ्रूण 14 दिनों के भीतर unhatched करने पर (हरी आयतों को रेखांकित किया, unhatched) 20x पर मनाया गया और 30x ईआरएम। (ख) बढ़ाया (क)। निचले सही की छवियों क्लिक करें यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 2:। Medaka अंडे की विशिष्ट प्ररूपी बायोमार्कर SNCs से अवगत कराया Medaka अंडे विकास मंच 21 में 6 दिनों के लिए ईआरएम के विभिन्न सांद्रता में (10 मिलीग्राम / एल -1) SNCs से अवगत कराया गया (क) सामान्य विकास के साथ नियंत्रण medaka भ्रूण।। (ख) विकास संबंधी विकृति (क्षति के प्रकाश डिग्री)। इस भ्रूण pericardiovascular शोफ दिखाया गया है; ट्यूबलर दिल; खून के थक्के; रक्त वाहिकाओं की अपर्याप्त विकास (और इस प्रकार ischemia), रीढ़ की हड्डी, पूंछ, आंखों और मस्तिष्क; और एक छोटी पूंछ। (ग) विकास संबंधी विकृति (क्षति की भारी डिग्री)। इस भ्रूण की जर्दी बोरी के विनाश से पता चला है; रक्त वाहिकाओं की अपर्याप्त विकास (और इस प्रकार ischemia), रीढ़ की हड्डी, पूंछ, आंखों और मस्तिष्क; और एक छोटी पूंछ। (ख) और (ग) में संकेत में 20x और 30x ईआरएम दक्षिणी नौसेना कमान जोखिम पर मनाया गया। <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: medaka अंडे के विकास के दौरान विषाक्तता बायोमार्कर पर SNCs या चांदी नाइट्रेट के लिए जोखिम के प्रभाव के विकास के चरण 21 medaka अंडे एक में SNCs (10 मिलीग्राम / एल -1) या चांदी नाइट्रेट (10 मिलीग्राम / एल -1 चांदी के रूप में) से अवगत कराया। ERMS की श्रृंखला 6 दिनों के लिए मनाया गया। [नीला] कंट्रोल (ईआरएम); [लाल] 10 मिलीग्राम / एल -1 ईआरएम में कम से SNCs; [ग्रीन] 10 मिलीग्राम / एल -1 ईआरएम में चांदी के रूप में Agno 3। (क) के अनुसार 15 सेकंड हृदय की दर। हृदय की दर को घटाना स्वास्थ्य बिगड़ती इंगित करता है। (ख) आँखों व्यास। आंख व्यास घटाना तंत्रिका तंत्र के विकास के अवरोध को इंगित करता है। (ग) पूर्ण शरीर की लंबाई। डेपूरे शरीर की लंबाई बढ़ती विकास निषेध इंगित करता है। (घ) दर अंडे सेने। घटाना सेने दर SNCs की उपस्थिति के जहरीले प्रभाव को इंगित करता है। (ई) परीक्षण समाधान (मिलीग्राम / एल -1) में SNCs या चांदी नाइट्रेट से घुलनशील चांदी परिसरों की सांद्रता। (च) SNCs या चांदी नाइट्रेट के संपर्क में भ्रूण में रजत सांद्रता ERMS की एक श्रृंखला में। * महत्वपूर्ण अंतर (विचरण के विश्लेषण, पी <0.05) संबंधित 1x ईआरएम समाधान के साथ तुलना में। NA: उपलब्ध नहीं है, क्योंकि केवल एक ही रची। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
Medaka एक मीठे पानी में मछली है कि अत्यधिक समुद्री जल के लिए सहनशील है; यह अच्छी तरह से ज्ञात नहीं है कि इस मछली के मूल प्राकृतिक वास जापानी तट 6 बंद खारे पानी था। इसलिए, medaka मछली क्लोराइड कोशिकाओं 7 अच्छी तरह से विकसित किया है। इस अनूठी संपत्ति केवल मछली की एक प्रजाति का उपयोग करके लवणता के एक समारोह के रूप में वातावरण में रसायनों की विषाक्तता परीक्षण करने के लिए एक नया तरीका के साथ वैज्ञानिकों (मीठे पानी समुद्र के पानी के लिए) प्रदान करता है।
चरण 21 में medaka अंडे प्राप्त करने के लिए, अंडे चरण 20. आमतौर पर हर सुबह काटा और चयनित किया जाना चाहिए, medaka जोड़े (सिर्फ सूर्योदय से पहले) सुबह जल्दी संभोग और सूर्योदय के द्वारा अंडे का उत्पादन शुरू करते हैं। सुबह में काटा अंडे चरण में 10 या 11 के बारे में होना चाहिए तो प्रयोग के शुरू होने से पहले अंडे के विकास को नियंत्रित करने की जरूरत है, अंडे का विकास पहले चरण 21 तक पहुँच जाता है 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 15 के तापमान का उपयोग करके धीमा किया जा सकता है। चांदी एकाग्रता को मापने (घुलनशील SILVईआर) परीक्षण समाधान में और dechorionated भ्रूण में दक्षिणी नौसेना कमान विषाक्तता की लवणता निर्भरता के बारे में हमारी जांच करने के लिए महत्वपूर्ण था। क्योंकि इसकी उच्च विशिष्टता का मतलब यह कोई हानिकारक proteinase है कि अंडे सेने एंजाइम, जरायु को दूर करने के लिए सबसे अच्छा जैविक रूप से उपयुक्त एंजाइम है। अन्य proteinases सिफारिश नहीं कर रहे। अब तक केवल सेने एंजाइम उपलब्ध medaka के लिए है; यह इस विधि से एक सीमा है।
रासायनिक विषाक्तता परीक्षण के परिणाम पर लवणता का स्पष्ट प्रभाव दिखा दिया है कि, इस तरह के प्राकृतिक जलीय गुण का अनुकरण के रूप में वास्तविक रूप में संभव हमारे प्रयोगों के रूप में, वातावरण में रसायनों की विषाक्तता की जांच के लिए उपयोगी था। खोज की है कि दक्षिणी नौसेना कमान उच्च सांद्रता के कारण चांदी विषाक्तता लवणता की वृद्धि हुई थी सब जलीय क्षेत्रों में प्रदूषक रसायन का ईकोटोकसीकोलौजी करने के लिए अत्यधिक लागू है। समुद्री जल में सामान्य रासायनिक विषाक्तता परीक्षण के मामले में, वहाँ के रूप में अभी तक कोई मछली मॉडल nominatअधिकृत अंतरराष्ट्रीय संगठनों (जैसे, ओईसीडी और एड द्वारा अंतरराष्ट्रीय मानकीकरण संगठन)। मीठे पानी में मछलियों (जैसे, medaka, zebrafish, कार्प, इंद्रधनुष, और मूर्ख मनुष्य छोटी मछली) है कि रासायनिक विषाक्तता परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया है के अलावा, केवल medaka लवणता अनुकूलन के फायदे के सभी है, एंजाइम उपलब्धता, उच्च उपजाऊपन, और एक अंडे सेने आकार प्रयोगशाला प्रयोगों में आसान उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से छोटा है। इसके अलावा, medaka एक व्यापक तापमान रेंज के लिए अनुकूलित किया जा सकता (2 से 38 डिग्री सेल्सियस) 6। जलीय वातावरण में, लवणता और तापमान रसायनों के भाग्य पर सबसे महत्वपूर्ण पर्यावरणीय प्रभावों कर रहे हैं; हमारे विधि इसलिए जलीय पर्यावरण अनुसंधान की एक श्रृंखला के लिए परिवर्तनीय होना चाहिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
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- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
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