Introduction
Det overordnede målet var å utvikle en metode for celle seeding, lagring og testing av fluidic biochips i ECIS biosensor. Målet for utviklingen av denne biosensor var å møte amerikanske hæren spesifikasjoner for et felt bærbar enhet som kan oppdage mulig forurensning av drikkevannskilder blir brukt av soldater. Kravene til toksisitet sensoren var at det kunne detektere et bredt spekter av giftige industri forbindelser raskt (i løpet av en time) ved konsentrasjoner som er relevante for menneskers helse, at anordningen være felt-flyttbare, og de biologiske komponenter vil ha en holdbarhet på minst ni måneder. Kulde, men ikke frysing, av lett bedervelige komponentene var akseptabelt.
Historisk sett har felt bærbare vann testing teknologier med en biologisk komponent til dem (slik som antistoffer, enzymer, eller nukleinsyrer) vært analytt-spesifikt 1-3. Ulempen til disse typer biosensorer er at de vil only detektere en type kjemisk på en gang. Flere sensorer er nødvendig hvis det er mistanke om at mer enn en kjemisk er til stede. Hvis en spesifikk sensor er ikke i testen repertoaret, kan kjemiske forurensninger i vannet lett gå ubemerket.
Bred-baserte toksisitet sensorer, på den annen side, har potensial for å fylle dette gapet teknologi. Disse har vanligvis en cellulær komponent til dem 4-8. Fordelene med en bred toksisitet biosensorer er at de kan detektere nærværet av et bredt utvalg av kjemiske forurensninger, herunder blandinger og ukjente, i en forholdsvis kort tidsperiode 5,9,10.
Konseptet med å bruke måling av elektrisk impedans av cellemonolagene som en mulig toksisitet sensor, som også er kjent som elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS), ble først beskrevet av Giæver og Keese 11. I løpet av de siste to tiårene har det vist seg å være en følsom indikator på celle viability og cytotoksisitet. I utgangspunktet, blir cellemonolaget som er festet til elektrodene på biochips utsettes for høy frekvens og lav spenning og strømstyrke vekselstrøm signal. De sammenflytende monolag av celler som hindrer strømmen av elektroner. Når integriteten av cellemonolaget er kompromittert (for eksempel når et giftig kjemisk stoff blir innført), den ECIS sensor for å måle en endring i den elektriske impedans 11-14. Figur 1 illustrerer prinsippet for ECIS i forhold til cellemonolaget på biochip .
Figur 1:.. Prinsippet om ECIS Illustrasjon av en celle monolag på en biochip med forenklet ECIS leseren elektrisk skjema Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
12. Disse cellene var ikke praktisk for feltbruk, men fordi de nødvendige hyppige endringer medier, hadde en begrenset holdbarhet, og krevde en kunstig CO to miljø og en 37 ° C inkubasjon temperatur. Det ble oppdaget at en kommersielt tilgjengelig cellelinje avledet fra regnbueørret gjelle epitelceller (RTgill W-1-celler) kan testes ved romtemperatur ved omgivelses CO 2, dannes en konfluent monolag i biochips, kunne lagres ved kjøletemperaturer, og hadde en rask respons (en time eller mindre) til et bredt spekter av kjemikalier ved konsentrasjoner som er relevante for menneskers helse 12. Anvendelser av RTgill-W1 celler i toksikologi, samt i grunnforskning, er gjennomgått av Lee et al. 15
Metoder for seeding, lagring og testing av fluidic biochips inneholdermonolag av RTgill-W1 celler på fluidic biochips i en ECIS biosensor er beskrevet her. Fluidumsforbindelsene biochips kan lagres i opp til 9 måneder i en nedkjølt tilstand og kan sendes i en kald lagring container, for testing av drikkevann supplies.The medfølgende ECIS lesere, eller testenhetene, blir sendt separat. De biochips har to komponenter til dem; en øvre polykarbonat lag med to separate væskekanaler og en lavere elektronisk lag som inneholder fire elektrodene per kanal for impedans sensing. Det er 10 arbeids elektroder per blokk; hver elektrode er 250 mikrometer i diameter. De sammenstilte biochips har gull elektrode tilkoblinger for å anskaffe impedans målinger når de settes inn i ECIS testenhet. Hver av de to lukkede fluid U-formede kanaler vil holde 2 ml av den RTgill-W1 cellesuspensjonen. Figur 2 viser et fluid biochip i ECIS leseren med en forstørrelse av et sammenflytende celler på en enkelt føleelektrode.
Figur 2:.. Fluidic biochip i ECIS Reader forstørrede området viser en konfluent monolag av RTgill-W1 celler på en enkelt sensing elektrode Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
1. Utarbeidelse av Test Materialer
MERK: For å forberede biochips for testing, flere konfluente kolber av RTgill-W1 cellene trenger for å være klar. Et godt estimat over antall kolber som trengs er en konfluent T175-kolbe i 16 biochips å bli podet.
- Utfør følgende trinn i en klasse II biologisk sikkerhet kabinett (biohood) ved bruk av aseptisk teknikk. Bruk 70% etanol for desinfisering av biohood og materiale plassert i panseret.
- Forbered fibronektin substrat for fluid biochips ved tining en 1 mg hetteglass med fibronektin og fortynning i 100 ml steril L-15 media for en konsentrasjon på 10 ug / ml. Fryse i 40 ml alikvoter i sterile 50 ml koniske polypropylenrør ved -20 ° C. Tine i romtemperatur i flere timer før såing de biochips. Tint, ikke fryses på nytt.
- Fremstille cellekulturmedier ved å tilsette 50 ml kalvefosterserum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamin supplement, og 5 ml av en penicillin / streptomycin-løsning (10.000 enheter penicillin / ml og 10 000 ug streptomycin / ml) lager til 500 ml L-15 medium. Dette vil gi 560 ml av cellekulturmedier inneholdende 9% serum. Kjøle.
Merk: Dette vil være fullstendig celledyrkningsmedier som brukes til kulturflasker og biochips.
- Pulverisert Media Ampuller
- Forbered forhånd 0,1 dram snap-cap hetteglass som inneholder 60 mg ± 0,5% av L-15ex pulver ved hjelp av en automatisert pulver dispenser. Label hetteglass med datoen pulveret ble utlevert og avkjøl hetteglass (i mengder 50) i gjenlukkbar metalliserte poly poser; hver inneholdende tre 1 g silikagel tørkepakker.
Merk: L-15ex pulverisert medie ampuller kan lages og lagres i opp til 9 måneder i forkant av testing.
- Forbered forhånd 0,1 dram snap-cap hetteglass som inneholder 60 mg ± 0,5% av L-15ex pulver ved hjelp av en automatisert pulver dispenser. Label hetteglass med datoen pulveret ble utlevert og avkjøl hetteglass (i mengder 50) i gjenlukkbar metalliserte poly poser; hver inneholdende tre 1 g silikagel tørkepakker.
- Lag en løsning av 100 ml 20% blekemiddel ved å fortynne klorin med avionisert (DI) vann. Anslår at 5 ml blekemiddel vil være nødvendig for hver biochip.
- Gjør biochip tubing forsamlinger ved å kutte 27 mm deler av autoklaver biokompatible rør (2 seksjoner for hver biochip å bli seedet) og passer begge ender av røret med polykarbonat slip luer beslag. Plasser slangen forsamlinger i en autoklaverbare pose og autoklav for 8 minutter ved 134 ° C. Også autoklav biochip plugger (2 per biochip) i en egen pose på de samme innstillingene.
- Autoklav DI vann i 30 min at121 ° C.
Merk: Dette vannet skal brukes til skylling biochips etter seeding. Anslår at 10 ml vil være nødvendig for hver biochip.
Merk: Den faktiske volumet av hver kanal er biochip 2 ml, men 5 ml sterilt vann blir skylt gjennom hver kanal etter fjerning av kloroppløsning. - Lage sprøyteinjeksjon produksjonsrørenhetene ved å kutte 27 mm seksjoner av biokompatibelt rør og feste hannkile luer-beslag til begge ender av røret. Plasser produksjonsrørenhetene i en papir varmforsegling sterilisering posen og autoklav i 8 minutter ved 134 &# 176; C.
2. Fluidic biochip Seeding Prosedyre
Merk: Utfør alle prosedyrer der biochips eller media håndteres i en klasse II biologisk sikkerhet kabinett ved bruk av aseptisk teknikk.
- Tjuefire timers før planlagt seeding, fjerne biochips fra produsent emballasje i biohood og plasser i steriliserte plastinstrument tilfeller.
- Sterilisere biochips ved hjelp av en 20% blekemiddel som følger
Merk: Historisk har dette bleking prosedyren hindret soppvekst i biochips ved langtidslagring i tilfelle at plasma sterilisering av biochips gjort av produsenten var ikke effektive.- Ved å bruke en 20 ml steril sprøyte med en sprøyteinjeksjon rørenhet festet og arbeider i biohood, injiserer 2 ml av den 20% blekemiddel inn i hver kanal i biochip. La de biochips å sitte i en time med blekemiddel.
- Etter en time, vakuum aspIrate blekemiddel fra begge kanaler ved hjelp av en steril mann slip luer enheten festet til vakuumsugeslangen. Bruk en av de biochip tubing forsamlinger som en belastning når skylle biochips.
- Ved hjelp av en steril 20 ml sprøyte festet til en steril sprøyte injeksjonsmodulen, å spyle hver kanal av brikken med 5 ml sterilt vann, slik at det overskytende vann kan renne inn i en beholder i biohood. Deretter vakuum-aspirer av vannet som bare beskrevet for blekemiddel og plassere biochips tilbake i plastinstrument tilfeller og la i biohood før sådd med celler dagen etter.
- Seksti minutter før utsåing av biochips, injiserer 2 ml av 10 pg / ml fibronektin oppløsning inn i hver kanal i biochip. La biochips i biohood i 60 min, og deretter vakuum aspireres av fibronektin (som beskrevet i trinn 2.2.3) før poding av biochip med celler. Plasser to delene av sterile biochip produksjonsrørenhetene (seavsnitt 1.4) på portene på biochips.
- Trypsineres en konfluent RTgill-W1 T175 kolbe for hver 16 biochips bruker prosedyrene beskrevet i American Type Culture Collection (ATCC) produktbeskrivelsen 16.
- Aspirer av media fra konfluent kolben (e) av celler.
- Rens cellelaget med 15 ml PBS og deretter suge av.
- Tilsett 6 ml trypsin / EDTA til cellelaget i hvert T175 kolbe og tillate cellene å trypsineres i ~ 5 min.
- Tilsett 15 ml komplett L-15 cellekulturmedium til hver kolbe for å stoppe trypsinering.
- Kombiner de cellesuspensjoner i en steril engangsbeholder.
Merk: Emballasjestørrelse kan variere fra 150-500 ml, avhengig av antall biochips blir seedet. Anslår at 5 ml cellesuspensjon vil være nødvendig per biochip.
- Fjern ~ 1 ml av cellesuspensjonen, og plasser i en mikrosentrifuge rør for telling. Ved hjelp av en lysfelt mikroskop med en 10X objective og et hemocytometer, telle en 10 ul alikvot av cellene og beregne volumet av KOMPLETT V-15 cellekultur papir som er nødvendige for å oppnå en cellesuspensjon på 2,5 x 10 5 celler / ml.
Merk: Hvis du bruker cellesuspensjonen til frø kolber å fortsette kulturen, ville dette være poenget å gjøre det. Juster cellesuspensjonen konsentrasjonen ved hjelp av komp L-15 cellekulturmedier. - Ved hjelp av en steril 20 ml syringeattached til en steril sprøyte sprøyterørenheten (se avsnitt 1.6), injisere 2,5 ml av cellesuspensjonen inn i den ytre port for hver kanal i biochip (dvs. portene som ikke har røret festet), slik at noe av den ekstra cellesuspensjonen til å strømme ut av røret inn i en avfallsbeholder i biohood.
Merk: Dette vil sikre at hele kanalen og festet slangen vil være full av cellesuspensjonen.- Opprett et lukket løkke for hver biochip kanal ved å sette den frie enden av slangen med luer Fitting inn i de ytre porter for hver kanal.
- Tørk overflødig media ut av de lukkede sløyfer med et papirhåndkle fuktet med 70% etanol og plassere biochips tilbake i plastboksen i en 20 ° C inkubator. Gi hver biochip et unikt identifikasjonsnummer.
- På dager 4 og 7, fjerne biochips fra 20 ° C inkubator og fylle media i alle de biochips med temperatur-likevekt komplett L-15 cellekulturmedier. Følg samme prosedyre som i trinn 2.6, bortsett fra bruk bare L-15 cellekulturmedium i stedet (ikke cellesuspensjon). Plasser biochips tilbake i 20 ° C inkubator etter dag 4 fôring.
- Etter dag 7 fôring, og ta bort slangene fra chips og sett autoklaveres tappepluggene i biochips.
- Plasser biochips i en boks i en 6 ° C inkubator før brukt til testing.
Merk: Brikkene kan oppbevares ved kjøletemperaturer for opptil 9 måneder og er fortsatt levedyktig for testing in ECIS lesere.
3. ECIS Testing med biochips
- Forbered test kjemikalier ved bruk. (Se Brennan, et al., 2012 7 for utarbeidelse av testkjemikalier).
- Fjern ECIS leser og test forsyninger fra bæreveske. Fjern en forberedt biochip fra 6 ° C inkubator. Plasser biochip på et papirhåndkle. Slå på ECIS leseren.
- Ved hjelp av 10 ml sprøyter, fordeles 10 ml vann kontroll til en merket 0,5 ounce klar plast kontroll krukke og 10 ml av prøven inn i en merket 0,5 ounce klar plast test krukke.
Merk: 1) Sørg for å fjerne bobler for en nøyaktig måling. 2) Sprøytene og krukker er fargekodet; blå for kontroll og rødt for test. - Fjern de to pulverisert medie ampuller fra folieposer. Åpne en av pulverisert mediehetteglass (bruk multiverktyg hvis nødvendig) og hell hele innholdet i en ampulle i glasset med kontroll vann, slippe hele flasken innløsning også. Gjenta denne fremgangsmåten med test glasset. Cap og riste glassene for å sikre at pulveret er oppløst.
- Fyll hver av de fargede 10 ml sprøyter med 9 ml av enten kontroll (blå sprøyte) eller test (rød sprøyte) løsninger fra de respektive ampuller. Fjern luftbobler fra sprøyter.
- Fjern pluggene fra biochip porter og fest avløp.
- Plasser biochip inn den flyttbare plastbrett i ECIS leseren og lukk lokket.
- Fest fylte sprøyter til de ytre biochip porter og fest sprøytestempelet.
- Fra hovedskjermen, velg "NEXT" for å starte pre-test.
Merk: Reader-programvaren vil sjekke impedanser. Hvis impedanser er innenfor rekkevidde satt av brukeren (vanligvis mellom 1000 og 3000 ohm) vil skjermen registrere "Cartridge Bestått" som vist i figur 3, og instruere brukeren å velge "Neste" og programvaren vil fortsette til trinn 3.10). Dersom impedansene er ikke innenfordet innstilte området på grunn av en defekt biochip eller feil tilkobling av biochip til leseren (vanligvis på grunn av en forskyvning av elektrodene), så vil skjermen registrere "Cartridge Failed", og brukeren vil ha mulighet til å enten "Abort" eller "Verify" testen.- Velg "Avbryt" for å gå tilbake til trinn 3.9). Velg "Bekreft" for å gå videre til trinn 3.10) etter å ha mottatt et "Cartridge Bestått" meldingen og velge "Neste".
Merk: Det er best å ta biochip ut og visuelt inspisere den for feil eller lekker hvis en "Cartridge Failed" melding er mottatt før du fortsetter med en ny biochip.
- Velg "Avbryt" for å gå tilbake til trinn 3.9). Velg "Bekreft" for å gå videre til trinn 3.10) etter å ha mottatt et "Cartridge Bestått" meldingen og velge "Neste".
Figur 3:. ECIS Reader Skjermbilde av en biochip med Akseptable Impedans Readings Biletet viser innledende impedans målinger i ohm av hver av de fire control elektroder (CE) og 4 test prøve elektroder (SE) innenfor fluidic biochip. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Når du blir bedt av leseren, skriv prøven informasjon ved hjelp av en myk tastatur og velg "Godta" når du er ferdig.
Merk: ECIS leseren programvaren vil automatisk stemple hvert datasett med dato, klokkeslett og annen informasjon oppgitt av brukeren; slik som biochip nummer, og den type kjemisk og konsentrasjon. To minutter av impedans data vil bli samlet inn fra det innsatte biochip og et tidsur på skjermen vil telle ned tiden. - Etter to minutter når du får instruksjoner på skjermen som blinker i en rød boks, trykk "NESTE". Når du blir bedt av en blinkende grønn boks til "injisere prøver nå", injisere kontroll og test medier fra vedlagte sprøyter samtidig inn i biochip flaels. La sprøytene på plass på biochips når du er ferdig.
Merk: Impedans verdier skal samles én gang i minuttet i 60 min. Hvis ECIS leserprogramvaren bestemmer at behandlingen kanalen er statistisk forskjellig fra styrekanalen på et punkt mellom 10 og 60 minutter etter starten av testen, vil skjermen på skjermen vil da indikere at prøven er "forurenset". Dersom behandlingen ikke er forskjellig fra styrekanalen, så vil skjermen indikere "No Forurensning funnet" ved slutten av testkjøringen. - Rekordtestresultatene som er forurenset eller ikke forurenset for hver prøve.
- På slutten av testkjøringen, fjern og kast biochip. Skyll og luft-tørke sprøytene, test ampuller og flyttbare plastbrett som huset den biochip under testene.
Merk: ECIS leseren har 4 GB onboard lagring for den operative programvaren, styringsmodeller og test filer generert fra å kjøre en test. Dette gjør det mulig for flere thousand testfiler skal lagres på leseren. Filer kan hentes med en USB hoppe stasjonen og overføres til en datamaskin for videre analyse for forskningsformål hvis ønskelig.
Representative Results
Den ECIS teknologi er beskrevet i denne artikkelen gjennomgikk tester på US Environmental Protection Agency (USEPA) -sponsored Technology Testing og evaluering Program (TTEP). Tretten kjemikalier ble valgt for testing som representanter for et bredt spekter av giftige industri forbindelser som kan være mulige forurensninger av drikkevann. Under testingen ble det 9 av de 13 detektert ved ECIS innen en time ved konsentrasjoner som er relevante for menneskers helse 8. Tabell 1 viser resultatene av denne forurensningen testingen. Figur 4 er representativt for hva en "forurenset" resultat vil se ut på den ECIS leseren skjermen. For det meste, cellulære impedanser redusert for forurensede prøvene sammenlignet med kontroller. I noen tilfeller kan visse forbindelser forårsake en økning i impedans.
Også sammenfattet i tabell 1. figur 5) for en representativ skjermbilde av "No Forurensning funnet".
Figur 4: ECIS Reader Skjermbilde av en "forurenset" Vann Eksempel Et eksempel på normaliserte impedans grafikk og resultater fra en vannprøve som ble forurenset.. Blå linjer representerer normalisert impedansene til hver av styreelektrodene; røde linjene representerer normaliserte impedans av hver av prøven elektrodene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ECIS Reader Skjermbilde av en "No Forurensning Detected" Vann Eksempel Et eksempel på normaliserte impedans grafikk og resultater fra en vannprøve som ikke var forurenset.. Blå linjer representerer normalisert impedansene til hver av styreelektrodene; røde linjene representerer normaliserte impedans av hver av prøven elektrodene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kategori | forurensning | Testede konsentrasjon (mg / l) 1 | Oppdaget ≤1 time n = 4/4 chips | |||
| Plantevernmidler | aldikarb | 0,17 | Nei | |||
| Arsen ic (natrium arsenite) | 4.5 | ja | ||||
| Azid (natriumazid) | 46.7 | ja | ||||
| Fenamiphos | 0,56 | Nei | ||||
| methamidophos | 1.4 | Nei | ||||
| metyl parathion | 33.6 | ja | ||||
| Paraquat (diklorid) | 4.6 | Nei | ||||
| Pentachlorophenate (natrium) | 71,9 | ja | ||||
| industri~~POS=TRUNC | Ammoniakk | 924 | ja | |||
| Kobber (II kobbersulfat) | 103 | ja | ||||
| Cyanide (natrium) | 3 "> 14ja | |||||
| Kvikksølv (klorid) | 24,7 | ja | ||||
| toluen | 444 | ja | ||||
| Clean Water 2 | none | NA | Nei | |||
| 1 konsentrasjonene som ble testet er de samme som i manuskriptet med Widder, et al. (2014). | ||||||
| 2 40 rene vannprøver ble kjørt uten forurensning. | ||||||
Tabell 1: Forurensninger i vannprøver oppdaget av ECIS.
Discussion
Den ECIS teknologi utvikling i et laboratorium innstilling og var i stand til å oppdage potensielle vann forurensninger i konsentrasjoner som er relevante for menneskers helse. Den portabilitet og pakking av teknologien gjør det bidrar til feltbruk.
Kritiske trinn i protokollen for å lykkes med teknologien er som følger: 1) Opprettholde aseptiske forhold under kultur, seeding, og foring av biochips, 2) Hold seeded biochips i nedkjølt før du er klar for testing siden RTgill-W1 celler vil ikke overleve meget lang når de utsettes for temperaturer over 25 ° C, 3) nøyaktig veie den L-15ex i de pulverformede media ampullene og nøyaktig måle vannprøvene for å unngå fremstilling av falske positiver, som kan være forårsaket av en endring i osmolalitet på media i stedet prøve giftighet, 4) Følg bruksanvisningen på ECIS skjermen for å kjøre testene. Programvaren i leseren vil varsle brukeren om en biochip er uakseptabelt for testing (basert på innledende impedans avlesninger) når den biochip blir først satt inn i leseren. Hvis impedansen nivåene er uakseptabelt for testing, vil programvaren ikke tillate brukeren å fortsette med testing inntil en ny biochip anvendes. Grunner for uakseptable impedans målinger er vanligvis på grunn av en liten forskyvning av biochip elektroder med ECIS leseren pinner eller væskelekkasje langs en av de liming kantene av biochip.
Det er noen grenser for denne teknologien fordi ECIS sensoren har bare blitt testet med drikkevann og ikke med overflatevann. De RTgill-W1 celler som er på biochip tåler ikke frost eller temperaturer langt over 25 ° C i lengre perioder (tidsrammen kan være fra timer til dager avhengig av temperaturen. De biochips fungerer best i temperaturer fra kjølig til romtemperatur syv. De er klare for umiddelbar bruk, men rett etter at removed fra kjølelager. Bærbare kalde lagercontainere er i dag brukt av hæren personell i felt for temperaturfølsomme forsyninger. Disse samme beholdere kan anvendes for seeded biochip transport.
En annen grense for denne teknologien er at selv om det er et bredbåndet sensor giftighet, betyr det ikke reagerer godt, hvis i det hele tatt, for å cholinesterase-hemmende stoffer, for eksempel enkelte plantevernmidler. For å fylle denne funksjonen gapet, er ECIS føleren er utformet for å brukes sammen med en kommersielt tilgjengelig hurtig pesticid test-analyse ved testing av vannprøver for å forsyne brukeren med et bredere spekter av toksisitetstesting. Settet er en hurtig enzymatisk assay utviklet for å påvise organofosfat og karbamatpesticider i løpet av 30 min.
Den ECIS sensor utfyller wqas-PM (Water Quality Analysis System - forebyggende medisin) felt vann teste systemet, som nå brukes av militære forebyggende medisin personell å oppdage, arsenic, bly, eller cyanid i et drikkevann prøve. Selv om ECIS sensoren ikke vil identifisere hvilken forurensningen er, vil det indikere at visse metaller eller organiske forbindelser er til stede, noe som indikerer at vannet ikke kan være egnet for menneskelig konsum. De ECIS testresultater er tilgjengelig innen en time. Vannprøvene kan deretter sendes ut for ytterligere analyse for identifikasjon av forurensningene hvis det er et positivt testresultat.
Som beskrevet ovenfor, er det ECIS leseren utformet for å være en del av et system som inkluderer en separat enzymatisk ACE kit for å dekke et bredt spektrum av forurensningen deteksjon. Begge disse leserne blir pakket i en solid sak for felt transport for feltbruk av soldater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70% ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 ml syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 g silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing. |
| 50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C. |
| NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com |
ACE-400 | Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water |
References
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S.
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
