Abstract
A salinidade constitui uma característica importante do ambiente aquático. Para os organismos aquáticos que define os habitats de água doce, água salobra e água do mar. Os testes de toxicidade dos produtos químicos e avaliações de seus riscos ecológicos para os organismos aquáticos são freqüentemente realizada em água doce, mas a toxicidade dos produtos químicos para os organismos aquáticos depende do pH, temperatura e salinidade. Não existe um método, no entanto, para testar a dependência salinidade de toxicidade para os organismos aquáticos. Aqui, usamos medaka (Oryzias latipes), porque eles podem se adaptar à água doce, água salobra e água do mar. Diferentes concentrações do meio de criação de embriões (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) foram empregadas para testar a toxicidade de partículas nanocolloidal prata (SNCs) para Medaka ovos (ERM 1x e 30x ERM têm pressões osmóticas equivalentes à água doce e água do mar, respectivamente). Em placas de seis poços de plástico, de 15 ovos medaka, em triplicado, foram expostas a SNCs a 10 mg / L &# 8722; 1 em diferentes concentrações de MTC a pH 7 e 25 ° C no escuro.
Foi utilizado um microscópio de dissecação e um micrômetro para medir a frequência cardíaca por 15 seg e olho de diâmetro no dia 6 e comprimento do corpo cheio de larvas em incubação dia (secção 4). Os embriões foram observados até a eclosão ou dia 14; Em seguida, contou a taxa de eclosão todos os dias, durante 14 dias (Seção 4). Para ver a acumulação de prata em embriões, que usamos em espectrometria de massa com plasma para medir a concentração de prata de soluções de teste (seção 5) e embriões dechorionated (secção 6) .A toxicidade dos SNCs para embriões medaka, obviamente, aumentou com o aumento da salinidade. Este novo método permite-nos testar a toxicidade dos produtos químicos em diferentes salinidades.
Introduction
Desde a criação da Organização para a Cooperação e as diretrizes de teste Desenvolvimento Económico (OCDE) para produtos químicos de teste em 1979, 38 guias do teste foram publicados na Seção 2 das orientações, efeitos sobre os sistemas bióticos 1. Todos os organismos aquáticos testados ter sido de habitats de água doce, ou seja, plantas de água doce; algas; invertebrados, como dáfnias e quironomídeos; e peixes, como medaka, peixe-zebra, e truta arco-íris. Em comparação com ambientes de água salgada, ambientes de água doce estão mais directamente afectados pelas actividades económicas e industriais humanos. Portanto, ambientes de água doce foram priorizados para testes, porque eles estão em maior risco de poluição.
Nas zonas costeiras, incluindo estuários, salinidades variam entre as condições de água e água salgada, salobra, e estas áreas são muitas vezes poluída por atividade industrial 2. As zonas costeiras e as suas zonas húmidas associadas são caracterizados por hbiodiversidade ecológica igh e produtividade. ecossistemas costeiros devem, portanto, ser protegido da poluição química. No entanto, tem havido pesquisas ecotoxicológicas em habitats de água e água salgada salobra limitado.
Sakaizumi 3 estudaram as interacções entre tóxicos metil-mercúrio e salinidade em ovos medaka japoneses e descobriram que o aumento da pressão osmótica da solução de teste aumentou a toxicidade do mercúrio metilo. . Sumitani et al 4 utilizaram ovos medaka para investigar a toxicidade do lixiviado de aterro sanitário; eles descobriram que a equivalência osmótica de lixiviados para os ovos era a chave para induzir anormalidades durante a embriogênese. Além disso, Kashiwada 5 relataram que as nanopartículas de plástico (39,4 nm de diâmetro) facilmente permeado através do córion medaka ovo em condições salobras (15x embrião criação médio (ERM)).
Um modelo pequeno peixe típico, os medaka japonês (Oryzias latipes 6. Medaka japonês pode viver em condições que variam de água doce para a água do mar por causa de suas células de cloreto altamente desenvolvidos 7. Eles são, portanto, susceptíveis de ser útil para testar em condições com uma vasta gama de salinidade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os medaka japoneses utilizados neste estudo foram tratados de forma humana, em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Toyo, com a devida consideração para o alívio do sofrimento e desconforto.
1. Prata nanocolóides (SNCs)
- Comprar SNCs purificadas (20 mg / L-1, 99,99% de pureza, de partículas de diâmetro médio cerca de 28,4 ± 8,5 nm, suspensas em água destilada).
- Validar a pureza e concentração da prata por espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) para análises de acordo com o manual de funcionamento 8. O método de pré-tratamento para ICP-MS análises está descrito no capítulo 7.
2. Preparação de SNC Solutions (misturas de prata Colloids e Ag +) com diferentes salinidades
- Preparar 60 × MTC que consiste em 60 g de NaCl, 1,8 g de KCl, 2,4 g de CaCl 2 2H 2 O, e 9,78 g de MgSO 4 · 7H 2 O em 1 L de ultágua rapure; ajustar o pH para 7,0 com 1,25% de NaHCO3 em água ultrapura.
- Agita-se a solução MTC a 25 ° C durante a noite.
- Misture SNCs com ERM diluída. Prepare 40 ml de cada solução mista SNC-ERM. A concentração final é de 10 mg / L-1 de SNCs em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x).
- Ajustar o pH da solução mista SNC-MTC para 7,0 com 0,625% de NaHCO3 em água ultrapura. ajuste do pH é muito importante na preparação da solução SNC, porque Ag + de libertação é facilitada por condições acídicas 9.
- Use AgNO 3 como composto de referência para SNCs.
- Misture AgNO3 com ERM diluído. Preparar 40 ml de AgNO3 -ERM solução mista a uma concentração de AgNO3 de 15,7 mg / L-1 (10 mg / L de prata -1) em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x) .
Nota: Para examinar a toxicidade colóide de prata, AgNO3solução, que é uma fonte de prata solúvel, é usado como composto de referência para SNCs, que são uma mistura de colóides de prata e prata solúvel.
- Misture AgNO3 com ERM diluído. Preparar 40 ml de AgNO3 -ERM solução mista a uma concentração de AgNO3 de 15,7 mg / L-1 (10 mg / L de prata -1) em diferentes concentrações de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ou 30x) .
3. Medaka cultura e colheita Egg
- Obter o medaka (O. latipes) (estirpe vermelho-alaranjado) (60 homens e 60 mulheres).
- medaka cultura como grupos (20 homens e 20 mulheres como um grupo) em ERM 1x em 3 tanques L, usando um sistema de cultura flow-through medaka.
- Cultura nas seguintes condições:
intervalo de pH do meio de cultura: 6,2-6,5
luz: ciclo escuro: 16: 8 hr
temperatura do meio de cultura: 24 ° C ± 0,5
pressão osmótica do meio de cultura: 257 mOsm
- Cultura nas seguintes condições:
- Alimente medaka sobre náuplios de Artemia salina às 10:00 (uma vez por dia) e alimentar uma dieta de peixe seco artificial às 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinco vezes por dia).
- Obter A. náuplios salina. <li> Prepare 5 L de uma solução de sal de 3,0% num copo de plástico.
- Adicionar 30 g de ovos de artémia para a solução do sal contido no copo.
- Incubar os ovos a 25 ° C durante 48 horas com borbulhamento (4 L / min -1) usando uma bomba de arejamento.
- Após 48 h, parar o borbulhamento.
- Deixar a solução repousar durante 5 a 10 min para separar o A. eclodidos salina náuplios (parte inferior da solução) a partir de ovos não eclodidos e cascas de ovos (parte superior da solução).
- Remover a camada superior da solução por decantação.
- Filtra-se a porção inferior da solução através de um peneiro com aberturas de 283 um, e recolher os náuplios que passam através de uma rede com aberturas de 198 ^ m.
- Alimente o náuplios aos medaka dentro de 6 horas.
4. Ensaios de Toxicidade de SNCs ou AgNO3
- Lavar os ovos medaka (fase 21), três vezes com solução de ensaio [SNCs (10 mg / L-1) ou AgNO 3 (15,7 mg / L-1 como de 10 mg / L de prata -1) para cada concentração de MTC (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, ou 30x) a pH 7]. Como controlos, usam ovos em 1 × a 30 × MTC a um pH de 7.
- Adicionar 15 ovos enxaguados a 5 ml de cada solução de teste em seis-se placas de plástico. (Execute os experimentos de exposição três vezes por SNC ou AgNO3 toxicidade testando o uso de cada solução de teste.)
- Enrole as placas em folha de alumínio.
- Incubar as placas revestidas apresentam um de 25 ° C no escuro até à eclosão ou durante 14 dias.
- Observar os ovos expostos a cada 24 horas para mudanças biológicas e ovos mortos (Figuras 1 e 2).
- Trocar as soluções de teste a cada 24 horas.
- Realizar observações como se segue.
- No dia 6 de exposição, contar o ritmo cardíaco (por 15 segundos) of embriões medaka sob um microscópio de dissecação, utilizando um cronometro (Figura 3A).
- No dia 6 de exposição, medir o tamanho do olho (diâmetro) de embriões medaka sob um microscópio de dissecação, usando um micrómetro (Figura 3b).
- No dia incubação, medir os comprimentos de corpo inteiro de larvas sob um microscópio de dissecação, utilizando um micrômetro (Figura 3c).
- Contar o número total de ovos que eclodem expostos ao longo dos 14 dias (Figura 3D).
5. Isolamento de prata solúvel de Solução SNC, e análise de prata
- Isolar prata solúveis a partir de cada solução SNC (uma mistura de colóides de prata e prata solúvel) por filtração através de um filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g e 4 ° C durante 10 min. Usar um filtro de membrana de 3 kDa, para isolar prata solúvel dos SNCs, porque o diâmetro médio de relatado SNCs agregados no MTC 1x é 67,8 nm, 11 umnd a de Ag + é 0,162 nm 12; a membrana de 3 kDa, exclui partículas com diâmetros de 2 nm ou mais 13.
- Medir a concentração de prata em 50 ml de solução filtrada (= a concentração de prata solúvel) por análise de ICP-MS (Figura 3e) de acordo com o manual de instruções ICP-MS 8. O método de pré-tratamento para o ICP-MS análises está descrito no capítulo 7.
6. Medição de prata bioacumulação em Medaka Embriões
- Expor ovos medaka (fase 21) para SNCs ou AgNO3 como descrito na seção 4.
- No dia 6 de exposição, remover cório do ovo (isto é, dechorion) usando Medaka incubação da enzima de acordo com o protocolo descrito no Livro Medaka 14.
- Medir a concentração de prata dos ovos dechorioned pela análise ICP-MS de acordo com o ICP-MS manual de operação 8 (Figura 3-F). o pré-tratamentométodo para a ICP-MS análises está descrito no capítulo 7.
7. Medição de Concentração de prata pelo ICP-MS Análise
- Adicione exemplos [50 mL de solução de prata (para validação da concentração de prata, secção 1); três embriões dechorionated (seção 5); ou 50 ml de solução filtrada (seção 5)] para um copo de 50 ml Teflon.
- Adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura ao copo de 50 ml.
- Aquece-se a mistura sobre uma placa quente a 110 ° C, até pouco antes de secar (cerca de 3 h).
- Para dissolver a matéria orgânica por completo, adicionar 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura e 0,5 ml de peróxido de hidrogénio para a proveta.
- Aquecer a mistura novamente na chapa quente até pouco antes de ele seca (cerca de 3 horas).
- Dissolve-se o resíduo em 4 ml de solução de ácido nítrico 1,0% ultrapura.
- Transferência de 4 ml de solução para um tubo de centrífuga.
- Repita duas vezes 7,6-7,7 (um total de três vezes). O volume final é de 12,0ml.
- Medir a concentração de prata da amostra (dissolvido em ácido nítrico ultrapura 1,0%) por meio de análise ICP-MS de acordo com o manual de instruções 8.
- Use uma interna e uma solução padrão externo (Veja Lista de Materiais) para quantificar a concentração de prata. A solução padrão interna e externa é credenciada pela Associação Americana de Acreditação de Laboratórios (A2LA). Os limites de detecção de prata foram 0,0018 ng / ml -1 (solução) e 0,016 ng mg de peso -1 (corpo do embrião).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O efeito da salinidade na toxicidade SNC foi muito óbvio: a indução de morte ou deformidade foi salinidade dependentes (Figuras 1 e 2). Nós medimos biomarcadores fenotípicas (frequência cardíaca, tamanho do olho, comprimento de corpo inteiro, e taxa de eclosão) no SNC (10 mg / L -1) embriões -exposed. Esses biomarcadores fenotípicas revelou dependente da salinidade toxicidade SNC.
coração taxas variaram de 29,6 a 32,2 batimentos / 15 seg durante todo 1x a 30x ERM nos controles. No entanto, eles diminuíram significativamente (P <0,01) com o SNC ou AgNO3 exposição em 30x ERM (Figura 3A). Diminuindo a frequência cardíaca indica deterioração da saúde. Não houve diferenças significativas no comprimento do corpo cheio de larvas sob controle ou AgNO3 exposição em salinidades variando de 5x a 30x ERM em comparação com o respectivo 1x ERM solutions. comprimento do corpo foi consistentemente 4,55-4,69 mm. No entanto, o comprimento do corpo diminuiu significativamente (P <0,01) a 4,33 e 3,77 milímetros, como um resultado da exposição ao SNC em 15x e 20x MTC em comparação com as respectivas soluções 1x MTC; Além disso, diminuiu para 3,75 mm de 30x ERM (análise estatística não estava disponível no 30x ERM porque só um chocado) (Figura 3c). Diminuindo o comprimento de corpo inteiro indica inibição do crescimento. Não houve diferenças significativas no diâmetro do olho nos controlos nas salinidades variam de 1x a 30x ERM comparação com ERM 1x; diâmetro do olho foi consistentemente 0,357 a 0,366 mm. No entanto, diminuiu significativamente após SNC ou AgNO3 exposição em 20x ou 30x MTC em comparação com as respectivas soluções 1x ERM (Figura 3b). Diminuindo diâmetro do olho indica a inibição do desenvolvimento do sistema nervoso. Todos os ovos de controlo incubados no prazo de 14 dias. No entanto, após a exposição SNC em 20x e 30x MTC a taxa de eclosão diminuiu significativamente para 71% e 2%, respectivamente, da taxa no MTC 1x (P <0,01) (Figura 3D). Além disso, após a exposição de AgNO 3 diminuiu significativamente em 30x MTC (P <0,01). Diminuindo a taxa de eclosão indica o efeito tóxico da presença de SNCs ou AgNO 3. Estes quatro biomarcadores fenotípicas mostram, portanto, salinidade dependente toxicidade SNC.
Salinidade aumenta a formação do complexo de metal solúvel em água, e estes complexos pode ter efeitos tóxicos 3,8. No nosso estudo, as análises de ICP-MS de prata revelou que as concentrações de prata solúveis em soluções de ensaio aumentou com o aumento da salinidade; a concentração de prata nos embriões também aumentou (Figuras 3e, 3f).
"/>
Figura 1: aumento da salinidade aumenta a toxicidade SNC. A mortalidade e o número de embriões desenvolvidos anormalmente aumentada com o aumento da salinidade sob exposição SNC. (A) matriz de imagens de ovos medaka expostos a 10 mg / L -1 solução SNC em diferentes concentrações do MTC. As imagens são típicos dos ovos medaka expostos a SNCs e observados sob um microscópio de dissecação. medaka ovos de controlo estavam bem desenvolvidos, e todos eles incubados em 1x a 30x MTC. Aos 10 mg / L -1 exposição SNC, embora todos os ovos eclodidos medaka em 1x a 15x ERM, deformidades do desenvolvimento (vermelho esboçado retângulos, unhatched) e embriões não eclodidos no prazo de 14 dias (verde delineado retângulos, unhatched) foram observados em 20x e 30x ERM. (b) ampliado imagens do canto inferior direito do (a). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Biomarcadores fenotípica típicos de ovos medaka expostos a SNCs Medaka ovos em fase de desenvolvimento foram expostas a 21 SNCs (10 mg / L-1) em diferentes concentrações de MTC durante 6 dias (a) Controlo de embriões medaka com o desenvolvimento normal.. (b) deformidade desenvolvimento (leve grau de dano). Este embrião exibido edema pericardiovascular; coração tubular; coágulos de sangue; desenvolvimento inadequado dos vasos sanguíneos (e, portanto, isquemia), da medula espinal, cauda, olhos e cérebro; e uma cauda curta. (c) deformidade Desenvolvimento (pesado grau de dano). Este embrião mostrou destruição do saco vitelino; desenvolvimento inadequado dos vasos sanguíneos (e, portanto, isquemia), da medula espinal, cauda, olhos e cérebro; e uma cauda curta. Os sinais em (b) e (c) foram observados após exposição SNC em 20x e 30x MTC. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos da exposição a SNCs ou nitrato de prata em biomarcadores toxicológicos durante o desenvolvimento do ovo Medaka Developmental fase 21 ovos medaka expostos a SNCs (10 mg / L -1) ou nitrato de prata (10 mg / L -1 como a prata) em um. série de ERM foram observados durante 6 dias. [Blue] Control (ERM); [red] SNCs a 10 mg / L -1 no MTC; [green] AgNO 3 a 10 mg / L -1 como a prata no MTC. (a) A frequência cardíaca por 15 seg. Diminuindo a frequência cardíaca indica deterioração da saúde. Diâmetro (b) dos olhos. Diminuindo diâmetro do olho indica a inibição do desenvolvimento do sistema nervoso. (C) comprimento de corpo inteiro. devincando comprimento de corpo inteiro indica inibição do crescimento. (d) taxa de eclosão. Diminuindo a taxa de eclosão indica o efeito tóxico da presença de SNCs. (E) As concentrações de complexos solúveis de prata ou nitrato de prata SNCs em soluções de ensaio (mg / L -1). (F) As concentrações de prata em embriões expostos ao SNCs ou nitrato de prata numa série de ERM. * Diferença significativa (análise de variância, P <0,05) em comparação com a respectiva solução 1x MTC. NA: não disponível, porque só um chocado. As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medaka é um peixe de água doce que é altamente tolerante à água do mar; não é bem conhecido que o habitat natural original este peixe era água salgada ao largo da costa japonesa 6. Assim, peixes medaka ter bem desenvolvida células de cloreto 7. Esta propriedade única fornece aos cientistas uma nova maneira de testar a toxicidade dos produtos químicos no ambiente em função da salinidade (água doce para a água do mar), utilizando apenas uma única espécie de peixe.
Para obter ovos medaka na fase 21, os ovos devem ser colhidas todas as manhãs e selecionados na fase 20. Normalmente, os pares medaka começam acasalando no início da manhã (logo antes do nascer do sol) e produzem ovos por nascer do sol. Os ovos colhidos na manhã deve ser de cerca de 10 ou fase 11. Se há uma necessidade de controlar o desenvolvimento do ovo antes do inicio da experiência, o desenvolvimento do ovo pode ser retardado através da utilização de temperaturas de 15 a 20 ° C antes da fase 21 é alcançado. Medição da concentração de prata (silv solúveler) nas soluções de teste e em embriões dechorionated foi importante para nossa investigação da dependência salinidade da toxicidade SNC. A incubação de enzima é a melhor enzima biologicamente adequado para a remoção do cório, devido sua elevada especificidade significa que não tem nenhuma proteinase prejudicial. Outras proteases não são recomendados. Até agora, a enzima única incubação disponível é que, para medaka; esta é uma limitação deste método.
O efeito óbvio da salinidade sobre o resultado dos testes de toxicidade químicos demonstraram que simular tais propriedades aquáticos naturais tão realista quanto possível, como em nossos experimentos, foi útil para investigar a toxicidade dos produtos químicos no ambiente. A descoberta de que a toxicidade SNC devido às concentrações elevadas de prata foi aumentada pela salinidade é altamente aplicável à ecotoxicologia de produtos químicos poluentes em todas as áreas aquáticas. No caso dos testes de toxicidade química geral na água do mar, não existe ainda nenhum modelo peixes nominated por organizações internacionais autorizadas (por exemplo, a OCDE ea Organização Internacional para Padronização). Entre os peixes de água doce (por exemplo, medaka, peixe-zebra, carpa, truta arco-íris, e vairão) que foram utilizados para testes de toxicidade química, somente o medaka tem todas as vantagens de adaptação salinidade, incubação disponibilidade enzima, alta fecundidade, e uma tamanho suficientemente pequeno para fácil utilização em experiências de laboratório. Além disso, medaka pode ser adaptada a uma vasta gama de temperaturas (2-38 ° C) 6. Em ambientes aquáticos, salinidade e temperatura são as influências ambientais mais importantes sobre o destino dos produtos químicos; o nosso método, por conseguinte, deve ser modificado para uma série de pesquisas ambiente aquático.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
