Introduction
El objetivo general fue desarrollar un método para la siembra de células, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos en el biosensor ECIS. El objetivo para el desarrollo de este biosensor era para satisfacer las especificaciones del Ejército de EE.UU. para un dispositivo portátil de campo que podría detectar la posible contaminación de los suministros de agua potable que se utiliza por los soldados. Los requisitos para el sensor de toxicidad fueron que podría detectar un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos rápidamente (dentro de una hora) a concentraciones relevantes para la salud humana, que el dispositivo sea de campo portátil, y los componentes biológicos tendría una vida útil de al menos nueve meses. Refrigeración, pero no helada, de los componentes perecederos era aceptable.
Históricamente, las tecnologías de campo portátiles de análisis de agua con un componente biológico para ellos (tales como anticuerpos, enzimas o ácidos nucleicos) han sido específico del analito 1-3. La desventaja de estos tipos de biosensores es que van a ONLy detectar un tipo de producto químico a la vez. Se necesitan sensores múltiples si se sospecha de que más de un producto químico está presente. Si un sensor específico no está en el repertorio de evaluación, los contaminantes químicos en el agua podrían fácilmente no se detectan.
sensores de toxicidad de base amplia, por el contrario, tienen el potencial para llenar esta brecha tecnológica. Estos por lo general tienen un componente celular a ellos 4-8. Las ventajas de los biosensores de toxicidad son de amplia base que pueden detectar la presencia de una amplia variedad de contaminantes químicos, incluidas las mezclas y las incógnitas, en un período relativamente corto de tiempo 5,9,10.
El concepto de usar la medición de la impedancia eléctrica de monocapas de células como una posible toxicidad sensor, que también se conoce como eléctrico de pila de sustrato de impedancia de detección (IEM), fue descrito por primera vez por Giaever y Keese 11. Durante las últimas dos décadas se ha demostrado que es un indicador sensible de VIAB célulaility y la citotoxicidad. Básicamente, la monocapa de células que se adhiere a los electrodos en los biochips se expone a alta frecuencia y baja tensión y la señal de corriente alterna amperaje. La monocapa confluente de células impide el flujo de electrones. Cuando se ve comprometida la integridad de la monocapa celular (como cuando se introduce una sustancia química tóxica), el sensor ECIS registra un cambio en la impedancia eléctrica 11-14. La figura 1 ilustra el principio de ECIS en relación con la monocapa de células en el biochip .
Figura 1:.. Principio de ECIS Ilustración de una monocapa de células en un biochip con lector de ECIS simplificado esquema eléctrico Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
12. Estas células no eran prácticos para el uso en el campo, sin embargo, debido a que requiere cambios frecuentes de medios de comunicación, tenía una vida útil limitada, y se requiere un ambiente artificial de CO2 y una temperatura de 37 ° C de incubación. Se descubrió que una línea celular disponible en el mercado derivado de las células epiteliales de la trucha arco iris de enmalle (células RTgill 1 W-) podría ponerse a prueba a una temperatura ambiente de CO ambiente 2, formado una monocapa confluente en los biochips, podría ser almacenado a temperaturas de refrigeración, y tenido una respuesta rápida (1 hora o menos) a un amplio espectro de productos químicos en concentraciones relevantes para la salud humana 12. Aplicaciones de las células RTgill-W1 en toxicología, así como en investigación básica, son revisados por Lee et al. 15
Los métodos para la siembra, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos que contienenmonocapas de células RTgill-W1 en biochips de fluidos en un biosensor ECIS se describen aquí. Los biochips de fluidos se pueden almacenar durante un máximo de 9 meses en un estado refrigerado y pueden ser enviados en un contenedor de almacenamiento en frío, para la prueba de supplies.The de agua potable que acompañan a los lectores ECIS, o unidades de prueba, se envían por separado. Los biochips tienen dos componentes a ellos; una capa de policarbonato superior con dos canales de fluido separados, y una capa inferior electrónica que contiene cuatro electrodos por canal para detección de impedancia. Hay 10 electrodos de trabajo por la almohadilla; cada electrodo es de 250 micras de diámetro. Los biochips reunidos tienen conexiones de electrodo de oro para adquirir lecturas de impedancia cuando se inserta en la unidad de prueba ECIS. Cada uno de los dos canales en forma de U de fluidos cerrados llevará a cabo 2 ml de la suspensión celular RTgill-W1. La figura 2 muestra un biochip fluídico en el lector ECIS con una ampliación de una células confluentes en un único electrodo de detección.
Figura 2:.. Biochip neumático en ECIS lector área ampliada muestra una monocapa confluente de células RTgill-W1 en un único electrodo de detección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
1. Preparación de la Prueba de Materiales
NOTA: Con el fin de preparar los biochips para la prueba, varios matraces confluentes de células RTgill-W1 tiene que estar listo. Una buena estimación de la cantidad de frascos que se necesita es un confluente T175 matraz durante 16 biochips para ser sembradas.
- Realice los siguientes pasos en un armario de clase II biológica de seguridad (biohood) utilizando una técnica aséptica. Utilizar etanol al 70% para la desinfección del biohood y cualquier material colocado en la campana.
- Preparar sustrato fibronectina para los biochips fluídicos descongelando un vial 1 mg de fibronectina y diluir en 100 ml de estériles L 15-media para una concentración de 10 mg / ml. Congelar en alícuotas de 40 ml en tubos de 50 ml cónicos de polipropileno estériles a -20 ° C. Descongelar a temperatura ambiente varias horas antes de sembrar los biochips. Una vez descongelado, no volver a congelar.
- Preparar medios de cultivo celular mediante la adición de 50 ml de suero bovino fetal, 5 ml de 200 mM de una sup L-alanil-L-glutaminacomplemento, y 5 ml de una solución de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / ml y / ml 10 000 g de estreptomicina) stock a 500 ml de L 15-media. Esto dará lugar a 560 ml de medio de cultivo celular que contiene 9% de suero. Refrigerar.
Nota: Este será el medio de cultivo celular completo que se utiliza para los frascos de cultivo y los biochips.
- Los viales en polvo Medios
- Preparar con anticipación viales de 0,1 copita de tapa a presión que contienen 60 mg ± 0,5% de polvo de L-15ex usando un dispensador de polvo automatizado. Etiquetar los viales con la fecha en que se dispensa el polvo y viales refrigerar (en cantidades de 50) en bolsas de plástico metalizadas pueden volver a cerrar; que contienen cada uno tres 1 g de gel de sílice paquetes de desecación.
Nota: Los viales de L-15ex medios de comunicación en polvo se pueden hacer y se almacenan durante un máximo de 9 meses antes de la prueba.
- Preparar con anticipación viales de 0,1 copita de tapa a presión que contienen 60 mg ± 0,5% de polvo de L-15ex usando un dispensador de polvo automatizado. Etiquetar los viales con la fecha en que se dispensa el polvo y viales refrigerar (en cantidades de 50) en bolsas de plástico metalizadas pueden volver a cerrar; que contienen cada uno tres 1 g de gel de sílice paquetes de desecación.
- Hacer una solución de 100 ml de 20% de lejía por dilución de lejía de uso doméstico con agua desionizada (DI). Estiman que se necesitarán 5 ml de solución de cloro por cada biochip.
- Hacer conjuntos de tubos biochip mediante la reducción de 27 mm secciones de tubo biocompatible autoclavable (2 secciones para cada biochip para ser sembradas) y colocar los dos extremos del tubo con accesorios Luer de policarbonato de deslizamiento. Coloque los conjuntos de tubos en una bolsa de autoclave y la autoclave durante 8 minutos a 134 ° C. También tapones autoclave biochip (2 por biochip) en una bolsa separada en la misma configuración.
- agua DI autoclave durante 30 minutos at121 ° C.
Nota: Esta agua será utilizada para el lavado biochips después de la siembra. Estiman que serán necesarios 10 ml por cada biochip.
Nota: El volumen real de cada canal de biochip es de 2 ml, pero 5 ml de agua estéril se aclara a través de cada canal después de la eliminación de la solución de lejía. - Hacer conjuntos de tubos de inyección de la jeringa mediante la reducción de 27 mm secciones de tubo biocompatible y fijar accesorios de deslizamiento luer macho a ambos extremos de la tubería. Coloque los conjuntos de tubos en una bolsa de esterilización de papel sellado térmico y autoclave durante 8 minutos a 134 y# 176; C.
2. Procedimiento neumático biochip Siembra
Nota: Realizar todos los procedimientos en los que los biochips o los medios de comunicación se maneja de una cabina de seguridad biológica clase II utilizando una técnica aséptica.
- Veinticuatro horas antes de la siembra programada, eliminar los biochips de envasado fabricante en el biohood y colocar en estuches de instrumentos de plástico esterilizados.
- Esterilizar los biochips utilizando una solución de lejía al 20% de la siguiente
Nota: Históricamente, este procedimiento de blanqueo ha impedido el crecimiento de hongos en los biochips durante el almacenamiento a largo plazo en el caso de que la esterilización por plasma de los biochips hecho por el fabricante no era eficaz.- El uso de un 20 ml de jeringa estéril con una tubería de inyección de jeringa conjunto unido y trabajando en el biohood, inyectar 2 ml de la solución de cloro 20% en cada canal del biochip. Permitir a los biochips para sentarse durante 1 hora con la solución de cloro.
- Después de una hora, asp vacíoiRate la solución de cloro de ambos canales a través de un conjunto de deslizamiento luer macho estéril conectada a la tubería de succión de vacío. Utilice uno de los conjuntos de tubos biochip como un drenaje que se enjuaguen los biochips.
- Con una jeringa de 20 ml estéril conectada a un conjunto de inyección jeringa estéril, enjuague cada canal del chip con 5 ml de agua estéril, permitiendo que el exceso de agua se drene en un recipiente en el biohood. Entonces vacío aspirado fuera del agua como se acaba de describir para el blanqueo y coloque los biochips de nuevo en las cajas de los instrumentos de plástico y dejar en el biohood hasta sembrada con células al día siguiente.
- Sesenta minutos antes de la siembra de los biochips, inyectar 2 ml de la solución de fibronectina 10 mg / ml en cada canal del biochip. Dejar los biochips en el biohood de 60 min, y luego la aspiradora aspirado fuera de la fibronectina (como se describe en el paso 2.2.3) antes de la siembra el biochip con las células. Coloque dos secciones de los conjuntos de tubos estériles biochip (consultela sección 1.4) en los puertos de los biochips.
- Trypsinize uno confluentes RTgill-W1 matraz T175 por cada 16 biochips utilizando procedimientos descritos en la descripción del producto de lámina de la American Type Culture Collection (ATCC) 16.
- Aspirar los medios de comunicación del matraz (s) confluente de células.
- Enjuagar la capa de células con 15 ml de PBS y luego aspirar fuera.
- Añadir 6 ml de tripsina / EDTA a la capa de células en cada matraz T175 y permiten a las células trypsinize de ~ 5 min.
- Añadir 15 ml de medio de cultivo celular completo L-15 a cada matraz para detener la tripsinización.
- Se combinan las suspensiones de células en un recipiente estéril desechable.
Nota: El tamaño del envase puede variar de 150-500 ml, dependiendo de la cantidad de biochips se sembró. Estiman que se necesitarán 5 ml de suspensión celular por biochip.
- Retire ~ 1 ml de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga para el recuento. El uso de un microscopio de campo claro con un objecti 10Xve y un hemocitómetro, el recuento una alícuota de 10 l de las células y calcular el volumen de completa L-15 medios de cultivo celular necesaria para alcanzar una suspensión de células de 2,5 x 10 5 células / ml.
Nota: Si se utiliza la suspensión de células para sembrar matraces para continuar con la cultura, este sería el momento para hacerlo. Ajustar la concentración de la suspensión de células usando completa medios de cultivo celular L-15. - El uso de un estériles de 20 ml syringeattached a un conjunto de tubería de inyección de jeringa estéril (ver sección 1.6), inyectar 2,5 ml de la suspensión celular en el puerto exterior de cada canal del biochip (es decir, los puertos que no tienen el tubo adjunto), permitiendo que algunos de la suspensión de células extra para fluir fuera de la tubería en un contenedor de residuos en el biohood.
Nota: Esto asegurará que todo el canal y el tubo conectado se llena de la suspensión celular.- Crear un bucle cerrado para cada canal de biochip mediante la inserción del extremo libre de la manguera con el Fitti luerng en los puertos exteriores para cada canal.
- Limpie cualquier exceso de los medios de comunicación fuera de los circuitos cerrados con una toalla de papel humedecido con 70% de etanol y colocar los biochips de nuevo en la caja de plástico en un 20 ° C incubadora. Dé a cada biochip un número de identificación único.
- En los días 4 y 7, eliminar los biochips de la 20 ° C incubadora y reponer los medios de comunicación en todos los biochips con medios de cultivo celular completo L-15 de temperatura-equilibrada. Seguir el mismo procedimiento que en el paso 2.6, salvo el uso justo L-15 medios de cultivo celular en vez (sin suspensión de células). Coloque los biochips de nuevo en la incubadora de 20 ° C después de la alimentación el día 4.
- Después de la alimentación el día 7, retirar y desechar las mangueras de los chips e insertar los tapones de drenaje tratadas en autoclave en los biochips.
- Coloque los biochips en una caja en un incubador a 6 ° hasta que se usaron para la prueba.
Nota: Las fichas se pueden almacenar a temperaturas de refrigeración para un máximo de 9 meses y siguen siendo viables para i prueban los lectores ECIS.
3. Prueba de ECIS con biochips
- Preparar sustancias químicas de prueba si se utiliza. (Ver Brennan, et al., 2012 7 para la preparación de productos químicos de ensayo).
- Retire lector de ECIS y materiales de prueba a partir de la caja de transporte. Retirar un biochip preparado desde el 6 ° C incubadora. Coloque el biochip en una toalla de papel. Encender el lector de ECIS.
- El uso de jeringas de 10 ml, dispensar 10 ml de agua de control en un 0,5 oz marcado frasco de plástico transparente de control y 10 ml de la muestra de ensayo en un 0,5 oz jarra de prueba clara plástica etiquetada.
Nota: 1) Asegúrese de eliminar las burbujas para una medición precisa. 2) Las jeringas y frascos están codificados por color; azul para el control y el rojo para la prueba. - Retire los dos viales de medios de comunicación en polvo de las bolsas de papel de aluminio. Abre uno de los viales de comunicación en polvo (el uso de herramientas de usos múltiples, si es necesario) y verter todo el contenido de un vial en el frasco con agua de control, dejando caer todo el frasco ensolución también. Repita este procedimiento con la jarra de prueba. Tapar y agitar los frascos para asegurar que el polvo se disuelva.
- Llenar cada uno de los colores jeringas de 10 ml con 9 ml de cualquiera de control (jeringa azul) o soluciones de respectivos viales de prueba (jeringa rojo). Eliminar las burbujas de aire de las jeringas.
- Retire los tapones de los puertos de biochips y conectar el desagüe.
- Coloque el biochip en la bandeja de plástico extraíble en el lector ECIS y cierre la tapa.
- Adjuntar jeringas llenas a los puertos de biochips exteriores y conecte el émbolo de la jeringa.
- En la pantalla principal, seleccione "SIGUIENTE" para iniciar la pre-prueba.
Nota: El software lector comprobará impedancias. Si impedancias están dentro del rango establecido por el usuario (por lo general entre 1.000 y 3.000 ohmios) la pantalla se registrará "Cartucho Passed" como se indica en la figura 3, e instruir al usuario que seleccione "Siguiente" y el software pasará a la etapa 3.10). Si las impedancias no están dentro deel rango de ajuste debido a un biochip defectuoso o conexión defectuosa del biochip para el lector (por lo general debido a una mala alineación de los electrodos), a continuación, la pantalla se registrará "Cartucho Error" y el usuario tendrá la opción de "Cancelar" o "Verificar" la prueba.- Seleccione "Cancelar" para volver al paso 3.9). Seleccione "Verificar" para continuar con el paso 3.10) después de recibir un mensaje de "Cartucho Passed" y seleccionar "Siguiente".
Nota: Es mejor tomar el biochip y visualmente inspeccione si tiene defectos o fugas si un "cartucho falló" mensaje es recibido antes de proceder a un nuevo biochip.
- Seleccione "Cancelar" para volver al paso 3.9). Seleccione "Verificar" para continuar con el paso 3.10) después de recibir un mensaje de "Cartucho Passed" y seleccionar "Siguiente".
Figura 3:. ECIS lector de pantalla de un biochip con lecturas de la impedancia aceptables La captura de pantalla muestra las lecturas de impedancia en ohmios iniciales de cada uno de los 4 coNTROL electrodos (CE) y 4 electrodos de muestras de ensayo (SE) dentro del biochip de fluidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Cuando se le solicite por el lector, introducir información de la muestra usando un teclado en pantalla y luego seleccione "Aceptar" cuando haya terminado.
Nota: El software lector de ECIS sellará automáticamente cada conjunto de datos con la fecha, hora y otra información introducida por el usuario; tales como el número biochip, y el tipo de producto químico y la concentración. Dos minutos de datos de impedancia se recoge del biochip insertado y un temporizador en la pantalla de cuenta regresiva del tiempo. - Después de dos minutos cuando se lo solicite instrucciones que aparecen en pantalla que parpadean dentro de un cuadro rojo, pulsar "NEXT". Cuando se le pregunte por una caja verde parpadeante "inyectar muestras ahora", inyectar el control y los medios de prueba desde las jeringas unidas simultáneamente en el biochip channels. Deje las jeringas en su lugar en los biochips cuando haya terminado.
Nota: Los valores de impedancia serán recogidos una vez por minuto durante 60 minutos. Si el software lector de ECIS determina que el canal de tratamiento es estadísticamente diferente del canal de control en cualquier punto entre 10 y 60 minutos después del comienzo de la prueba, a continuación, la visualización en pantalla indicará que la muestra está "contaminado". Si el tratamiento no es diferente de la del canal de control, a continuación, la pantalla indicará "no hay contaminación detectado" al final de la prueba de funcionamiento. - resultados de las pruebas de récords como contaminada o no contaminados para cada muestra.
- Al final de la prueba de funcionamiento, retirar y desechar el biochip. Enjuague y seque al aire las jeringas, viales de ensayo y bandeja de plástico extraíble que albergaba el biochip durante las pruebas.
Nota: El lector de ECIS tiene 4 GB de almacenamiento a bordo para el software operativo, los modelos de control y los archivos de prueba generados a partir de la ejecución de un ensayo. Esto permite varios THousand archivos de prueba para ser almacenados en el lector. Los archivos pueden ser recuperados con una unidad de salto USB y transferir a un ordenador para su posterior análisis con fines de investigación, si se desea.
Representative Results
La tecnología ECIS se describe en el presente documento se sometió a pruebas en la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) patrocinada Testing Programa de Tecnología y Evaluación (TTEP). Se seleccionaron trece productos químicos para probar como representantes de un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos que podrían ser posibles contaminantes del agua potable. Durante las pruebas, 9 de los 13 fueron detectados por ECIS dentro de una hora a concentraciones que son relevantes para la salud humana 8. La Tabla 1 muestra los resultados de este ensayo contaminante. La figura 4 es representativo de lo que es un "contaminado" resultado será similar en la pantalla lector de ECIS. En su mayor parte, las impedancias celulares disminuyeron para las muestras contaminadas, en comparación con los controles. En ocasiones, ciertos compuestos pueden causar un aumento en la impedancia.
También se resumen en la Tabla 1 Figura 5) para una captura de pantalla representativa de "No hay contaminación detectado".
Figura 4: ECIS lector de pantalla de un "contaminado" Muestra de agua Un ejemplo de gráficos normalizados de impedancia y los resultados de una muestra de agua que estaba contaminada.. Las líneas azules representan impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de control; líneas rojas representan las impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de la muestra de prueba. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ECIS lector de pantalla de un "no hay contaminación detectado" Muestra de agua Un ejemplo de gráficos normalizados de impedancia y los resultados de una muestra de agua que no estaba contaminada.. Las líneas azules representan impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de control; líneas rojas representan las impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de la muestra de prueba. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Categoría | contaminante | Concentración ensayada (mg / L) 1 | Detectado ≤1 hora n = 4/4 virutas | |||
| Los pesticidas | aldicarb | 0.17 | no | |||
| Arsen ic (arsenito de sodio) | 4.5 | sí | ||||
| Azida (azida de sodio) | 46.7 | sí | ||||
| fenamifos | 0.56 | no | ||||
| metamidofos | 1.4 | no | ||||
| El metil paratión | 33.6 | sí | ||||
| Paraquat (dicloruro de) | 4.6 | no | ||||
| Pentaclorofenato (sodio) | 71.9 | sí | ||||
| Productos químicos industriales | Amoníaco | 924 | sí | |||
| Copper (sulfato de cobre II) | 103 | sí | ||||
| El cianuro (sodio) | 3 "> 14sí | |||||
| Mercurio (cloruro) | 24.7 | sí | ||||
| tolueno | 444 | sí | ||||
| El agua limpia 2 | ninguna | N / A | no | |||
| 1 concentraciones ensayadas son los mismos que en el manuscrito por Widder, et al. (2014). | ||||||
| 2 40 muestras de agua limpia se llevaron a cabo sin contaminación. | ||||||
Tabla 1: Los contaminantes en muestras de agua detectado por ECIS.
Discussion
La tecnología ECIS tuvo un buen desempeño en un entorno de laboratorio y fue capaz de detectar posibles contaminantes del agua en concentraciones que son relevantes para la salud humana. La portabilidad y el embalaje de la tecnología hace que sea propicio para el uso en el campo.
Los pasos críticos en el protocolo para el éxito de la tecnología son los siguientes: 1) Mantener condiciones asépticas durante el cultivo, la siembra, y la alimentación de los biochips, 2) Mantener los biochips sembradas en condiciones refrigeradas hasta que esté listo para la prueba ya que las células RTgill-W1 no sobrevivir mucho tiempo una vez que se someten a temperaturas por encima de 25 ° C, 3) pesar con precisión la L-15ex en los viales de los medios en polvo y medir con precisión las muestras de agua para evitar la producción de falsos positivos, que pueden ser causados por un cambio en la osmolalidad de los medios de comunicación en lugar de la toxicidad de la muestra, 4) Siga las instrucciones del usuario en la pantalla ECIS para ejecutar las pruebas. El software en el lector alertará al usuario si un biochip es inaceptable para las pruebas (en base a las lecturas iniciales de impedancia) cuando el biochip se inserta primero en el lector. Si los niveles de impedancia son inaceptables para la prueba, el software no permitirá que el usuario para proceder con la prueba hasta que se utiliza un nuevo biochip. Las razones para las lecturas de impedancia inaceptables son por lo general debido a una ligera falta de alineación de los electrodos biochip con los pasadores lector ECIS o fugas de fluido a lo largo de uno de los bordes de encolado del biochip.
Hay algunos límites a esta tecnología debido a que el sensor de ECIS sólo se ha probado con agua potable y no con las aguas superficiales. Las células RTgill-W1 que se encuentran en el biochip no pueden tolerar la congelación o las temperaturas muy por encima de 25 ° C durante períodos prolongados de tiempo (período de tiempo puede ser de horas o días dependiendo de la temperatura. Los biochips funcionan mejor en un rango de temperatura de refrigeración de 7 temperatura ambiente. Ellos están listos para su uso inmediato, sin embargo, justo después de haber sido removed de una cámara frigorífica. contenedores portátiles de almacenamiento en frío son utilizados actualmente por personal del Ejército en el campo de los suministros sensibles a la temperatura. Estos mismos contenedores se pueden utilizar para el transporte biochip cabeza de serie.
Otro límite para esta tecnología es que a pesar de que es un sensor de toxicidad de banda ancha, no responden bien, en todo caso, a los compuestos inhibidores de la colinesterasa, tales como algunos pesticidas. Para llenar este vacío capacidad, el sensor ECIS está diseñado para ser utilizado conjuntamente con un ensayo de prueba rápida de pesticidas disponibles en el comercio cuando el análisis de muestras de agua con el fin de proporcionar al usuario una gama más amplia de pruebas de toxicidad. El kit es un ensayo enzimático rápido diseñado para detectar pesticidas organofosforados y carbamatos dentro de 30 min.
El sensor de ECIS complementa el wqas-PM (Sistema de Análisis de la Calidad del Agua - Medicina Preventiva) Sistema de prueba de agua en el campo, utilizado actualmente por personal de medicina preventiva para detectar militares, Arsenic, plomo, o cianuro en una muestra de agua potable. Aunque el sensor ECIS no va a identificar lo que es el contaminante, se indicará si ciertos metales o compuestos orgánicos están presentes, lo que indica que el agua puede no ser adecuado para el consumo humano. Los resultados de la prueba ECIS están disponibles dentro de una hora. Las muestras de agua a continuación, pueden ser enviados para su posterior análisis para la identificación del contaminante, si se obtiene un resultado positivo de la prueba.
Como se describió anteriormente, el lector ECIS está diseñado para ser parte de un sistema que incluye un kit de ACE enzimática separado con el fin de cubrir un amplio espectro de detección de contaminantes. Ambos de estos lectores están siendo empaquetados en una caja resistente para transporte de campo para uso en campo por los soldados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70% ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 ml syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 g silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing. |
| 50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C. |
| NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com |
ACE-400 | Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water |
References
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