Abstract
Saltindhold er en vigtig egenskab af vandmiljøet. For vandorganismer definerer levestederne for ferskvand, brakvand, og havvand. Test af giftigheden af kemikalier og vurderinger af deres økologiske risici for vandorganismer ofte udføres i ferskvand, men af kemikaliers toksicitet for vandorganismer, afhænger af pH, temperatur og saltholdighed. Der er ingen metode imidlertid til afprøvning af saltholdighed afhængighed af toksicitet for vandorganismer. Her brugte vi Medaka (Oryzias latipes), fordi de kan tilpasse sig til ferskvand, brakvand, og havvand. Forskellige koncentrationer af embryo-opdræt medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, og 30x) blev anvendt til at teste toksiciteten af sølv nanocolloidal partikler (SNCS) til Medaka æg (1x ERM og 30x ERM har osmotiske tryk svarende til ferskvand og havvand, henholdsvis). I seks-godt plastplader blev 15 Medaka æg i tre eksemplarer udsat for SNCS ved 10 mg / l &# 8722; 1 i forskellige koncentrationer af ERM ved pH 7 og 25 ° C i mørke.
Vi brugte en dissektionsmikroskop og et mikrometer til at måle puls pr 15 sek og øje diameter på fuld kropslængde på larverne på klækning dag (afsnit 4) dag 6 og. De embryonerne blev observeret indtil klækningen eller dag 14; vi derefter talt den udklækningsmængde hver dag i 14 dage (afsnit 4). For at se sølv ophobning i embryoner, brugte vi induktivt koblet plasma massespektrometri til at måle sølv koncentrationen af test-løsninger (afsnit 5) og dechorionated embryoner (afsnit 6) .Den toksicitet SNCS til Medaka embryoner naturligvis steg med stigende saltholdighed. Denne nye metode giver os mulighed for at teste toksiciteten af kemikalier i forskellige saltindhold.
Introduction
Siden oprettelsen af Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) retningslinjer for testning til test kemikalier i 1979, har 38 retningslinjer blevet offentliggjort i afdeling 2 i retningslinjerne, påvirkning af biotiske Systems 1. Alle de vandorganismer testede have været fra ferskvandsområder, nemlig ferskvand planter; alger; hvirvelløse dyr såsom dafnier og chironomider; og fisk såsom Medaka, zebrafisk og regnbueørred. Sammenlignet med saltvand miljøer, er ferskvandsmiljøer mere direkte påvirket af menneskelige økonomiske og industrielle aktiviteter. Derfor har ferskvandsmiljøer prioriteret til test, fordi de har større risiko for forurening.
I kystområder, herunder flodmundinger, saltholdigheder varierer mellem brakvand og havvand betingelser, og disse områder er ofte forurenet af industriel aktivitet 2. Kystområderne og deres tilhørende vådområder er kendetegnet ved hIGH økologiske biodiversitet og produktivitet. Kystnære økosystemer skal derfor beskyttes mod kemisk forurening. Imidlertid har der været begrænset økotoksikologiske i brakvand og havvand levesteder.
Sakaizumi 3 studerede de toksiske interaktioner mellem methyl-kviksølv og saltindhold i japanske Medaka æg og fundet, at forøgelse af det osmotiske tryk af testopløsningen forstærkede toksiciteten af methylkviksølv. . Sumitani et al 4 brugte Medaka æg til at undersøge toksicitet deponeringsperkolat; de fandt, at den osmotiske ækvivalens af perkolat til æggene var nøglen til at fremkalde abnormiteter under embryogenese. Desuden Kashiwada 5 rapporteret, at plast nanopartikler (39,4 nm i diameter) let trængte gennem Medaka æg chorion under brakvand betingelser (15x embryo opdræt medium (ERM)).
En typisk små fisk model, de japanske Medaka (Oryzias latipes 6. Japanske Medaka kan leve under forhold, der spænder fra ferskvand til havvand på grund af deres højt udviklede chlorid celler 7. De er derfor sandsynligvis være nyttigt for at teste i forhold med en bred vifte af saltholdigheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De japanske Medaka anvendt i denne undersøgelse blev behandlet humant i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer Toyo University, under hensyntagen til lindring af lidelse og ubehag.
1. Sølv Nanocolloids (SNCS)
- Købe oprensede SNCS (20 mg / L -1, 99,99% renhed, partikelstørrelse middeldiameter omkring 28,4 ± 8,5 nm suspenderet i destilleret vand).
- Godkend renheden og koncentrationen af sølv ved induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS) analyser i henhold til betjeningsvejledningen 8. Forbehandlingen metode til ICP-MS-analyser er beskrevet i afsnit 7.
2. Udarbejdelse af SNC Solutions (Blandinger af Silver Kolloider og Ag +) med forskellige saltholdigheder
- Forbered 60 × ERM bestående af 60 g NaCl, 1,8 g KCI, 2,4 g CaCl2 · 2H 2 O og 9,78 g MgSO4 · 7H 2 O i 1 I ULTrapure vand; pH indstilles til 7,0 med 1,25% NaHCO3 i ultrarent vand.
- Omrør ERM opløsning ved 25 ° C natten over.
- Bland SNCS med fortyndet ERM. Forbered 40 ml af hver SNC-ERM blandet opløsning. Slutkoncentrationen er 10 mg / l -1 af SNCS i forskellige koncentrationer af ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x).
- Juster pH af SNC-ERM blandede opløsning til 7,0 med 0,625% NaHCO3 i ultrarent vand. pH-justering er meget vigtigt i fremstilling af SNC opløsning, fordi Ag + frigivelse lettes ved sure betingelser 9.
- Brug AgNO3 som referencestof for SNCS.
- Bland AgNO3 med fortyndet ERM. Forbered 40 ml AgNO3 -ERM blandet opløsning ved en AgNO3 koncentration på 15,7 mg / L -1 (10 mg / l -1 sølv) i forskellige koncentrationer af ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x) .
Bemærk: For at undersøge sølv kolloid toksicitet, AgNO3løsning, som er en kilde til opløseligt sølv, anvendes som referencestof for SNCS, som er en blanding af sølv kolloider og opløseligt sølv.
- Bland AgNO3 med fortyndet ERM. Forbered 40 ml AgNO3 -ERM blandet opløsning ved en AgNO3 koncentration på 15,7 mg / L -1 (10 mg / l -1 sølv) i forskellige koncentrationer af ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, eller 30x) .
3. Medaka Kultur og Egg Høst
- Anskaf Medaka (O. latipes) (orange-rød stamme) (60 mænd og 60 kvinder).
- Kultur Medaka som grupper (20 mænd og 20 kvinder som en gruppe) i 1x ERM i 3 L tanke ved hjælp af en Medaka gennemstrømning dyrkning system.
- Kultur på følgende betingelser:
pH-område dyrkningsmediet 6.2 til 6.5
lys: mørke cyklus: 16: 8 t
temperatur af dyrkningsmediet: 24 ± 0,5 ° C
osmotiske tryk af dyrkningsmediet: 257 mOsm
- Kultur på følgende betingelser:
- Feed Medaka på Artemia salina nauplier klokken 10:00 (en gang om dagen) og foder en kunstig tør fisk kost på 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, og 17:00 (fem gange om dagen).
- Opnå A. salina nauplier. <li> Forbered 5 I af en 3,0% saltopløsning i et plastbæger.
- Der tilsættes 30 g af saltlage rejer æg til saltopløsningen i bægerglasset.
- Inkuber æggene ved 25 ° C i 48 timer med gennembobling (4 L / min -1) under anvendelse af en beluftning pumpe.
- Efter 48 timer, stoppe boblende.
- Lad opløsningen henstå i 5 til 10 min for at adskille den skraverede A. salina nauplier (nederste del af opløsning) fra de udklækkede æg og æggeskaller (øvre del af løsningen).
- Fjern det øverste lag af opløsningen ved dekantering.
- Foretage nedre del af opløsningen gennem en sigte med åbninger på 283 um, og indsamle nauplii'erne, der passerer igennem et net med åbninger på 198 um.
- Før nauplier til Medaka inden 6 timer.
4. Toksicitet Test af SNCS eller AgNO3
- Skyl Medaka æg (trin 21) tre gange med testopløsning [SNCS (10 mg / l -1) eller AgNO3 (15,7 mg / L -1 som 10 mg / l -1 sølv) ved hver koncentration af ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, eller 30x) ved pH 7]. Som kontroller anvendes æg i 1 × til 30 × ERM ved pH 7.
- Tilføj 15 skyllede æg til 5 ml af hver prøveopløsning i seks-brønds plastplader. (Udfør forsøgene eksponering tre gange for SNC eller AgNO3 toksicitetstest hjælp af hvert testopløsning.)
- Pak pladerne i alufolie.
- Inkubér indpakkede plader ved 25 ° C i mørke, indtil udrugning eller i 14 dage.
- Overhold de udsatte æg hver 24 timer for biologiske ændringer og døde æg (figur 1 og 2).
- Udskift testopløsningerne hver 24 timer.
- Udfør observationer som følger.
- På dag 6 af eksponering, tælle puls (per 15 sek) of Medaka embryoner under et dissektionsmikroskop ved hjælp af et stopur (figur 3a).
- På dag 6 af belysningen måles øjet størrelse (diameter) af Medaka embryoner under et dissektionsmikroskop ved hjælp af et mikrometer (figur 3b).
- På klækning dag, måle hele kroppen længder af larver under et dissektionsmikroskop ved hjælp af et mikrometer (figur 3c).
- Tæl det samlede antal eksponerede æg, der udklækkes i de 14 dage (figur 3D).
5. Isolering af opløselig Silver fra SNC Solution, og sølv Analyse
- Isoler opløseligt sølv fra hver SNC-opløsning (en blanding af sølv kolloider og opløseligt sølv) ved filtrering gennem en 3 kDa membranfilter ved 14.000 x g og 4 ° C i 10 minutter. Brug en 3 kDa membranfilter at isolere opløselige sølv fra SNCS, fordi den rapporterede middeldiameter af aggregerede SNCS i 1x ERM er 67,8 nm 11 and at Ag + er 0,162 nm 12; 3 kDa membran udelukker partikler med diametre på 2 nm eller mere 13.
- Måling af koncentrationen af sølv i 50 pi filtrerede opløsning (= det opløselige sølvkoncentration) ved ICP-MS-analyse (figur 3e) ifølge ICP-MS betjeningsvejledningen 8. Forbehandlingen metode til ICP-MS-analyser er beskrevet i afsnit 7.
6. Måling af Silver Bioakkumulering i Medaka Embryoner
- Expose Medaka æg (fase 21) til SNCS eller AgNO3 som beskrevet i afsnit 4.
- På dag 6 af eksponering, fjerne chorion fra ægget (dvs. dechorion) ved hjælp Medaka klækning enzym ifølge protokollen beskrevet i Medaka Bog 14.
- Mål sølv koncentrationen af de dechorioned æg ved ICP-MS-analyse i henhold til ICP-MS betjeningsvejledning 8 (figur 3f). forbehandlingenmetode til ICP-MS-analyser er beskrevet i afsnit 7.
7. Måling af Silver Koncentration af ICP-MS analyse
- Tilføj prøver [50 pi sølv løsning (for validering af sølv koncentration, afsnit 1); tre dechorionated embryoner (afsnit 5); eller 50 gi filtrerede opløsning (afsnit 5)] til en 50 ml Teflon bæger.
- Tilsættes 2,0 ml ultrarent salpetersyre til 50 ml bægerglas.
- Opvarm blandingen på en varmeplade ved 110 ° C, indtil lige før det tørrer ud (ca. 3 timer).
- At opløse organisk stof fuldstændigt, tilsættes 2,0 ml ultrarent salpetersyre og 0,5 ml hydrogenperoxid til bægerglasset.
- Blandingen opvarmes igen på varmepladen indtil lige før det tørrer ud (ca. 3 timer).
- Opløs resten i 4 ml 1,0% ultrarent salpetersyreopløsning.
- Overfør 4 ml opløsning til et centrifugerør.
- Gentag 7,6-7,7 to gange (i alt tre gange). Slutvolumenet er 12,0ml.
- Mål sølv koncentrationen af prøven (opløst i 1,0% ultrarent salpetersyre) ved hjælp af ICP-MS-analyse i henhold til betjeningsvejledningen 8.
- Brug en intern og en ekstern standardopløsning (se Materialer List) at kvantificere koncentrationen sølv. Den interne og eksterne standardopløsning er akkrediteret af American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Detektionsgrænser sølv var 0,0018 ng / ml -1 (opløsning) og 0,016 ng mg-vægt -1 (embryo kroppen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningen af saltholdighed på SNC toksicitet var meget indlysende: induktionen af deformitet eller dødsfald saltholdighed afhængig (figur 1 og 2). Vi målte fænotypiske biomarkører (hjertefrekvens, øjet størrelse, fuld krop længde, og klækning rate) i SNC (10 mg / l -1) -exposed embryoner. Disse fænotypiske biomarkører afslørede saltholdighed-afhængig SNC toksicitet.
Heart varierede fra 29,6 til 32,2 slag / 15 sek hele 1x til 30x ERM i kontrollerne. Men de faldt signifikant (P <0,01) med SNC eller AgNO3 eksponering i 30x ERM (figur 3a). Faldende puls indikerer helbred forværres. Der var ingen signifikante forskelle i fuld kropslængde på larverne under kontrol eller AgNO3 eksponering ved saltholdigheder lige fra 5x til 30x ERM i forhold til de respektive 1x ERM solutions. Kropslængde var konsekvent 4,55-4,69 mm. Imidlertid kropslængde faldt betydeligt (P <0,01) til 4,33 og 3,77 mm, som følge af SNC eksponering i 15x og 20x ERM sammenlignet med de respektive 1x ERM løsninger; Desuden faldt den til 3,75 mm i 30x ERM (statistisk analyse ikke var tilgængelige på 30x ERM, fordi kun én skraveret) (figur 3c). Faldende fuld kropslængde indikerer væksthæmning. Der var ingen signifikante forskelle i øjet diameter i kontrollen ved saltholdigheder lige fra 1x til 30x ERM sammenlignet med 1x ERM; eye diameter var konsekvent 0,357 til 0,366 mm. Men det faldt betydeligt ved SNC eller AgNO3 eksponering i 20x eller 30x ERM sammenlignet med i de respektive 1x ERM opløsninger (figur 3b). Aftagende eye diameter indikerer udviklingsmæssige hæmning af nervesystemet. Alle kontrol æg klækkede inden for 14 dage. Dog ved SNC eksponering i 20x og 30x ERM den klækning faldt markant til 71% og 2%, henholdsvis af den sats i 1x ERM (P <0,01) (Figur 3d). Også efter AgNO3 eksponering faldt betydeligt i 30x ERM (P <0,01). Faldende udklækningsmængde angiver den toksiske virkning af tilstedeværelsen af SNCS eller AgNO3. Disse fire fænotypiske biomarkører viser derfor saltholdighed afhængige SNC toksicitet.
Saltholdighed øger vandopløseligt metalkompleks-dannelse og disse komplekser kan have toksiske virkninger 3,8. I vores undersøgelse, ICP-MS-analyser af sølv afslørede, at de opløselige sølv koncentrationer i testopløsningerne steget som saltholdigheden steg; Sølvkoncentrationen i embryonerne også forøget (fig 3e, 3f).
"/>
Figur 1: Stigende saltholdighed stiger SNC toksicitet. Dødelighed og antallet af unormalt udviklede embryoer steg med stigende saltholdighed under SNC eksponering. (A) Image array af Medaka æg udsættes for 10 mg / l -1 SNC opløsning ved forskellige ERM koncentrationer. Billeder er typisk for Medaka æg udsættes for SNCS og observeret under et dissektionsmikroskop. Kontrol Medaka æg var veludviklet, og alle af dem udklækket i 1x til 30x ERM. Ved 10 mg / l -1 SNC eksponering, selv om alle de Medaka æg klækket i 1x til 15x ERM, udviklingsmæssige deformiteter (rød skitserede rektangler, uklækkede) og embryoner udklækkede inden for 14 dage (grøn skitserede rektangler, uklækkede) blev observeret ved 20x og 30x ERM. (b) Forstørret billeder af nederst til højre på (a). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Typiske fænotypiske biomarkører for Medaka æg udsat for SNCS Medaka æg på udviklingsstadiet 21 blev udsat for SNCS (10 mg / l -1) i forskellige koncentrationer af ERM i 6 dage (a) Kontrollen Medaka foster med normal udvikling.. (b) Developmental deformitet (lys grad af beskadigelse). Dette embryo viste pericardiovascular ødem; rørformede hjerte; blodpropper; utilstrækkelig udvikling af blodkarrene (og dermed iskæmi), rygmarv, hale, øjne og hjerne; og en kort hale. (c) Developmental deformitet (tung grad af beskadigelse). Dette embryo viste ødelæggelse af blommesækken; utilstrækkelig udvikling af blodkarrene (og dermed iskæmi), rygmarv, hale, øjne og hjerne; og en kort hale. Tegnene i (b) og (c) blev observeret ved SNC eksponering i 20x og 30x ERM. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effekter af eksponering for SNCS eller sølvnitrat om toksikologiske biomarkører under Medaka æg udvikling udviklingsstadiet 21 Medaka æg udsat for SNCS (10 mg / l -1) eller sølvnitrat (10 mg / L -1 som sølv) i et. blev observeret række Erms i 6 dage. [Blå] Kontrol (ERM); [red] SNCS på 10 mg / l -1 i ERM; [grøn] AgNO3 ved 10 mg / l -1 som sølv i ERM. (a) Puls pr 15 sek. Faldende puls indikerer helbred forværres. (B) Eye diameter. Aftagende eye diameter indikerer udviklingsmæssige hæmning af nervesystemet. (C) Fuld kropslængde. dekrøl fuld kropslængde indikerer væksthæmning. (d) Skravering sats. Faldende klækning sats angiver den toksiske virkning af tilstedeværelsen af SNCS. (E) Koncentrationer af opløselige sølv komplekser fra SNCS eller sølvnitrat i testopløsninger (mg / L -1). (F) Sølv koncentrationer i embryoner udsat for SNCS eller sølvnitrat i en serie af Erms. * Signifikant forskel (variansanalyse, P <0,05) sammenlignet med det respektive 1x ERM opløsning. NA: ikke tilgængelig, fordi kun én udklækket. Fejl søjler indikerer standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medaka er en ferskvandsfisk, der er meget tolerant over for havvand; Det er ikke kendt, at den oprindelige naturlige habitat denne fisk var saltvand ud for den japanske kyst 6. Derfor Medaka fisk har veludviklede klorid celler 7. Denne unikke egenskab giver forskere med en ny måde at teste toksiciteten af kemikalier i miljøet som en funktion af saltholdighed (ferskvand til havvand) ved hjælp af kun en enkelt art af fisk.
For at opnå Medaka æg i stadie 21, skal æg høstes hver morgen og valgt på trin 20. Normalt begynder Medaka par parring i de tidlige morgentimer (lige før solopgang) og producere æg ved solopgang. Æg høstet i morgen skal være ca. stadium 10 eller 11. Hvis der er behov for at kontrollere æg udvikling før starten af eksperimentet, kan ægget udvikling bremses af ved hjælp temperaturer på 15 til 20 ° C før trin 21 er nået. Måling af koncentrationen sølv (opløselige søler) i testopløsningerne og i dechorionated embryoer var vigtig for vores undersøgelse af saltholdighed afhængighed af SNC toksicitet. Skravering enzym er bedst biologisk egnet enzym til fjernelse chorion, fordi dens høje specificitet betyder, at det ikke har nogen skadelig proteinase. Andre proteinaser anbefales ikke. Hidtil har den eneste udrugning enzym tilgængelig er, at for Medaka; dette er en begrænsning af denne fremgangsmåde.
Den indlysende effekt af saltholdighed på resultatet af de kemiske toksicitet viste, at simulere sådanne naturlige akvatiske egenskaber så realistisk som muligt, som i vores eksperimenter, var nyttigt for at undersøge toksiciteten af kemikalier i miljøet. Opdagelsen af, at SNC toksicitet på grund af høje koncentrationer sølv blev forøget med saltholdigheden er meget gældende for økotoksiciteten af forurenende kemikalier i alle vandområder. I tilfælde af almindelig kemisk toksicitetstest i havvand, der endnu ingen fisk model udpeged af autoriserede internationale organisationer (f.eks, OECD og International Organization for Standardization). Blandt de ferskvandsfisk (f.eks Medaka, zebrafisk, karpe, regnbueørred, og Tykhovedet elritse), der har været anvendt til kemisk toksicitet, kun Medaka har alle fordelene ved saltholdighed tilpasning, udrugning enzym tilgængelighed, høj frugtbarhed, og en størrelse tilstrækkelig lille til nem brug i laboratorieforsøg. Endvidere kan Medaka tilpasses til et bredt temperaturområde (2 til 38 ° C) 6. I vandmiljøer, saltholdighed og temperatur er de vigtigste miljømæssige påvirkninger på skæbne kemikalier; vores metode bør derfor kunne ændres for en række akvatiske miljøforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
