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तैयारी और का परीक्षण मुक़ाबला आधारित विषाक्तता के लिए पीने के पानी के नमूने लिए रैपिड मूल्यांकन RTgill-W1 कोशिकाओं के साथ Fluidic biochips

Published: March 7, 2016 doi: 10.3791/53555
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1U.S. Army Center for Environmental Health Research, 2Nanohmics, Inc.

Introduction

समग्र लक्ष्य सेल बोने, ECIS biosensor में भंडारण और fluidic biochips के परीक्षण के लिए एक विधि विकसित करने के लिए किया गया था। इस biosensor के विकास के लिए लक्ष्य के लिए एक क्षेत्र पोर्टेबल डिवाइस है कि पीने के पानी की आपूर्ति के संभावित संक्रमण पता लगा सकता है सैनिकों द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए अमेरिकी सेना के विनिर्देशों को पूरा करने के लिए किया गया था। सेंसर विषाक्तता के लिए आवश्यकताओं थे कि यह विषाक्त औद्योगिक यौगिकों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम तेजी से (एक घंटे के भीतर) मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक सांद्रता में, पता लगा सकता है कि इस उपकरण के क्षेत्र पोर्टेबल होना, और जैविक घटकों के एक शैल्फ जीवन के लिए होता है कम से कम नौ महीने। प्रशीतन, लेकिन ठंड नहीं, खराब होने के घटकों स्वीकार्य था।

ऐतिहासिक रूप से उन्हें एक जैविक घटक के साथ क्षेत्र पोर्टेबल जल परीक्षण प्रौद्योगिकियों (जैसे एंटीबॉडी, एंजाइमों, या न्यूक्लिक एसिड के रूप में) analyte-विशिष्ट 1-3 कर दिया गया है। biosensors के इन प्रकार के नुकसान यह है कि वे onl जाएगाy एक समय में रासायनिक का एक प्रकार का पता लगाने। यदि यह संदेह होता है कि एक से अधिक रासायनिक मौजूद है कई सेंसर की जरूरत है। एक विशिष्ट सेंसर परीक्षण प्रदर्शनों की सूची में नहीं है, तो पानी में रासायनिक contaminants आसानी से नहीं चल पाता जा सकते हैं।

व्यापक आधार वाली विषाक्तता सेंसर, दूसरे हाथ पर, संभावित इस प्रौद्योगिकी की खाई को भरने के लिए है। ये आम तौर पर उन्हें 4-8 करने के लिए एक सेलुलर घटक है। व्यापक आधार वाली विषाक्तता biosensors के लाभ है कि वे मिश्रण और अज्ञात, 5,9,10 समय की एक अपेक्षाकृत कम समय में रासायनिक contaminants सहित, की एक विस्तृत सरणी की उपस्थिति का पता लगा सकते हैं।

एक संभव विषाक्तता सेंसर, जो भी बिजली सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ECIS) के रूप में जाना जाता है के रूप में सेल monolayers के बिजली प्रतिबाधा के माप का उपयोग करने की अवधारणा है, पहले Giaever और Keese 11 से वर्णित किया गया था। पिछले दो दशकों में यह सेल viab का एक संवेदनशील सूचक होना दिखाया गया हैबड़प्पन और cytotoxicity। असल में, सेल monolayer कि biochips पर इलेक्ट्रोड का पालन किया है और उच्च आवृत्ति कम वोल्टेज और amperage बारी वर्तमान संकेत के संपर्क में है। कोशिकाओं का मिला हुआ monolayer इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह में बाधा उत्पन्न करती। जब सेल monolayer की अखंडता (जैसे कि जब एक जहरीले रसायन के रूप में पेश किया जाता है) समझौता किया है, ECIS सेंसर विद्युत प्रतिबाधा में एक परिवर्तन रिकॉर्ड 11-14। चित्रा 1 biochip पर सेल monolayer के संबंध में ECIS के सिद्धांत को दिखाता है ।

आकृति 1
चित्रा 1:।। सरलीकृत ECIS पाठक बिजली योजनाबद्ध के साथ एक biochip पर एक सेल monolayer के ECIS चित्रण का सिद्धांत यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

12 में वर्णित में इस्तेमाल किया गया। इन कोशिकाओं, क्षेत्र में उपयोग के लिए व्यावहारिक नहीं थे तथापि, क्योंकि वे लगातार मीडिया में परिवर्तन की आवश्यकता है, एक सीमित शैल्फ जीवन था, और एक कृत्रिम सीओ 2 के माहौल और एक 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन तापमान की आवश्यकता है। यह पाया गया है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइन इंद्रधनुष गिल उपकला कोशिकाओं (RTgill डब्ल्यू -1 कोशिकाओं) से प्राप्त होता परिवेश सीओ 2 में कमरे के तापमान पर परीक्षण किया जा सकता है, biochips में एक मिला हुआ monolayer का गठन, प्रशीतित तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है, और मानव स्वास्थ्य के 12 के लिए प्रासंगिक सांद्रता में एक तेजी से प्रतिक्रिया (1 घंटा या इससे कम) रसायनों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए किया था। विष विज्ञान में RTgill-W1 कोशिकाओं के आवेदन, के रूप में अच्छी तरह से बुनियादी अनुसंधान के रूप में, ली एट अल द्वारा समीक्षा की जाती है। 15

बोने, भंडारण और युक्त fluidic biochips के परीक्षण के लिए तरीकेएक ECIS biosensor में fluidic biochips पर RTgill-W1 कोशिकाओं के monolayers यहाँ वर्णित हैं। fluidic biochips एक प्रशीतित राज्य में अप करने के लिए 9 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है और, एक कोल्ड स्टोरेज कंटेनर में भेज दिया जा सकता ECIS पाठकों पीने के पानी SUPPLIES.THE के साथ, या परीक्षण इकाइयों के परीक्षण के लिए अलग से भेज रहे हैं। biochips उन्हें दो घटक है; दो अलग-अलग चैनलों के तरल पदार्थ, और एक कम इलेक्ट्रॉनिक परत है कि प्रतिबाधा संवेदन के लिए चैनल के अनुसार चार इलेक्ट्रोड पैड शामिल है के साथ एक ऊपरी परत पॉली कार्बोनेट। वहाँ पैड प्रति 10 कार्य इलेक्ट्रोड होते हैं; प्रत्येक इलेक्ट्रोड व्यास में 250 माइक्रोन है। इकट्ठे biochips जब ECIS परीक्षण इकाई में डाला प्रतिबाधा रीडिंग प्राप्त करने के लिए सोने इलेक्ट्रोड कनेक्शन है। दो संलग्न fluidic यू के आकार चैनलों में से प्रत्येक RTgill-W1 सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर आयोजित करेगा। चित्रा 2 एक एकल संवेदन इलेक्ट्रोड पर एक मिला हुआ कोशिकाओं का एक बढ़ाई साथ ECIS रीडर में एक fluidic biochip पता चलता है।


चित्रा 2:।। ECIS रीडर में fluidic Biochip बढ़ाया क्षेत्र एक भी संवेदन इलेक्ट्रोड पर RTgill-W1 कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer से पता चलता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

1. टेस्ट सामग्री की तैयारी

नोट: आदेश के परीक्षण के लिए तैयार करने के लिए biochips में, RTgill-W1 कोशिकाओं के कई मिला हुआ बोतल तैयार होने की जरूरत है। जरूरत बोतल की संख्या का एक अच्छा अनुमान एक मिला हुआ T175 कुप्पी के लिए 16 biochips वरीयता प्राप्त किया जा रहा है।

  1. एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट (biohood) सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने में निम्न चरणों का प्रदर्शन। biohood और किसी भी सामग्री हुड में रखा disinfecting के लिए 70% इथेनॉल का प्रयोग करें।
    1. फ़ाइब्रोनेक्टिन की एक 1 मिलीग्राम शीशी विगलन और 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए बाँझ एल -15 मीडिया की 100 मिलीलीटर में गिराए द्वारा fluidic biochips के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन सब्सट्रेट तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब में 40 मिलीलीटर aliquots में रुक। biochips बोने से पहले कमरे के तापमान पर कई घंटे पहले गला लें। एक बार thawed, refreeze नहीं है।
    2. 200 के 5 मिलीलीटर मिमी एक एल alanyl-एल glutamine समर्थन भ्रूण गोजातीय सीरम के 50 मिलीलीटर, जोड़कर सेल संस्कृति मीडिया तैयारplement, और एक पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 5 मिलीलीटर (10,000 इकाइयों पेनिसिलिन / एमएल और 10,000 माइक्रोग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल) के एल -15 मीडिया के 500 मिलीलीटर के लिए शेयर। यह 9% सीरम युक्त सेल संस्कृति मीडिया की 560 मिलीलीटर निकलेगा। ठण्डा।
      नोट: यह पूरा सेल संस्कृति संस्कृति बोतल और biochips के लिए इस्तेमाल किया मीडिया होगा।
  2. पाउडर मीडिया शीशियों
    1. समय से आगे 0.1 घूंट स्नैप-टोपी एक स्वचालित पाउडर निकालने की मशीन का उपयोग कर ± एल 15ex पाउडर के 0.5% से 60 मिलीग्राम से युक्त शीशियों तैयार करें। तारीख पाउडर तिरस्कृत किया गया था और सर्द शीशियों recloseable metalized पाली बैग में (50 की मात्रा में) के साथ शीशियों लेबल; प्रत्येक युक्त तीन 1 ग्राम सिलिका जेल सुखाना पैक।
      नोट: एल-15ex पाउडर मीडिया शीशियों बनाया और परीक्षण के अग्रिम में अप करने के लिए 9 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  3. विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ घरेलू ब्लीच गिराए द्वारा 100 मिलीलीटर 20% ब्लीच का समाधान करें। अनुमान है कि ब्लीच समाधान के 5 मिलीलीटर प्रत्येक द्वि लिए आवश्यक हो जाएगाochip।
  4. 27 मिमी autoclavable biocompatible ट्यूबिंग (प्रत्येक biochip के लिए 2 वर्गों वरीयता प्राप्त किया जाना है) के कुछ वर्गों में कटौती करके biochip ट्यूबिंग विधानसभाओं बनाओ और पॉली कार्बोनेट पर्ची Luer फिटिंग के साथ ट्यूब के दोनों सिरों से फिट है। 134 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए एक autoclavable बैग और आटोक्लेव में ट्यूबिंग विधानसभाओं रखें। एक ही सेटिंग में भी आटोक्लेव biochip प्लग (2 biochip प्रति) एक अलग बैग में।
  5. डिग्री सेल्सियस at121 30 मिनट के लिए आटोक्लेव डि पानी।
    नोट: यह पानी बोने के बाद biochips धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। अनुमान है कि 10 मिलीलीटर प्रत्येक biochip लिए आवश्यक हो जाएगा।
    नोट: प्रत्येक biochip चैनल की वास्तविक मात्रा 2 मिलीलीटर है, लेकिन बाँझ पानी के 5 मिलीलीटर ब्लीच समाधान को हटाने के बाद प्रत्येक चैनल के माध्यम से rinsed है।
  6. 27 मिमी biocompatible ट्यूबिंग के वर्गों में कटौती और ट्यूबिंग के दोनों सिरों के लिए पुरुष पर्ची Luer फिटिंग संलग्न द्वारा इंजेक्शन सिरिंज ट्यूबिंग विधानसभाओं बनाओ। 134 और 8 मिनट के लिए एक कागज गर्मी सील नसबंदी पाउच और आटोक्लेव में ट्यूबिंग विधानसभाओं की जगह# 176; सी।

2. Fluidic Biochip सीडिंग प्रक्रिया

नोट: सभी प्रक्रियाओं जहां biochips या मीडिया के एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए कैबिनेट में नियंत्रित किया जाता है प्रदर्शन करना।

  1. अनुसूचित बोने से पहले चौबीस घंटा, biohood में निर्माता पैकेजिंग और निष्फल प्लास्टिक साधन मामलों में जगह से biochips को हटा दें।
  2. एक 20% ब्लीच समाधान का उपयोग कर के रूप में निम्नानुसार biochips जीवाणुरहित
    नोट: ऐतिहासिक दृष्टि से, इस घटना विरंजन प्रक्रिया में लंबी अवधि के भंडारण के दौरान biochips में कवक विकास को रोका गया है कि biochips निर्माता द्वारा किया प्लाज्मा नसबंदी प्रभावी नहीं था।
    1. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज एक इंजेक्शन टयूबिंग के साथ बाँझ सिरिंज विधानसभा जुड़ी है और biohood में काम करने का उपयोग करना, biochip के प्रत्येक चैनल में 20% ब्लीच समाधान के 2 मिलीलीटर इंजेक्षन। biochips ब्लीच समाधान के साथ 1 घंटे के लिए बैठने के लिए अनुमति दें।
    2. एक घंटे, वैक्यूम एएसपी के बादएक बाँझ पुरुष पर्ची Luer विधानसभा वैक्यूम सक्शन ट्यूबिंग से जुड़ी का उपयोग करते हुए दोनों चैनलों से ब्लीच समाधान क्रुद्ध। एक नाली के रूप में biochip ट्यूबिंग विधानसभाओं में से एक का प्रयोग करें जब biochips rinsing।
    3. एक बाँझ 20 मिलीलीटर एक बाँझ सिरिंज इंजेक्शन विधानसभा से जुड़ी सिरिंज का प्रयोग, बाँझ पानी की 5 मिलीलीटर के साथ चिप के प्रत्येक चैनल फ्लश, अतिरिक्त पानी biohood में एक कंटेनर में पलायन करने की अनुमति देता है। फिर पानी सिर्फ ब्लीच के लिए वर्णित और biochips प्लास्टिक साधन मामलों में वापस जगह है और जब तक अगले दिन कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त biohood में छोड़ के रूप में बंद वैक्यूम महाप्राण।
  3. साठ मिनट, biochips बोने biochip के प्रत्येक चैनल में 10 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान के 2 मिलीलीटर इंजेक्षन करने से पहले। 60 मिनट के लिए biohood में biochips छोड़ दो, और फिर कोशिकाओं के साथ biochip बोने से पहले (कदम 2.2.3 में वर्णित) फ़ाइब्रोनेक्टिन बंद महाप्राण शून्य। बाँझ biochip ट्यूबिंग विधानसभाओं के दो वर्गों (जगह के लिए देखेंbiochips के बंदरगाहों पर धारा 1.4)।
  4. अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC) उत्पाद विवरण चादर 16 में उल्लिखित प्रक्रियाओं का उपयोग हर 16 biochips के लिए एक मिला हुआ RTgill-W1 T175 कुप्पी Trypsinize।
    1. कोशिकाओं का मिला हुआ कुप्पी (एस) से मीडिया से दूर महाप्राण।
    2. पीबीएस के 15 मिलीलीटर के साथ सेल परत कुल्ला और फिर बंद aspirate।
    3. प्रत्येक T175 फ्लास्क में सेल परत करने के लिए trypsin / EDTA के 6 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं ~ 5 मिनट के लिए trypsinize करने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. प्रत्येक फ्लास्क पूरा एल -15 सेल संस्कृति मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ें trypsinization को रोकने के लिए।
    5. एक बाँझ प्रयोज्य कंटेनर में सेल निलंबन का मिश्रण।
      नोट: कंटेनर आकार 150-500 मिलीलीटर, biochips की संख्या वरीयता प्राप्त किया जा रहा है पर निर्भर से भिन्न हो सकते हैं। अनुमान है कि सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर प्रति biochip की जरूरत होगी।
  5. सेल निलंबन के ~ 1 मिलीलीटर निकालें और गिनती के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में जगह है। एक 10X objecti साथ एक brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग करनाve और एक hemocytometer, कोशिकाओं की एक 10 μl विभाज्य गिनती और पूर्ण एल -15 सेल संस्कृति 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए जरूरी मीडिया की मात्रा की गणना।
    नोट: सेल निलंबन का उपयोग जारी रखने के लिए संस्कृति बोतल बीज के लिए करते हैं, तो यह ऐसा करने के लिए बिंदु होगा। पूरा एल -15 सेल संस्कृति मीडिया का उपयोग सेल निलंबन एकाग्रता को समायोजित करें।
  6. एक बाँझ 20 मिलीलीटर एक बाँझ सिरिंज इंजेक्शन ट्यूबिंग विधानसभा (1.6 खंड देखें) syringeattached का प्रयोग, biochip के प्रत्येक चैनल के बाहरी बंदरगाह में इंजेक्षन सेल निलंबन के 2.5 मिलीलीटर (यानी, बंदरगाहों कि ट्यूबिंग संलग्न नहीं है), अतिरिक्त सेल निलंबन के कुछ biohood में एक अपशिष्ट कंटेनर में ट्यूबिंग से बाहर प्रवाह करने की इजाजत दी।
    नोट: यह सुनिश्चित होगा कि पूरे चैनल और संलग्न ट्यूबिंग सेल निलंबन का पूरा हो जाएगा।
    1. Luer fitti के साथ नली के मुक्त अंत डालने से प्रत्येक biochip चैनल के लिए एक संलग्न पाश बनाएंप्रत्येक चैनल के लिए बाहरी बंदरगाहों में एनजी।
    2. एक कागज तौलिया 70% इथेनॉल के साथ सिक्त के साथ बंद छोरों के बंद किसी भी अतिरिक्त मीडिया साफ कर लें और biochips एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लास्टिक के डिब्बे में वापस जगह है। प्रत्येक biochip एक अनूठी पहचान संख्या दीजिए।
  7. दिन 4 और 7 पर, 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से हटा दें और biochips तापमान equilibrated पूरा एल -15 सेल संस्कृति मीडिया के साथ biochips के सभी में मीडिया की भरपाई होगी। उपयोग को छोड़कर 2.6 कदम सिर्फ एल -15 सेल संस्कृति मीडिया के बजाय (कोई सेल निलंबन) के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें। दिन 4 खिलाने के बाद 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में biochips वापस प्लेस।
    1. दिन 7 खिलाने के बाद, हटाने और चिप्स से hoses त्यागने और biochips में autoclaved नाली प्लग डालें।
    2. जब तक परीक्षण के लिए इस्तेमाल एक 6 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक बॉक्स में biochips रखें।
      नोट: चिप्स अप करने के लिए 9 महीनों के लिए प्रशीतित तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है और अभी भी परीक्षण मैं के लिए व्यवहार्य हैंn ECIS पाठकों।

3. biochips साथ ECIS परीक्षण

  1. यदि का उपयोग कर परीक्षण रसायन तैयार करें। (देखें ब्रेनन, एट अल।, परीक्षण रसायन की तैयारी के लिए 2012 7)।
  2. ले जाने के मामले से ECIS पाठक और परीक्षण की आपूर्ति निकालें। 6 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से एक तैयार biochip निकालें। एक कागज तौलिया पर biochip रखें। ECIS पाठक चालू करें।
  3. 10 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग करना, एक लेबल 0.5 औंस स्पष्ट प्लास्टिक जार में नियंत्रण नियंत्रण पानी की 10 मिलीलीटर और एक लेबल 0.5 औंस स्पष्ट प्लास्टिक जार में परीक्षण परीक्षण के नमूने के 10 मिलीलीटर बांटना।
    नोट: 1) एक सटीक माप के लिए बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। 2) सीरिंज और जार कलर-कोडेड कर रहे हैं; नियंत्रण और परीक्षण के लिए लाल रंग के लिए नीले रंग की।
  4. पन्नी बैग से दो पाउडर मीडिया शीशियों निकालें। पाउडर मीडिया शीशियों में से एक (प्रयोग बहुउद्देशीय उपकरण यदि आवश्यक हो तो) और नियंत्रण के पानी के साथ जार में एक शीशी की सारी सामग्री डाल, में पूरे शीशी छोड़ने ओपनसमाधान के रूप में अच्छी तरह से। परीक्षण जार के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ। कैप और जार हिला सुनिश्चित करने के लिए कि पाउडर भंग कर रहा है।
  5. या तो नियंत्रण (नीला सिरिंज) या टेस्ट (लाल सिरिंज) संबंधित शीशियों से समाधान के 9 मिलीलीटर के साथ रंग का 10 मिलीलीटर सीरिंज से प्रत्येक भरें। सीरिंज से हवाई बुलबुले निकालें।
  6. biochip बंदरगाहों से प्लग निकालें और नाली देते हैं।
  7. ECIS रीडर में हटाने योग्य प्लास्टिक ट्रे में रखें biochip और ढक्कन बंद कर दें।
  8. बाहरी biochip बंदरगाहों के लिए भरा सीरिंज देते हैं और सिरिंज सवार देते हैं।
  9. मुख्य स्क्रीन से, "अगले" का चयन पूर्व परीक्षण आरंभ करने के लिए।
    नोट: रीडर सॉफ्टवेयर impedances की जाँच करेगा। Impedances उपयोगकर्ता (1000 और 3000 के बीच आमतौर पर ओम) स्क्रीन रजिस्टर करेंगे द्वारा निर्धारित सीमा के भीतर कर रहे हैं के रूप में 3 चित्र में संकेत दिया है, और चयन करने के लिए "अगला" उपयोगकर्ता को हिदायत और सॉफ्टवेयर 3.10 कदम के लिए) आगे बढ़ना होगा "कारतूस पारित"। impedances के भीतर नहीं कर रहे हैंएक दोषपूर्ण biochip या पाठक (आमतौर पर इलेक्ट्रोड की एक misalignment के कारण) को biochip की दोषपूर्ण कनेक्शन की वजह से सेट रेंज, तो स्क्रीन रजिस्टर करेंगे "कारतूस असफल" और उपयोगकर्ता के लिए या तो "गर्भपात" का विकल्प होगा या "सत्यापित करें" परीक्षण।
    1. 3.9 कदम के लिए) वापस जाने के लिए "गर्भपात" का चयन करें। "सत्यापित करें" का चयन करने के लिए कदम 3.10) एक "कारतूस पारित" संदेश प्राप्त करने और "अगला" चयन करने के बाद आगे बढ़ने के लिए।
      नोट: यह सबसे अच्छा है biochip बाहर ले और नेत्रहीन दोष या लीक यदि एक "कारतूस विफल" संदेश एक नया biochip के साथ आगे बढ़ने से पहले प्राप्त होता है के लिए यह निरीक्षण किया।

चित्र तीन
चित्रा 3:। स्वीकार्य मुक़ाबला रीडिंग के साथ एक Biochip की ECIS रीडर स्क्रीनशॉट स्क्रीनशॉट 4 सह में से प्रत्येक के ओम में प्रारंभिक प्रतिबाधा रीडिंग से पता चलता हैntrol इलेक्ट्रोड (सीई) और 4 परीक्षण नमूना इलेक्ट्रोड (एसई) fluidic biochip के भीतर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पाठक से प्रेरित है, एक नरम कीबोर्ड का उपयोग नमूना जानकारी दर्ज करें और फिर जब समाप्त चुनें "स्वीकार"।
    नोट: ECIS पाठक सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से तिथि, समय और अन्य जानकारी उपयोगकर्ता द्वारा दर्ज साथ प्रत्येक डाटासेट टिकट जाएगा; ऐसे biochip संख्या, और रासायनिक और एकाग्रता के प्रकार के रूप में। प्रतिबाधा डेटा के दो मिनट डाला biochip से एकत्र किया जाएगा और एक परदे पर टाइमर गिनती-नीचे होगा समय।
  2. दो मिनट जब स्क्रीन पर निर्देशों है कि एक लाल बॉक्स के भीतर चमकता रहे द्वारा प्रेरित करने के बाद, "अगले" मारा। "नमूने अब इंजेक्षन" करने के लिए एक चमकती हरे बॉक्स से प्रेरित है, biochip Chann में एक साथ संलग्न सीरिंज से नियंत्रण और परीक्षण मीडिया इंजेक्षनएल्स। biochips पर जगह में छोड़ दो सीरिंज जब समाप्त हो गया।
    नोट: मुक़ाबला मूल्यों 60 मिनट के लिए एक बार प्रति मिनट एकत्र किया जाएगा। ECIS पाठक सॉफ्टवेयर निर्धारित करता है कि इलाज के चैनल सांख्यिकीय रूप से परीक्षण की शुरुआत के बाद 10 और 60 मिनट के बीच किसी भी बिंदु पर नियंत्रण चैनल से अलग है, तो परदे पर प्रदर्शन से संकेत मिलता है कि नमूना "दूषित है।" यदि उपचार नियंत्रण चैनल से अलग नहीं है, तो स्क्रीन "कोई संदूषण का पता चला" परीक्षण चलाने के अंत में संकेत जाएगा।
  3. दूषित है या नहीं के रूप में रिकार्ड परीक्षण के परिणाम के प्रत्येक नमूना के लिए दूषित।
  4. परीक्षण चलाने के अंत में, हटाने और biochip त्यागें। कुल्ला और सीरिंज, परीक्षण शीशियों और हटाने योग्य प्लास्टिक ट्रे जो परीक्षण के दौरान biochip रखे हवा सूखी।
    नोट: ECIS पाठक परिचालन सॉफ्टवेयर के लिए जहाज पर भंडारण की 4 जीबी की है, नियंत्रण मॉडल और परीक्षण फ़ाइलें एक परीक्षण चलने से उत्पन्न। यह कई वीं के लिए अनुमति देता हैousand परीक्षण फ़ाइलें रीडर पर संग्रहित किया जा सके। फ़ाइलें एक यूएसबी ड्राइव कूद के साथ लिया गया है और अगर वांछित अनुसंधान प्रयोजनों के लिए आगे के विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर को हस्तांतरित किया जा सकता है।

Representative Results

ECIS प्रौद्योगिकी इस पत्र में वर्णित अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (USEPA) में परीक्षण कराना पड़ा प्रायोजित प्रौद्योगिकी परीक्षण और मूल्यांकन कार्यक्रम (TTEP)। तेरह रसायन विषाक्त औद्योगिक यौगिकों कि पीने के पानी के दूषित पदार्थों को संभव हो सकता है की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के प्रतिनिधि के रूप में परीक्षण के लिए चयन किया गया था। परीक्षण के दौरान, 13 9 सांद्रता है कि मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक हैं पर एक घंटा के भीतर ECIS से पता चला रहे थे 8। तालिका 1 इस दूषित पदार्थों को परीक्षण के परिणामों को दिखाता है। चित्रा 4 एक "दूषित" परिणाम पर की तरह क्या लग रही होगी की प्रतिनिधि है ECIS पाठक स्क्रीन। अधिकांश भाग के लिए, सेलुलर impedances नियंत्रण की तुलना में दूषित नमूनों के लिए कम किया है। कभी कभी, कुछ यौगिकों प्रतिबाधा में वृद्धि का कारण हो सकती है।

इसके अलावा तालिका 1 में संक्षेप (चित्रा 5 देखें)।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक "दूषित" जल नमूना के ECIS रीडर स्क्रीनशॉट सामान्यीकृत प्रतिबाधा ग्राफिक्स और एक पानी का नमूना है कि दूषित था से परिणाम का एक उदाहरण है।। ब्लू लाइनों नियंत्रण इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक की सामान्यीकृत impedances प्रतिनिधित्व करते हैं; लाल लाइनों परीक्षण नमूना इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक की सामान्यीकृत impedances प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: एक "कोई संदूषण का पता चला" जल नमूना के ECIS रीडर स्क्रीनशॉट सामान्यीकृत प्रतिबाधा ग्राफिक्स और एक पानी का नमूना है कि दूषित नहीं किया गया था से परिणाम का एक उदाहरण है।। ब्लू लाइनों नियंत्रण इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक की सामान्यीकृत impedances प्रतिनिधित्व करते हैं; लाल लाइनों परीक्षण नमूना इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक की सामान्यीकृत impedances प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3 "> 14
वर्ग contaminant एकाग्रता का परीक्षण (मिलीग्राम / एल) 1 पता चला ≤1 घंटे
एन = 4/4 चिप्स
कीटनाशकों aldicarb 0.17 नहीं
Arsen आईसी (सोडियम आर्सेनाइट) 4.5 हाँ
अब्द (सोडियम azide) 46.7 हाँ
Fenamiphos 0.56 नहीं
methamidophos 1.4 नहीं
मिथाइल Parathion 33.6 हाँ
Paraquat (dichloride) 4.6 नहीं
Pentachlorophenate (सोडियम) 71.9 हाँ
औद्योगिक रसायन अमोनिया 924 हाँ
कॉपर (तांबा द्वितीय सल्फेट) 103 हाँ
साइनाइड (सोडियम) हाँ
बुध (क्लोराइड) 24.7 हाँ
टोल्यूनि 444 हाँ
स्वच्छ जल 2 कोई नहीं NA नहीं
1 सांद्रता का परीक्षण किया Widder, एट अल द्वारा पांडुलिपि के रूप में ही कर रहे हैं। (2014)।
2 40 स्वच्छ पानी के नमूने कोई संदूषण के साथ चलाए जा रहे थे।

तालिका 1: ECIS द्वारा पता लगाया पानी के नमूनों में contaminants।

Discussion

ECIS प्रौद्योगिकी एक प्रयोगशाला स्थापित करने में अच्छा प्रदर्शन किया और सांद्रता है कि मानव स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक हैं पर संभावित पानी दूषित पदार्थों को पता लगाने के लिए सक्षम था। पोर्टेबिलिटी और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में उपयोग के लिए अनुकूल पैकेजिंग यह बनाता है।

1) संस्कृति, बोने के दौरान मम्मियाँ स्थिति बनाए रखने, और biochips के खिला, 2) वरीयता प्राप्त biochips प्रशीतित परिस्थितियों में तैयार है जब तक RTgill-W1 कोशिकाओं के बाद परीक्षण के लिए रखें: तकनीक की सफलता के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार हैं बहुत देर तक एक बार वे ऊपर 25 डिग्री सेल्सियस तापमान के अधीन हैं बच नहीं होगा, 3) सही पाउडर मीडिया शीशियों में एल-15ex वजन और सही झूठी सकारात्मक है, जिसमें एक पारी की वजह से हो सकता है उत्पादन से बचने के लिए पानी के नमूने लिए उपाय नमूना विषाक्तता के बजाय मीडिया की परासरणीयता, 4) के लिए परीक्षण चल ECIS स्क्रीन पर उपयोगकर्ता निर्देशों का पालन करें। रीडर में सॉफ्टवेयर एक द्वि यदि उपयोगकर्ता सूचित करेंगेochip परीक्षण (प्रारंभिक प्रतिबाधा रीडिंग के आधार पर) के लिए अस्वीकार्य जब biochip पहले पाठक में डाला जाता है। प्रतिबाधा स्तर के परीक्षण के लिए अस्वीकार्य हैं, तो सॉफ्टवेयर जब तक एक नया biochip प्रयोग किया जाता है उपयोगकर्ता के परीक्षण के साथ आगे बढ़ने की अनुमति नहीं दी जाएगी। अस्वीकार्य प्रतिबाधा रीडिंग के लिए कारण ECIS पाठक पिन या biochip के gluing किनारों के साथ तरल पदार्थ के रिसाव के साथ biochip इलेक्ट्रोड की एक मामूली misalignment के कारण आम तौर पर कर रहे हैं।

इस प्रौद्योगिकी के लिए कुछ सीमा क्योंकि ECIS सेंसर ही नहीं है और सतह के पानी के साथ पीने के पानी के साथ परीक्षण किया गया है रहे हैं। RTgill-W1 कोशिकाओं है कि biochip पर कर रहे हैं समय की लंबी अवधि (समय सीमा घंटे से तापमान पर निर्भर दिनों के लिए हो सकता है के लिए ज्यादा से ऊपर 25 डिग्री सेल्सियस ठंड या तापमान को सहन नहीं कर सकता। Biochips एक तापमान रेंज में सबसे अच्छा कार्य करने के लिए प्रशीतित से कमरे के तापमान 7। वे सही आर रहने के बाद तत्काल उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं, हालांकि,कोल्ड स्टोरेज से emoved। पोर्टेबल कोल्ड स्टोरेज कंटेनर वर्तमान में तापमान के प्रति संवेदनशील आपूर्ति के लिए क्षेत्र में सेना के जवानों द्वारा किया जाता है। ये वही कंटेनर वरीयता प्राप्त biochip परिवहन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रौद्योगिकी के लिए एक और सीमा होती है कि भले ही यह एक व्यापक बैंड विषाक्तता सेंसर है, यह इस तरह के कुछ कीटनाशकों के रूप में कोलीनेस्टेरेस बाधा यौगिकों, करने के लिए अच्छी तरह से प्रतिक्रिया नहीं है, अगर सब पर है। इस क्षमता के अंतर को भरने के लिए, ECIS सेंसर जब आदेश विषाक्तता परीक्षण की एक व्यापक रेंज के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करने के लिए पानी के नमूने के परीक्षण के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तेजी से कीटनाशक परीक्षण परख के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए बनाया गया है। किट एक तेजी से एंजाइमी 30 मिनट के भीतर organophosphate और carbamate कीटनाशकों का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया परख है।

क्षेत्र पानी परीक्षण प्रणाली, वर्तमान में सैन्य preventative दवा कर्मियों द्वारा पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया, आर्सेन - ECIS सेंसर WQAS-PM (Preventative चिकित्सा जल गुणवत्ता विश्लेषण प्रणाली) का पूरकआईसी, सीसा, या पीने के पानी के नमूने में साइनाइड। हालांकि ECIS सेंसर पहचान नहीं होगा क्या प्रदूषक है, यह अगर कुछ धातुओं या कार्बनिक यौगिकों मौजूद हैं संकेत मिलता है, यह दर्शाता है कि पानी मानव उपभोग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। ECIS परीक्षण के परिणाम एक घंटा के भीतर उपलब्ध हैं। पानी के नमूने तो दूषित पदार्थों की पहचान के लिए आगे के विश्लेषण के लिए बाहर भेजा जा सकता है अगर वहाँ एक सकारात्मक परीक्षण के परिणाम है।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, ECIS पाठक एक प्रणाली है कि आदेश में दूषित पदार्थों का पता लगाने की एक व्यापक स्पेक्ट्रम को कवर करने के लिए एक अलग एंजाइमी ऐस किट शामिल हैं का हिस्सा बनने के लिए बनाया गया है। इन पाठकों के दोनों सैनिकों द्वारा क्षेत्र में उपयोग के लिए क्षेत्र परिवहन के लिए एक मजबूत मामले में पैक किया जा रहा है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 16000-085 Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).
Fibronectin, bovine plasma EMD Millipore Corp.   www.emdmillipore.com       341631-1 mg Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips.
L-15 media without L-glutamine Lonza  www.lonzabioscience.com 12-700F Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C.
L-15ex powdered media with phenol red US Biological        www.usbio.net L1501 Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips.
PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ Lonza  www.lonzabioscience.com 17-516F Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.  
Trypsin, EDTA Lonza  www.lonzabioscience.com CC-5012 Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. 
T175 culture flasks Fisher Scientific
www.fishersci.com		 12-565-30 Used for culturing RTgill-W1 cells.
Bleach Chlorox                                 www.chlorox.com Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.
70% ethyl alcohol For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)  American Type Tissue Culture Collection            www.atcc.org CRL-2523 Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM Lonza  www.lonzabioscience.com 35050-061 Store at room temperature.  Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K Lonza  www.lonzabioscience.com 17-602E Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Pharmed BPT tubing U.S. Plastic Corp.      www.usplastic.com 57317 Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies Value Plastics        MTLS210-9 Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.
20 ml syringes, slip-tip VWR Scientific      us.vwr.com BD302831 Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials Bottles Jars and Tubes, Inc.   www.bottlesjarsandtubes.com 30600 Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.
Autoclavable Plastic Instrument Box
17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"		 Medi-Dose EPS     medidose.com IB701 Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. 
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” CardinalHealth        www.cardinalhealth.com 90713 Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.
Quantos automated powder dispenser Mettler Toledo       www.mt.com QB5 Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.
ECIS reader Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.
3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags Uline                 www.uline.com S-16893 Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.
Leatherman squirt ps4 Amazon          www.Amazon.com Used to open powdered media vials.
1 g silica gel desiccant packets  Uline                 www.uline.com S-3902 Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.
Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles Fisher Scientific
www.fishersci.com		 09-740-25C or E Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.
Plugs for biochips Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C.
Drains for ECIS biochips Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader.  Allows for excess media to drain from channels during test injections. 
Hemocytometer Fisher Scientific
www.fishersci.com		 S17040 Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.
Brightfield microscope w/ 10X objective Leitz Labovert Any brightfield microscope is acceptable.
Class II biological safety cabinet Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.
Microcentrifuge tubes, 0.6 ml Fisher Scientific
www.fishersci.com		 02-681-311 Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells.
Slip 10 cc red syringes Procedure Products, Inc.       www.procedureproducts.com S/49S 30-R Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip.
Slip 10 cc blue syringes Procedure Products, Inc.       www.procedureproducts.com S/49S 30-B Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip.
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps SKS Bottle & Packaging, Inc.        www.sks-bottle.com 0605-30 Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing.
50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes Fisher Scientific     www.fishersci.com 12-565-269 Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C.
NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test ANP Technologies, Inc.
www.anptinc.com		 ACE-400 Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 109 मछली कोशिकाओं प्रतिबाधा सेंसर biochip पानी विषाक्तता ECIS monolayer क्षेत्र पोर्टेबल
तैयारी और का परीक्षण मुक़ाबला आधारित विषाक्तता के लिए पीने के पानी के नमूने लिए रैपिड मूल्यांकन RTgill-W1 कोशिकाओं के साथ Fluidic biochips
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Brennan, L. M., Widder, M. W.,… More

Brennan, L. M., Widder, M. W., McAleer, M. K., Mayo, M. W., Greis, A. P., van der Schalie, W. H. Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity. J. Vis. Exp. (109), e53555, doi:10.3791/53555 (2016).

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