Introduction
Het algemene doel is een werkwijze voor het zaaien van cellen, opslag en het testen van vloeibare biochips in het ECIS biosensor ontwikkelen. Het doel voor de ontwikkeling van deze biosensor was even US Army specificaties voor een veld draagbaar apparaat dat mogelijke besmetting van het drinkwater voorziening kan detecteren gebruikt door soldaten. De eisen voor de toxiciteit sensor waren dat het een breed spectrum van toxische industriële verbindingen snel kunnen detecteren (binnen een uur) bij concentraties gezondheid van de mens, dat de inrichting veld draagbaar, en de biologische componenten zou een houdbaarheid hebben van ten minste negen maanden. Koeling, maar niet bevriezen, van bederfelijke componenten aanvaardbaar was.
Historisch gezien gebied draagbare water testtechnologieën met een biologische component daarvan (bijvoorbeeld antilichamen, enzymen of nucleïnezuren) analyt-specifieke 1-3 geweest. Het nadeel van dit soort biosensoren is dat ze ONLy detecteren een soort chemisch tegelijk. Meerdere sensoren nodig als het vermoeden bestaat dat er meer dan één chemische stof aanwezig is. Als een bepaalde sensor niet in de test repertoire, kan chemische verontreinigingen in het water gemakkelijk onopgemerkt.
Brede toxiciteit sensoren, daarentegen, hebben het potentieel om deze technologie leemte. Deze hebben gewoonlijk een cellulaire component te 4-8. De voordelen van brede toxiciteit biosensoren zijn dat zij de aanwezigheid van een breed scala aan chemische verontreinigingen, met inbegrip van mengsels en onbekenden, in een relatief korte tijd 5,9,10 kan detecteren.
Het concept van het meten van de elektrische impedantie van celmonolagen als mogelijke toxiciteit sensor, die ook bekend staat als elektrische cel-substraat impedantiedetectie (ECIS), werd eerst beschreven door Giaever en Keese 11. In de afgelopen twee decennia is gebleken een gevoelige indicator van de cel zijn Viabiliteit en cytotoxiciteit. In principe is de cel monolaag die is gehecht aan de elektroden op de biochips blootgesteld aan hoge frequentie en lage spanning en stroomsterkte wisselstroomsignaal. De confluente monolaag van cellen belemmert de elektronenstroom. Wanneer de integriteit van de cel monolaag wordt aangetast (zoals wanneer een toxische chemische stof wordt geïntroduceerd), de ECIS sensor registreert een verandering in de elektrische impedantie 11-14. Figuur 1 illustreert het principe van ECIS ten opzichte van de cel monolagen worden biochip .
Figuur 1:.. Principe van ECIS Illustratie van een cel monolaag op een biochip met vereenvoudigde ECIS lezer elektrische schema Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
12 beschreven. Deze cellen waren niet praktisch voor gebruik in het veld, echter, omdat ze verplicht frequent media veranderingen, had een beperkte houdbaarheid, en vereist een kunstmatige CO 2-omgeving en een 37 ° C incubatietemperatuur. Er werd ontdekt dat een commercieel verkrijgbare cellijn afgeleid van regenboogforel gill epitheelcellen (RTgill W-1 cellen) kunnen worden getest bij kamertemperatuur bij omgevingstemperatuur CO 2, vormden een confluente monolaag in de biochips, kan worden bewaard bij koeltemperaturen, en had een snelle reactie (1 uur of minder) met een breed spectrum van chemische stoffen bij concentraties voor de volksgezondheid 12 relevant. Toepassingen van RTgill-W1 cellen in toxicologie en in fundamenteel onderzoek, worden beoordeeld door Lee et al. 15
Werkwijzen voor het zaaien, opslag en het testen van vloeibare biochips diemonolagen van RTgill-W1 cellen op vloeibare biochips per ECIS biosensor worden beschreven. De vloeibare biochips kan worden opgeslagen voor maximaal 9 maanden in een gekoelde staat en kan worden geleverd in een koude opslag container, voor het testen van het drinkwater supplies.The begeleidende ECIS lezers, of testunits, worden apart verzonden. De biochips hebben twee componenten om hen; een bovenste laag van polycarbonaat met twee aparte vloeistof kanalen, en een lagere elektronische laag die vier elektroden per kanaal voor impedantie sensing bevat. Er zijn 10 werkende elektroden per pad; elke elektrode 250 urn in diameter. De geassembleerde biochips hebben goud elektrode aansluitingen voor het verwerven van impedantie metingen wanneer ingebracht in de ECIS testeenheid. Beide ingesloten vloeibare U-vormige kanalen 2 ml van de RTgill-W1 celsuspensie bevatten. Figuur 2 toont een vloeibare biochip in het ECIS lezer met een vergroting van een confluente cellen op een meetelektrode.
Figuur 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader vergrote gebied toont een confluente monolaag van RTgill-W1 cellen op een enkele detectie-elektrode Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van testmaterialen
Opmerking: Om de biochips bereiden voor het testen, verscheidene confluente flessen van RTgill-W1 cellen moeten klaar staan. Een goede schatting van het aantal flessen nodig is een samenvloeiing T175 kolf gedurende 16 biochips worden gezaaid.
- Voer de volgende stappen in een klasse II bioveiligheidskast (biohood) met behulp van aseptische techniek. Gebruik 70% ethanol voor het ontsmetten van de biohood en materialen geplaatst in de kap.
- Bereid fibronectine substraat voor de vloeibare biochips door ontdooien een 1 mg flesje van fibronectine en verdunnen in 100 ml steriel L-15 medium voor een concentratie van 10 ug / ml. Bevriezen in 40 ml aliquots in steriele 50 ml conische polypropyleen buizen bij -20 ° C. Ontdooien bij kamertemperatuur enkele uren vóór het zaaien biochips. Eenmaal ontdooid, niet opnieuw invriezen.
- Bereid celkweekmedia door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamine supcomplement en 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing (10.000 eenheden penicilline / ml en 10.000 pg streptomycine / ml) bouillon aan 500 ml L-15 media. Dit wordt 560 ml celkweekmedium bevattende 9% serum werd verkregen. Koel.
Opmerking: Dit zal de volledige celkweek media gebruikt voor de cultuur kolven en biochips zijn.
- Gepoederde Media Flesjes
- Bereid van tevoren 0,1 dram snap-cap flacons met 60 mg ± 0,5% van de L-15ex poeder met behulp van een geautomatiseerde poeder dispenser. Label de flesjes met de datum van de poeder werd afgegeven en in de koelkast flesjes (in hoeveelheden van 50) in hersluitbare gemetalliseerde plastic zakken; elk drie 1 g silicagel uitdroging packs.
Opmerking: L-15ex poedervormige media flacons kunnen worden gemaakt en bewaard tot 9 maanden voorafgaand aan het testen.
- Bereid van tevoren 0,1 dram snap-cap flacons met 60 mg ± 0,5% van de L-15ex poeder met behulp van een geautomatiseerde poeder dispenser. Label de flesjes met de datum van de poeder werd afgegeven en in de koelkast flesjes (in hoeveelheden van 50) in hersluitbare gemetalliseerde plastic zakken; elk drie 1 g silicagel uitdroging packs.
- Voeg een oplossing van 100 ml 20% bleekmiddel door verdunning bleekmiddel met gedeïoniseerd (DI) water. Schatten dat 5 ml bleekwater oplossing nodig zullen zijn voor elk biochip.
- Voeg biochip buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten van autoclaveerbare biocompatibele buis (2 delen per biochip wordt gezaaid) en breng de uiteinden van de buis met polycarbonaat slip luer fittings. Plaats tubing samenstellingen in een autoclaveerbare zak en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 ° C. Ook autoclaaf biochip pluggen (2 per biochip) in een aparte zak bij dezelfde instellingen.
- Autoclaaf DI water gedurende 30 min at121 ° C.
Opmerking: Dit water wordt gebruikt voor het spoelen biochips na zaaien. Schatten dat 10 ml nodig zullen zijn voor elke biochip.
Opmerking: Het werkelijke volume van elk biochip kanaal 2 ml, maar 5 ml steriel water wordt gespoeld door middel van elk kanaal na verwijdering van bleekwater-oplossing. - Voeg spuitinjectie buis samenstellen door snijden 27 mm gedeelten biocompatibele buizen en bevestigen mannelijke luer slip installatiemateriaal aan beide uiteinden van de buis. Plaats de slang assemblages in een papieren warmte-seal sterilisatie zakje en autoclaaf gedurende 8 minuten bij 134 &# 176; C.
2. Fluidic Biochip Seeding Procedure
Opmerking: Voer alle procedures waarin de biochips of de media wordt behandeld in een klasse II bioveiligheidskast met behulp van aseptische techniek.
- Vierentwintig uur voor de geplande zaaien, verwijder de biochips van de fabrikant verpakking in de biohood en plaats in gesteriliseerde plastic instrument gevallen.
- Steriliseer het biochips met een 20% bleekmiddeloplossing als volgt
Opmerking: Historisch gezien heeft deze procedure bleken schimmelgroei in de biochips voorkomen tijdens langdurige opslag in het geval dat het plasma sterilisatie van de biochips gedaan door de fabrikant was niet effectief.- Met behulp van een steriele 20 ml spuit met een injectiespuit injectie buis constructie bevestigd en werken in de biohood injecteren 2 ml van de 20% bleekwater oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips te zitten gedurende 1 uur met de bleekwater oplossing.
- Na één uur vacuüm aspRazend het bleekmiddel oplossing van beide kanalen met een steriele mannelijke slip luer montage aan de afzuiging slang. Gebruik een van de biochip slang assemblages als een drain bij het spoelen van de biochips.
- Met behulp van een steriele 20 ml spuit bevestigd aan een steriele injectiespuit inspuitsamenstel Spoel elk kanaal van de chip met 5 ml steriel water, zodat het overtollige water afvoer in een container in de biohood. Dan vacuüm aspireren uit het water als zojuist beschreven voor het bleekmiddel en plaats de biochips terug in de plastic instrument gevallen en laat in de biohood tot ingezaaid met cellen van de volgende dag.
- Zestig min vóór het zaaien biochips Injecteer 2 ml van 10 ug / ml fibronectine oplossing in elk kanaal van de biochip. Laat de biochips in de biohood gedurende 60 min, en vervolgens vacuüm aspireren van de fibronectine (zoals beschreven in stap 2.2.3) voor het zaaien de biochip met cellen. Plaats twee gedeelten van de biochip steriele buis samenstellen (zieparagraaf 1.4) op de havens van de biochips.
- Trypsinize een confluente RTgill-W1 T175 kolf voor elke 16 biochips middels procedures in de American Type Culture Collection (ATCC) productbeschrijving plaat 16.
- Aspireren van de media uit de samenvloeiing fles (s) van de cellen.
- Spoel de cel laag met 15 ml PBS en vervolgens te zuigen uit.
- Voeg 6 ml trypsine / EDTA de cellaag in elke T175 kolf en laat cellen trypsinize gedurende ~ 5 min.
- Voeg 15 ml volledige L-15 media voor celkweek aan elke kolf trypsine te stoppen.
- Combineer de celsuspensies in een steriele houder.
Noot: Tankgrootte varieert 150-500 ml, afhankelijk van het aantal biochips worden gezaaid. Schatten dat 5 ml celsuspensie nodig zal zijn per biochip.
- Verwijderen ~ 1 ml van de celsuspensie en plaats in een microcentrifugebuis voor het tellen. Met een helderveld microscoop met 10x DOELSTEve en een hemocytometer, behoren een 10 pl aliquot van de cellen en bereken het volume van volledige L-15 celkweekmedium nodig om een celsuspensie van 2,5 x 10 5 cellen / ml bereiken.
Opmerking: Bij gebruik van de celsuspensie aan kolven zaad aan de kweek voortgezet, zou dit het punt dat te doen. Pas de celsuspensie concentratie met behulp van volledige L-15 celkweek media. - Met behulp van een steriele 20 ml syringeattached een steriele injectiespuit injectie buis constructie (zie paragraaf 1.6), injecteer 2,5 ml van de celsuspensie in de buitenste poort van elk kanaal van de biochip (dwz de poorten die de slang bevestigd hebben), waardoor een deel van de extra celsuspensie uit de buis te stromen in een afvalcontainer in de biohood.
Opmerking: Dit zal ervoor zorgen dat het hele kanaal en de bijgevoegde slang vol van de celsuspensie zal zijn.- Maak een gesloten lus voor elk biochip kanaal door het invoegen van het vrije uiteinde van de slang met de Luer fitting in de buitenste poorten voor elk kanaal.
- Veeg overtollig papier uit de gesloten lussen met een papieren doek bevochtigd met 70% ethanol en zet de biochips terug in de plastic box aan een 20 ° C incubator. Geef elke biochip een uniek identificatienummer.
- Op dag 4 en 7, verwijder de biochips uit de 20 ° C incubator vervult de media in alle biochips met temperatuur geëquilibreerd volledige L-15 celkweekmedium. Volg dezelfde procedure als in stap 2.6 met uitzondering van het gebruik slechts L-15 celkweek media in plaats (geen celsuspensie). Plaats de biochips terug in de 20 ° C incubator na 4 dagen voeden.
- Na de dag 7 voeden, te verwijderen en gooi de slangen van de chips en steek de geautoclaveerd aftappluggen in de biochips.
- Plaats de biochips in een doos in een 6 ° C incubator tot gebruik voor het testen.
Opmerking: De chips kunnen worden bewaard bij koeltemperaturen tot 9 maanden en nog steeds levensvatbaar voor het testen in de ECIS lezers.
3. ECIS Testen met biochips
- Bereid analyse chemicaliën als het gebruiken. (Zie Brennan, et al., 2012 7 voor de bereiding van de test chemische stoffen).
- Verwijder ECIS reader en test leveringen uit de draagtas. Verwijderen van een biochip bereid uit de 6 ° C incubator. Plaats de biochip op een papieren handdoek. Schakel de ECIS lezer.
- Met behulp van 10 ml spuiten, afzien van 10 ml van de controle water in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic controle pot en 10 ml van het monster in een gemerkte 0,5 ounce doorzichtige plastic-test pot.
Opmerking: 1) Zorg ervoor dat u bellen te verwijderen voor een nauwkeurige meting. 2) De spuiten en potten hebben een kleurcode; blauw voor de controle en rood voor de test. - Verwijder de twee gepoederde media flacons uit de folie zakken. Open een van de gepoederde media flacons (gebruik multifunctionele tool indien nodig) en giet gehele inhoud van een flesje in de pot met controle water, laten vallen van de gehele flacon inoplossing ook. Herhaal deze procedure met de test pot. Dop en schud de potten zodat het poeder wordt opgelost.
- Vul elk van de gekleurde 10 ml spuiten met 9 ml van ofwel controle (blauw spuit) of toets (rode spuit) oplossingen van respectievelijke flesjes. Verwijder luchtbellen uit spuiten.
- Haal de stekkers uit de biochip havens en bevestig de afvoer.
- Plaats de biochip in de verwijderbare plastic bak in de ECIS lezer en sluit het deksel.
- Hechten injectiespuiten aan de buitenste biochip havens en bevestig de zuiger.
- Vanuit het hoofdscherm, selecteer "NEXT" om pre-test te starten.
Opmerking: Reader software impedanties controleren. Als impedanties zich binnen het bereik van de gebruiker (meestal tussen 1000 en 3000 ohm) het scherm registreert ingesteld "Cartridge Geslaagd", zoals aangegeven in figuur 3, en instrueer de gebruiker in staat om "Next" te selecteren en de software zal overgaan tot stap 3.10). Als de impedantie niet binnenhet ingestelde bereik als gevolg van een defecte biochip of gebrekkige aansluiting van de biochip om de lezer (meestal te wijten aan een foutieve uitlijning van de elektroden), dan zal het scherm registreren "Cartridge mislukt 'en zal de gebruiker de optie om ofwel" Afbreken "of "Controleer" de test.- Selecteer "Afbreken" om terug te gaan naar stap 3.9). Selecteer "Controleer" om door te gaan naar stap 3.10) na ontvangst van een "Cartridge Passed 'boodschap en het selecteren van" Next ".
Opmerking: Het beste is om de biochip nemen en visueel inspecteren op gebreken of lekt als een "Cartridge Failed" bericht wordt ontvangen alvorens met een nieuwe biochip.
- Selecteer "Afbreken" om terug te gaan naar stap 3.9). Selecteer "Controleer" om door te gaan naar stap 3.10) na ontvangst van een "Cartridge Passed 'boodschap en het selecteren van" Next ".
Figuur 3:. ECIS Reader Screenshot van een Biochip met Acceptabel impedantie Readings Het screenshot toont eerste impedantie metingen in ohm van elk van de 4 control elektroden (CE) en 4 proefmonster elektroden (SE) binnen de vloeibare biochip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Wanneer u wordt gevraagd door de lezer, voer monster informatie met behulp van een zachte toetsenbord en selecteer vervolgens "Accepteren" als u klaar bent.
Let op: De ECIS reader software zal automatisch elke dataset met de datum, tijd en andere informatie door de gebruiker ingevoerde stempel; zoals de biochip nummer en het soort chemisch en concentratie. Twee min van impedantie gegevens worden verzameld uit de ingevoegde biochip en een timer op het scherm zal count-down tijd. - Na twee min als daarom wordt gevraagd door de instructies op het scherm die knipperen binnen een rode doos, klik op "NEXT". Wanneer u wordt gevraagd door een knipperende groene vak 'injecteren samples nu ", injecteer de controle en test media uit de bijgevoegde spuiten gelijktijdig in de biochip channels. Laat de spuiten op zijn plaats op de biochips als u klaar bent.
Opmerking: impedantie waarden zullen eenmaal per minuut worden verzameld voor 60 min. Als de ECIS lezer software bepaalt dat de behandeling kanaal is statistisch significant verschillend van de controle-kanaal op elk punt tussen de 10 en 60 minuten na de start van de test, dan is de weergave op het scherm geeft aan dat het monster "Verontreinigde". Als de behandeling is niet anders dan de controle-kanaal, dan is het scherm toont "No Contamination gedetecteerd" aan het einde van de test run. - Record testresultaten besmet of niet verontreinigd voor elk monster.
- Aan het einde van de test uit te voeren, te verwijderen en gooi de biochip. Spoel en air-droog de spuiten, testen flesjes en verwijderbaar plastic bakje waarin de biochip tijdens de tests gehuisvest.
Opmerking: De ECIS lezer heeft 4 GB aan opslag aan boord van de operationele software, controle modellen en de testbestanden gegenereerd op basis van een test. Hierdoor kunnen meerdere Thousand testbestanden worden opgeslagen op de lezer. Bestanden kunnen worden opgehaald met een USB sprongaandrijving en overgebracht naar een computer voor verdere analyse voor onderzoeksdoeleinden indien gewenst.
Representative Results
De ECIS technologie beschreven in dit document onderging testen op de US Environmental Protection Agency (USEPA) gesponsorde Technology Testing and Evaluation Program (TTEP). Dertien chemicaliën werden geselecteerd voor het testen als vertegenwoordigers van een breed spectrum van industriële toxische verbindingen die kunnen worden genomen verontreinigingen van drinkwater. Tijdens het testen, 9 van de 13 werden gedetecteerd door ECIS binnen een uur bij concentraties die voor de gezondheid relevant zijn 8. Tabel 1 toont de resultaten van deze verontreiniging testen. Figuur 4 representeert wat een "Verontreinigde" resultaat zou zien op de lezer scherm ECIS. Voor het grootste deel, cellulaire impedanties afgenomen voor verontreinigde monsters in vergelijking met controles. Soms kunnen bepaalde verbindingen een verhoging van de impedantie veroorzaken.
Ook samengevat in Tabel 1 figuur 5) voor een representatief screenshot van "No Contamination gedetecteerd".
Figuur 4: ECIS Reader Screenshot van een 'Besmette' Water Sample Een voorbeeld van een genormaliseerde impedantie graphics en resultaten van een watermonster die besmet was.. Blauwe lijnen geven genormaliseerde impedantie van elk van de stuurelektrodes; rode lijnen geven de genormaliseerde impedantie van elk van de test sample elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: ECIS Reader Screenshot van een "No Contamination gedetecteerd" Water Sample Een voorbeeld van een genormaliseerde impedantie graphics en resultaten van een watermonster die niet besmet was.. Blauwe lijnen geven genormaliseerde impedantie van elk van de stuurelektrodes; rode lijnen geven de genormaliseerde impedantie van elk van de test sample elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Categorie | verontreinigende | Geteste concentratie (mg / l) 1 | Gedetecteerd ≤1 uur n = 4/4 chips | |||
| bestrijdingsmiddelen | aldicarb | 0.17 | Nee | |||
| Arsen ic (natrium arseniet) | 4.5 | Ja | ||||
| Azide (natriumazide) | 46.7 | Ja | ||||
| fenamifos | 0.56 | Nee | ||||
| methamidofos | 1.4 | Nee | ||||
| methyl parathion | 33.6 | Ja | ||||
| Paraquat (dichloride) | 4.6 | Nee | ||||
| Pentachlorophenate (natrium) | 71.9 | Ja | ||||
| Industrial Chemicals | ammonia | 924 | Ja | |||
| Koper (koper II sulfaat) | 103 | Ja | ||||
| Cyanide (natrium) | 3 "> 14Ja | |||||
| Kwik (chloride) | 24.7 | Ja | ||||
| Tolueen | 444 | Ja | ||||
| Schoon Water 2 | geen | NA | Nee | |||
| 1 geteste concentraties zijn dezelfde als in het manuscript van Widder, et al. (2014). | ||||||
| 2 40 schoon water monsters werden uitgevoerd met geen verontreiniging. | ||||||
Tabel 1: Verontreinigingen in watermonsters gedetecteerd door ECIS.
Discussion
De ECIS technologie goed gepresteerd in een laboratorium setting en was in staat om potentiële water verontreinigingen detecteren bij concentraties die voor de menselijke gezondheid van belang zijn. De draagbaarheid en de verpakking van de technologie maakt het bevorderlijk is voor gebruik in het veld.
Kritische stappen in het protocol voor het succes van de technologie zijn als volgt: 1) Handhaaf aseptische omstandigheden tijdens de cultuur, het zaaien, en het voeden van de biochips, 2) Houd de gezaaide biochips in gekoelde omstandigheden tot klaar om te testen, omdat de RTgill-W1 cellen zal niet lang als ze worden blootgesteld aan temperaturen boven 25 ° C te overleven, 3) weeg nauwkeurig de L-15ex in het poedervormige media flesjes en nauwkeurig de watermonsters te voorkomen die valse positieven, die kunnen worden veroorzaakt door een verschuiving in de osmolaliteit van media in plaats van monster toxiciteit, 4) Volg gebruiker aanwijzingen op het scherm ECIS voor het uitvoeren van de tests. De software in de lezer de gebruiker als een bi waarschuwenochip onaanvaardbaar te testen (op basis van initiële impedantie metingen) wanneer de biochip eerst in de lezer is geplaatst. Als de impedantie niveaus onaanvaardbaar testen, zal de software niet kan de gebruiker doorgaan met testen totdat een nieuwe biochip wordt gebruikt. Redenen voor onaanvaardbare impedantie metingen worden meestal veroorzaakt door een kleine speling van de biochip elektroden met ECIS lezer pennen of vloeistoflekkage langs een van de randen lijmen van de biochip.
Er zijn een aantal beperkingen aan deze technologie omdat de ECIS sensor is alleen getest met het drinken van water en niet met oppervlaktewater. De RTgill-W1 cellen die op de biochip kan niet tolereren bevriezing of temperaturen ver boven 25 ° C gedurende langere tijd (tijdsbestek kan variëren van uren tot dagen, afhankelijk van de temperatuur. De biochips functioneren het beste in een temperatuurbereik van de koelkast naar kamertemperatuur 7. Ze zijn direct klaar voor gebruik, maar direct na het zijn removed van koude opslag. Draagbare koude opslag containers worden momenteel gebruikt door personeel van het Leger in het veld voor temperatuurgevoelige benodigdheden. Dezelfde containers kunnen worden gebruikt voor geënte biochip transport.
Een andere beperking van deze technologie is dat, hoewel het een breedbandig toxiciteit sensor, het niet goed reageren of helemaal naar cholinesterase remmende verbindingen, zoals sommige pesticiden. Deze mogelijkheid leemte wordt het ECIS sensor ontworpen voor gebruik in combinatie met een commercieel beschikbare snelle pesticide testbepaling bij het testen van watermonsters om de gebruiker een breder toxiciteit verschaffen. De kit is een snelle enzymatische test ontworpen om organofosfaat en carbamaat pesticiden binnen 30 min detecteren.
De ECIS sensor vormt een aanvulling op het keek uit-PM (Water Quality Analysis System - Preventieve Geneeskunde) veld water testsysteem, momenteel gebruikt door militairen preventieve geneeskunde personeel op te sporen, Arsenic, lood, of cyanide in drinkwater monster. Hoewel het ECIS sensor identificeert wat de verontreiniging is, zal aangeven of bepaalde metalen of organische verbindingen aanwezig zijn, wat aangeeft dat het water niet geschikt voor menselijke consumptie zijn. De ECIS testresultaten beschikbaar zijn binnen een uur. De monsters water kan vervolgens worden verstuurd voor verdere analyse voor de identificatie van de verontreiniging als er een positief testresultaat.
Zoals hierboven beschreven, wordt de lezer ECIS ontworpen als onderdeel van een systeem dat een aparte enzymatische ACE kit bevat om een breed spectrum van verontreinigingsdetectie dekken. Beide lezers worden verpakt in een stevige koffer voor veld vervoer voor gebruik in het veld door soldaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70% ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 ml syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 g silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing. |
| 50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C. |
| NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com |
ACE-400 | Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water |
References
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S.
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
