Abstract
La salinité est une caractéristique importante de l'environnement aquatique. Pour les organismes aquatiques, il définit les habitats d'eau douce, d'eau saumâtre et l'eau de mer. Des tests de toxicité des produits chimiques et l'évaluation de leurs risques écologiques pour les organismes aquatiques sont fréquemment réalisées en eau douce, mais la toxicité des produits chimiques pour les organismes aquatiques dépend du pH, la température et la salinité. , Il n'y a pas de méthode, mais pour tester la dépendance à l'égard de la salinité de la toxicité pour les organismes aquatiques. Ici, nous avons utilisé medaka (Oryzias latipes) parce qu'ils peuvent adapter à l' eau douce, eau saumâtre et l' eau de mer. Différentes concentrations de milieu de l'embryon d'élevage (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x et 30x) ont été utilisées pour tester la toxicité des particules nanocolloïdales argent (SNCS) à Medaka oeufs (1x ERM et 30x ERM ont des pressions osmotiques équivalent à l'eau douce et l'eau de mer, respectivement). Dans des plaques à six puits en plastique de 15 œufs de medaka en trois exemplaires ont été exposés à DCN à 10 mg / L &# 8722; 1 à différentes concentrations du MCE à un pH de 7 et à 25 ° C dans l'obscurité.
Nous avons utilisé un microscope à dissection et un micromètre pour mesurer la fréquence cardiaque par un diamètre de 15 sec et les yeux le jour 6 et pleine longueur du corps des larves le jour (section 4) l'éclosion. Les embryons ont été observés jusqu'à l'éclosion ou le jour 14; nous avons ensuite compté le taux d'éclosion chaque jour pendant 14 jours (section 4). Pour voir l'accumulation d'argent dans les embryons, nous avons utilisé plasma à couplage inductif spectrométrie de masse pour mesurer la concentration d'argent de solutions de test (section 5) et les embryons dechorionated (section 6) .La toxicité du SNCS à des embryons de medaka évidemment augmenté avec l'augmentation de la salinité. Cette nouvelle méthode nous permet de tester la toxicité des produits chimiques dans différentes salinités.
Introduction
Depuis la création de l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) des lignes directrices d'essai pour les produits chimiques de test en 1979, 38 lignes directrices d'essai ont été publiés dans la section 2 des lignes directrices, des effets sur les systèmes biologiques 1. Tous les organismes aquatiques testés ont été des habitats d'eau douce, à savoir les plantes d'eau douce; algues; invertébrés tels que les daphnies et chironomes; et des poissons tels que le médaka, le poisson zèbre et la truite arc. Par rapport à des environnements d'eau salée, les environnements d'eau douce sont plus directement touchés par les activités économiques et industrielles humaines. Par conséquent, les environnements d'eau douce ont été priorisés pour les tests, car ils sont plus à risque de pollution.
Dans les zones côtières, y compris les estuaires, les salinités varient entre les conditions de l' eau et l' eau de mer saumâtre, et ces zones sont souvent polluées par l' activité industrielle 2. Les zones côtières et les zones humides associées sont caractérisées par hla biodiversité écologique aute et la productivité. Les écosystèmes côtiers doivent donc être protégées contre la pollution chimique. Cependant, il a été limité la recherche écotoxicologique dans les habitats d'eau et d'eau de mer saumâtre.
Sakaizumi 3 a étudié les interactions entre les toxiques de mercure de méthyle et de salinité dans les œufs de medaka japonais et a constaté que l' augmentation de la pression osmotique de la solution d'essai a amélioré la toxicité du mercure de méthyle. . Sumitani et al 4 utilisé des oeufs de medaka pour étudier la toxicité des lixiviats de décharge; ils ont constaté que l'équivalence osmotique du lixiviat aux oeufs était la clé pour induire des anomalies lors de l'embryogenèse. En outre, Kashiwada 5 rapporté que les nanoparticules en plastique (39,4 nm de diamètre) facilement pénétrés par le chorion medaka d'oeuf dans des conditions saumâtres (15x embryon d' élevage moyen (ERM)).
Un modèle de petits poissons typique, les médaka (Oryzias latipes de 6. Medaka japonais peuvent vivre dans des conditions allant de l' eau douce à l' eau de mer en raison de leurs cellules de chlorure hautement développés 7. Ils sont donc susceptibles d'être utiles pour tester dans des conditions avec une large gamme de salinités.
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Protocol
Les medaka japonais utilisés dans cette étude ont été traités avec humanité conformément aux directives institutionnelles de l'Université Toyo, en tenant compte de la réduction de la détresse et de l'inconfort.
1. Argent nanocolloïdes (SNC)
- Achetez SNC purifiées (20 mg / L -1, 99,99% de pureté, particule signifie un diamètre d' environ 28,4 ± 8,5 nm en suspension dans l' eau distillée).
- Valider la pureté et la concentration de l'argent par couplage inductif spectrométrie de masse à plasma (ICP-MS) analyse selon le manuel d'exploitation 8. Le procédé de prétraitement pour ICP-MS analyses est décrit à l'article 7.
2. Préparation de SNC Solutions (mélanges de colloïdes d' argent et Ag +) avec différentes salinités
- Préparer 60 × ERM consistant en 60 g de NaCl, 1,8 g de KCl, 2,4 g de CaCl 2 .2H 2 O, 9,78 g de MgSO 4 · 7H 2 O dans 1 L de ULTeau Rapure; ajuster le pH à 7,0 avec 1,25% de NaHCO 3 dans de l' eau ultrapure.
- Agiter la solution de GRE à 25 ° C pendant la nuit.
- Mélanger avec SNC ERM diluée. Préparer 40 ml de chaque solution mixte SNC-ERM. La concentration finale est de 10 mg / L -1 de SNC dans différentes concentrations de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x ou 30x).
- Ajuster le pH de la solution mixte SNC-ERM à 7,0 avec 0,625% NaHCO 3 dans l' eau ultrapure. l' ajustement du pH est très important dans la préparation de la solution de SNC, car la libération Ag + est facilitée par des conditions acides 9.
- Utiliser AgNO 3 en tant que composé de référence pour le SNC.
- Mélanger AgNO 3 avec ERM dilué. Préparer 40 ml de AgNO 3 -ERM solution mélangée à une concentration AgNO 3 de 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 argent) dans différentes concentrations de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x ou 30x) .
Remarque: Pour examiner la toxicité de l' argent colloïdal, AgNO 3solution, ce qui est une source d'argent soluble, est utilisé comme composé de référence pour DCN, qui sont un mélange de colloïdes d'argent et d'argent soluble.
- Mélanger AgNO 3 avec ERM dilué. Préparer 40 ml de AgNO 3 -ERM solution mélangée à une concentration AgNO 3 de 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 argent) dans différentes concentrations de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x ou 30x) .
3. Medaka Culture et récolte des oeufs
- Obtenir le medaka (latipes O.) (souche rouge-orange) (60 mâles et 60 femelles).
- medaka Culture en tant que groupes (20 mâles et 20 femelles comme un groupe) dans 1x ERM dans 3 L réservoirs en utilisant un système de culture d'écoulement medaka.
- Culture dans les conditions suivantes:
plage de pH du milieu de culture: 6/2 à 6/5
lumière: cycle d'obscurité: 16: 8 h
température du milieu de culture: 24 ± 0,5 ° C
la pression osmotique du milieu de culture: 257 mOsm
- Culture dans les conditions suivantes:
- Parasites medaka sur Artemia salina nauplii à 10h00 (une fois par jour) et de nourrir un régime alimentaire de poisson sec artificielle à 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 et 17:00 (cinq fois par jour).
- Obtenir A. nauplii salina. <li> Préparation 5 L d'une solution saline à 3,0% dans un bêcher de plastique.
- Ajouter 30 g d'oeufs d'artémias à la solution de sel dans le récipient.
- Incuber les oeufs à 25 ° C pendant 48 heures avec barbotage (4 L / min -1) à l' aide d' une pompe d'aération.
- Après 48 h, arrêter le bouillonnement.
- Laisser reposer la solution pendant 5 à 10 min pour séparer le A. hachurée salina nauplii (partie inférieure de la solution) à partir des œufs non éclos et des œufs (partie supérieure de la solution).
- Enlever la couche supérieure de la solution par décantation.
- Filtrez la partie inférieure de la solution à travers un tamis avec des ouvertures de 283 um, et de recueillir les nauplii qui passent à travers sur un filet avec des ouvertures de 198 um.
- Nourrir le nauplii aux medaka dans les 6 heures.
4. Essais de toxicité du SNC ou AgNO 3
- Rincer les œufs de medaka (étape 21) trois fois avec une solution de test [de SNC (10 mg / L -1) ou AgNO 3 (15,7 mg / L -1 10 mg / L -1 argent) à chaque concentration du MCE (1x, 5x , 10x, 15x, 20x ou 30x) à pH 7]. En tant que témoins, utiliser des oeufs à 1 × 30 × ERM à pH 7.
- Ajouter 15 œufs rincés à 5 ml de chaque solution d'essai dans six puits des plaques en plastique. (Effectuez les expériences d'exposition trois fois pour SNC ou de test AgNO 3 toxicité en utilisant chaque solution d'essai.)
- Envelopper les plaques dans du papier d'aluminium.
- Incuber les plaques enroulées à 25 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'éclosion ou pendant 14 jours.
- Observer les oeufs exposés toutes les 24 h pour les changements biologiques et les oeufs morts (figures 1 et 2).
- Echanger les solutions d'essai toutes les 24 heures.
- Effectuer des observations de la manière suivante.
- Le jour 6 de l'exposition, on compte le rythme cardiaque (par 15 sec) oembryons f de medaka sous un microscope à dissection en utilisant un chronomètre (Figure 3a).
- Au jour 6 de l' exposition, de mesurer la taille des yeux (diamètre) d'embryons de medaka sous un microscope à dissection à l'aide d' un micromètre (figure 3b).
- Le jour d' incubation, mesurer les longueurs du corps entier de larves sous un microscope à dissection en utilisant un micromètre (Figure 3c).
- Comptez le nombre total d'œufs qui éclosent exposés au cours des 14 jours (Figure 3d).
5. Isolation de Silver Soluble de SNC Solution, et analyse Argent
- Isolât d'argent soluble à partir de chaque solution SNC (un mélange de colloïdes d'argent et d'argent soluble) par filtration à travers un filtre à membrane 3 kDa à 14.000 x g et 4 ° C pendant 10 min. Utilisez un filtre 3 kDa de la membrane pour isoler l' argent soluble du SNCS, parce que le diamètre moyen rapporté de SNC agrégées 1x ERM est de 67,8 nm 11 and celle de Ag + est de 0,162 nm 12; la membrane 3 kDa ne comprend pas de particules ayant des diamètres de 2 nm ou plus 13.
- Mesurer la concentration d'argent dans 50 pi de solution filtrée (= la concentration d'argent soluble) par ICP-MS analyse (Figure 3e) selon le manuel d' exploitation ICP-MS 8. Le procédé de prétraitement pour l'ICP-MS analyses est décrit à l'article 7.
6. Mesure de Silver Bioaccumulation dans Medaka Embryons
- Exposer les œufs de medaka (étape 21) à SNC ou AgNO 3 comme décrit dans la section 4.
- Au jour 6 de l' exposition, enlever chorion de l'œuf ( par exemple, dechorion) à l'aide d'une enzyme médaka d' incubation suivant le protocole décrit dans le livre médaka 14.
- Mesurer la concentration en argent des oeufs dechorioned par analyse ICP-MS selon l'ICP-MS manuel de fonctionnement 8 (Figure 3f). le prétraitementméthode pour le ICP-MS analyses est décrit à l'article 7.
7. Mesure de la concentration d'argent par ICP-MS Analysis
- Ajouter des échantillons [50 ul de solution d'argent (pour la validation de la concentration en argent, section 1); trois embryons dechorionated (section 5); ou 50 pi de solution filtrée (section 5)] à un Teflon bêcher de 50 ml.
- Ajouter 2,0 ml de ultrapure acide nitrique à l'bêcher de 50 ml.
- Chauffer le mélange sur une plaque chaude à 110 ° C jusqu'à ce que juste avant qu'il ne se dessèche (environ 3 heures).
- Pour dissoudre la matière organique complètement, ajouter 2,0 ml de ultrapure acide nitrique et 0,5 ml de peroxyde d'hydrogène dans le bécher.
- Chauffer le mélange à nouveau sur la plaque chaude jusqu'à ce que juste avant qu'elle ne sèche (environ 3 heures).
- On dissout le résidu dans 4 ml d'une solution ultra-pure d'acide nitrique à 1,0%.
- Transférer 4 ml d'une solution dans un tube de centrifugeuse.
- Répéter 07/06 au 07/07 à deux reprises (un total de trois fois). Le volume final est de 12,0ml.
- Mesurer la concentration d'argent de l'échantillon (dissous dans 1,0% ultrapure acide nitrique) en utilisant l' analyse ICP-MS selon le manuel d'exploitation 8.
- Utiliser une interne et une solution de référence externe (Voir liste des matières) pour quantifier la concentration d'argent. La solution étalon interne et externe est accrédité par l'American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Les limites de détection de l' argent étaient 0,0018 ng / ml -1 (solution) et 0,016 ng mg poids -1 (corps de l' embryon).
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Representative Results
L'effet de la salinité sur la toxicité SNC était très évident: l'induction de la déformation ou la mort était dépendant de la salinité (figures 1 et 2). Nous avons mesuré les biomarqueurs phénotypiques (fréquence cardiaque, la taille des yeux, pleine longueur du corps, et de taux d' éclosion) dans SNC (10 mg / L -1) embryons -exposed. Ces marqueurs phénotypiques ont révélé la salinité dépendant SNC toxicité.
Les rythmes cardiaques allaient de 29,6 à 32,2 battements / 15 sec tout au long de 1x à 30x ERM dans les contrôles. Cependant, ils ont diminué de manière significative (P <0,01) avec SNC ou AgNO 3 exposition 30x ERM (Figure 3a). La diminution de la fréquence cardiaque indique la détérioration de la santé. Il n'y avait pas de différences significatives dans toute la longueur du corps des larves sous contrôle ou AgNO 3 exposition à des salinités allant de 5x à 30x ERM par rapport à la respective 1x ERM solutions. La longueur du corps était toujours à 4,69 mm 4,55. Cependant, la longueur du corps a diminué de manière significative (P <0,01) à 4,33 et 3,77 mm, à la suite d' une exposition à SNC 15x et 20x ERM par rapport aux solutions 1x ERM respectives; en outre, il a diminué à 3,75 mm en 30x ERM (analyse statistique n'a pas été disponible à 30x ERM , car un seul hachurée) (Figure 3c). La diminution de pleine longueur du corps indique l'inhibition de la croissance. Il n'y avait pas de différences significatives de diamètre de l'oeil dans les contrôles aux salinités allant de 1x à 30x ERM par rapport 1x ERM; diamètre de l'œil a été constamment 0,357 à 0,366 mm. Toutefois, il a diminué de manière significative sur SNC ou AgNO 3 exposition en 20x ou 30x ERM par rapport aux solutions 1x ERM respectives (Figure 3b). La diminution de diamètre de l'œil indique l'inhibition du développement du système nerveux. Tous les oeufs témoins ont éclos dans les 14 jours. Cependant, lors de l'exposition SNC en 20x et 30x ERM le taux d' éclosion a diminué de manière significative à 71% et 2%, respectivement, du taux de 1x ERM (P <0,01) (Figure 3d). En outre, sur AgNO 3 exposition , il a diminué de manière significative dans 30x ERM (P <0,01). La diminution du taux d' éclosion indique l'effet toxique de la présence de SNC ou AgNO 3. Ces quatre marqueurs phénotypiques montrent donc la toxicité dépendant de la salinité de SNC.
Salinité augmente la formation d' un complexe métallique soluble dans l'eau, et ces complexes peut avoir des effets toxiques 3,8. Dans notre étude, ICP-MS analyse d'argent a révélé que les concentrations d'argent solubles dans les solutions d'essai ont augmenté comme la salinité a augmenté; la concentration d'argent dans les embryons ont également augmenté (figures 3e, 3f).
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Figure 1: L' augmentation de la salinité augmente la toxicité SNC. La mortalité et le nombre d'embryons anormalement développés ont augmenté avec l' augmentation de la salinité dans l' exposition SNC. (A) tableau d'image des œufs de medaka exposés à 10 mg / L -1 solution SNC à différentes concentrations de GRE. Les images sont typiques des œufs de medaka exposés à SNC et observées sous un microscope à dissection. œufs de medaka de contrôle ont été bien développés, et tous éclos 1x à 30x ERM. À 10 mg / L -1 exposition SNC, bien que tous les oeufs de medaka éclos 1x à 15x ERM, des malformations du développement (rouge décrit rectangles, unhatched) et d' embryons non éclos dans les 14 jours (vert décrit rectangles, unhatched) ont été observés à 20x et ERM 30x. (b) Magnified images de la partie inférieure droite de (a). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Biomarqueurs phénotypiques typiques des œufs de medaka exposés à SNC oeufs Medaka au stade de développement 21 ont été exposés à SNC (10 mg / L -1) dans des concentrations différentes de la GRE pour 6 jours (a) embryon de medaka de contrôle avec le développement normal.. (b) déformation du développement (degré lumière de dégâts). Cet embryon affiché oedème pericardiovascular; coeur tubulaire; caillots sanguins; développement insuffisant des vaisseaux sanguins (et donc de l'ischémie), la moelle épinière, de la queue, des yeux et du cerveau; et une queue courte. (c) déformation du développement (degré lourd de dommages). Cet embryon a montré la destruction du sac de jaune; développement insuffisant des vaisseaux sanguins (et donc de l'ischémie), la moelle épinière, de la queue, des yeux et du cerveau; et une queue courte. Les signes (b) et (c) ont été observées lors de l'exposition SNC en 20x et 30x ERM. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Effets de l' exposition à la SNC ou du nitrate d'argent sur les biomarqueurs toxicologiques au cours du développement medaka oeuf développement stade 21 oeufs de medaka exposés à SNC (10 mg / L -1) ou du nitrate d' argent (10 mg / L -1 comme l' argent) dans un. série de modules ERM ont été observés pendant 6 jours. [Bleu] Contrôle (ERM); [rouge] à SNC 10 mg / L -1 au MCE; [vert] AgNO 3 à 10 mg / L -1 comme l' argent au MCE. (a) La fréquence cardiaque par 15 sec. La diminution de la fréquence cardiaque indique la détérioration de la santé. Diamètre (b) des yeux. La diminution de diamètre de l' œil indique l' inhibition du développement du système nerveux. (C) de la longueur du corps complet. defroissement pleine longueur du corps indique l' inhibition de la croissance. (d) Taux d' éclosion. La diminution du taux d' éclosion indique l'effet toxique de la présence de SNC. (E) Les concentrations de complexes d'argent solubles de SNC ou du nitrate d'argent dans des solutions d'essai (mg / L -1). (F) des concentrations d'argent dans les embryons exposés à SNC ou du nitrate d'argent dans une série de modules ERM. * Différence significative (analyse de variance, p <0,05) par rapport à la solution 1x ERM respective. NA: non disponible car un seul éclos. Les barres d'erreur indiquent l' écart type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Medaka est un poisson d'eau douce qui est très tolérant à l'eau de mer; il est pas bien connu que l'habitat naturel d' origine de ce poisson était d' eau salée au large de la côte japonaise 6. Par conséquent, les poissons de medaka ont bien développé des cellules de chlorure 7. Cette propriété unique offre aux scientifiques une nouvelle façon de tester la toxicité des produits chimiques dans l'environnement en fonction de la salinité (eau douce à l'eau de mer) en utilisant uniquement une seule espèce de poisson.
Pour obtenir des œufs de médaka au stade 21, les œufs doivent être récoltés chaque matin et sélectionnés à l'étape 20. Habituellement, les paires de medaka commencent accouplement tôt le matin (juste avant le lever du soleil) et produire des oeufs au lever du soleil. Les œufs récoltés le matin doivent être à peu près étape 10 ou 11. S'il est nécessaire de contrôler le développement des œufs avant le début de l'expérience, le développement des œufs peut être ralentie en utilisant des températures de 15 à 20 ° C avant l'étape 21 est atteinte. Mesurer la concentration en argent (arg solubleer) dans les solutions de test et d'embryons dechorionated était important de notre enquête sur la dépendance de la salinité de la toxicité SNC. Incubation de l'enzyme est la meilleure enzyme biologiquement appropriée pour éliminer le chorion, parce que sa spécificité élevée signifie qu'il n'a pas protéinase nuisible. D'autres protéases ne sont pas recommandés. Jusqu'à présent, l'enzyme n'éclosion disponible que pour medaka; c'est une limitation de cette méthode.
L'effet évident de la salinité sur les résultats des tests de toxicité chimique a démontré que la simulation de ces propriétés aquatiques naturelles de façon aussi réaliste que possible, comme dans nos expériences, a été utile pour étudier la toxicité des produits chimiques dans l'environnement. La découverte que SNC toxicité due à des concentrations élevées d'argent a été augmenté par la salinité est très applicable à l'écotoxicologie de produits chimiques polluants dans tous les milieux aquatiques. Dans le cas des essais de toxicité chimique générale en eau de mer, il n'y a pas encore de modèle de poisson Bien proposéed par des organisations internationales autorisées (par exemple, l'OCDE et Organisation internationale de normalisation). Parmi les poissons d'eau douce (par exemple, le médaka, le poisson zèbre, la carpe, la truite arc et Vairon à grosse tête) qui ont été utilisés pour les tests de toxicité chimique, seul le medaka a tous les avantages de la salinité adaptation, l' éclosion disponibilité de l' enzyme, une fécondité élevée, et un taille suffisamment petite pour une utilisation facile dans des expériences de laboratoire. En outre, medaka peuvent être adaptés à une large plage de température (2-38 ° C) 6. Dans les milieux aquatiques, de la salinité et de la température sont des influences environnementales les plus importantes sur le sort des produits chimiques; notre méthode devrait donc être modifiable pour une gamme de recherche sur l'environnement aquatique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
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- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
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