Introduction
Вирус гриппа А (ИФО) является оболочечный вирус и принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Его гены кодируют на сегментированных отрицательного смысла и одноцепочечной РНК-генома. У людей, IAV вызывает респираторные инфекции, которые происходят в сезонных вспышек эпидемии и несет потенциал для глобальных пандемий 1. После связывания с остатками сиаловой кислоты на поверхности клетки - хозяина 2, ИФО интернализируется в клатрин-зависимой эндоцитоза и клатриновых-независимых путей 3-8. Кислая среда (рН <5,5) в эндоцитических вакуолей вызывает значительное конформационные изменения в IAV спайка гликопротеина гемагглютинина (HA), что приводит к слиянию вирусной и поздней эндосомальной мембраны 9. После того, как капсида IAV (здесь также упоминается как вирусный "ядро") сбежал из поздних эндосом (LES), она не покрытом в цитозоле с последующим транспортом вирусных рибонуклеопротеинов (vRNPs) в ядро - сайт Oрепликация вируса F и транскрипции 10-13. До активации кислотой HA вируса испытывает постепенное снижение рН в системе эндоцитоза, что простые числа ядро для последующей его разборки 14-16. В этой "затравки" шаг ионных каналов М2 в вирусной мембране опосредуют приток протонов и K +10,14,16. Изменение концентрации ионов в интерьере вируса нарушает взаимодействие создать с помощью вирусного белка матрицы M1 и vRNP пучка восемь, и способствует Iav декапсидацию в цитоплазме следующего слияния мембран 10,14-17.
Прямой и количественный анализ на стадии грунтовочного было затруднено тем, что эндосомы трудно экспериментально получить доступ. Процесс входа, кроме того, весьма несинхронное. Кроме того, конечной точки анализы, такие как QRT-PCR высвобождаемых измерения вирусной РНК или инфекционности, не дают детальное представление о биохимическом состоянии вирусного capsiг при любом данном этапе записи. В то время как возмущение эндосомы, миРНК или медикаментозного лечения в значительной степени способствовало пониманию IAV записи 18-20, тонкая настройка трудно и склонны к неспецифических побочных эффектов в строго контролируемой программе эндосомы созревания.
Чтобы избежать этих проблем, мы адаптировали ранее разработанный протокол в пробирке , основанный на использовании градиента скорости центрифугирования 17. В отличие от других попыток 21,22, 23,24, которые были в основном на основе комбинации протеолитического расщепления и обработки детергентом с последующим анализом EM, этот подход позволил в легко измеримый результат. Центрифугирование через различные слои градиента позволяет осаждающихся частиц, которые будут подвергаться воздействию и реагировать с изменением условий контролируемым образом. В представленном протоколе, ИФО полученный из осветленного аллантоисной жидкости или очищенных вирусных частиц осаждают в двухслойную глицерина вградиент , в котором нижний слой содержит неионогенный детергент NP-40 (рисунок 1). По мере того как вирус входит во вторую, детергентов слой, содержащий, вирусные липидной оболочки и гликопротеины оболочки мягко солюбилизировали и оставили позади. Ядро, состоящий из восьми vRNP пучка и окружены матричным слоем, отложения в качестве стабильной структуры в гранулированной фракции. Вирусные основные белки, такие как M1 и vRNP-ассоциированной нуклеопротеида (NP), могут быть идентифицированы в осадке с помощью SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси. В частности, пользуясь имеющимися в продаже градиентном геле и окрашиванием с высокочувствительным коллоидного кумасси 25, обеспечивает высокую точность и обнаружение даже небольших количеств вирусных ядро-ассоциированных белков.
Это закладывает основу для тестирования является ли различных условий, таких как рН, концентрации соли и предполагаемых раздевания факторов оказывают влияние на поведение оседания основных компонентов и ядра Stabil ность. Для этой цели, только нижний, моющее средство слой, содержащий в градиенте глицерина модифицирован путем введения фактора или состояния интереса. Техника была особенно ценным при исследовании влияния различных значений рН и концентрации солей на целостность ядра IAV 16. Промежуточные этапы IAV раздевания можно было бы контролировать в том числе диссоциации матричного слоя при слегка кислом рН (<6,5) с последующим vRNP диссоциации при рН 5,5 и ниже 16,17 (рисунок 1). Последний шаг был еще более усиливается наличием высокой концентрации К + в глицериновый слой, отражающий поздний эндоцитических среду 16. Таким образом, как вирус и ядро осаждали через градиент они испытали изменяющуюся среду, которая имитирует условия в эндосомы. Результатом стала поэтапная разборка вирусного ядра в пробирке, дополняя результаты , полученные из клеточной биологии анализов.
т "> Метод , представленный здесь , позволило быстро и легко воспроизводимым анализ IAV (X31 и A / WSN / 33) и IBV (B / Lee / 40) раздевания вызвано кислом рН и увеличение K +16,17, а также разборки из парамиксовирусной сердечников при воздействии 17 щелочном рН. можно предположить , что этот подход может быть адаптирован к другим оболочечных вирусов , чтобы получить представление о биохимических свойств вирусного капсида и структуры капсида разборки во время ввода данных в ячейку.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка буферами и маточные растворы
- Подготовка MNT буфера (20 мМ MES, 30 мМ Трис и 100 мМ NaCl) при растворении 470 мг трис - гидрохлорида, 390 мг MES гидрата и 580 мг NaCl в 80 мл DDH 2 O. Настройка буфера до рН 7,4 , и довести его до конечного объема 100 мл с DDH 2 O.
- Подготовьте три идентичных решения 500 мМ MES - буфера путем растворения 9,76 г MES гидрат в 80 мл дН 2 O каждый. Отрегулировать буферы до рН 5,8, 5,4 и 5,0, соответственно, титрованием с помощью концентрированной NaOH. Доведите каждый буфер до конечного объема 100 мл с дН 2 O.
- Приготовьте два идентичных растворов 500 мМ трис - буфера путем растворения 7,88 г трис - гидрохлорида в 80 мл дН 2 O каждый и регулировать рН до 7,4 и 6,4, соответственно, титрованием с помощью концентрированной HCl. Доведите буфера до конечного объема 100 мл с дН 2 O.
- Приготовьте 50% -ный раствор глицерина в дН 2 O и размешать хорошо до GlycЭрол гомогенно смешивают. Фильтр раствора через Steritop блок фильтра (размер пор 0,22 мкм) в стеклянной бутылке.
- Приготовьте 10% раствор NP-40 и 1 М NaCl в дН 2 O.
- Приготовьте 25x ингибитор протеазы концентрированную путем растворения двух таблеток в 4 мл DDH 2 O.
2. Приготовление глицерине Градиенты
- Подготовка 5 мл детергента мастер-буферной смеси (300 мМ NaCl, 2% NP-40, 2x концентрированный ингибитор протеазы) раствор для каждого условия рН для теста (рН 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 и 5,0). Для этого смешайте 9 мл 1 М NaCl, 6 мл 10% NP-40, 2,4 мл на 25x ингибитор протеазы запаса и 9 DDH мл 2 0.
- Для каждого значения рН состояния пипеткой 4,4 мл мастер-смеси в 50 мл коническую пробирку.
- Для получения значений рН выше 5,8 добавляют 0,6 мл соответствующего отрегулированным значением рН 500 мМ Трис-маточного раствора в пробирку. Для рН 5,8 и ниже, добавляют 0,6 мл соответствующего отрегулированным рН раствора 500 мМ MES.
- Сделайте 5мл буферного раствора , содержащего 300 мМ NaCl, ингибитор протеазы , 2x, 60 мМ Трис рН доводили до 7,4 и DDH 2 O. Это будет служить в качестве моющего средства, свободной от буфера управления градиентом.
- При необходимости точной регулировки рН растворов до рН 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 и 5,0 добавлением концентрированной HCI или NaOH растворы, соответственно.
- Добавьте 5 мл 50% -ного раствора в глицерине до 5 мл моющего средства, содержащего и моющих свободных смесей буферных результате в шести различных 25% -ного раствора глицерина. Проверьте значения рН с помощью индикатора рН полоски.
Примечание: В случае измеренный рН существенно отличается от требуемого значения, соответствующие решения должны быть готовы снова. - Готовят 15% раствора глицерина путем смешивания 50% глицерине с дН 2 O в соотношении 3: 7.
3. ультрацентрифугирования IAV
- Добавьте 3 мл 15% раствора глицерина в ультра-прозрачных центрифужные пробирки (13,2 мл, 14 мм х 89 мм), с помощью 5 мл шприц и урожденнаяСКД (21 г, длину 9 см). Не оставлять капель на внутренней стенке трубы, как это могло бы нарушить целостность градиента. Повторите это в общей сложности шесть центрифужные пробирки, по одному для каждой из пяти условий рН, чтобы проверить и один для контрольного образца.
- Тщательно помещают 3,4 мл 25% раствора глицерина под слоем глицерина 15% с помощью 5 мл шприца и длинной иглой. Будьте осторожны, чтобы не смешивать эти два слоя. Повторите эту процедуру для всех шести условий для проверки с соответствующими отрегулированным рН растворов глицерина.
Примечание: Работа в кабинете биологической безопасности класс II для следующих шагов. - Аккуратно наложения глицерина градиенты с 30 мкл осветленных аллантоисной жидкости, содержащей Iav (X31, H3N2), разведенного в 1 мл буфера (МНТ соответствует около 20-30 мкг общего вирусного белка) для каждого градиента.
- Баланс противоположных трубок и поместить их в ультрацентрифугирования ротор SW41. Центрифуга в течение 150 мин, при 55000 х г, и 12 ° C.
- После центрифугирования, тщательноудалить супернатант, то есть оба слоя глицерина с помощью чистой пипетки Пастера и аспиратора. Ресуспендируют осадок в 40 мкл (1x) невосстанавливающих буфера для образцов LDS. Важно пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы полностью растворить осадок. Передача образца в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
4. SDS-PAGE пеллетных дробей и окрашиванием Кумасси
- Нагреть все образцы при температуре 95 ° С в течение 10 мин. На этом этапе образцы могут храниться при температуре от -20 ° С до тех пор, пока они анализируют с помощью SDS-PAGE.
- Нагрузка 20 мкл растворенных гранул на предварительно отлитого градиентом (4-12%), мини-гель Bis-Tris и работать в течение 1 ч при 200 В в 1х MOPS SDS проточном буфере.
- Сделать фиксации раствора с 40% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты в DDH 2 O.
- Инкубировать гель в фиксирующей растворе в течение 1 часа и окрашивают в течение ночи в 15 см для культивирования клеток в чашке с достаточным объемом коллоидного раствора Кумасси, осторожновстряхивании при комнатной температуре.
Примечание: Важно, чтобы закрыть тарелку, чтобы избежать испарения окрашивающего раствора. - Destain геля в DDH 2 O. Заменить DDH 2 O каждые 15-20 мин , пока фоновый гель не станет ясно. Хранить гель в DDH 2 O при температуре 4 ° С до тех пор, пока не будет проверяться на наличие полосы квантификации.
- Сканирование геля при высоком разрешении и использовать имеющиеся в продаже или на заказ программное обеспечение для количественного определения интенсивности полосы белка. Вычтите фоновый сигнал из области, близкой к соответствующим диапазонам и нормализовать эти значения для моющих средств, свободных от контрольных образцов (при рН 7,4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как уже говорилось, грунт в эндосомами требуется, чтобы сделать ядро Iav раздевания компетентным. Известно, что протонирование ядра ослабляет взаимодействие М1 и vRNPs (в составе вирусной РНК, NP, и полимераза PB1 / PB2 / ПА). Этот процесс начинается, когда входящий вирус подвергается рН 6,5 (или ниже) в ранних эндосом (ЭЭС) и продолжается до вируса перегорает при рН около 5,0 в Лез.
Для того, чтобы имитировать снижение рН, нижний слой глицерина градиентов доводили до значений рН от 7,4 до 5,0 при постоянной концентрации соли. Х31 полученный из осветленного аллантоисной жидкости подвергали градиента скорости центрифугирования и анализировали с помощью SDS-PAGE (рис 2А, В). Без моющего средства , присутствующего в градиенте (рис 2А, lane1) интактные вирионы осаждали, как это отражено характерным рисункомгруппы, представляющие HA (HA1 и HA2; 63 кДа), NP (56 кДа) и M1 (27 кДа) в кумасси гель. Так как гель проводили в невосстанавливающих условиях, протеолитически расщеплен НА1 и НА2 все еще связаны дисульфидными связями и работать при температуре приблизительно 64 кДа. В восстановительных условиях полосы , соответствующие ГА1 и ГА2 представляется очень близко к полосам NP и M1, соответственно, что затрудняет точно интерпретировать и определения интенсивности полос, которые только полученные из вирусного ядра (Фигура 2В).
При добавлении NP-40 в нижней части (25%) , глицерин слой оболочки вируса , включая HA, NA и М2 солюбилизировали и одна вирусная ядро осаждаются в гранулах во время ультрацентрифугирования (рис 1, рисунок 2, полоса 2). Начиная с рН ниже 6,5, М1 постепенно теряется из гранул фракции, достигая минимума между рН 5,8 и 5,4 (рис2А, В). При рН ниже 5,8 vRNPs диссоциируют и, таким образом, потеряли из гранул. Ранее было показано , что, по сути, весь vRNPs высвобождаются в верхний слой, так как их высвобождение коррелирует с потерей PB2 из гранул фракции 16. Интенсивность полосы белка были определены, показывая два различных пороговых значений рН для разборки слоя M1 и диссоциации vRNP пучков, соответственно (рисунок 2). Дополнительные полосы можно было наблюдать на гель, который может соответствовать Полимеразная белки PB1 (87 кДа), PB2 (86 кДа), PA (83 кД), и М2 (11 кДа). Из-за их более низкой числа копий внутри Iav вирионов мы не смогли достоверно определить свою идентичность, и они, следовательно, не будут приняты во внимание при количественной оценке.
Рисунок 1: Схематическое изображение IAV 
Рисунок 2: ИФО ядро разборки в пробирке при подкислении (А) В пробирке разборку ядер x31 при различных значениях рН в нижнем слое глицерина.. В качестве контроля, NP-40 была пропущена из нижнего слоя глицерина (первая дорожка). Образцы разделяли с помощью SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях с последующим окрашиванием кумасси. Вирусные белковые полосы обозначены справа. (Б) Денситометрический Количественное интенсивностей вирусных белковых полос , показанных в (А). Белковые интенсивности полос для M1 и NP были нормализованы к тем, при рН 7,4 без NP-40. Данные представлены в виде средств двукратному эксперименту ± стандартное отклонение (SD). Взято из Стауффер и др., 2014 16.ge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вирусные капсиды являются метастабильными макромолекулярных комплексов. В то время как сборка вирионов требует капсидирования и конденсацию генома вируса, начало следующего раунда инфекции зависит от разборки этой компактной конструкции капсида. Вирусы развились , чтобы использовать различные клеточные механизмы для контроля покрытия-раздевание цикла, в том числе клеточных рецепторов, наставниками, протеолитические ферменты, физические силы , предоставляемые моторными белками или геликаз, а также рН и ионной переключатели 26,27. Здесь мы описываем подход в пробирке , основанный на глицерол центрифугирования в градиенте , чтобы специально исследовать влияние факторов , способствующих разборку ядра IAV. Этот метод может быть потенциально адаптирован для рассечения раздевающей процессы других оболочечных вирусов.
При использовании коллоидного кумасси, основные структурные белки IAV М1, НП, и ГК могут быть четко обнаружены в SDS-PAGE, даже при относительно небольшом вируса участнле номер. Тем не менее, более углубленные характеристика осажденного структуры капсида и ее состав потребует последующих мер анализов, таких как электронная микроскопия (как ранее представленной 28), вестерн - блоттинга, динамическое рассеяние света или масс - спектрометрии. Дальнейшее расширение протокола может включать в себя фракционирование нижнего (25%) фазы глицерина и анализа специфических ключевых компонентов.
Регулировка нижнего слоя глицерина к оптимальному слитого рН 5,0 (для X31) привело к почти полной диссоциации матричного слоя (рисунок 2) 16. Тем не менее, около 30% от входного сигнала NP-прежнему может быть обнаружен при этом значении рН. Вполне возможно , что из - за отсутствия клеточных раздевания факторов в этой конфигурации, такие как недавно идентифицированного гистондезацетилазы 6 (HDAC6) 18, происходит неполное разборки. Внутри клетки медленно подкисление вирусного ядра и воздействием перехода от Na + на K + 16. Мы не исключаем, что в нашей установке, неионный детергент частично разрушает кислотно-открытую и дестабилизацию сердцевину. Тем не менее, не влияет на ядро осаждающихся при нейтральном значении рН не наблюдается , указанные аналогичные интенсивности полосы белка по сравнению с не-солюбилизированных образцов (фиг.2А, сравните дорожки 1 и 2). Несмотря на то, анализ, представленный здесь оказались весьма воспроизводимым и (как таковой) достаточно прочным для диапазона количественной оценки, можно было наблюдать некоторый диапазон изменения.
Использование глицерина в данном протоколе имеет решающее значение для исхода эксперимента. Как ранее сообщалось , 17, ультрацентрифугирования через градиент сахарозы дестабилизирует ядро Iav, которая, вероятно , из - за высокой осмотической силы , созданной сахарозой. Очистка IAV с помощью градиентов сахарозы может оказывать подобные эффекты. Поэтому мы сравнили яйца выращенных X31 получен из сл arified аллантоисной жидкости и сахароза-очищенные запасы. Ни одна из основных различий можно было наблюдать в отношении влияния кислого рН на стабильность ядра (данные не показаны). Тем не менее, для того , чтобы исключить возможные побочные эффекты осмотически активного сахарозы, мы рекомендуем провести в пробирке раздевания анализа с осветленных аллантоисной жидкости или концентрированных супернатантов клеточных культур.
К тому же при выборе градиентного материала, важно, чтобы сохранить целостность градиента, чтобы не влиять на поведение седиментации лизированных вирусных ядер и обеспечения воспроизводимости результатов. Кроме того, неполное ресуспендирования гранул фракции после ультрацентрифугирования, вероятно, приводит к различным результатам. Наконец, мы настоятельно рекомендуем регулирование рН моющих растворов, содержащих буфер в идеале в тот же день эксперимента, как небольшие изменения в ионной концентрации могут иметь сильное воздействие на вирусную стабильности ядра.
Содержание "> Важно отметить, что в зависимости от конкретного штамма IAV, различную эффективность разборки может привести к возникновению на основании свойств соответствующего M1 и варианты НП. Это также может применяться для мутантных вирусов. Таким образом, пороговые значения рН для матричного слоя и vRNP диссоциации должны быть определены для соответствующего штамма IAV перед проведением анализа дополнительного влияния. для анализа специфических условий на вирусную стабильности ядра мы рекомендуем корректировать нижний глицерол слой до величины рН таким образом, чтобы полумаксимальную разборку М1 достигается. возможно, для исследования влияния конкретных ионов или восстановителей путем модификации моющего средства, содержащего слой соответственно. Предположительные клеточные раздевающей факторы могут быть добавлены непосредственно в градиенте глицерина. в случае цитоплазматических факторов, третий глицерол слой в нижней части градиента может быть введен, который доводили до нейтрального рН, содержит клеточный фактор интереса, и свободна от моющего средства. Таким образом, йе градиент трехслойный бы еще более точно имитировать прохождение вируса через систему эндоцитоза и высвобождения сегментов генов в нейтральной цитоплазме.Взятые вместе, мы представляем надежный , но простой анализ в пробирке для изучения Iav грунтование и декапсидацию, который имеет потенциал для универсальных модификаций для решения различных вопросов в контексте вступления IAV. Кроме того, он может быть применен для исследования въездные процессы других оболочечных вирусов с соответствующими раздевающей механизмами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Yohei Ямаути и Роберта Манчини за предоставление нам реагентов. Лаборатория AH была поддержана Первоначальными Networks обучения Мари Кюри (ITN), Европейский совет по научным исследованиям (ERC) и Швейцарского Национального научного фонда (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A.
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A.
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
