Abstract
Соленость является важной характеристикой водной среды. Для водных организмов она определяет среду обитания пресной воды, солоноватой воды и морской воды. Испытания токсичности химических веществ и оценки их экологических рисков для водных организмов часто выполняются в пресной воде, но токсичность химических веществ для водных организмов зависит от рН, температуры и солености. Там не существует метода, однако, для проверки солености зависимость токсичности для водных организмов. Здесь мы использовали Оризии (Oryzias latipes) , потому что они могут приспособиться к пресной воде, соленой воды и морской воды. Различные концентрации эмбриона выращивания среды (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x и 30x) были использованы для проверки токсичности частиц серебра nanocolloidal (ВНС) в Оризии яйца (1x ERM и 30x ERM имеют осмотического давления, эквивалентной к пресной и соленой воде, соответственно). В шести хорошо пластмассовых плит, 15 оризии яйца в трех экземплярах подвергались ВНС на 10 мг / л &# 8722; 1 в различных концентрациях ERM при рН 7 и 25 ° C в темноте.
Мы использовали рассекает микроскоп и микрометр для измерения частоты сердечных сокращений на 15 сек и глаз диаметра на 6-й день и всю длину тела личинок на вылупления день (раздел 4). Эмбрионы не наблюдалось до вылупления или 14-й день; Затем мы подсчитали штриховки скорость каждый день в течение 14 дней (раздел 4). Чтобы увидеть накопление серебра в эмбрионах, мы использовали индуктивно связанной плазмы масс-спектрометрии для измерения концентрации серебра тестовых растворов (раздел 5) и dechorionated эмбрионов (раздел 6) .The токсичность ВНС до оризии эмбрионов, очевидно, увеличивается с увеличением солености. Этот новый метод позволяет проверить токсичность химических веществ в различных соленостью.
Introduction
С момента создания Организации экономического сотрудничества и принципами клинических испытаний развития (ОЭСР) для тестирования химических веществ в 1979 году, 38 руководящих принципов тестирования были опубликованы в разделе 2 руководящих принципов, воздействие на биотические системы 1. Все водные организмы тестируемых были из пресноводных сред обитания, а именно пресноводных растений; водоросли; беспозвоночные, такие как дафнии и хирономид; и рыбы, такие как оризии, данио и радужной форели. По сравнению с соленой водой окружающей среды, пресноводные среды более непосредственно влияют человека экономической и промышленной деятельности. Таким образом, пресноводные среды стали приоритетными для тестирования, потому что они подвергаются более высокому риску от загрязнения.
В прибрежных районах, в том числе лиманов, соленость колеблется от солоноватой воды и морской воды условий, и эти участки часто загрязнены промышленной деятельности 2. Прибрежные районы и связанные с ними водно-болотные угодья характеризуются чIGH экологическое биоразнообразие и продуктивность. Поэтому прибрежные экосистемы должны быть защищены от химического загрязнения. Тем не менее, было ограничено экотоксикологическую исследований в солоноватой воде сред обитания и морской воды.
Sakaizumi 3 изучали токсичные взаимодействия между метилртути и солености в японских яиц оризии и обнаружили , что увеличение осмотического давления исследуемого раствора повышается токсичность метилртути. . Sumitani и др 4 использовали Оризии яйца для исследования токсичности свалок; они обнаружили, что осмотическое эквивалентность фильтрате к яйцам было ключом к индукции аномалий во время эмбриогенеза. Кроме того, Kashiwada 5 сообщалось , что пластиковые наночастицы (39,4 нм в диаметре) легко проникшего через оризия яйца хориона при солоноватой условиях (15x эмбрион выращивания среды (ERM)).
Типичная маленькая модель рыбы, японские оризия (Oryzias latipes 6. Японские оризия могут жить в условиях , начиная от пресной воды в морскую воду из - за их высокоразвитых хлоридных клеток 7. Они, следовательно, могут быть полезны для тестирования в условиях с широким диапазоном соленостью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Японские оризия, используемые в данном исследовании, были обработаны гуманно в соответствии с институциональными рекомендациями Тойо университета, с учетом для облегчения бедствия и дискомфорта.
1. Серебряный наноколлоиды (ВНС)
- Покупка очищенные вторые национальные (20 мг / л -1, 99,99% чистоты, частицы со средним диаметром около 28,4 ± 8,5 нм , взвешенных в дистиллированной воде).
- Проверка чистоты и концентрации серебра с индуктивно связанной плазмой масс - спектрометрии (МС-ИСП) анализ в соответствии с руководством по эксплуатации 8. Способ предварительной обработки для ICP-MS анализа описана в разделе 7.
2. Подготовка SNC Solutions (Смеси Silver коллоидов и Ag +) с различными соленостью
- Подготовка 60 × ERM , состоящий из 60 г NaCl, 1,8 г KCl, 2,4 г CaCl 2 · 2H 2 O и 9,78 г MgSO 4 · 7H 2 O в 1 л Ultrapure воды; доведения рН до 7,0 с помощью 1,25% раствора NaHCO 3 в сверхчистой воде.
- Перемешать раствор ERM при 25 ° С в течение ночи.
- Смешайте с разведенным вторые национальные ERM. Приготовьте 40 мл каждого SNC-ERM смешанного раствора. Конечная концентрация составляет 10 мг / л -1 ВНС в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x).
- Регулировка рН SNC-ERM смешанного раствора до 7,0 с помощью 0,625% NaHCO 3 в сверхчистой воде. регулирование рН очень важно при приготовлении раствора SNC, так как Ag + высвобождение облегчается кислой среды 9.
- Используйте AgNO 3 в качестве эталонного соединения для ВНС.
- Смешайте AgNO 3 с разбавленным ERM. Приготовьте 40 мл AgNO 3 -ERM смешанном растворе при концентрации AgNO 3 15.7 мг / л -1 (10 мг / л -1 серебра) в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x) ,
Примечание: Для исследования токсичности серебра коллоидный, AgNO 3Решение, которое является источником растворимого серебра, используют в качестве эталонного соединения для ВНС, которые представляют собой смесь из серебра коллоидов и растворимого серебра.
- Смешайте AgNO 3 с разбавленным ERM. Приготовьте 40 мл AgNO 3 -ERM смешанном растворе при концентрации AgNO 3 15.7 мг / л -1 (10 мг / л -1 серебра) в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x) ,
3. Оризии Культура и яйца Уборка урожая
- Получить Оризии (О. latipes) (оранжево-красный штамм) (60 самцов и 60 самок).
- Культура оризия как группы (20 мужчин и 20 женщин в качестве одной группы) в 1x ERM в 3 л цистернах с использованием проточного системы культивирования Оризии.
- Культура при следующих условиях:
Диапазон рН культуральной среды: 6,2 до 6,5
свет: темно цикл: 16: 8 ч
Температура культуральной среды: 24 ± 0,5 ° С
Осмотическое давление питательной среды: 257 мОсм
- Культура при следующих условиях:
- Поток Оризии на Артемия Салина науплиев в 10:00 (раз в день) и кормить искусственную сухой рыбы диету в 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (пять раз в день).
- Получить А. заИпа науплии. <Li> Приготовьте 5 л 3,0% -ного раствора соли в пластиковый стакан.
- Добавьте 30 г артемии яйца в растворе соли в стакане.
- Инкубировать яйца при температуре 25 ° С в течение 48 ч при барботировании (4 л / мин -1) при помощи аэрации насоса.
- Через 48 ч остановить бульканье.
- Дайте раствору отстояться в течение от 5 до 10 мин , чтобы отделить вылупившихся А. салина Науплиусы (нижняя часть раствора) из Незаштрихованная яиц и яичной скорлупы (верхняя часть раствора).
- Удалите верхний слой раствора декантацией.
- Фильтр нижнюю часть раствора через сито с отверстиями 283 мкм, и собирают науплии, которые проходят через на сетку с отверстиями 198 мкм.
- Поток науплии к оризии в течение 6 часов.
4. Токсичность Испытание ВНС или AgNO 3
- Промыть Оризии яйца (этап 21) три раза с испытуемым раствором [ВНС (10 мг / л -1) или AgNO 3 (15.7 мг / л -1 , как 10 мг / л -1 серебра) при каждой концентрации ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x или 30x) при рН 7]. В качестве контроля используют яйца в 1 × до 30 × ERM при рН 7.
- Добавьте 15 промытые яйца до 5 мл каждого испытуемого раствора в шести-луночных пластиковых пластин. (Выполните экспериментов по воздействию три раза для SNC или AgNO 3 токсичность тестирование с использованием каждого испытуемого раствора.)
- Оберните пластин в алюминиевую фольгу.
- Инкубируйте обернутые пластин при 25 ° С в темноте до вылупления или в течение 14 дней.
- Соблюдайте экспонированных яйца каждые 24 ч для биологических изменений и мертвых яиц (рисунки 1 и 2).
- Обмен испытуемых растворов каждые 24 ч.
- Выполните наблюдения следующим образом.
- На 6-й день воздействия, подсчитать частоту сердечных сокращений (за 15 сек) оF медака эмбрионы под микроскопом рассекает с помощью секундомера (фиг.3А).
- На 6 -й день воздействия, измерить размер глаз (диаметр) оризии эмбрионов под микроскопом рассекает с помощью микрометра (фигура 3В).
- На инкубационных день, измеряют полные длины тела личинок под препаративным микроскопом с помощью микрометра (рис 3в).
- Подсчитать общее количество выставленных яиц , которые люк в течение 14 дней (Рис 3).
5. Выделение серебра из растворимой SNC Solution и Silver Analysis
- Изолировать растворимого серебра из каждого раствора SNC (смесь серебра коллоидов и растворимого серебра) с помощью фильтрации через 3 кДа мембранный фильтр при 14000 х г и 4 ° С в течение 10 мин. С помощью 3 кДа мембранного фильтра для выделения растворимого серебра из ВНС, так как сообщенное средний диаметр агрегированных ВНС в 1x ERM составляет 67,8 нм 11 аго , что из Ag + составляет 0,162 нм 12; 3 кДа мембрана исключает частицы диаметром 2 нм или более 13.
- Измерьте концентрацию серебра в 50 мкл отфильтрованного раствора (= растворимая концентрации серебра) с помощью ICP-MS анализа (рис 3e) в соответствии с инструкцией по эксплуатации ICP-MS 8. Способ предварительной обработки для ИСП-МС анализа описана в разделе 7.
6. Измерение Серебряного биоаккумуляции в оризии Эмбрионы
- Expose Оризии яйца (стадия 21) ВНС или AgNO 3 , как описано в разделе 4.
- На 6 -й день воздействия, удалить хориона из яйца (то есть, dechorion) с использованием Оризии инкубационных фермента в соответствии с протоколом , описанным в оризии книге 14.
- Измерьте концентрацию серебра в dechorioned яиц путем анализа ICP-MS в соответствии с ИСП-МС Руководство по эксплуатации 8 (рис 3f). предварительная обработкаметод ICP-MS анализа описана в разделе 7.
7. Измерение серебра концентрации с помощью ICP-MS анализа
- Добавить примеры [50 мкл раствора серебра (для проверки концентрации серебра; раздел 1); три dechorionated эмбрионов (раздел 5); или 50 мкл отфильтрованного раствора (раздел 5)] в стакане тефлоновой 50 мл.
- Добавить 2,0 мл сверхчистой азотной кислоты в химический стакан емкостью 50 мл.
- Нагреть смесь на горячей плите при 110 ° С до тех пор, как раз, прежде чем она высыхает (около 3 ч).
- Для того, чтобы полностью растворить органическое вещество, добавьте 2,0 мл сверхчистой азотной кислоты и 0,5 мл перекиси водорода в стакан.
- Нагреть смесь снова на горячей плите, пока незадолго до ее высыхания (около 3 ч).
- Остаток растворяют в 4 мл 1,0% раствора сверхчистой азотной кислоты.
- Передача 4 мл раствора в пробирку для центрифугирования.
- Повторить от 7,6 до 7,7 раза (в общей сложности три раза). Конечный объем составляет 12,0мл.
- Измеряют концентрацию серебра в образце (растворенного в 1,0% сверхчистой азотной кислоты) , с помощью анализа ICP-MS в соответствии с руководством по эксплуатации 8.
- Используйте внутренний и внешний стандартное решение (см список материалов) для количественного определения концентрации серебра. Внутреннее и внешнее стандартное решение аккредитована Американской ассоциации по аккредитации лабораторий (A2LA). Пределы обнаружения серебра были 0,0018 нг / мл - 1 (раствор) и 0,016 нг мг-вес -1 (эмбриона тела).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние солености на токсичность SNC была очень очевидна: индукция уродства или смерти была соленость зависимых (1 и 2). Мы измеряли фенотипических биомаркеров (частота сердечных сокращений, размер глаз, полная длина тела и скорость вылупления) в SNC (10 мг / л -1) -exposed эмбрионов. Эти фенотипические биомаркеры выявили соленость зависящих от SNC токсичности.
Частота сердечных сокращений в диапазоне от 29,6 до 32,2 уд / 15 сек в течение от 1x до 30x ERM в контрольной группе. Тем не менее, они значительно уменьшились (P <0,01) с SNC или AgNO 3 экспозиции в 30x ERM (рис 3а). Снижение частоты сердечных сокращений указывает ухудшение здоровья. Там не было никаких существенных различий в полной длине тела личинок под контролем или AgNO 3 экспозиции при соленостью в диапазоне от 5х до 30х МВК по сравнению с соответствующим 1x ERM solutions. Длина тела была последовательно 4,55 до 4,69 мм. Тем не менее, длина тела значительно снизилась (P <0,01) до 4,33 и 3,77 мм, в результате воздействия SNC в 15х и 20х ERM по сравнению с соответствующими 1x ERM решений; кроме того, она снизилась до 3,75 мм в 30x ERM (статистический анализ не был доступен на 30x ERM , потому что только один вылупились) (рис 3в). Уменьшение полной длины тела указывает на торможение роста. Там не было никаких существенных различий в диаметре глаз в контроле на соленостью в диапазоне от 1x до 30x ERM по сравнению с 1x ERM; Диаметр глаз был последовательно 0,357 до 0,366 мм. Тем не менее, она значительно снизилась на SNC или AgNO 3 экспозиции в 20х или 30х ERM по сравнению с в соответствующих 1x ERM решений (рис 3b). Уменьшение диаметра глаз указывает на торможение с развитием нервной системы. Все яйца вылупились управления в течение 14 дней. Тем не менее, при воздействии SNC в 20х и 30х ERM штриховки скорость значительно снизилась до 71% и 2%, соответственно, скорости в 1x ERM (P <0,01) (рис 3d). Кроме того , после AgNO 3 экспозиции он значительно уменьшился в 30x ERM (P <0,01). Уменьшение скорости вылупления указывает на токсический эффект присутствия ВНС или AgNO 3. Таким образом, эти четыре фенотипических биомаркеров показывают соленость зависимой токсичности SNC.
Соленость увеличивает образование металла водорастворимый комплекс, и эти комплексы могут иметь токсические эффекты 3,8. В нашем исследовании, ИСП-МС анализ серебра показали, что растворимые серебра концентрации в тестируемых растворах возрастает по мере роста солености увеличилась; концентрация серебра в эмбрионах также увеличилась (Фигуры 3е, 3f).
"/>
Рисунок 1: Увеличение солености увеличивает токсичность SNC. Смертность и количество аномально развитых эмбрионов увеличивается с увеличением солености под воздействием SNC. (А) массив Изображение оризии яиц , подвергающихся 10 мг / л -1 раствора ВНС при различных концентрациях ERM. Изображения типичны оризии яиц, подвергшихся воздействию ВНС и наблюдали под микроскопом рассекает. Контроль оризии яйца были хорошо развиты, и все они вылупились в 1х до 30х ERM. При 10 мг / л -1 экспозиции SNC, хотя все оризии яйца вылупились в 1x до 15x ERM, уродств развития (красный указано прямоугольниками, Незаштрихованная) и эмбрионов невыведенное в течение 14 дней (зеленый указано прямоугольниками, Незаштрихованная) наблюдались при 20х и 30x ERM. (б) Увеличенный изображения в нижнем правом углу (а). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Типичные фенотипические биомаркеры оризии яйца подвергаются ВНС медака яйца на стадии развития 21 подвергались воздействию ВНС (10 мг / л -1) в различных концентрациях МВК в течение 6 дней (а) управления оризия эмбрион с нормальным развитием.. (б) Развивающее деформация (легкая степень повреждения). Этот эмбрион отображается pericardiovascular отек; трубчатые сердца; сгустки крови; недостаточное развитие кровеносных сосудов (и, таким образом, ишемия), спинной мозг, хвост, глаза и мозг; и короткий хвост. (с) Развивающее деформация (тяжелая степень повреждения). Этот эмбрион показал разрушение желточного мешка; недостаточное развитие кровеносных сосудов (и, таким образом, ишемия), спинной мозг, хвост, глаза и мозг; и короткий хвост. Знаки в (б) и (с) наблюдались при воздействии SNC в 20х и 30х ERM. <A HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Эффекты воздействия ВНС или нитрата серебра на токсикологических биомаркеров в процессе развития оризия яйца стадии развития 21 оризии яйца подвергаются ВНС (10 мг / л -1) или нитрат серебра (10 мг / л -1 , как серебро) в. наблюдались серии ERMS в течение 6 дней. [Синий] Control (ERM); [красный] ГКНБ в дозе 10 мг / л -1 в ERM; [зеленый] AgNO 3 в дозе 10 мг / л -1 как серебро в ERM. (а) Частота сердечных сокращений на 15 сек. Снижение частоты сердечных сокращений указывает ухудшение здоровья. Диаметр (б) глаз. Уменьшение диаметра глаз указывает на торможение с развитием нервной системы. (С) длина всего тела. Deбиговки полная длина тела указывает на торможение роста. (d) скорость вылупления. Уменьшение скорости вылупления указывает на токсический эффект присутствия ВНС. (Е) концентрации растворимых комплексов серебра из ВНС или нитрата серебра в исследуемых растворах (мг / л -1). (Е) концентрации серебра в эмбрионов , подвергшихся ВНС или нитрата серебра в серии Erms. * Значительная разница (дисперсионный анализ, P <0,05) по сравнению с соответствующим раствором 1x ERM. NA: нет в наличии, потому что только один вылупились. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оризии является пресноводная рыба, которая является весьма терпимы к морской воде; он не очень хорошо известно , что первоначальная естественная среда обитания этой рыбы была соленой воды у берегов Японии 6. Следовательно, оризии рыбы имеют хорошо развитые хлоридные клетки 7. Это уникальное свойство предоставляет ученым новый способ проверки токсичности химических веществ в окружающую среду в зависимости от солености (пресная вода к морской воде) с использованием только одного вида рыбы.
Для получения Оризии яйца на стадии 21, яйца должны быть собраны каждое утро и выбирается на этапе 20. Как правило, пары оризии начинают спаривание ранним утром (до восхода солнца) и производят яйца с восходом солнца. Яйца собирают утром должны быть приблизительно в стадии 10 или 11. Если есть необходимость контролировать развитие яйца до начала эксперимента, развитие яйца может быть замедлено использованием температур от 15 до 20 ° С до того стадия 21 достигается. Измерение концентрации серебра (растворимый SILVэ) в тестовых растворах и в dechorionated эмбрионов имеет важное значение для нашего исследования солености зависимости токсичности SNC. Инкубационные фермент является лучшим биологически подходящим ферментом для удаления хориона, так как его высокая специфичность означает, что он не оказывает вредного протеиназы. Не рекомендуется использовать другие протеиназы. До сих пор единственным вылупления фермент, доступный в том, что для оризии; это одно ограничение этого метода.
Очевидное влияние солености на результатах испытаний химической токсичности показали, что моделируя такие природные водные свойства как можно более реалистично, как и в наших экспериментах, был полезен для исследования токсичности химических веществ в окружающей среде. Открытие того, что SNC токсичность из-за высокой концентрации серебра была увеличена солености весьма применима к экотоксичности химических загрязнителей во всех акваториях. В случае общего тестирования химической токсичности в морской воде, не существует до сих пор нет рыбы модель nominatред уполномоченными международными организациями (например, ОЭСР и Международная Организация Стандартизации). Среди пресноводных рыб (например, оризия, данио, карп, радужной форели, и Гольян) , которые были использованы для тестирования химической токсичности, только оризия имеет все преимущества адаптации солености, инкубационные наличие фермента, высокая плодовитость, а размер достаточно мал для удобного использования в лабораторных экспериментах. Кроме того, оризия может быть приспособлена к широкому диапазону температур ( От 2 до 38 ° С) 6. В водной среде, солености и температуры, являются наиболее важными экологические влияния на судьбу химических веществ; Поэтому наш метод должен быть изменяемым для целого ряда водных экологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
