Abstract
Salinitet er en viktig egenskap ved det vannmiljøet. For vannlevende organismer definerer det habitater av ferskvann, brakkvann og sjøvann. Tester av giftigheten av kjemikalier og vurdering av deres økologiske risiko for vannorganismer blir ofte utført i ferskvann, men giftigheten av kjemikalier for vannorganismer avhenger av pH, temperatur og saltholdighet. Det er ingen metode, men for testing av saltinnhold avhengighet av toksisitet overfor vannorganismer. Her har vi brukt medaka (Oryzias latipes) fordi de kan tilpasse seg ferskvann, brakkvann og sjøvann. Ulike konsentrasjoner av embryo oppdragelse medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x og 30x) ble benyttet for å teste giftigheten av sølv nanocolloidal partikler (SNCS) til medakaegg (1x ERM og 30x ERM ha tilsvarende osmotiske trykk til ferskvann og sjøvann, henholdsvis). I seks-brønns plast plater, ble 15 medakaegg i tre eksemplarer utsatt for SNCS på 10 mg / l &# 8722, en i forskjellige konsentrasjoner av erm ved pH 7 og 25 ° C i mørket.
Vi brukte en dissekere mikroskop og et mikrometer for å måle hjertefrekvensen per 15 sek og øye diameter på dag 6 og full kroppslengde på larvene på klekking dag (§ 4). Embryoene ble observert før klekking eller dag 14; vi deretter telles klekke sats hver dag i 14 dager (§ 4). For å se sølv opphopning i embryoer, brukte vi induktivt koplet plasma massespektrometri å måle sølv konsentrasjonen av testløsninger (kapittel 5) og dechorionated embryoer (seksjon 6) sikret toksisitet av SNCS til medakafostre åpenbart økte med økende saltholdighet. Denne nye fremgangsmåten gjør det mulig for oss å teste giftigheten av kjemikalier i forskjellige saliniteter.
Introduction
Siden etableringen av Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) test retningslinjer for testing av kjemikalier i 1979, har 38 test retningslinjer publisert i punkt 2 i retningslinjene, virkninger på Biotiske 1 Systems. Alle de vannlevende organismer som ble testet har vært fra ferskvann, nemlig ferskvann planter; alger; virvelløse dyr som dafnier og fjærmygg; og fisker som medaka, sebrafisk, og regnbueørret. Sammenlignet med saltvann miljøer, er ferskvannsmiljøer mer direkte berørt av menneskelige økonomiske og industrielle aktiviteter. Derfor har ferskvannsmiljøer vært prioritert for testing, fordi de har høyere risiko for forurensning.
I kystnære områder, inkludert elvemunninger, saltholdighet varierer mellom brakkvanns og sjøvanns forhold, og disse områdene er ofte forurenset av industriell aktivitet 2. Kystnære områder og deres tilknyttede våtmarker er preget av high økologisk mangfold og produktivitet. Kystnære økosystemer må derfor beskyttes mot kjemisk forurensning. Men det har vært begrenset økotoksikologisk forskning i brakkvann og sjøvann habitater.
Sakaizumi tre studerte de toksiske interaksjoner mellom metylkvikksølv og saltholdighet i japanske medakaegg og fant at ved å øke det osmotiske trykk av prøveløsningen forsterket toksisitet av metylkvikksølv. . Sumitani et al fire brukes medakaegg å undersøke giftigheten av deponi sigevann; de fant at osmotisk verdigheten av sigevann til eggene var nøkkelen til å indusere forstyrrelser under embryogenese. I tillegg Kashiwada 5 rapportert at plastnanopartikler (39,4 nm i diameter) lett gjennomsyret gjennom medaka egg chorion henhold brakkvann (15x embryo oppdragelse medium (ERM)).
En typisk liten fisk modell, den japanske medaka (Oryzias latipes 6. Japansk medaka kan leve under forhold som strekker seg fra ferskvann til sjøvann på grunn av deres høyt utviklede klorid celler 7. De er derfor sannsynlig å være nyttig for å teste i forhold med et bredt spekter av saltholdighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De japanske medaka brukt i denne studien ble behandlet humant i samsvar med de institusjonelle retningslinjer fra Toyo University, med hensyn til å lindre nød og ubehag.
1. Silver Nanocolloids (SNCS)
- Kjøpe rensede SNCS (20 mg / l -1, 99,99% renhet, partikkel midlere diameter på 28,4 ± 8,5 nm suspenderes i destillert vann).
- Validere renheten og konsentrasjonen av sølv ved induktivt koplet plasma massespektrometri (ICP-MS) analyser i henhold til bruksanvisningen 8. Forbehandlingen metode for ICP-MS analyser er beskrevet i kapittel 7.
2. Utarbeidelse av SNC Solutions (blandinger av Silver Colloids og Ag +) med ulike salinitet
- Forbered 60 × ERM bestående av 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl 2 · 2H 2 O, og 9,78 g MgSO4 · 7H 2 O i en L av ultrapure vann; justere pH til 7,0 med 1,25% NaHCO3 i ultrarent vann.
- Rør ERM løsning ved 25 ° C over natten.
- Bland SNCS med utvannet ERM. Forbered 40 ml av hver SNC-ERM blandet løsning. Sluttkonsentrasjonen er 10 mg / l -1 av SNCS i forskjellige konsentrasjoner av erm (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x).
- Juster pH-verdien i SNC-erm blandet oppløsning til 7,0 med 0,625% NaHCO3 i ultrarent vann. pH-justering er meget viktig ved fremstilling av SNC løsning, fordi Ag + frigivelse lettes ved sure betingelser 9.
- Bruk Agno 3 som en referanseforbindelse for SNCS.
- Bland Agno 3 med fortynnet ERM. Fremstille 40 ml AGNO 3 -ERM blandet oppløsning ved en AGNO 3 konsentrasjon på 15,7 mg / L-1 (10 mg / L -1 sølv) i forskjellige konsentrasjoner av erm (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x) .
Merk: For å undersøke sølv kolloid giftighet, Agno 3oppløsning, som er en kilde til løselig sølv, blir brukt som en referanseforbindelse for SNCS, som er en blanding av sølv kolloider og oppløselig sølv.
- Bland Agno 3 med fortynnet ERM. Fremstille 40 ml AGNO 3 -ERM blandet oppløsning ved en AGNO 3 konsentrasjon på 15,7 mg / L-1 (10 mg / L -1 sølv) i forskjellige konsentrasjoner av erm (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x) .
3. Medaka Kultur og Egg Innhøsting
- Skaff medaka (O. latipes) (orange-rød stamme) (60 hanner og 60 hunner).
- Kultur medaka som grupper (20 hanner og 20 hunner som en gruppe) i 1x ERM i 3 L tanker ved hjelp av en medaka gjennomstrømnings dyrking system.
- Kultur på følgende vilkår:
pH-området av kulturmediet: 6.2 til 6.5
lys: mørke syklus: 16: 8 timers
Temperaturen i kulturmedium: 24 ± 0,5 ° C
osmotiske trykk av kulturmediet: 257 mOsm
- Kultur på følgende vilkår:
- Mate medaka på Artemia salina nauplier kl 10:00 (en gang daglig) og mate en kunstig tørr fisk diett kl 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 og 17:00 (fem ganger om dagen).
- Skaff A. salina nauplier. <li> Forbered 5 l av en 3,0% saltoppløsning i et plastbeger.
- Tilsett 30 g av artemia egg til saltoppløsningen i begerglasset.
- Inkuber egg ved 25 ° C i 48 timer med boblende (4 l / min-1) ved hjelp av en luftepumpe.
- Etter 48 timer stoppe bobler.
- La løsningen stå i 5 til 10 minutter for å separere den skraverte A. salina nauplii (nedre del av løsningen) fra unhatched egg og eggeskall (øvre del av løsningen).
- Fjerne det øvre lag av løsningen ved dekantering.
- Filtrer den nedre del av oppløsningen gjennom en sikt med åpninger på 283 um, og samle nauplii som passerer gjennom på et nett med åpninger på 198 um.
- Mate nauplier til medaka innen seks timer.
4. Toxicity Testing av SNCS eller Agno 3
- Skyll medakaegg (trinn 21) tre ganger med prøveoppløsning [SNCS (10 mg / l -1) eller AGNO 3 (15,7 mg / l -1 som 10 mg / l -1 sølv) ved hver konsentrasjon av erm (1x, 5x , 10x, 15x, 20x eller 30x) ved pH 7]. Som kontroller bruke egg i 1 × 30 × ERM ved pH 7.
- Legg 15 skylt egg til 5 ml av hver testløsning i seks-brønns plast plater. (Utfør eksponeringsforsøk tre ganger for SNC eller Agno 3 toksisitet testing med hver test løsning.)
- Pakk platene i aluminiumsfolie.
- Inkuber innpakket platene ved 25 ° C i mørke før klekking eller i 14 dager.
- Observer utsatte egg hver 24 time for biologiske endringer og døde egg (figur 1 og 2).
- Bytt testløsningene hver 24 time.
- Utfør observasjoner som følger.
- På dag 6 av eksponering, telle hjertefrekvensen (per 15 sek) of medakafostre under ett dissekere mikroskop ved hjelp av en stoppeklokke (figur 3a).
- På dag 6 av eksponering, måle størrelsen øyet (diameter) av medakafostre under et disseksjonsmikroskop ved hjelp av en mikrometer (figur 3b).
- På klekking dag, måle full kroppslengder larver i henhold til en dissekere mikroskop ved hjelp av en mikrometer (figur 3c).
- Telle det totale antall eksponerte egg som klekker i løpet av de 14 dagene (Figur 3d).
5. Isolering av Løselig Silver fra SNC Solution, og Silver analyse
- Isolere oppløselig sølv fra hver SNC oppløsning (en blanding av sølv kolloider og oppløselig sølv) ved filtrering gjennom et 3 kDa membranfilter ved 14.000 x g og 4 ° C i 10 min. Bruk en 3 kDa membranfilter for å isolere løselig sølv fra SNCS, fordi den rapporterte gjennomsnittlig diameter på aggregerte SNCS i 1x ERM er 67,8 nm 11 and at av Ag + er 0,162 nm 12; 3 kDa membran utelukker partikler med diameter på 2 nm eller mer 13.
- Mål sølv-konsentrasjonen i 50 ul filtrert oppløsning (= det oppløselige sølvkonsentrasjon) av ICP-MS-analyse (figur 3e) i henhold til ICP-MS bruksanvisningen 8. Forbehandlingen metode for ICP-MS analyser er beskrevet i kapittel 7.
6. Måling av Silver bioakkumulere i medakafostre
- Expose medakaegg (scene 21) til SNCS eller Agno 3 som beskrevet i kapittel 4.
- På dag 6 av eksponering, fjerne korion fra egg (dvs. dechorion) ved hjelp av medaka klekkeenzym i henhold til protokollen som er beskrevet i den medaka Book 14.
- Mål sølv konsentrasjonen av de dechorioned egg ved ICP-MS-analyse i henhold til ICP-MS bruksanvisning 8 (figur 3f). forbehandlingenmetode for ICP-MS analyser er beskrevet i kapittel 7.
7. Måling av sølv Konsentrasjon av ICP-MS-analyse
- Legg prøver [50 ul sølv løsning (for validering av sølv konsentrasjon, seksjon 1); tre dechorionated embryoer (§ 5); eller 50 ul filtrert oppløsning (seksjon 5)] til et 50 ml begerglass Teflon.
- Tilsett 2,0 ml ultrarent salpetersyre til 50 ml begerglass.
- Varm opp blandingen på en varm plate ved 110 ° C til like før det tørker ut (ca. 3 timer).
- For å oppløse organisk stoff fullstendig, tilsett 2,0 ml ultrarent salpetersyre og 0,5 ml hydrogenperoksid til begerglasset.
- Varm opp blandingen igjen på den varme platen før like før det tørker ut (ca. 3 timer).
- Oppløs residuet i 4 ml 1,0% ultrarent salpetersyreoppløsning.
- Overføring 4 ml oppløsning til et sentrifugerør.
- Gjenta 7,6 til 7,7 ganger (totalt tre ganger). Det endelige volum er 12,0ml.
- Mål sølv-konsentrasjonen av prøven (oppløst i 1,0% ultrarent salpetersyre) ved hjelp av ICP-MS-analyse i henhold til bruksanvisningen 8.
- Bruk en intern og en ekstern standardløsning (Se Materials List) for å kvantifisere sølv konsentrasjon. Den interne og eksterne standardløsning er akkreditert av American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Deteksjonsgrenser sølv var 0,0018 ng / ml -1 (oppløsning) og 0,016 ng mg vekt -1 (embryo kroppen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningen av saltinnhold på SNC toksisitet var meget åpenbare: induksjon av misdannelse eller død ble saltholdighet uselvstendige (figur 1 og 2). Vi målte fenotypiske biomarkører (hjertefrekvens, øye størrelse, full kroppslengde, og klekking rate) i SNC (10 mg / L -1) -exposed embryoer. Disse fenotypiske biomarkører avslørte saltholdighet avhengig SNC toksisitet.
Hjerterytme varierte fra 29,6 til 32,2 slag / 15 sek hele 1x til 30x ERM i kontrollene. Men redusert de signifikant (p <0,01) med SNC eller Agno 3 eksponering i 30x ERM (figur 3a). Avtagende puls indikerer sviktende helse. Det var ingen signifikante forskjeller i full kroppslengde på larvene under kontroll eller Agno 3 eksponering ved saltholdighet varierer fra 5x til 30x ERM sammenlignet med de respektive 1x ERM s-vedtak. Kroppslengde var konsekvent 4,55 til 4,69 mm. Imidlertid, redusert kroppslengde signifikant (P <0,01) i 4,33 og 3,77 mm, som et resultat av eksponering i SNC 15x og 20x ERMen sammenlignet med de respektive 1x ERM løsninger; dessuten redusert det til 3,75 mm i 30x ERM (statistisk analyse var ikke tilgjengelig på 30x ERM fordi bare ett klekket) (figur 3c). Avtagende full kroppslengde indikerer veksthemming. Det var ingen signifikante forskjeller i øyet diameter i kontrollene på saltholdighet varierer fra 1x til 30x ERM sammenlignet med 1x ERM; øye diameter var konsekvent 0,357 til 0,366 mm. Men det sunket betraktelig på SNC eller Agno 3 eksponering i 20x eller 30x ERM sammenlignet med i de respektive 1x ERM løsninger (figur 3b). Avtagende diameter øye tyder på utviklingshemming av nervesystemet. Alle kontroll eggene klekket i løpet av 14 dager. Men ved SNC eksponering i 20x og 30x ERM klekke sank betydelig til 71% og 2%, henholdsvis av satsen i 1x ERM (P <0,01) (Figur 3d). Også, ved Agno 3 eksponeringen redusert det betraktelig i 30x ERM (P <0,01). Avtagende klekking hastighet indikerer toksisk effekt av tilstedeværelsen av SNCS eller Agno 3. Disse fire fenotypiske biomarkører viser derfor saltholdighet avhengig SNC toksisitet.
Saltholdighet øker vannoppløselige metallkompleksdannelse, og disse kompleksene kan ha toksiske virkninger 3,8. I vår studie ICP-MS-analyser av sølv viste at de løselige sølv konsentrasjonene i testløsningene økes som saliniteten øker; sølvkonsentrasjonen i embryoer også økes (fig 3e, 3f).
"/>
Figur 1: Økende saltholdighet øker SNC toksisitet. Dødelighet og antall unormalt utviklet embryoer økte med økende saltinnhold i henhold SNC eksponering. (A) Bilde rekke medakaegg eksponert for 10 mg / l -1 SNC oppløsning ved forskjellige konsentrasjoner ERM. Bildene er typisk for medakaegg utsatt for SNCS og observert under et disseksjonsmikroskop. Kontroll medakaegg var godt utviklet, og alle av dem klekket i 1x til 30x ERM. Ved 10 mg / L -1 SNC eksponering, selv om alle de medakaegg klekket i 1x til 15x ERM, utviklings misdannelser (rød skissert rektangler, unhatched) og embryoer unhatched innen 14 dager (grønn skissert rektangler, unhatched) ble observert ved 20x og 30x ERM. (b) Forstørret bilde av nederst til høyre (a). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Typiske fenotypiske biomarkører for medakaegg eksponert for SNCS medakaegg på utviklingsstadiet 21 ble utsatt for SNCS (10 mg / l -1) i forskjellige konsentrasjoner av erm i 6 dager (a) Kontroll medaka embryo med normal utvikling.. (b) Utviklingsmessig misdannelse (lys graden av skade). Dette embryo vises pericardiovascular ødem; rørformet hjerte; blodpropp; utilstrekkelig utvikling av blodkar (og således iskemi), ryggmarg, hale, øyne, og hjerne; og en kort hale. (c) Utviklingsmessig misdannelse (tung graden av skade). Dette embryo viste ødeleggelse av plommesekken; utilstrekkelig utvikling av blodkar (og således iskemi), ryggmarg, hale, øyne, og hjerne; og en kort hale. Tegnene i (b) og (c) ble observert på SNC eksponering i 20x og 30x ERM. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Effekter av eksponering for SNCS eller sølvnitrat om toksikologiske biomarkører i løpet medaka egg utvikling utviklingsstadiet 21 medakaegg utsatt for SNCS (10 mg / L -1) eller sølvnitrat (10 mg / L -1 som sølv) i en. serie erms ble observert i 6 dager. [Blue] Control (ERM); [red] SNCS på 10 mg / L -1 i ERM; [green] Agno 3 ved 10 mg / L -1 som sølv i ERM. (a) Hjertefrekvens per 15 sek. Avtagende puls indikerer sviktende helse. (B) Eye diameter. Avtagende diameter øye tyder på utviklingshemming av nervesystemet. (C) Full kroppslengde. debretter full kroppslengde indikerer veksthemming. (d) Klekking rate. Avtagende klekking frekvens indikerer den toksiske virkning av nærværet av SNCS. (E) Konsentrasjonen av oppløselige sølvkomplekser fra SNCS eller sølvnitrat i testløsningene (mg / l -1). (F) Sølv konsentrasjoner i embryoer som er utsatt for SNCS eller sølvnitrat i en serie av Erms. * Betydelig forskjell (analyse av varians, P <0,05) sammenlignet med den respektive 1x erm løsning. NA: ikke tilgjengelig fordi bare ett klekket. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medaka er en ferskvannsfisk som er svært tolerant til sjøvann; Det er ikke kjent at den opprinnelige naturlige habitat for denne fisken var saltvann utenfor den japanske kysten 6. Derfor Medaka fisk har velutviklede klorid celler 7. Denne unike eiendommen gir forskere med en ny måte å teste giftigheten av kjemikalier i miljøet som en funksjon av saltholdighet (ferskvann til sjøvann) ved hjelp av bare en enkelt art av fisk.
For å få medakaegg på scenen 21, må egg høstes hver morgen og valgte på scenen 20. Vanligvis begynner Medaka par parring i tidlig morgen (like før soloppgang) og produsere egg ved soloppgang. Egg høstet om morgenen må være omtrent planet 10 eller 11. Hvis det er behov for å styre egg utvikling før starten av forsøket, kan egg utvikling bli redusert ved å anvende temperaturer på 15 til 20 ° C før trinn 21 er nådd. Måling av sølv konsentrasjon (løselig sølere) i testløsninger og i dechorionated embryoer var viktig for vår undersøkelse av saltholdighet avhengighet av SNC toksisitet. Klekkeenzym er best biologisk egnet enzym for å fjerne chorion, fordi den høye spesifisitet betyr at det ikke har noen skadelig protease. Andre proteinaser er ikke anbefalt. Så langt er det bare klekking enzymet tilgjengelig som for medaka; Dette er en begrensning av metoden.
Den åpenbare virkning av saltholdighet på utfallet av de kjemiske toksisitetstester viste at simulerer slike naturlige vann egenskaper så realistisk som mulig, som i våre eksperimenter, var nyttig for å undersøke toksisiteten av kjemikalier i miljøet. Oppdagelsen av at SNC toksisitet på grunn av høye sølvkonsentrasjoner ble økt med saltinnhold er svært aktuelt å økotoksikologien av forurensende kjemikalier i alle vannområder. Når det gjelder generelle kjemiske toksisitetstesting i sjøvann, er det ennå ikke noe fisk modell nominated av autoriserte internasjonale organisasjoner (f.eks OECD og Internasjonal organisasjon for standardisasjon). Blant de ferskvannsfisk (f.eks medaka, sebrafisk, karpe, regnbueørret, og Hodet ørekyte) som har blitt brukt for kjemisk toksisitet testing, har bare medaka alle fordelene med saltholdighet tilpasning, klekking enzymet tilgjengelighet, høy fruktbarhet, og en størrelse tilstrekkelig liten for enkel bruk i laboratorieforsøk. Videre kan medaka tilpasses et bredt temperaturområde (2 til 38 ° C) 6. I vannmiljøer, saltholdighet og temperatur er de viktigste miljømessige påvirkninger på skjebnen av kjemikalier; vår metode bør derfor være modifiserbare for en rekke vann miljøforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
