Introduction
Le virus grippal A (IAV) est un virus enveloppé et appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Ses gènes sont codés sur une, de sens négatif, segmenté et de génome à ARN simple brin. Chez l' homme, l' IAV provoque des infections respiratoires, qui se produisent dans les flambées épidémiques saisonnières et porte le potentiel de pandémies mondiales 1. Lors de la liaison à des résidus d'acide sialique sur la surface de la cellule hôte 2, IAV est internalisée par endocytose dépendante de la clathrine et indépendante de la clathrine voies 3-8. Le milieu acide (pH <5,5) dans les vacuoles d' endocytose déclenche un changement conformationnel dans la majeure IAV pic glycoprotéine hémagglutinine (HA), qui se traduit par la fusion du virus et la fin de la membrane endosomique 9. Une fois que la capside IAV (ici aussi appelé "core" virale) a échappé de endosomes tardifs (les), il est non couché dans le cytosol suivi par le transport des ribonucléoprotéines virales (vRNPs) dans le noyau - le site ola réplication virale et la transcription f 13/10. Avant l'activation de l' acide de HA du virus subit une diminution progressive du pH dans le système d'endocytose, ce qui amorce le noyau pour son démontage ultérieur 14-16. Dans ce "amorçage" étape les canaux ioniques M2 dans la membrane virale médier l'afflux de protons et K +10,14,16. La variation de la concentration ionique à l'intérieur du virus perturbe les interactions accumulent par la protéine virale de la matrice M1 et les huit vRNP faisceau, et facilite IAV déshabillage dans le cytoplasme suivant la fusion membranaire 10,14-17.
analyse directe et quantitative de l'étape d'amorçage a été entravée par le fait que les endosomes sont difficiles d'accès expérimentalement. Le processus d'entrée est, par ailleurs, fortement non-synchrone. En outre, point final des essais, tels que qRT-PCR d'ARN ou d'infectivité virales mesures publiées, ne fournissent pas une image détaillée de l'état biochimique de la capsi viraled à une étape donnée d'entrée. Alors que la perturbation des endosomes par siRNA ou un traitement médicamenteux a contribué de manière significative à la compréhension de l' IAV entrée 18-20, réglage fin est difficile et sujette à des effets secondaires non spécifiques dans le programme endosome de maturation étroitement contrôlé.
Pour éviter ces problèmes, nous avons adapté le protocole précédemment développé in vitro basée sur l'utilisation de la vitesse de centrifugation en gradient de 17. Contrairement à d' autres tentatives 21,22, 23,24, qui sont principalement basés sur des combinaisons de clivage protéolytique et un traitement détergent , suivi d' une analyse EM, cette approche a permis un résultat facilement quantifiables. Centrifugation à travers les différentes couches de gradient permet aux particules sédimentent à être exposée et réagissent avec les conditions changeantes de façon contrôlée. Dans le protocole présenté, IAV dérivé de liquide allantoïdien clarifié ou de particules virales purifiées sont sédimentées dans un glycérol à deux couchesgradient dans lequel la couche inférieure contient le détergent non ionique NP-40 (figure 1). Comme le virus pénètre dans la deuxième couche, contenant un détergent, l'enveloppe lipidique et glycoprotéines d'enveloppe virale sont doucement solubilisés et laissé derrière. Le noyau, composée de huit vRNP faisceau et entourés par une couche de matrice, des sédiments comme une structure stable dans la fraction de culot. protéines de nucléocapside virale, telles que M1 et nucléoprotéine vRNP associée (NP), peuvent être identifiés dans le culot par SDS-PAGE et une coloration de Coomassie. En particulier, en profitant de disponibles dans le commerce des gels de gradient et la coloration avec le colloïdale très sensible Coomassie 25, permet une grande précision et la détection de petites quantités de protéines de base associées virales.
Ceci définit la base pour tester si des conditions différentes telles que le pH, la concentration en sel, et les facteurs déshabillage putatifs ont des effets sur le comportement de sédimentation des composants de base et le noyau stabil lité. A cet effet, seule la couche inférieure contenant un détergent dans le gradient de glycérol est modifiée par l'introduction d'un facteur ou d'une condition d'intérêt. La technique a été particulièrement utile pour étudier l'effet des différentes valeurs de pH et des concentrations de sel sur l'intégrité du noyau IAV 16. IAV étapes intermédiaires de déshabillage pourraient être surveillées , y compris la dissociation de la couche de matrice à un pH légèrement acide (<6,5) , suivie par une dissociation vRNP à pH 5,5 et inférieure 16,17 (figure 1). Cette dernière étape a été encore amélioré par la présence d' une forte concentration de K + dans la couche de glycérol, ce qui reflète un milieu endocytic retard 16. Ainsi, comme le virus et le noyau sédimentés à travers le gradient ils ont connu un milieu changeant qui imite les conditions dans les endosomes. Le résultat était un démontage par étapes du noyau viral in vitro, en complément des résultats provenant de tests de biologie cellulaire.
t "> La méthode présentée ici a permis rapide et une analyse hautement reproductible des IAV (X31 et A / WSN / 33) et IBV (B / Lee / 40) déshabillage déclenchée par un pH acide et l' augmentation de K +16,17 ainsi que le démontage des noyaux paramyxovirus sur un pH alcalin exposition 17. Il est concevable que l'approche peut être adaptée à d' autres virus enveloppés pour mieux comprendre les propriétés biochimiques de la structure de la capside virale et capside démontage lors de l' entrée de la cellule.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de Tampons et Solutions mères
- Préparer tampon TMN (MES 20 mM, Tris 30 mM et NaCl 100 mM) en dissolvant 470 mg Tris Hydrochloride, 390 mg MES hydrate et 580 mg de NaCl dans 80 ml ddH 2 O. Régler le tampon à pH 7,4 et l' amener à un volume final de 100 ml avec ddH 2 O.
- Préparer trois solutions identiques de tampon 500 mM MES en dissolvant 9,76 g MES hydrate dans 80 ml dH 2 O chacun. Ajuster les tampons à pH 5,8, 5,4 et 5,0 respectivement par titrage avec du NaOH concentré. Amener chaque tampon jusqu'à un volume final de 100 ml avec dH 2 O.
- Préparer deux solutions identiques de tampon 500 mM Tris en dissolvant 7,88 g de chlorhydrate de Tris dans 80 ml de dH2Û chacun et ajuster le pH à 7,4 et 6,4 respectivement par titrage avec du HCl concentré. Amener le tampon jusqu'à un volume final de 100 ml avec dH 2 O.
- Préparer la solution de glycérol à 50% dans dH 2 O et bien mélanger jusqu'à ce que le glycerol est mélangé de façon homogène. Filtrer la solution à travers une unité de filtration Steritop (0,22 um de taille des pores) dans une bouteille en verre.
- Préparer 10% de NP-40 et une solution 1 M de NaCl dans dH 2 O.
- Préparer 25x inhibiteur de la protéase concentrée en dissolvant deux comprimés dans 4 ml ddH 2 O.
2. Préparation de Glycérine Dégradés
- Préparer 5 ml de détergent maître tampon mélange (300 mM de NaCl, 2% de NP-40, 2x concentré inhibiteur de protéase) solution pour chaque condition de pH à l'essai (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 et 5,0). A cet effet, mélanger 9 ml de 1 M de NaCl, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml de l'inhibiteur de la protéase 25x actions, et 9 ml ddH 2 0.
- Pour chaque condition de pH pipette 4,4 ml de mélange maître dans un tube conique de 50 ml.
- Pour les valeurs de pH supérieures à 5,8 ajouter 0,6 ml de 500 mM de Tris solution mère à pH ajusté respectif au tube. Pour un pH de 5,8 et inférieure ajouter 0,6 ml de la mM MES 500 solution mère à pH ajusté respectif.
- Faire 5ml d' une solution tampon contenant du NaCl 300 mM, inhibiteur de protéase 2x, de Tris 60 mM ajusté à pH 7,4 et ddH 2 O. Cela servira de tampon de gradient de commande sans détergent.
- Si nécessaire, bien ajuster le pH des solutions à pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, et 5,0 en ajoutant des solutions de HCl ou de NaOH concentré, respectivement.
- Ajouter 5 ml de glycerol à 50% à 5 ml des mélanges tampons détergents contenant et sans détergent résultant en six solutions de glycérol 25% différents. Vérifier les valeurs de pH à l'aide de l'indicateur de pH bandes.
NOTE: Dans le cas où le pH mesuré diffère sensiblement de la valeur souhaitée, les solutions respectives doivent être préparées à nouveau. - Préparer la solution de glycérol à 15% en mélangeant 50% du stock de glycérol avec dH 2 O dans un rapport de 3: 7.
3. ultracentrifugation de IAV
- Ajouter 3 ml de solution de glycerol à 15% dans des tubes de centrifugation ultra claires (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) en utilisant une seringue de 5 ml et une needle (21 G, 9 cm de long). Ne pas laisser des gouttes sur la paroi intérieure du tube, car cela pourrait perturber l'intégrité du gradient. Répéter cette opération pour un total de six tubes de centrifugation, une pour chacune des cinq conditions de pH pour tester et un pour l'échantillon témoin.
- Placez délicatement la solution de glycérol 3,4 ml de 25% sous la couche de glycérol de 15% en utilisant une seringue de 5 ml et une longue aiguille. Prenez soin de ne pas mélanger les deux couches. Répétez cette opération pour les six conditions pour tester les solutions de glycérol à pH ajusté respectifs.
NOTE: Le travail en classe II biosécurité cabinet pour les étapes suivantes. - superposer délicatement les gradients de glycérol avec 30 ul clarifié liquide allantoïdien contenant IAV (X31, H3N2) dilué dans 1 ml de tampon TMN (correspond à environ 20-30 ug de protéine virale totale) pour chaque gradient.
- Solde opposés tubes et les placer dans un ultracentrifugation rotor SW41. Centrifugeuse pour 150 min, à 55.000 xg, et 12 ° C.
- Après la centrifugation, soigneusementéliminer le surnageant, à savoir, les deux couches de glycérol en utilisant une pipette propre Pasteur et un aspirateur. Remettre en suspension le culot dans 40 ul (1x) non réductrices tampon d'échantillon LDS. Il est important de pipeter monter et descendre plusieurs fois pour dissoudre le culot complètement. Transférer l'échantillon dans un tube de 1,5 ml.
4. SDS-PAGE des granules Fractions et Coomassie
- Chauffer tous les échantillons à 95 ° C pendant 10 min. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à ce qu'elles soient analysées par SDS-PAGE.
- 20 ul de charge des granulés dissous sur un gradient de pré-coulée (12.04%) du gel de mini-Bis-Tris et exécutés pendant 1 heure à 200 V dans 1 x MOPS SDS tampon en cours d'exécution.
- Faire une solution de fixation avec 40% de méthanol et de l' acide acétique à 10% glaciaire ddH 2 O.
- Incuber le gel dans une solution de fixation pendant 1 heure et tacher la nuit dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm avec un volume suffisant de solution de Coomassie colloïdal tout en douceuragitation à température ambiante.
NOTE: Il est important de fermer le plat afin d'éviter l'évaporation de la solution de coloration. - Destain le gel dans ddH 2 O. Remplacez le ddH 2 O toutes les 15-20 minutes jusqu'à ce que le fond de gel devient clair. Conserver le gel dans ddH 2 O à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit analysé pour la bande de quantification.
- Scannez le gel à haute résolution et utiliser des logiciels disponibles ou sur mesure dans le commerce pour la quantification des intensités des bandes de protéines. Soustraire le signal d'arrière-plan dans une région proche des bandes respectives et à normaliser ces valeurs pour les échantillons témoins sans détergent (à pH 7,4).
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Representative Results
Comme déjà discuté, l'amorçage dans les endosomes est nécessaire pour rendre le noyau IAV décapsidation compétente. Protonation du noyau affaiblit l'interaction de M1 et vRNPs (composé de l'ARN viral, NP, et la polymérase PB1 complexe / PB2 / PA). Ce processus est lancé lorsque le virus entrant est exposé à un pH de 6,5 (ou inférieur) au début des endosomes (SEE) et continue jusqu'à ce que les fusibles de virus à un pH d'environ 5,0 à LEs.
Afin d'imiter la diminution du pH, de la couche inférieure des gradients de glycerol ont été ajustés à des valeurs comprises entre pH 7,4 et 5,0, à une concentration en sel constante. X31 dérivé du liquide allantoïdien clarifié a été soumis à un gradient de vitesse centrifugation et analysé par SDS-PAGE (figure 2A, B). Sans détergent présent dans le gradient (figure 2A, piste 1) virions intacts sont culottées, comme en témoigne le motif caractéristique debandes représentant HA (HA1 et HA2, 63 kDa), NP (56 kDa) et M1 (27 kDa) dans le gel coloré au Coomassie. Etant donné que le gel a été exécuté dans des conditions non réductrices, HA1 et HA2 clivée par protéolyse sont encore reliés par des liaisons disulfure et tournent à environ 64 kDa. Dans des conditions réductrices les bandes correspondant à HA1 et HA2 semblent très proches des bandes NP et M1, respectivement, ce qui rend difficile d'interpréter fidèlement et de déterminer l' intensité de la bande qui sont uniquement dérivées du noyau viral (figure 2B).
Après addition de NP-40 au fond (25%) de glycérol superposer l'enveloppe virale , y compris HA, NA et M2 ont été solubilisées et le noyau viral seul sédimenté dans la pastille pendant l' ultracentrifugation (figure 1; la Figure 2, piste 2). En partant d'un pH inférieur à 6,5, M1 est progressivement perdue à partir de la fraction de culot, pour atteindre un minimum entre pH 5,8 et 5,4 (Figure2A, B). Ci-dessous, pH 5,8 vRNPs ont été dissociées et donc perdu du culot. Auparavant, il a été montré que, en fait, vRNPs entiers sont libérés dans la couche supérieure, comme leur libération en corrélation avec la perte de PB2 de la fraction de culot 16. L' intensité des bandes de protéines ont été déterminées, révélant deux seuils distincts de pH pour le démontage de la couche M1 et la dissociation des faisceaux vRNP, respectivement (figure 2). Des bandes supplémentaires ont pu être observées sur le gel, ce qui pourrait correspondre à l'protéines polymerases PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa) et M2 (11 kDa). En raison de leur nombre de copies inférieur à l'intérieur virions IAV nous ne pouvions pas déterminer de manière fiable leur identité et ils étaient par conséquent pas pris en considération pour la quantification.
Figure 1: Représentation schématique de l'IAV 
Figure 2: IAV noyau désassemblage in vitro lors de l' acidification (A) Dans le démontage in vitro des noyaux X31 à différentes conditions de pH dans la couche de glycérol inférieure.. En tant que témoin, le NP-40 a été omis dans la couche de glycérol inférieure (première voie). Les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE dans des conditions non réductrices, suivie par coloration de Coomassie. des bandes de protéines virales sont indiquées sur la droite. (B) densitométrique quantification des intensités des bandes de protéines virales montrés dans (A). Protein intensités de bande pour M1 et NP ont été normalisées à ceux à pH 7,4, sans NP-40. Les données sont représentées comme moyen d'expériences en double ± écart-type (SD). Adapté de Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
capsides virales sont des complexes macromoléculaires métastables. Alors que l'assemblage de virions nécessite l'encapsidation et la condensation du génome du virus, l'initiation du prochain cycle de l'infection dépend de démontage de cette structure de capside compact. Les virus ont évolué pour exploiter divers mécanismes cellulaires pour contrôler le cycle de revêtement décapsidation, y compris des récepteurs cellulaires, des chaperons, des enzymes protéolytiques, des forces physiques fournies par les protéines motrices ou les hélicases, ainsi que le pH et les commutateurs ioniques 26,27. Ici, nous décrivons une approche in vitro basée sur une centrifugation de gradient de glycérol pour tester spécifiquement l'effet de facteurs favorisant le démontage du noyau IAV. La technique peut potentiellement être adaptée pour disséquer des processus décapsidation d'autres virus enveloppés.
En utilisant Coomassie colloïdal, les principales protéines IAV structurelles M1, NP, et HA peut être clairement détecté dans SDS-PAGE, même avec une relativement petite partic de virusNuméro le. Pourtant, une caractérisation plus en profondeur de la structure de la capside sédimenté et sa composition nécessiterait un suivi des analyses, telles que la microscopie électronique (comme présenté précédemment 28), Western blot, la diffusion dynamique de la lumière ou la spectrométrie de masse. Une nouvelle extension du protocole pourrait inclure le fractionnement du (25%) phase inférieure de glycérol et de l'analyse des composants spécifiques de base.
L' ajustement de la couche de glycérine inférieure à la fusion optimale de pH 5,0 (pour X31) a conduit à une dissociation presque complète de la couche de matrice (figure 2) 16. Cependant, environ 30% du signal d'entrée NP peut encore être détecté à ce pH. Il est possible qu'en raison de l'absence de facteurs décapsidation cellulaires dans cette configuration, comme récemment identifié histone déacétylase 6 (HDAC6) 18, le démontage incomplet se produit. À l' intérieur de la cellule, lente acidification de la nucléocapside virale et de l' exposition à un commutateur de Na + K + 16. Nous ne pouvons pas exclure que dans notre configuration, le détergent non-ionique perturbe partiellement le noyau acide exposée et déstabilisé. Cependant, aucun effet sur le noyau sédimentant à pH neutre est observée indiquée par l' intensité des bandes de protéines similaires par rapport à des échantillons non solubilisé (figure 2A, comparer les pistes 1 et 2). Bien que, l'analyse présentée ici avéré être hautement reproductible et (en tant que telle est) assez robuste pour la bande de quantification, une certaine plage de variation peut être observée.
L'utilisation du glycérol dans ce protocole est critique pour le résultat de l'expérience. Comme indiqué précédemment 17, ultracentrifugation à travers un gradient de saccharose déstabilise le noyau IAV, qui est probablement due à une force osmotique élevée créée par le saccharose. Purification de IAV via des gradients de saccharose peut avoir des effets similaires. Par conséquent, nous avons comparé l'oeuf cultivé X31 dérivé de cl liquide allantoïdien arified et les stocks de saccharose purifié. Aucune différence importante n'a pu être observée en ce qui concerne l'influence du pH acide sur la stabilité de base (données non présentées). Néanmoins, afin d'exclure les effets secondaires potentiels du saccharose osmotiquement actif, nous vous recommandons d' effectuer le test in vitro avec décapsidation clarifié allantoïque surnageants de culture de cellules fluides ou concentrées.
Outre le choix du matériau dégradé, il est important de maintenir l'intégrité du gradient de ne pas influer sur le comportement de sédimentation des cores viraux lysées et d'assurer des résultats reproductibles. De plus, la remise en suspension incomplète de la fraction de culot après ultracentrifugation conduit probablement à des résultats différents. Enfin, nous vous recommandons fortement d'ajuster le pH des solutions tampons les contenant du détergent, idéalement le jour même de l'expérience que de petits changements dans la concentration ionique peut avoir un effet drastique sur la stabilité de base virale.
content "> Il est important de noter que selon la souche IAV particulier, différents rendements de démontage peut se produire en fonction des propriétés de la M1 respective et variantes NP. Cela pourrait aussi demander des virus mutants. Ainsi, les seuils de pH pour la couche de matrice et vRNP dissociation doivent être déterminées pour la souche IAV respective avant de tester les influences supplémentaires. pour l'analyse des conditions spécifiques sur la stabilité de base virale, nous vous proposons le réglage de la couche de glycérol inférieure à une valeur de pH de telle sorte que le démontage demi-maximale de M1 est atteint. Il est possible pour étudier l'influence des ions spécifiques ou des agents réducteurs en modifiant la couche contenant un détergent en conséquence. facteurs décapsidation cellulaires putatives peuvent être ajoutés directement au gradient de glycérol. Dans le cas de facteurs cytoplasmiques, une troisième couche de glycérol au bas de la pente peut être introduit, qui est ajusté à un pH neutre, contient le facteur cellulaire présentant un intérêt, et est exempt de détergent. de cette façon, ee tricouche gradient imiterait encore davantage le passage du virus dans le système d'endocytose et la libération des segments de gène dans le cytoplasme neutre.Pris ensemble, nous présentons un test robuste et simple in vitro pour étudier IAV amorçage et déshabillage, qui a le potentiel de modifications polyvalents afin de répondre à diverses questions dans le contexte de l' IAV entrée. En outre, elle peut être utilisée pour étudier les processus d'entrée d'autres virus enveloppés, avec des mécanismes associés déshabillage.
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Acknowledgments
Nous remercions Yohei Yamauchi et Roberta Mancini pour nous fournir des réactifs. Le laboratoire AH a été soutenue par les réseaux de formation initiale Marie Curie (ITN), le Conseil européen de la recherche (CER), et par le Fonds national suisse (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
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