Abstract
塩分は水生環境の重要な特徴です。水生生物にとっては、淡水、汽水、海水の生息地を定義します。化学物質や水生生物への生態リスクの評価の毒性のテストは頻繁に淡水で実行されますが、水生生物への化学物質の毒性はpH、温度、および塩分濃度に依存します。何の方法は、水生生物への毒性の塩分濃度依存性を試験するために、しかし、ありません。彼らは淡水、汽水、海水に適応することができますので、ここでは、メダカ（ メダカ）を用いました 。胚飼育培地（ERM）の異なる濃度は、（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、および30倍）が卵をメダカする銀ナノコロイド粒子（SNCが）の毒性を試験するために使用した（1×ERMと30X ERMは、浸透圧相当を持っています）は、それぞれ、淡水と海水へ。 6ウェルプラスチックプレートでは、三連で15メダカの卵は、10mg / L＆でのSNCにさらされました＃8722;暗所でpH7のERMの異なる濃度で1〜25°C。
私たちは、日（セクション4）の孵化に6日目に15秒、眼の直径あたりの心拍数と幼虫のフルボディの長さを測定するために解剖顕微鏡やマイクロメーターを使用していました。胚を孵化または14日目まで観察されました。私たちは、その後、14日（第4章）のために毎日孵化率を数えました。胚における銀の蓄積を確認するために、我々は銀のテスト・ソリューション（第5節）の濃度とdechorionated胚（セクション6）明らかに増加塩分濃度とともに増加したメダカ胚へのSNCの選択図毒性を測定するために、誘導結合プラズマ質量分析法を使用していました。この新しい方法は、異なる塩分中の化学物質の毒性を試験することを可能にします。
Introduction
1979年の試験化学物質のための経済協力開発機構（OECD）の試験のガイドラインについては組織の設立以来、38テストガイドラインはガイドライン、生物的システム1への影響の第2節で公開されています。テストした水生生物のすべては、淡水の生息地、すなわち淡水植物からなっています。藻類;このようなミジンコやユスリカなど無脊椎動物。そして、このようなメダカ、ゼブラフィッシュ、およびニジマスなどの魚。塩水環境と比較して、淡水環境はより直接的に人間の経済・産業活動の影響を受けています。彼らは汚染からリスクが高いので、したがって、淡水環境は、テストのために優先順位付けされています。
河口などの沿岸地域では、塩分は汽水や海水条件の間で変動し、これらの領域は、多くの場合、産業活動2によって汚染されています。沿岸地域とそれに関連する湿地は、時間によって特徴付けられます生態系の生物多様性と生産性IGH。沿岸の生態系は、したがって、化学物質汚染から保護されなければなりません。しかし、汽水、海水の生息地での限られた環境毒性学の研究がなされてきました。
Sakaizumi 3は、日本のメダカの卵中のメチル水銀と塩分との間に毒性の相互作用を研究し、試験溶液の浸透圧を増加させることがメチル水銀の毒性を増強することを見出しました。炭谷ら 4は、埋立地浸出水の毒性を調べるために、メダカの卵を使用。彼らは卵への浸出水の浸透等価が胚形成中に異常を誘発するための鍵であることがわかりました。また、柏田5は、プラスチック製のナノ粒子（直径39.4 nm）と簡単に塩気の条件の下でメダカ卵の漿膜（15X胚飼育培地（ERM））を透過していることを報告しました。
典型的な小魚モデル、日本のメダカ（ メダカ 6で使用されてきました。日本のメダカは、その高度に発達した塩化セル7の淡水から海水までの条件で生きることができます。したがって、それらは、塩分の広い範囲の条件で試験するために有用である可能性があります。
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Protocol
本研究で用いたメダカは、苦痛や不快感の軽減に配慮し、東洋大学の制度ガイドラインに従って人道的に処理しました。
1.シルバーナノコロイド（SNCが）
- 精製されたのSNCを購入した（20mg / L -1、純度99.99％、粒子は、蒸留水に懸濁28.4±8.5 nm程度の直径を意味します）。
- 誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により、銀の純度および濃度を検証するには、取扱説明書8に記載の分析します。 ICP-MS分析のための前処理方法は、項7に記載されています。
SNCソリューション異なる塩分と（シルバーコロイドとAg +の混合物）の調製
- 60グラムのNaCl、1.8グラムのKCl、2.4グラムののCaCl 2・2H 2 O、およびULTの1L中9.78グラムのMgSO 4・7H 2 Oからなる60×ERMを準備rapure水;超純水中の1.25％NaHCO 3でpHを7.0に調整します。
- 一晩25℃でのERMソリューションをかき混ぜます。
- 希釈したERMとのSNCを混ぜます。各SNC-ERM混合溶液40mlを準備します。最終濃度は、ERMの異なる濃度でのSNCの10 mg / Lで-1である（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍）。
- 超純水中の0.625パーセントのNaHCO 3で7.0にSNC-ERM混合溶液のpHを調整します。 Ag +放出は酸性条件9により促進されるため、pH調整は、SNCの溶液を調製する際に非常に重要です。
- SNCのための参照化合物としてのAgNO 3を使用してください。
- 希ERMとのAgNO 3を混ぜます。 15.7 mg / LでのAgNO 3濃度でのAgNO 3 -ERM混合溶液の40ミリリットルを準備-1 ERMの異なる濃度で（10 mg / Lで-1銀）（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍） 。
注：銀コロイド毒性を調べるために、 硝酸銀可溶性銀の供給源である溶液を、銀コロイドと可溶性銀の混合物であるのSNCのための参照化合物として使用されます。
- 希ERMとのAgNO 3を混ぜます。 15.7 mg / LでのAgNO 3濃度でのAgNO 3 -ERM混合溶液の40ミリリットルを準備-1 ERMの異なる濃度で（10 mg / Lで-1銀）（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍） 。
3.メダカ文化と卵の収穫
- メダカ（O.のメダカ ）（橙赤色株）（60人の男性と60人の女性）を取得します。
- メダカフロースルー培養系を用いて、3 Lタンク内の1倍ERMで（1グループとして20人の男性と20人の女性）グループなどの文化メダカ。
- 以下の条件での文化：
培養液のpH範囲：6.2〜6.5
光：暗サイクル：16：8時間
培養液の温度：24±0.5°C
培地の浸透圧：257ミリオスモル
- 以下の条件での文化：
- （1日5回）（一日一回）10:00にアルテミア・サリナノープリウスにメダカをフィードし、午前9時、11時、午前13時、午後03時、および17時に人工乾燥魚食を食べます。
- Aを得ました。サリナノープリウス。 <LI>プラスチックビーカー中の3.0％塩溶液の5 Lを準備します。
- ビーカー内の塩溶液にブラインシュリンプの卵の30グラムを追加します。
- 曝気ポンプを用いて、（4 L /分-1）を吹き込みながら48時間、25℃で卵をインキュベートします。
- 48時間後、バブリングを停止します。
- 解決策は、斜線のA.を分離するために5〜10分間放置します未孵化卵や卵の殻（溶液の上部）からサ リナノープリウス（溶液の下部）。
- デカンテーションにより溶液の上層を削除します。
- 283ミクロンの開口部を有するふるいを通してソリューションの下部をフィルタし、198ミクロンの開口部がネット上を通過ノープリウスを収集します。
- 6時間以内にメダカにノープリウスを養います。
4.毒性のSNCの試験または硝酸銀
- メダカの卵をすすぐ（ステージ21）試験溶液[SNCは（10 mg / Lの-1）または硝酸銀で3回ERMの各濃度（1×、5×で（15.7 mg / Lで-1は10mg / L -1銀など） 、10倍、15倍、20倍、または30倍）pH7の]。対照として、pH7で30×ERMに1×で卵を使用しています。
- 6ウェルプラスチックプレートの各試験溶液5mlに15すすい卵を加えます。 （各試験液を使用してSNCかのAgNO 3毒性試験のための露光実験三回実行）。
- アルミホイルでプレートを包みます。
- 孵化するまで、または14日間暗所で25℃で包まれたプレートをインキュベートします。
- 生物学的変化と死んだ卵のために露出卵ごとに24時間を守って（ 図1および図 2）。
- 試験溶液を24時間毎に交換します。
- 次のように観測を行います。
- 曝露の6日目に、O（15秒ごとに）心拍数を数えますストップウォッチ（ 図3a）を用いて、解剖顕微鏡下でのFメダカ胚。
- 曝露の6日目に、マイクロメーター（ 図3b）を使用して、解剖顕微鏡下でメダカの胚の眼の大きさ（直径）を測定します。
- 孵化日に、マイクロメーター（ 図3c）を使用して、解剖顕微鏡下で幼虫のフルボディの長さを測定します。
- 14日（ 図3d）の上に孵化露出した卵の総数をカウントします。
5. SNC溶液からの可溶性銀の単離、およびシルバー分析
- 14,000 xで3 kDaの膜フィルターを通して濾過することにより、各SNC液（銀コロイドと可溶性銀の混合物）から水溶性銀を分離 gで10分間4°C。 1×ERM中の凝集のSNCの報告平均直径は67.8 nmの11であるため、SNCのから水溶性銀を分離するために3 kDaの膜フィルターを使用しますNDのAg +のそれは0.162 nmの12です。 3 kDaの膜が2nm以上13の直径を有する粒子を除外します。
- ICP-MS取扱説明書8に記載の ICP-MS分析（ 図3E）により濾過した溶液の50μl中銀濃度（=可溶性銀濃度）を測定します。 ICP-MS分析のための前処理方法は、項7に記載されています。
メダカ胚におけるシルバー生物蓄積の6.測定
- セクション4で説明したようにSNCのかのAgNO 3にメダカの卵（ステージ21）を公開します。
- 曝露の6日目に、 メダカブック 14に記載のプロトコルに従って酵素を孵化メダカを用いて、卵（ すなわち 、dechorion）から絨毛膜を除去します。
- ICP-MS取扱説明書8（ 図3F）に応じてICP-MS分析によりdechorioned卵の銀濃度を測定します。前処理ICP-MS分析のための方法は、第7章に記載されています。
ICP-MS分析による銀濃度の7.測定
- （;セクション1の銀濃度の検証のための）サンプル[銀溶液50μlを追加します。 3 dechorionated胚（第5節）。または50ミリリットルのテフロンビーカーに濾過した溶液を50μl（セクション5）]。
- 50ミリリットルのビーカーに超純硝酸の2.0ミリリットルを追加します。
- それは（約3時間）乾く直前まで110℃のホットプレート上で混合物を加熱します。
- 完全に有機物を溶解するために、ビーカーに超純硝酸と過酸化水素の0.5ミリリットルの2.0ミリリットルを追加します。
- それは（約3時間）乾く直前までホットプレート上で再び混合物を加熱します。
- 1.0％超高純度の硝酸溶液4mlに残留物を溶解します。
- 転送遠心チューブに溶液4ml。
- （3回の合計）を2回7.7から7.6を繰り返します。最終容量は12.0ですミリリットル。
- 取扱説明書8に記載のICP-MS分析を用いて（1.0％超純粋硝酸に溶解した）サンプルの銀の濃度を測定します。
- 内部および外部の標準液を使用して銀濃度を定量化するために（ 物質 一覧を参照してください）。内部および外部標準溶液は米国試験所認定協会（A2LA）の認定を受けています。銀の検出限界は0.0018 ng / mlで-1（溶液）と0.016 ngのMG-重量-1（胚体）でした。
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Representative Results
SNCの毒性に対する塩分の影響は非常に明白であった：奇形や死の誘導は、塩分濃度依存（ 図1および図 2）でした。我々は（10 mg / Lで-1）-exposed胚SNCで表現型のバイオマーカー（心拍数、アイサイズ、フルボディの長さ、および孵化率）を測定しました。これらの表現型のバイオマーカーは、塩分濃度依存SNC毒性を明らかにしました。
心拍数は、29.6 32.2拍/対照の30倍のERMへの1x全体で15秒の範囲でした。しかし、それらは、30X ERM（ 図 3a）にSNCまたはAgNO 3を露光して（P <0.01）有意に減少しました。心拍数を下げると、健康を損なうことを示しています。制御の下で幼虫またはそれぞれの1x ERMのと比較して5倍から30倍ERMまでの塩分でのAgNO 3露出のフルボディの長さに有意差はなかったですolutions。体の長さは4.69ミリメートルに一貫して4.55でした。しかし、体の長さはそれぞれ1倍ERMソリューションと比較して15倍と20倍ERMでSNCの暴露の結果として、4.33と3.77ミリメートルに（P <0.01）が有意に減少しました。しかも、それは30倍ERM（一つだけが孵化しているため、統計的分析は30倍ERMでは利用できませんでした）（ 図 3c）で3.75ミリメートルに減少しました。フルボディの長さを小さくすると、成長阻害を示しています。 1倍のERMに比べて1倍から30倍ERMまでの塩分で対照の眼の直径に有意差はなかったです。眼の直径が0.366ミリメートルに一貫して0.357でした。しかし、それはそれぞれ1倍ERMソリューションで（ 図 3b）と比較して20倍または30倍ERMでSNCかのAgNO 3の暴露時に有意に減少しました。眼の直径を小さくすると、神経系の発達の阻害を示しています。すべては14日以内に孵化した卵を制御します。しかし、20倍と30倍でSNC露光時 ERM孵化率は、1×ERM（P <0.01）（ 図 3d）における速度の、それぞれ、71％および2％ま で有意に減少しました。また、AgNO 3を曝露すると、それは30倍ERM（P <0.01）で有意に減少しました。孵化率を小さくすると、SNCのかのAgNO 3の存在の毒性効果を示しています。これらの4表現型のバイオマーカーは、したがって、塩分依存SNCの毒性を示します。
塩分は、水溶性金属錯体形成を増加させ、これらの複合体は、毒性作用3,8を持っている可能性があります。我々の研究では、ICP-MSは、銀の分析塩分濃度が増加するにつれて、試験溶液中の可溶性銀濃度が増加したことを明らかにしました。胚中の銀濃度も増加した（ 図3E、3F）。
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図1：塩分濃度の増加は、SNCの毒性を増加させます。死亡率と異常に開発された胚の数は、SNCの露出の下で塩分濃度の増加に伴って増加した。10 mg / Lで-1異なるERM濃度でSNCの溶液に曝露メダカの卵の（a）の画像の配列。画像は、メダカ卵のSNCに露出し、解剖顕微鏡下で観察さの典型です。コントロールメダカの卵はよく開発され、それらのすべてが30倍ERMに1倍で孵化させました。 10時mg / Lで-1 SNC暴露、15X ERM、発達奇形（赤は未孵化、長方形を概説）と14日以内に未孵化胚への1xに孵化したメダカの卵のすべてが（緑が未孵化、長方形を概説）20倍で観察されたもののと（A）。の右下の30倍ERM。（b）の拡大画像この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：SNCのにさらさメダカの卵の典型的な表現型バイオマーカーメダカの卵発達段階での21は、6日間ERMの異なる濃度（10 mg / Lで-1）のSNCに暴露された正常な発達と（a）の制御メダカ胚。。。 （b）は発達変形（損傷の光度）。この胚はpericardiovascular浮腫を表示しました。管状の心;血の塊;不十分な血管の発達（したがって虚血）、脊髄、尾、眼及び脳;そして、短い尾。（c）の発達変形（損傷の重度）。この胚は、卵黄嚢の破壊を示しました。不十分な血管の発達（したがって虚血）、脊髄、尾、眼及び脳;そして、短い尾。 （b）及び（c）中の符号は、20倍及び30倍ERMでSNCの曝露の際に観察されました。 <href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：メダカ卵の開発中に毒物学的バイオマーカー上のSNCまたは硝酸銀への曝露の影響でのSNC（10 mg / Lの-1）または硝酸銀（10 mg / Lで-1銀など）にさらさ進化の段階21メダカの卵。 ERMの一連の6日間観察しました。 [青]コントロール（ERM）; [赤] ERM中10mg / L -1でのSNC。 [緑]を10mg / L -1銀などのERM中でのAgNO 3。15秒あたりの（a）は、心拍数。心拍数を下げると、健康を損なうことを示している。（b）の目の直径。眼の直径を小さくすると、神経系の発達の阻害を示す。（C）全体長。デフルボディの長さを折り目は、成長阻害を示している。（d）の孵化率。孵化率を下げるとのSNCの存在の毒性効果を示している。（e）の可溶性銀錯体の濃度のSNCまたは硝酸銀から試験溶液（mg / Lで-1）で。SNCのか、硝酸銀に暴露された胚（f）において銀濃度ERMの一連のインチ*それぞれの1倍ERMソリューションと比較して有意差（分散分析、P <0.05）。 NA：一方だけが孵化しているため利用できません。エラーバーは標準偏差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
メダカは、海水に対して非常に寛容である淡水魚です。よくこの魚の本来の自然の生息地は、日本の沿岸6オフ海水だったことは知られていません。したがって、メダカは塩化セル7よく発達してきました。このユニークなプロパティは、魚の単独種のみを使用して、塩分（海水への淡水）の関数として、環境中の化学物質の毒性を試験するための新しい方法で科学者を提供します。
ステージ21でのメダカの卵を得るために、卵は毎朝収穫し、通常ステージ20で選択する必要があり、メダカのペアは（ちょうど日の出前）早朝に交配を開始し、日の出によって卵を産みます。午前中に採取した卵は、実験開始前に、卵の発達を制御する必要がある場合には、ステージ21に到達する前に、卵の開発は15〜20℃の温度を使用することによって遅くすることができるステージ約10または11でなければなりません。銀の濃度を測定する（可溶性SILV試験溶液中とdechorionated胚においてerは）SNC毒性の塩分濃度依存性の我々の調査に重要でした。その高い特異性は、それが有害なタンパク質分解酵素を持っていないことを意味するための酵素を孵化すると、絨毛膜を除去するための最良の生物学的に適当な酵素です。その他のプロテイナーゼは推奨されません。これまでのところ、利用可能な唯一の孵化酵素は、メダカのためにということです。これは、この方法の一つの制限です。
化学毒性試験の結果に塩分の明らかな影響は我々の実験のように、など現実的に可能な限り、このような自然の水生特性をシミュレートし、環境中の化学物質の毒性を調べるために有用であることを実証しました。高銀の濃度に起因するSNCの毒性は塩分によって増加した発見はすべての水生領域における汚染物質の化学物質の生態毒性に非常に適用可能です。海水中の一般的な化学毒性試験の場合には、何の魚のモデルnominatはまだありません許可された国際機関（ 例えば 、OECDとによって編 国際標準化機構）。化学毒性試験のために使用されている淡水魚（ 例えば 、メダカ、ゼブラフィッシュ、コイ、ニジマス、およびファットヘッドミノー）の中で、唯一のメダカは、酵素の利用可能性、高い繁殖力、および孵化、塩分適応の利点のすべてを持っています室内実験で簡単に使用するために十分に小さいサイズ。また、メダカは、広い温度範囲に適合させることができます （2〜38℃）で6。水生環境では、塩分濃度と温度は、化学物質の運命上で最も重要な環境の影響です。私たちの方法は、したがって、水生環境研究の範囲で変更可能でなければなりません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
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