Abstract
Salthalten är en viktig egenskap hos vattenmiljön. För vattenlevande organismer den definierar livsmiljöer för sötvatten, bräckt vatten och havsvatten. Tester av toxicitet av kemikalier och bedömningar av deras ekologiska risker för vattenlevande organismer ofta utförs i sötvatten, men toxicitet kemikalier för vattenlevande organismer beror på pH, temperatur och salthalt. Det finns ingen metod är emellertid för testning av salthalten beroende på toxicitet för vattenlevande organismer. Här har vi använt medaka (Oryzias latipes) eftersom de kan anpassa sig till sötvatten, bräckt vatten och havsvatten. Olika koncentrationer av embryo-uppfödning medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x och 30x) användes för att testa toxiciteten hos silver nanocolloidal partiklar (SNCs) att Medaka ägg (1x ERM och 30x ERM har osmotiska trycket motsvarande till sötvatten och havsvatten, respektive). I sex brunnar plastplattor, var 15 ägg medaka i tre exemplar utsättas för SNCs vid 10 mg / L &# 8722; 1 i olika koncentrationer av ERM vid pH 7 och 25 ° C i mörker.
Vi använde en dissekera mikroskop och en mikrometer för att mäta hjärtfrekvensen per 15 sekunder och ögon diameter på dag 6 och full kroppslängd av larverna på kläckning dag (avsnitt 4). Embryona observerades tills kläckning eller dag 14; vi sedan räknade kläckning ränta varje dag i 14 dagar (avsnitt 4). Att se silver ackumulering i embryon, använde vi induktivt kopplad plasma masspektrometri för att mäta silverkoncentrationen av testlösningar (avsnitt 5) och dechorionated embryon (avsnitt 6) .Det toxicitet SNCs till medaka embryon naturligtvis med ökande salthalt. Denna nya metod gör det möjligt för oss att testa toxiciteten hos kemikalier i olika salthalter.
Introduction
Sedan inrättandet av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) riktlinjer för test för att testa kemikalier i 1979, har 38 riktlinjer för test publicerats i avsnitt 2 i riktlinjerna, Effekter på Biotiska Systems 1. Alla de testade akvatiska organismerna har varit från sötvattensmiljöer, nämligen sötvatten växter; alger; ryggradslösa djur som Daphnia och fjädermyggor; och fiskar såsom medaka, zebrafisk och regnbåge. Jämfört med saltvatten miljöer är sötvattensmiljöer mer direkt påverkas av människans ekonomiska och industriella verksamhet. Därför har sötvattensmiljöer prioriterats för att testa, eftersom de löper större risk från föroreningar.
I kustområden, inklusive flodmynningar, salthalt varierar mellan bräckt vatten och havsvatten förhållanden, och dessa områden är ofta förorenat av industriell verksamhet 2. Kustområden och deras tillhörande våtmarker kännetecknas av hIGH ekologiska mångfalden och produktivitet. Kust ekosystem måste därför skyddas från kemisk förorening. Det har dock varit begränsad ekotoxikologiska forskning i bräckt vatten och havsvatten miljöer.
Sakaizumi tre studerade de toxiska interaktioner mellan metylkvicksilver och salthalt i japanska medaka ägg och fann att en ökning av det osmotiska trycket av testlösningen förbättrade toxiciteten hos metylkvicksilver. . Sumitani et al 4 använde medaka ägg för att undersöka toxicitet lakvatten; De fann att den osmotiska likvärdighet av lakvatten till äggen var nyckeln till att framkalla avvikelser under embryogenes. Dessutom Kashiwada 5 rapporterade att plastnanopartiklar (39,4 nm i diameter) genomsyrade lätt genom medaka ägg chorion i bräckt vatten (15x embryo uppfödning medium (ERM)).
En typisk småfisk modell, den japanska medaka (Oryzias latipes 6. Japanska medaka kan leva under förhållanden som sträcker sig från sötvatten till saltvatten på grund av deras högt utvecklade klorid celler 7. De är därför sannolikt att vara användbart för att testa under förhållanden med ett brett utbud av salthalter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De japanska medaka som används i denna studie behandlas humant i enlighet med de institutionella riktlinjer Toyouniversitetet, med hänsyn tagen till att lindra ångest och obehag.
1. Silver Nanocolloids (SNCs)
- Köpa renade SNCs (20 mg / L -1, 99,99% renhet, partikelmedeldiameter om 28,4 ± 8,5 nm suspenderad i destillerat vatten).
- Validera renheten och koncentrationen av silver genom induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICP-MS) analyser enligt bruksanvisningen 8. Förbehandlingsmetoden för ICP-MS-analyser beskrivs i avsnitt 7.
2. Framställning av SNC Solutions (Blandningar av Silver kolloider och Ag +) med olika salthalter
- Förbered 60 × ERM bestående av 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl2 · 2H 2 O, och 9,78 g MgSO 4 · 7 H2O i en liter ultrapure vatten; justera pH till 7,0 med 1,25% NaHCOs 3 i ultrarent vatten.
- Rör om ERM-lösning vid 25 ° C över natten.
- Blanda SNCs med utspätt ERM. Bered 40 ml av varje SNC-ERM blandade lösningen. Den slutliga koncentrationen är 10 mg / L -1 av SNCs i olika koncentrationer av ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x).
- Justera pH av SNC-ERM blandade lösningen till 7,0 med 0,625% NaHCO 3 i ultrarent vatten. pH-justering är mycket viktigt vid framställning av SNC-lösning, eftersom Ag + frisättning underlättas av sura betingelser 9.
- Använda AgNOs 3 som en referensförening för SNCs.
- Blanda AgNOs 3 med utspädd ERM. Förbered 40 ml AgNOs 3 -ERM blandade lösningen vid en AgNOs 3 koncentration av 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 silver) i olika koncentrationer av ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x) .
OBS: För att undersöka silver kolloid toxicitet, AgNOs 3lösning, som är en källa av lösligt silver, används som en referensförening för SNCs, som är en blandning av silver kolloider och lösligt silver.
- Blanda AgNOs 3 med utspädd ERM. Förbered 40 ml AgNOs 3 -ERM blandade lösningen vid en AgNOs 3 koncentration av 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 silver) i olika koncentrationer av ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x) .
3. Medaka kultur och ägg Skörd
- Erhålla medaka (O. latipes) (orange-röd-stam) (60 hanar och 60 honor).
- Kultur medaka som grupper (20 män och 20 kvinnor som en grupp) i 1x ERM i 3 L tankar med hjälp av en medaka genomströmnings odling systemet.
- Kultur på följande villkor:
pH-område av odlingsmediet: 6,2-6,5
ljus: mörker-cykel: 16: 8 tim
temperaturen på odlingsmediet: 24 ± 0,5 ° C
osmotiska trycket av odlingsmediet: 257 mOsm
- Kultur på följande villkor:
- Feed medaka på Artemia salina naupliuslarverna kl 10:00 (en gång dagligen) och mata en artificiell torr fisk kost vid 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 och 17:00 (fem gånger per dag).
- Erhålla A. salina nauplii. <li> Förbered 5 L av en 3,0% saltlösning i en plastbägare.
- Tillsätt 30 g av artemia ägg till saltlösningen i bägaren.
- Inkubera äggen vid 25 ° C under 48 h med bubblande (4 L / min -1) med användning av en luftningspump.
- Efter 48 timmar, stoppa bubblande.
- Låt lösningen stå under 5 till 10 min för att separera den kläckta A. salina nauplii (lägre del av lösningen) från okläckta ägg och äggskal (övre del av lösningen).
- Ta bort det övre skiktet av lösningen genom dekantering.
- Filtrera den nedre delen av lösningen genom en sikt med öppningar av 283 | j, m, och samla naupliuslarverna som passerar igenom på ett nät med öppningar av 198 um.
- Mata naupliuslarverna till de medaka inom 6 h.
4. kemikalieprövning av SNCs eller AgNOs 3
- Skölj medaka ägg (steg 21) tre gånger med provlösningen [SNCs (10 mg / L -1) eller AgNOs 3 (15,7 mg / L -1 som 10 mg / L -1 silver) vid varje koncentration av ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x eller 30x) vid pH 7]. Som kontroller använda ägg i 1 × till 30 × ERM vid pH 7.
- Tillsätt 15 sköljda ägg till 5 ml av varje testlösning i sex brunnar plastplattor. (Utför exponeringsexperiment tre gånger för SNC eller AgNOs 3 toxicitet kontroller genom varje testlösning.)
- Linda plattorna i aluminiumfolie.
- Inkubera inslagna plattorna vid 25 ° C i mörker tills kläckningen eller under 14 dagar.
- Följ de exponerade ägg varje 24 timmar för biologiska förändringar och döda ägg (figur 1 och 2).
- Utbyta testlösningarna varje 24 h.
- Utför observationer på följande sätt.
- På dag 6 av exponering, räkna hjärtfrekvens (per 15 sek) of medaka embryon under ett dissekera mikroskop med hjälp av ett stoppur (figur 3a).
- På dag 6 av exponering, mäta ögon storlek (diameter) av medaka embryon under ett dissektionsmikroskop med användning av en mikrometer (figur 3b).
- På kläckning dag, mäta hela kroppen längder larver under ett dissektionsmikroskop med hjälp av en mikrometer (Figur 3c).
- Räkna det totala antalet exponerade ägg som kläcks under de 14 dagarna (figur 3d).
5. Isolering av lösliga silver från SNC lösning, och Silver analys
- Isolera löslig silver från varje SNC-lösning (en blandning av silver kolloider och lösligt silver) genom filtrering genom ett 3 kDa membranfilter vid 14.000 x g och 4 ° C under 10 min. Använd en 3 kDa membranfilter för att isolera löslig silver från SNCs, eftersom den rapporterade medeldiameter av aggregerade SNCs i 1x ERM är 67,8 nm 11and det av Ag + är 0,162 nm 12; kDa membran 3 utesluter partiklar med en diameter av 2 nm eller mer 13.
- Mät silverkoncentrationen i 50 pl filtrerad lösning (= den lösliga silverkoncentrationen) med ICP-MS-analys (figur 3e) enligt ICP-MS bruksanvisningen 8. Förbehandlingsmetoden för ICP-MS-analyser beskrivs i avsnitt 7.
6. Mätning av Silver Bioackumulering i Medaka embryon
- Exponera medaka ägg (stadium 21) till SNCs eller AgNOs 3 som beskrivs i avsnitt 4.
- På dag 6 av exponering, ta bort chorion från ägget (dvs dechorion) med hjälp av medaka kläckning enzym enligt det protokoll som beskrivs i Medaka Book 14.
- Mät silver koncentrationen av dechorioned ägg med ICP-MS-analys enligt ICP-MS bruksanvisningen 8 (figur 3f). förbehandlingenmetod för ICP-MS-analyser beskrivs i avsnitt 7.
7. Mätning av Silver Koncentration av ICP-MS-analys
- Lägg prover [50 il silverlösning (för validering av silverkoncentrationen, avsnitt 1); tre dechorionated embryon (avsnitt 5); eller 50 pl filtrerad lösning (avsnitt 5)] till en 50 ml teflonbägare.
- Lägga 2,0 ml ultrarent salpetersyra till 50 ml bägare.
- Värm blandningen på en varm platta vid 110 ° C tills strax innan det torkar ut (ca 3 h).
- För att lösa upp det organiska materialet fullständigt, tillsätt 2,0 ml av ultrarent salpetersyra och 0,5 ml väteperoxid till bägaren.
- Värm blandningen igen på den varma plattan förrän strax innan det torkar ut (ca 3 h).
- Lös återstoden i 4 ml 1,0% ultrarent salpetersyralösning.
- Över 4 ml av lösningen till ett centrifugrör.
- Upprepa 7,6-7,7 gånger (totalt tre gånger). Den slutliga volymen är 12,0ml.
- Mät silverkoncentrationen i provet (löst i 1,0% ultrarent salpetersyra) med ICP-MS-analys enligt bruksanvisningen 8.
- Använd en intern och en extern standardlösning (se Material List) att kvantifiera silverkoncentrationen. De interna och externa standardlösningen är ackrediterat av American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Detektionsgränser för silver var 0,0018 ng / ml -1 (lösning) och 0,016 ng mg vikt -1 (embryo kroppen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av salthalt på SNC toxicitet var mycket uppenbar: induktion av deformitet eller död var salthalt osjälvständiga (fig 1 och 2). Vi mätte fenotypiska biomarkörer (hjärtfrekvens, ögon storlek, hela kroppen längd och kläckning ränta) i SNC (10 mg / L -1) -exposed embryon. Dessa fenotypiska biomarkörer avslöjade salthalt beroende SNC toxicitet.
Hjärtfrekvenser varierade från 29,6 till 32,2 slag / 15 sek under 1x till 30x ERM i kontrollerna. Minskade dock de avsevärt (P <0,01) med SNC eller AgNOs 3 exponering i 30x ERM (figur 3a). Minskande hjärtfrekvens indikerar försämrade hälsa. Det fanns inga signifikanta skillnader i hela kroppen längd larverna under kontroll eller AgNOs 3 exponering vid salthalter som sträcker sig från 5x till 30x ERM jämfört med motsvarande 1x ERM solutions. Kroppslängd var genomgående 4,55-4,69 mm. Minskade emellertid kroppslängd signifikant (P <0,01) till 4,33 och 3,77 mm, som ett resultat av SNC exponering i 15x och 20x ERM jämfört med respektive 1x ERM lösningar; Dessutom minskade det till 3,75 mm 30x ERM (statistisk analys var inte tillgänglig på 30x ERM eftersom endast en kläckts) (Figur 3c). Minskande hela kroppen längd indikerar tillväxthämning. Det fanns inga signifikanta skillnader i ögat diameter i kontrollerna vid salthalter som sträcker sig från 1x till 30x ERM jämfört med 1x ERM; ögondiameter var genomgående 0,357 till 0,366 mm. Minskade emellertid avsevärt på SNC eller AgNOs 3 exponering i 20x eller 30x ERM jämfört med i respektive 1x ERM lösningar (figur 3b). Minskande öga diameter indikerar utvecklings hämning av nervsystemet. Alla kontroll äggen kläckta inom 14 dagar. Men på SNC exponering i 20x och 30x ERM kläckningshastigheten minskade väsentligt till 71% och 2%, respektive, av hastigheten i 1x ERM (P <0,01) (figur 3d). Även på AgNOs 3 exponering minskade betydligt under 30x ERM (P <0,01). Minskande kläckning takt indikerar den toxiska effekten av närvaron av SNCs eller AgNOs 3. Dessa fyra fenotypiska biomarkörer visar därför salthalt beroende SNC toxicitet.
Salthalt ökar vattenlösliga metallkomplexbildningen, och dessa komplex kan ha toxiska effekter 3,8. I vår studie, ICP-MS-analyser av silver avslöjade att de lösliga silver koncentrationer i testlösningarna ökade salthalten ökas; silverkoncentrationen i embryon ökade (figurerna 3e, 3f).
"/>
Figur 1: Ökande salthalt ökar SNC toxicitet. Mortalitet och antalet onormalt utvecklade embryon ökade med ökande salthalt enligt SNC exponering. (A) Bild matris med ägg medaka exponerade för 10 mg / L -1 SNC lösning vid olika ERM koncentrationer. Bilder är typiska för ägg medaka exponerade för SNCs och observerades under ett dissektionsmikroskop. Kontroll medaka ägg var väl utvecklad, och alla av dem kläcktes i 1x till 30x ERM. Vid 10 mg / L -1 SNC exponering, även om alla de medaka äggen kläckts i 1x till 15x ERM, utvecklings missbildningar (röd beskrivs rektanglar, unhatched) och embryon okläckta inom 14 dagar (grön beskrivs rektanglar, unhatched) observerades vid 20x och 30x ERM. (b) förstorade bilder av nedre högra hörnet av (a). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Typiska fenotypiska biomarkörer för medaka ägg utsätts för SNCs Medaka ägg på utvecklingsstadiet 21 exponerades för SNCs (10 mg / L -1) i olika koncentrationer av ERM under 6 dagar (a) Kontroll medaka embryo med normal utveckling.. (b) Utvecklings missbildning (ljus graden av skada). Detta embryo visas pericardiovascular ödem; rörformig hjärta; blodproppar; otillräcklig utveckling av blodkärl (och därmed ischemi), ryggmärg, svans, ögon och hjärna; och en kort svans. (c) Utvecklings missbildning (tung graden av skada). Detta embryo visade förstörelse av äggulan säcken; otillräcklig utveckling av blodkärl (och därmed ischemi), ryggmärg, svans, ögon och hjärna; och en kort svans. Tecknen i (b) och (c) observerades vid SNC exponering i 20x och 30x ERM. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekter av exponering för SNCs eller silvernitrat på toxikologiska biomarkörer under medaka ägg utveckling utvecklingsstadium 21 medaka ägg utsätts för SNCs (10 mg / L -1) eller silvernitrat (10 mg / L -1 som silver) i en. serie ERMS observerades under 6 dagar. [Blå] Kontroll (ERM); [red] SNCs vid 10 mg / L -1 i ERM; [grönt] AgNOs 3 vid 10 mg / L -1 som silver i ERM. (a) Puls per 15 sek. Minskande hjärtfrekvens indikerar försämrad hälsa. (B) Ögon diameter. Minskande öga diameter indikerar utvecklings hämning av nervsystemet. (C) Hela kroppslängden. deskrynklas hela kroppen längd indikerar tillväxthämning. (d) Kläckning hastighet. Minskande kläckning takt indikerar den toxiska effekten av närvaron av SNCs. (E) Halterna av lösliga silverkomplex från SNCs eller silvernitrat i testlösningar (mg / L -1). (F) Silver koncentrationer i embryon utsatta för SNCs eller silvernitrat i en serie av ERMS. * Signifikant skillnad (variansanalys, P <0,05) jämfört med motsvarande 1x ERM lösning. NA: inte tillgänglig eftersom bara en kläckts. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medaka är en sötvattensfisk som är mycket tolerant mot havsvatten; Det är inte känt att den ursprungliga naturliga livsmiljö denna fisk var saltvatten utanför den japanska kusten 6. Därför har medaka fisk välutvecklade klorid celler 7. Denna unika egenskap ger forskare med ett nytt sätt att testa toxiciteten hos kemikalier i miljön som en funktion av salthalt (sötvatten för havsvatten) genom användning av en enda fiskart.
För att erhålla medaka ägg på scenen 21, skall äggen skördas varje morgon och valda vid steg 20. Vanligtvis börjar medaka par parning tidigt på morgonen (strax före soluppgången) och producerar ägg av soluppgången. Ägg som skördats på morgonen måste vara ca stadium 10 eller 11. Om det finns ett behov av att kontrollera ägg utveckling före starten av experimentet, kan ägg utveckling bromsas genom användning av temperaturer på 15 till 20 ° C före steget 21 nås. Mätning av silverkoncentrationen (löslig SILer) i testlösningarna och i dechorionated embryon var viktigt för vår undersökning av salthalten beroende av SNC toxicitet. Kläckning enzym är den bästa biologiskt lämpligt enzym för avlägsnande av chorion, därför att dess höga specificitet innebär att den inte har någon skadlig proteinas. Andra proteinaser rekommenderas inte. Hittills är den enda kläckning enzym finns det för medaka; detta är en begränsning av denna metod.
Den uppenbara effekten av salthalt på resultatet av de kemiska toxicitetstester visade att simulera sådana naturliga akvatiska egenskaper så realistiskt som möjligt, som i våra experiment var användbar för att undersöka toxicitet av kemikalier i miljön. Upptäckten att SNC toxicitet på grund av höga silverkoncentrationer ökades med salthalten är mycket tillämplig på ekotoxikologi av förorenande kemikalier i alla vattenområden. När det gäller allmän testning kemisk toxicitet i havsvatten, finns det ännu ingen fisk modell valberednied av auktoriserade internationella organisationer (t.ex. OECD och International Organization for Standardization). Bland de sötvattensfiskar (t.ex. medaka, zebrafisk, karp, regnbåge, och fathead elritza) som har använts för att testa kemisk toxicitet, har endast medaka alla fördelarna med salthalt anpassning kläckning enzym tillgänglighet, hög fruktsamhet, och en storlek tillräckligt liten för enkel användning i laboratorieexperiment. Vidare kan medaka anpassas till ett brett temperaturområde (2 till 38 ° C) 6. I vattenmiljöer, salthalt och temperatur är de viktigaste miljöpåverkan på ödet av kemikalier; vår metod bör därför vara modifierbara för en rad vatten miljöforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
