Introduction
甲型流感病毒（IAV）是包膜病毒属于正粘病毒科的。它的基因编码的一个分段，负义单链RNA基因组。在人类中，IAV引起呼吸道感染，发生的季节性疫情和承担全球性流行病1的潜力。在结合于宿主细胞表面2上的唾液酸残基，IAV是通过网格蛋白依赖的内吞作用和网格蛋白独立的途径3-8内化。在胞吞液泡的酸性环境（pH值<5.5）触发在IAV穗糖蛋白血凝素（HA），这导致在病毒融合和已故体膜9的一个主要的构象变化。一旦IAV衣壳（这里也被称为病毒“核心”）已经从晚期内涵体（LES），它在胞质溶胶中，随后通过病毒核糖核蛋白（vRNPs）转运到细胞核未涂覆逃脱 - 的部位O˚F病毒复制和转录10-13。之前的HA的酸活化的病毒经历在内吞系统，素数为随后的拆卸14-16芯pH的逐渐减少。在此“启动”步骤中的病毒膜M2离子通道介导的质子和K +10,14,16的流入。该病毒内部的离子浓度的变化扰乱了相互作用的基质蛋白M1和八个vRNP束建立，并促进IAV脱壳在以下膜融合10,14-17细胞质中。
起动步骤的直接和定量的分析已经阻碍了一个事实，即内涵体难以接近实验。入门过程，而且高度非同步的。此外，终点测定法，如释放的病毒RNA或感染性测量的定量RT-PCR，没有提供关于病毒capsi的生化状态的详细的图片ð在进入任何给定的一步。同时通过siRNA或药物治疗的内体扰动已显著贡献IAV进入18-20的理解，微调是困难的，容易出现非特异性副作用，在严格控制的内吞体成熟方案。
为了避免这些问题，我们已经适于基于使用速度梯度离心17的以前开发体外协议。相对于其他的尝试21,22，23,24，其中大多数是基于蛋白水解裂解和清洁剂处理，然后进行EM分析的组合，这种方法使一个容易量化的结果。离心通过不同的梯度层允许沉降颗粒被暴露，并与以受控的方式变化的情况作出反应。在所提出的协议，IAV从澄清尿囊液的或纯化的病毒颗粒衍生的被沉淀成两层甘油梯度，其中所述底层包含非离子型洗涤剂NP-40（ 图1）。作为病毒进入第二，含去污剂的层，病毒脂质包膜和包膜糖蛋白轻轻溶解并留下。核心，八个vRNP束的组成和由一个基质层包围，沉积物作为一个稳定的结构进沉淀部分。病毒核心蛋白，例如M1和vRNP相关核蛋白（NP），可以在通过SDS-PAGE和考马斯染色的沉淀来识别。特别是，考虑市售梯度凝胶的优点，并与高度敏感的胶体考马斯25染色，使高精度，即使是少量的病毒核心相关蛋白的检测。
此设置的基础用于测试是否不同的条件，例如pH，盐浓度，和推定脱壳因素上的核心部件和芯STABIL的沉淀行为的影响性。到这个目的，在甘油梯度只有较低的，含去污剂的层是通过将因子或感兴趣的条件进行修改。该技术已在研究的不同的pH值和盐浓度的IAV芯16的完整性的影响特别有价值的。 IAV脱壳的中间步骤可以在随后vRNP离解在pH 5.5和下部16,17（ 图1）温和的酸性pH值（<6.5）进行监测，包括在基质层的离解。后者步骤是由高K +浓度的甘油层的存在进一步增强，反映了晚内吞环境16。因此，当病毒和芯通过梯度沉降他们经历了改变环境中核内体，模仿的条件。结果是在体外病毒核心的逐步解体，补充细胞生物学实验得出的结果。
T“>这里介绍的方法，使快速和IAV的高度重复性分析（X31和A / WSN / 33）和IBV（B /李/ 40）脱壳由酸性pH值触发增钾+16,17以及拆卸的在碱性pH曝光17副粘病毒核心。可以想象，该方法可以适于其它包膜病毒进入细胞过程中深入了解病毒衣壳的结构和衣壳拆卸的生化特性。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.缓冲区和股票溶液的制备
- 由470毫克的Tris盐酸，390毫克的MES水合物和580毫克氯化钠溶解在80毫升的DDH 2 O制备的MNT缓冲液（20mM MES，30毫摩尔Tris和100mM NaCl）中调整缓冲至pH 7.4，并将其与的DDH 2 O带来至100ml的最终体积
- 通过在80毫升的dh每2 O溶解9.76克MES水合物准备500毫米MES缓冲三个相同的解决方案。通过用浓NaOH滴定调节缓冲剂至pH 5.8，5.4和5.0，分别。带来各缓冲器的100毫升的dh 2 O的最终体积
- 通过在80ml各溶解7.88克Tris盐酸的dh 2 O制备的500mM Tris缓冲液两个相同的解决方案，并调节pH值至分别7.4和6.4，通过用浓HCl滴定。使缓冲至100ml与卫生署2 O的最终体积
- 用蒸馏水2 O准备50％的甘油溶液，搅拌均匀，直到GLYC埃罗尔是均匀混合。过滤通过一个Steritop滤波器单元（0.22微米孔径）成玻璃瓶的溶液。
- 制备10％NP-40溶液和1M NaCl的卫生署2 O.
- 通过在4毫升的DDH 2 O溶解两片准备25倍浓缩的蛋白酶抑制剂
2.甘油梯度的制备
- 制备5毫升洗涤剂缓冲主混合物（300毫摩尔NaCl，2％NP-40，2倍浓缩的蛋白酶抑制剂），用于每一pH条件下的溶液至试验（pH为7.4，6.4，5.8，5.4和5.0）。为了这个目的，混合9毫升1M NaCl的的6毫升10％的NP-40，2.4毫升25×蛋白酶抑制剂的股票，并且9毫升的DDH 2 0。
- 对于每一pH条件下吸管4.4毫升的主混合物到50毫升锥形管中。
- 用于pH值高于5.8添加0.6毫升相应调节pH的500毫摩尔Tris原液到管。用于pH 5.8和更低的添加0.6毫升相应调节pH的500mM的MES原液。
- 制作5毫升含有300mM NaCl的缓冲液，2×蛋白酶抑制剂，60毫摩尔Tris调节至pH 7.4和的DDH 2 O这将作为不含去污剂的控制梯度缓冲液。
- 如果需要，通过分别添加浓HCl或NaOH溶液，精细调节溶液至pH 7.4，6.4，5.8，5.4和5.0的pH值。
- 将5ml的50％甘油原液添加到5ml导致六个不同的25％甘油溶液含洗涤剂和不含去污剂的缓冲混合物。通过用pH试纸检查的pH值。
注意：如果所测量的pH值从所需值显著不同，各自的溶液应该再次制备。 - 7比：通过在3混合50％甘油的库存与卫生署2 O制备15％甘油溶液中。
3. IAV的超速离心
- 通过使用5ml的注射器和娘家姓添加3毫升15％甘油溶液到超清晰离心管（13.2毫升14毫米×89毫米）DLE（21g的9厘米长）。在管的内壁不离开滴因为这可能会扰乱梯度的完整性。重复此一共有六个离心管，每个的五个pH条件来测试和一个用于控制的样品。
- 小心地将15％甘油层下3.4毫升25％甘油溶液，通过使用5ml的注射器和长针。小心两层不能混用。重复此为所有六个条件与相应的调节pH的甘油溶液进行测试。
注：II级生物安全柜工作，为下面的步骤。 - 轻轻覆盖用30微升澄清含有IAV（X31，H3N2）在1ml MNT缓冲液稀释的尿囊液的甘油梯度（相当于总病毒蛋白的约20-30微克）对于每个梯度。
- 平衡对立管，将它们放入一个SW41超速离心转子。离心150分钟，55,000 XG和12℃。
- 离心后，小心通过使用干净巴斯德吸管和一抽吸器除去上清液， 即 ，既甘油层。重悬在40微升（1×）的非还原性LDS样品缓冲液沉淀。它到吸管上下数次以完全溶解沉淀是重要的。将样品转移到1.5 ml离心管。
沉淀部分和考马斯染色的4 SDS-PAGE
- 加热所有样品在95℃下进行10分钟。此时的样品可以贮存于-20℃，直到它们通过SDS-PAGE进行分析。
- 负载20微升溶解丸粒到一个预制梯度（4-12％）的Bis-Tris微型凝胶在1×MOPS SDS 200伏运行1小时运行缓冲液。
- 使用40％的甲醇和10％冰醋酸在DDH 2 O定影溶液
- 孵育在定影溶液的凝胶1小时，并在15厘米的细胞培养皿用胶体考马斯溶液足够体积，同时轻轻染色过夜在室温下摇动。
注：以关闭盘以避免染色溶液的蒸发是很重要的。 - 退色在DDH 2 O.凝胶直至凝胶背景变得清晰更换DDH 2 O的每次15-20分钟。存储在DDH 2 O的凝胶在4°C，直到它被扫描带量化。
- 扫描高分辨率的凝胶，并使用市售的或定制的软件，用于蛋白质谱带强度的定量。减去从靠近相应频带的区域中的背景信号和（在pH 7.4）正常化这些值到不含去污剂的对照样品。
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Representative Results
如已经讨论的，在核内体内吸需要呈现IAV芯脱壳胜任。芯的质子化削弱M1和vRNPs的相互作用（病毒RNA，NP组成，和聚合酶复合PB1 / PB2 / PA）。当传入病毒暴露于pH为在早期内涵体（EES）6.5（或更低），并继续进行，直到在的LE在pH5.0周围的病毒熔丝此过程开始。
以模仿，pH降低，甘油梯度的底层以恒定的盐浓度被调节至pH 7.4和5.0之间的值。从澄清的尿囊液衍生X31进行速度梯度离心分析通过SDS-PAGE（ 图2A，B）。不用洗衣粉中存在的梯度（ 图2A，lane1）完整的病毒粒子沉淀，通过的特征模式反映代表HA（HA1和HA2; 63 kDa）的乐队在考马斯，NP（56 kDa的）和M1（27 kDa的）染色凝胶。由于凝胶在非还原条件下运行，蛋白水解切割HA1和HA2仍然通过二硫键连接并运行在大约64 kDa的。在还原条件下对应于HA1和HA2频带似乎非常接近的NP和M1频带，分别使得难以忠实解释和确定被完全从病毒核心（ 图2B）衍生的带强度。
在加入NP-40的底部（25％）甘油层病毒包膜包括HA，NA，和M2分别为溶解和超速离心（ 图1; 图2，泳道2）中所述病毒核心单独沉淀成粒料。用pH低于6.5开始，M1被逐渐从沉淀级分丢失，达到pH值5.8和5.4（ 图之间的最小图2A，B）。 pH低于5.8 vRNPs解离，从而从沉淀物丢失。以前，已经显示，事实上，整个vRNPs被释放到上层，因为它们的释放与PB2的从沉淀级分16中的损失相关。测定蛋白条带强度，显示为vRNP束，分别（ 图2）的M 1层和离解的拆卸两个不同的pH值的阈值。额外条带可以在凝胶，这可能对应于聚合酶蛋白PB1（87 kDa的），PB2（86 kDa的），PA（83 kDa的），和M2（11 kDa）的上被观察到。由于IAV病毒体内部的低拷贝数，我们不能可靠地确定他们的身份和他们因此不考虑为定量。
图1：IAV的示意图 
图 2： 在 体外 酸化 IAV核心拆装 （A）在较低的甘油层不同的pH值条件下X31内核的体外拆卸。作为对照，NP-40从底部甘油层（第一泳道）被删去。样品通过SDS-PAGE在非还原条件，随后进行考马斯染色下分离。病毒蛋白条带在右边标明。 （B）在（A）中示出的病毒蛋白条带的强度的光密度定量。为M1和NP蛋白条带强度进行标准化为那些在pH7.4不使用NP-40。数据表示为重复实验±标准偏差（SD）的装置。从斯托弗等人 ，2014年16改编。ge.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
病毒衣壳是亚稳大分子复合物。虽然病毒粒子组装需要病毒基因组的衣壳和冷凝，下一轮感染的启动取决于这个紧凑的衣壳的结构拆卸。病毒已经进化到利用各种细胞机制，以控制涂层脱壳周期，包括细胞受体，伴侣分子，蛋白水解酶，由马达蛋白或解旋酶，以及pH和离子开关26,27提供物理力。在这里，我们描述了基于甘油梯度离心特异性测试的促进IAV芯拆卸因子的效果的体外方法。该技术可以潜在地适于解剖的其它包膜病毒脱壳过程。
通过使用胶体考马斯，主要结构IAV蛋白M1，NP和HA可以清楚地在SDS-PAGE即使相对小的病毒partic检测文件编号。然而，沉淀的衣壳结构的更深入的表征和其组合物将需要后续的分析，例如电子显微镜（如先前提出的28），Western印迹，动态光散射或质谱。该协议的进一步扩展可以包括较低的（25％）甘油特定核心组件的相位和分析的分馏。
下部甘油层到5.0（为X31）最优融合pH值的调整导致了基质层的几乎完全离解（ 图2）16。但是，大约30％的输入的NP信号仍然可以在该pH检测。这可能是由于没有在此设置的蜂窝脱壳因素，如最近鉴定的组蛋白脱乙酰6（HDAC6）18，不完全拆卸发生。在细胞内，从Na +的病毒核心和接触开关的缓慢酸化至K + 16病毒。我们不能排除，在我们的设置中，非离子型去污剂部分破坏酸暴露和不稳定芯。然而，在芯在中性pH沉降没有影响观察到的类似蛋白质谱带强度表示为相对于非溶解的样品（ 图2A，比较泳道1和2）。虽然，这里给出证明该测定是高度可再现的和（因此是）鲁棒足够用于频带量化，变化的一定范围内可以观察到。
在这个协议中所用的甘油是在实验的结果是至关重要的。如先前报道17，超速离心通过蔗糖梯度动摇的IAV芯，这可能是由于由蔗糖产生一个高渗透力。通过蔗糖梯度IAV的纯化可能会产生同样的效果。因此，我们比较蛋生长X31从CL派生 arified尿囊液和蔗糖纯化的股票。 （数据未显示）没有大的差异可能相对于核心稳定性酸性pH的影响被观察到。尽管如此，为了排除渗透活性蔗糖的潜在的副作用，我们建议执行与澄清尿囊液或浓缩的细胞培养上清液在体外脱壳测定。
除了梯度材料的选择，它保持梯度不影响裂解病毒核心的沉降行为，并确保可再现的结果的完整性是重要的。此外，超速离心后的沉淀级分的不完全再悬浮可能导致不同的结果。最后，我们强烈建议在实验的当天理想地调节含去污剂的缓冲溶液的pH为离子浓度的微小变化可能对病毒核心稳定性有强烈影响。
内容“>重要的是要注意，根据特定IAV菌株，不同的拆卸效率可能发生基于各个M1的性能是重要的和NP变体，这可能也适用于突变病毒。因此，对于矩阵层和vRNP pH值的阈值解离已用于测试额外的影响之前的各IAV应变来确定。有关对病毒核心稳定性，我们建议的底部甘油层调节至pH值，使得M1的半最大拆卸实现特定条件的分析，这是可能通过相应地修改所述含去污剂的层来调查特定离子或还原剂的影响。推定蜂窝脱壳因子可直接加入到甘油梯度，在细胞质因素的情况下，在梯度的底部的第三甘油层可以是引入，其调节至中性pH值，包含感兴趣的细胞因子，并且是自由洗涤剂。以这种方式，第Ë三层梯度将更加紧密地模仿病毒通过内吞系统和基因区段的释放通道进入中性细胞质。综上所述，我们提出了一个强大而简单的体外实验研究IAV启动和脱壳，这对通用的修改的可能性，以解决IAV条目的上下文不同的问题。此外，它可以应用于调查与相关脱壳机制的其它包膜病毒条目的进程。
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Acknowledgments
我们感谢河野洋平山内和罗伯塔·曼奇尼为我们提供了试剂。 ，欧洲研究委员会（ERC），以及由瑞士国家科学基金会（Sinergia）的AH实验室是由居里夫人初始培训网络（ITN）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
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