Introduction
Det overordnede mål var at udvikle en metode til celle såning, oplagring og afprøvning af fluide biochips i ECIS biosensor. Målet for udviklingen af denne biosensor var at opfylde US Army specifikationer for et felt bærbar enhed, der kunne afsløre eventuel forurening af drikkevand vandforsyning bliver brugt af soldater. Kravene til toksicitet sensoren var, at det kunne detektere et bredt spektrum af giftige industrielle forbindelser hurtigt (inden for en time) ved koncentrationer relevante for menneskers sundhed, at enheden være felt-bærbar, og de biologiske komponenter ville have en holdbarhed på mindst ni måneder. Refrigeration, men ikke frysning, af letfordærvelige komponenter var acceptabelt.
Historisk set har field bærbare vand afprøvning af teknologier med en biologisk komponent for dem (såsom antistoffer, enzymer eller nukleinsyrer) været analyt-specifik 1-3. Ulempen ved disse typer af biosensorer er, at de vil only detektere én type af kemisk ad gangen. Der er behov for flere sensorer, hvis der er mistanke om, at mere end én kemisk er til stede. Hvis en bestemt sensor ikke er i testen repertoire, kan kemiske forureninger i vandet nemt gå uopdaget.
Bredt funderet toksicitet sensorer, på den anden side, har potentiale til at udfylde denne teknologi hul. Disse har sædvanligvis en cellulær komponent til dem 4-8. Fordelene ved bredt baserede toksicitet biosensorer er, at de kan påvise tilstedeværelsen af en lang række kemiske forurenende stoffer, herunder blandinger og ubekendte, i en forholdsvis kort periode 5,9,10.
Begrebet ved hjælp af måling af elektrisk impedans af cellemonolag som en mulig toksicitet sensor, som også er kendt som elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS), blev først beskrevet af Giaever og Keese 11. I de seneste to årtier har det vist sig at være en følsom indikator for celle viaBility og cytotoksicitet. Grundlæggende er cellemonolaget, der er klæbet til elektroderne på biochips udsat for høj frekvens og lav spænding og strømstyrke vekselstrøm signal. Det sammenflydende monolag af celler hæmmer strømmen af elektroner. Når integriteten af cellemonolaget er kompromitteret (såsom når en toksisk kemikalie indført), ECIS sensoren registrerer en ændring i den elektriske impedans 11-14. Figur 1 illustrerer princippet ECIS i forhold til cellemonolaget på biochip .
Figur 1:.. Princippet om ECIS Illustration af en celle monolag på en biochip med forenklet ECIS læser elektriske skematiske Klik her for at se en større version af dette tal.
12. Disse celler var ikke praktisk til brug i felten, men fordi de krævede hyppige medieændringer, havde en begrænset holdbarhed, og krævede et kunstigt CO 2 miljø og en 37 ° C inkubation temperatur. Det blev opdaget, at en kommercielt tilgængelig cellelinie afledt fra regnbueørred gill epithelceller (RTgill W-1-celler) kunne testes ved stuetemperatur ved omgivelsernes CO 2, dannede et konfluerende monolag i biochips, kunne opbevares ved nedkølede temperaturer, og havde en hurtig reaktion (1 time eller mindre) til et bredt spektrum af kemikalier i koncentrationer betydning for menneskers sundhed 12. Anvendelser af RTgill-W1 celler i toksikologi, samt i grundforskning, gennemgås af Lee et al. 15
Metoder til såning, oplagring og afprøvning af strømningstekniske biochips indeholdermonolag af RTgill-W1 celler på fluide biochips i en ECIS biosensor er beskrevet her. De strømningstekniske biochips kan opbevares i op til 9 måneder i en nedkølet tilstand og kan sendes i en kold opbevaringsbeholder, til test af drikkevandet supplies.The ledsagende ECIS læsere, eller test-enheder, der sendes separat. De biochips har to komponenter til dem; et øvre polycarbonat lag med to separate fluidkanaler, og en lavere elektronisk lag, der indeholder fire elektroder per kanal for impedans sensing. Der er 10 arbejds- elektroder pr pad; hver elektrode er 250 um i diameter. De forsamlede biochips har guld elektrode forbindelser til at erhverve impedans aflæsninger når de indsættes i ECIS test enhed. Hver af de to lukkede fluide U-formede kanaler vil holde 2 ml af RTgill-W1 cellesuspension. Figur 2 viser en strømningsteknisk biochip i ECIS læseren med en forstørrelse på et konfluent celler på en enkelt detektionselektrode.
Figur 2:.. Fluidic Biochip i ECIS Reader Forstørret område viser et sammenflydende monolag af RTgill-W1 celler på en enkelt sensing elektrode Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
1. Forberedelse af Test Materialer
BEMÆRK: For at forberede de biochips til test, flere sammenflydende kolber af RTgill-W1 celler skal være klar. En god skøn over antallet af kolber nødvendige er en sammenflydende T175 kolbe i 16 biochips skal seedet.
- Udfør følgende trin i en klasse II biologisk sikkerhedsskab (biohood) ved hjælp af aseptisk teknik. Brug 70% ethanol til desinfektion af biohood og eventuelle materialer placeret i hætten.
- Forbered fibronectin substrat for de strømningstekniske biochips ved optøning en 1 mg hætteglas af fibronectin og fortynde i 100 ml sterile L-15 medier til en koncentration på 10 ug / ml. Frys i 40 ml portioner i sterile 50 ml koniske polypropylenrør ved -20 ° C. Tø op ved stuetemperatur flere timer forud for podning af biochips. Når optøet, må ikke nedfryses igen.
- Forbered cellekulturmedier ved tilsætning af 50 ml føtalt bovint serum, 5 ml 200 mM en L-alanyl-L-glutamin supplement, og 5 ml af en penicillin / streptomycin-opløsning (10.000 enheder penicillin / ml og 10.000 ug streptomycin / ml) lager til 500 ml L-15 medie. Dette vil give 560 ml celledyrkningsmedier indeholdende 9% serum. Opbevares i køleskab.
Bemærk: Dette vil være den komplette cellekulturmedier anvendes til dyrkningskolber og biochips.
- Pulveriseret Media Hætteglas
- Forbered før tid 0,1 dram snap-cap hætteglas indeholdende 60 mg ± 0,5% af L-15ex pulver ved hjælp af en automatiseret pulver dispenser. Mærk hætteglassene med datoen pulveret blev dispenseret og opbevares i køleskab hætteglas (i mængder på 50) i genlukkelige metalliseret poly poser; hver indeholder tre 1 g silicagel udtørring packs.
Bemærk: L-15ex pulveriserede medier hætteglas kan foretages og opbevares i op til 9 måneder forud for testning.
- Forbered før tid 0,1 dram snap-cap hætteglas indeholdende 60 mg ± 0,5% af L-15ex pulver ved hjælp af en automatiseret pulver dispenser. Mærk hætteglassene med datoen pulveret blev dispenseret og opbevares i køleskab hætteglas (i mængder på 50) i genlukkelige metalliseret poly poser; hver indeholder tre 1 g silicagel udtørring packs.
- Lav en opløsning af 100 ml 20% blegemiddel ved at fortynde blegemiddel med deioniseret (DI) vand. Skøn, der vil være behov for 5 ml blegemiddel løsning for hvert biochip.
- Gør biochip tubing samlinger ved at skære 27 sektioner af autoklaverbar biokompatible rør (2 sektioner for hver biochip der skal podes) mm og passer begge ender af røret med polycarbonat slip luerfittings. Placer slanger forsamlinger i en autoklaverbar pose og autoklave i 8 min ved 134 ° C. Også autoklave biochip stik (2 pr biochip) i en separat pose på de samme indstillinger.
- Autoklave DI vand i 30 min at121 ° C.
Bemærk: Dette vand vil blive anvendt til skylning biochips efter podning. Vurderer, at der vil være behov 10 ml for hver biochip.
Bemærk: Den egentlige mængde af hver biochip kanal er 2 ml, men 5 ml sterilt vand skylles igennem hver kanal efter fjernelse af blegemiddel løsning. - Gør sprøjte injektion tubing samlinger ved at skære 27 sektioner af biokompatible rør mm og vedhæfter mandlige slip luerfittings til begge ender af slangen. Placer slanger assemblies i et papir varmforseglende sterilisation pose og autoklave i 8 minutter ved 134 &# 176; C.
2. Fluidic Biochip Seedning Procedure
Bemærk: Udfør alle procedurer, hvor biochips eller medierne håndteres i en klasse II biologisk sikkerhedsskab med aseptisk teknik.
- Fireogtyve timer før planlagt såning, fjerne biochips fra producent emballage i biohood og plads i steriliserede tilfælde plast instrument.
- Steriliser biochips anvendelse af en 20% blegemiddelopløsning som følger
Bemærk: Historisk har denne blegning procedure forhindret svampevækst i biochips under langtidsopbevaring i tilfælde af, at plasma sterilisering af biochips udført af fabrikanten ikke var effektiv.- Ved hjælp af en 20 ml steril sprøjte med en sprøjte indsprøjtning slange fæstnet og arbejder i biohood, injicere 2 ml af 20% blegemiddel opløsningen i hver kanal af biochip. Tillad biochips at sidde i 1 time med blegemiddel opløsning.
- Efter en time vakuum aspvrede blegemiddelopløsningen fra begge kanaler under anvendelse af en steril mandlig slip luer fæstnet til vakuumkilden sugeslangen. Brug en af biochip slange forsamlinger som et dræn, når skylning af biochips.
- Anvendelse af en steril 20 ml sprøjte fastgjort til en steril sprøjte injektionsaggregatet, skylle hver kanal af chippen med 5 ml sterilt vand, idet overskydende vand løbe ned i en beholder i biohood. Derefter vakuum-aspirat fra vandet, som netop beskrevet for blegemiddel og placere biochips tilbage i plast sager instrument- og forlade om biohood indtil podet med celler den følgende dag.
- Tres minutter før podning af biochips, injiceres 2 ml af 10 ug / ml fibronectin opløsning i hver kanal i biochip. Lad biochips i biohood i 60 min, og derefter vakuum aspirat fra fibronectin (som beskrevet i trin 2.2.3) før podning af biochip med celler. Placer to sektioner af de sterile biochip slange forsamlinger (seafsnit 1.4) på havnene i de biochips.
- Trypsinisér en sammenflydende RTgill-W1 T175 kolbe for hver 16 biochips bruger procedurerne i American Type Culture Collection (ATCC) produktbeskrivelse ark 16.
- Aspirer off medierne fra sammenflydende kolbe (r) af celler.
- Skyl cellelaget med 15 ml PBS og derefter aspireres fra.
- Tilsæt 6 ml trypsin / EDTA til cellelaget i hver T175 kolbe og tillade cellerne at Trypsinisér for ~ 5 min.
- Tilsættes 15 ml komplet L-15 cellekultur medier til hver kolbe for at stoppe trypsinisering.
- Kombiner cellesuspensionerne i en steril engangsbeholder.
Bemærk: Emballage kan variere fra 150-500 ml, afhængig af antallet af biochips, der podet. Skøn, der vil være behov for 5 ml cellesuspension pr biochip.
- Fjern ~ 1 ml af cellesuspensionen og anbringes i et mikrocentrifugerør til tælling. Ved hjælp af en brightfield mikroskop med en 10X MÅLve og et hæmocytometer, tæller en 10 pi alikvot af cellerne og beregne mængden af komplet L-15 celledyrkningsmedier er nødvendig for at opnå en cellesuspension på 2,5 x 10 5 celler / ml.
Bemærk: Hvis der anvendes cellesuspensionen til frø kolber for at fortsætte kulturen, ville dette være det punkt at gøre dette. Indstille koncentrationen cellesuspensionen ved anvendelse komplet L-15 celledyrkningsmedier. - Anvendelse af en steril 20 ml syringeattached til en steril sprøjte injektion rørsamling (se afsnit 1.6), injiceres 2,5 ml af cellesuspensionen i den ydre port af hver kanal i biochip (dvs. de porte, der ikke har slangen vedhæftet), tillader nogle af de ekstra cellesuspension at strømme ud af slangen i en affaldsbeholder i biohood.
Bemærk: Dette vil sikre, at hele kanalen og fastgjort slange vil være fuld af cellesuspensionen.- Opret en lukket løkke for hver biochip kanal ved at indsætte den frie ende af slangen med luer Fitting ind i de ydre porte til hver kanal.
- Tør overskydende medier ud af de lukkede sløjfer med et stykke køkkenrulle fugtet med 70% ethanol og placere biochips tilbage i plastik kasse i et 20 ° C inkubator. Giv hver biochip et unikt identifikationsnummer.
- På dag 4 og 7, fjerne biochips fra 20 ° C inkubator og genopbygge medierne i alle biochips med temperatur-ligevægt komplet L-15 cellekultur medier. Følg samme fremgangsmåde som i trin 2.6, bortset brug kun L-15 celledyrkningsmedier stedet (ingen celle suspension). Placer biochips tilbage i 20 ° C inkubator efter dag 4 fodring.
- Efter dag 7 fodring, fjerne og kassere slangerne fra chips og sæt autoklaveres drænpropper i biochips.
- Placer biochips i en kasse i en 6 ° C inkubator indtil anvendes til testning.
Bemærk: Flisen kan opbevares ved afkølede temperaturer i op til 9 måneder og er stadig levedygtige til testning in ECIS læsere.
3. ECIS Test med Biochips
- Forbered test kemikalier, hvis du bruger. (Se Brennan, et al., 2012 7 til forberedelse af test kemikalier).
- Fjern ECIS læser og test forsyninger fra bæretaske. Fjern en forberedt biochip fra 6 ° C inkubator. Placer biochip på et stykke køkkenrulle. Tænd for ECIS læseren.
- Brug 10 ml sprøjter, dispensere 10 ml kontrol vand i en mærket 0,5 ounce klar plast kontrol krukke og 10 ml af prøven i en mærket 0,5 ounce klar plast test krukke.
Bemærk: 1) Sørg for at fjerne bobler for en nøjagtig måling. 2) sprøjter og krukker er farvekodede; blå for kontrol og rød for test. - Fjern to pulveriserede medier hætteglas fra folie poser. Åbn en af de pulveriserede medier hætteglas (brug multipurpose værktøj, hvis nødvendigt) og hæld hele indholdet af et hætteglas i glasset med kontrol vand, droppe hele flasken indopløsning samt. Gentag denne procedure med testen krukke. Cap og ryst glassene for at sikre, at pulveret er opløst.
- Fyld hver af de farvede 10 ml sprøjter med 9 ml enten kontrol (blå sprøjte) eller test (rød sprøjte) løsninger fra respektive hætteglas. Fjern luftbobler fra sprøjter.
- Fjern propperne fra biochip porte og vedhæfte afløbet.
- Placer biochip i flytbare plastik bakke i ECIS læseren og luk låget.
- Vedhæft fyldte injektionssprøjter til de ydre biochip porte og vedhæfte sprøjtens stempel.
- Fra hovedskærmen, skal du vælge "Næste" for at starte pre-test.
Bemærk: Reader kontrollerer impedanser. Hvis impedanser er inden for rækkevidde af brugeren (normalt mellem 1.000 og 3.000 ohm) vil skærmen registrere "Cartridge Bestået" som angivet i figur 3, og instruere brugeren at vælge "Next" og softwaren vil fortsætte til trin 3.10). Hvis impedanser ikke er indendet indstillede område på grund af en defekt biochip eller mangelfuld forbindelse af biochip til læserne (normalt på grund af en forskydning af elektroderne), hvorefter skærmen vil registrere "Cartridge Failed", og brugeren vil have mulighed for at enten "Abort" eller "Verify" testen.- Vælg "Afbryd" for at gå tilbage til trin 3.9). Vælg "Bekræft" for at fortsætte til trin 3.10) efter at have modtaget en "Cartridge Bestået" besked og vælge "Næste".
Bemærk: Det er bedst at tage biochip ud og visuelt inspicere det for fejl eller utæt, hvis en "Cartridge Failed" besked modtages før du fortsætter med en ny biochip.
- Vælg "Afbryd" for at gå tilbage til trin 3.9). Vælg "Bekræft" for at fortsætte til trin 3.10) efter at have modtaget en "Cartridge Bestået" besked og vælge "Næste".
Figur 3:. ECIS Reader Skærmbillede af en Biochip med Acceptable Impedans Readings Skærmbilledet viser indledende impedans aflæsninger i ohm i hver af de fire control elektroder (CE) og 4 test sample elektroder (SE) inden fluidik biochip. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Når du bliver bedt af læseren, indtaste prøve oplysninger ved hjælp af en blød tastatur og derefter vælge "Accepter", når du er færdig.
Bemærk: Den ECIS reader software vil automatisk stemple hver datasæt med dato, tid og andre oplysninger indtastet af brugeren; såsom biochip nummer, og typen af kemiske og koncentration. To minutter af impedans data vil blive indsamlet fra det indsatte biochip og en timer på skærmen tæller ned-tid. - Efter to minutter, når du bliver bedt om instruktionerne på skærmen, der blinker i en rød boks, hit "NEXT". Når du bliver bedt af en blinkende grøn boks til "indsprøjtes prøver nu", injicere kontrol og test medier fra de vedlagte sprøjter samtidigt ind i biochip kanaliels. Lad sprøjterne på plads på biochips når du er færdig.
Bemærk: impedansværdier vil blive indsamlet en gang i minuttet i 60 min. Hvis ECIS læseren software bestemmer, at behandlingen kanalen er statistisk forskellig fra kontrollen kanal på ethvert punkt mellem 10 og 60 minutter efter starten af testen, så visningen på skærmen angiver, at prøven er "Forurenet". Hvis behandlingen er ikke forskellig fra styrekanalen, hvorefter skærmen angiver "Ingen forurening Detected" i slutningen af prøvekørslen. - Optag testresultater som forurenet eller ikke er forurenet for hver prøve.
- Ved afslutningen af testkørslen, fjern og kassér biochippen. Skyl og lufttørre sprøjterne, test hætteglas og aftagelig plastbakke, som husede den biochip under prøverne.
Bemærk: Den ECIS læseren har 4 GB intern hukommelse for den operationelle software, styringsmodeller og testfilerne genereret fra at køre en test. Dette giver mulighed for flere thousand test filer, der skal gemmes på læseren. Filer kan hentes med et USB hoppe drev og overføres til en computer til videre analyse til forskningsformål, hvis det ønskes.
Representative Results
Den ECIS teknologi beskrives i dette papir undergik test på det amerikanske Environmental Protection Agency (USEPA) -sponsorerede Teknologi Test og evaluering Program (TTEP). Tretten kemikalier blev udvalgt til test som repræsentanter for et bredt spektrum af giftige industrielle forbindelser, der kunne være mulige forureninger af drikkevandet. Under afprøvning, 9 af de 13 blev påvist ved ECIS inden for en time ved koncentrationer, der er relevante for menneskers sundhed otte. Tabel 1 viser resultaterne af denne forurenende test. Figur 4 er repræsentativ for, hvad en "Forurenet" resultat ville se ud på ECIS læser skærmen. For det meste, cellulære impedanser faldet for forurenede prøver sammenlignet med kontroller. Lejlighedsvis kan visse forbindelser forårsage en stigning i impedans.
Også opsummeret i tabel 1 figur 5) for en repræsentativ skærmbillede af "Ingen forurening Detected".
Figur 4: ECIS Reader Skærmbillede af en "Forurenet" vandprøve Et eksempel på normaliserede impedans grafik og resultater fra en vandprøve, der var forurenet.. Blå linier repræsenterer normaliserede impedans hvert kontrolpunkt elektroder; røde linjer repræsenterer normaliserede impedanser af hver af prøven elektroder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ECIS Reader Skærmbillede af en "Ingen Forurening opdaget" vandprøve Et eksempel på normaliserede impedans grafik og resultater fra en vandprøve, der ikke var forurenet.. Blå linier repræsenterer normaliserede impedans hvert kontrolpunkt elektroder; røde linjer repræsenterer normaliserede impedanser af hver af prøven elektroder. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kategori | forurenende | Testet koncentration (mg / l) 1 | Opdagede ≤1 timer n = 4/4 chips | |||
| pesticider | aldicarb | 0,17 | ingen | |||
| Arsen ic (natrium arsenite) | 4,5 | Ja | ||||
| Azid (natriumazid) | 46.7 | Ja | ||||
| fenamiphos | 0,56 | ingen | ||||
| methamidophos | 1.4 | ingen | ||||
| methyl parathion | 33.6 | Ja | ||||
| Paraquat (dichlorid) | 4.6 | ingen | ||||
| Pentachlorophenate (natrium) | 71,9 | Ja | ||||
| Industrial Chemicals | Ammoniak | 924 | Ja | |||
| Kobber (Cu II-sulfat) | 103 | Ja | ||||
| Cyanid (natrium) | 3 "> 14Ja | |||||
| Kviksølv (chlorid) | 24.7 | Ja | ||||
| Toluen | 444 | Ja | ||||
| Clean Water 2 | ingen | NA | ingen | |||
| 1 testede koncentrationer er de samme som i manuskriptet af Widder et al. (2014). | ||||||
| 2 40 rent vand prøver blev kørt med nogen forurening. | ||||||
Tabel 1: Forurenende stoffer i vandprøver opdaget af ECIS.
Discussion
Den ECIS teknologi klarede sig godt i et laboratorium indstilling og var i stand til at opdage potentielle vand forurenende stoffer i koncentrationer, der er relevante for menneskers sundhed. Den bærbarhed og emballering af teknologi gør det befordrende for brug feltet.
Kritiske trin i protokollen for den succes, teknologien er som følger: 1) Opretholde aseptiske forhold under kultur, såning, og fodring af biochips, 2) Hold seedede biochips i kølede betingelser indtil den er klar til test, da RTgill-W1 celler vil ikke overleve meget længe, når de udsættes for temperaturer over 25 ° C, 3) afvejes nøjagtigt L-15ex i de pulveriserede medier hætteglas og nøjagtig måling vandprøverne for at undgå at generere falske positiver, som kan forårsages af en ændring i osmolalitet på medier i stedet prøve toksicitet, 4) Følg brugsanvisningen på skærmen ECIS for at køre testene. Softwaren i læseren vil advare brugeren, hvis en biochip er uacceptabel til afprøvning (baseret på indledende impedans aflæsninger), når biochip indsættes først i læseren. Hvis impedansen niveauer er uacceptable til test, vil softwaren ikke tillade brugeren at fortsætte med forsøget, indtil en ny biochip anvendes. Årsager til impedans uacceptable aflæsninger er normalt på grund af en mindre forskydning af biochip elektroder med ECIS læseren stifter eller væske lækage langs en af de lime kanter biochip.
Der er nogle grænser for denne teknologi, fordi den ECIS sensoren kun er afprøvet med drikkevand og ikke med overfladevand. De RTgill-W1 celler, der er på biochip kan ikke tåle frost eller temperaturer meget over 25 ° C i længere tid (tidshorisont kan være fra timer til dage afhængig af temperaturen. De biochips fungerer bedst i et temperaturområde fra nedkølet til stuetemperatur 7. De er klar til øjeblikkelig brug, men lige efter at være removed fra kølelager. Bærbare kolde opbevaringsbeholdere i øjeblikket bruges af hærens personel inden for temperaturfølsomme forsyninger. De samme beholdere kan anvendes til seeded biochip transport.
En anden begrænsning i denne teknologi er, at selv om det er en bredbåndet toksicitet sensor, betyder det ikke reagerer godt, hvis overhovedet, til cholinesterase-inhiberende forbindelser, såsom visse pesticider. For at udfylde denne funktion hul er ECIS sensor beregnet til anvendelse sammen med et kommercielt tilgængeligt hurtig pesticid test assay ved test vandprøver for at forsyne brugeren med en bredere vifte af toksicitetstestning. Sættet er en hurtig enzymatisk assay designet til at detektere organophosphat og carbamat pesticider inden for 30 min.
Den ECIS sensor supplerer wqas-PM (Water Quality Analysis System - forebyggende medicin) felt vand testsystem, som i øjeblikket bruges af militært forebyggende medicin personale til at opdage, arsenic, bly, eller cyanid i en drikkevandet prøve. Selvom ECIS sensoren ikke vil identificere, hvad forureningsstoffet er, vil det angive, om visse metaller eller organiske forbindelser er til stede, hvilket indikerer, at vandet ikke kan være egnet til konsum. De ECIS testresultater er tilgængelige inden for en time. Vandprøverne kan derefter sendes ud til yderligere analyse til identifikation af det forurenende hvis der er et positivt testresultat.
Som beskrevet ovenfor er ECIS læseren designet til at være en del af et system, der omfatter et separat enzymatisk ACE kit for at dække et bredt spektrum af forurenende detektion. Begge disse læsere bliver pakket i en robust taske til felt transport for felt brug af soldater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70% ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 ml syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 g silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing. |
| 50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C. |
| NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com |
ACE-400 | Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water |
References
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S.
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
