Summary
Два алгоритма анализа изображений, «дрозофила НМС морфометрия» и «дрозофила НМС Бутон морфометрия» были созданы, чтобы автоматически количественно девять морфологических особенностей нервно - мышечное соединение Drosophila (НМС).
Abstract
Синаптическая морфология плотно связана с синаптической эффективностью, и во многих случаях морфологических дефекты синапса в конечном счете, приводят к синаптической неисправности. Дрозофилы личиночное нервно - мышечное соединение (НМС), хорошо известная модель для глутаматэргических синапсов, было широко изучено в течение десятилетий. Выявление мутаций, вызывающих НМС морфологических дефектов показало репертуар генов, которые регулируют развитие синапсов и функцию. Многие из них были выявлены в крупномасштабных исследованиях, ориентированных на качественные подходы для выявления морфологических аномалий дрозофилы НМС. Недостаток качественного анализа является то, что многие тонкие игроки, способствующие НМС морфологии, вероятно, останется незамеченным. В то время как количественные анализы необходимы для выявления более тонких морфологических различий, такие анализы не часто выполняются, потому что они являются трудоемкими. Этот протокол описывает подробно два алгоритмов анализа изображений "дрозофила морфометрия»и„дрозофила НМС Бутон морфометрия“, доступная как Фиджи-совместимые макросы, для количественного, точного и объективного анализа морфометрического из Drosophila НМСА. Эта методика разработана для анализа NMJ терминалов immunolabeled с обычно используемыми маркерами Dlg-1 и . Brp Кроме того, его широкое применение для других маркеров, таких как HRP, СНТ и сыть представлен в этом протоколе макросы могут оценить девять морфологических НМС особенностей:. NMJ площадь, НМС по периметру, количество бутонов, НМС длины, НМС длинная ветвь длина, количество островов, число ветвей, число точек ветвления и числа активных зон в терминале NMJ.
Introduction
Когнитивный расстройства , такие как умственная отсталость, расстройство спектра аутизма и шизофрения часто характеризуется аномальной синаптической функцией 1, 2, 3. Synapse морфология и функция плотно переплетены; морфологические дефекты могут привести к синаптическим неисправностям и, в противоположном направлении, аберрантная синаптическая передача будет влиять на синаптическое созревание и морфологию 4, 5, 6.
Ряд модельных организмов были использованы для того , чтобы лучше понять синапсов биологию и пролил свет на синаптические изменения влияют на функцию мозга в состоянии здоровья и болезни 7, 8, 9. Дрозофилы НМС является экстенсивно изучен и хорошо создан в естественных условиях модели для глутаматергических SYnapse биологии 10, 11. В последние десятилетия эта модель была использована для физиологических и генов-ориентированных исследований, а также для крупномасштабных генетических экранов, с целью выявления морфологических различий между НМС. В частности, передние генетические экраны определили многие важные регулирующие органы и механизмы , лежащие в основе развития синапсов и функции 12, 13, 14, 15, 16. Тем не менее, большинство из этих экранов полагались на визуальной оценке терминала морфологии НМС и качественного определения синаптических аномалий или полуколичественного озвучивания нескольких морфологических признаков. Как следствие, довольно тонкие синаптические морфологические отклонения, которые не являются очевидными для человеческого глаза легко пропустили. Для того, чтобы иметь возможность всесторонне выявить количественные различия,НМС должна быть точно оценены систематическим количественной оценки морфологических параметров, представляющих интерес. Измерительные функции NMJ вручную является трудоемким, особенно при наличии несколько NMJ особенности интереса, и / или при выполнении крупномасштабных генетических скринингов. Для того чтобы поддержать многопараметрический, высокие пропускную способность морфологического анализа и достижение объективной количественной оценки, два макросы «дрозофила НМС морфометрия» и «дрозофила НМС Бутон морфометрия» были разработаны 17. Оба макроса работает в с открытым исходным кодом для анализа изображений программного обеспечения Фиджи 18, и может количественно как конфокальные и неконфокальные изображения.
Меры «дрозофила НМС морфометрии» NMJ терминалы иммуноокрашиванию с постсинаптическим маркерным диском большого-1 (Dlg-1) или пресинаптической пероксидазой хрена (HRP), со-меченный активным зоной маркеров bruchpilot (BRP). Квантифицируется девять морфологического парамяTers (далее описано ниже): НМС площадь, НМС периметра, количество бутонов, НМС длина, НМС длинной длина ветви, число островов, число ветвей, число точек ветвления и числа активных зон в синаптическом терминале (Рисунок 1) , Хотя алгоритм для определения числа бутонов присутствует в этой макрокоманды, она не отвечает критериям точности 17. Для того, чтобы правильно оценить число бутонов, необходимо использовать «дрозофила НМС Бутон морфометрию» макро, который специально предназначен для количественного определения бутонов с использованием NMJ препаратов иммуноокрашиванию анти-Synaptotagmin (сыть) или анти-цистеин строки белком (CSP), и совместно immunolabeled с BRP. Макро «дрозофила НМС Бутон морфометрия» квантифицирует следующие параметры: число бутонов, NMJ площадь BOUTON, NMJ длину, NMJ наибольшей длину ветви, количество островов, число ветвей, число точек ветвления и количество активных ZOуказанные в другом месте (рисунок 2).
Макросы состоят из 3 суб-макросов: (I) , «Преобразование в стек» идентифицирует все доступные файлы изображений и создает Z-hyperstacks и максимальные проекции интенсивности обоих каналов. Как выход, этот макрос будет генерировать два новых файлов в синапсах под названием «stack_image_name» и «flatstack_image_name». II) , «Определение ROI» откроет все максимальные проекции изображения «flatstack_image_name» последовательно и представить их с просьбой , чтобы вручную определить область интереса (ROI) , в котором удельная синаптической терминал интерес присутствует. Это было реализовано , чтобы обеспечить исключение синапсов , соединяющиеся с прилегающими мышцами и / или другими типами синаптических окончаний (например, 1s) , которые могут присутствовать в изображениях 11. (III) «Анализ» применяется полностью автоматизированный анализ для всех областей изображений в пределах границ ROI. В видеВ результате этого шага, пользователь получит два новых файл: «results.txt», где будет аннотированными все численные измерения и «res_image_name.tif», где основная сегментация изображения, полученная с помощью макроса будет проиллюстрирована. Во время анализа изображений три структуры являются производными от каждого синаптического терминала: НМС контура, в NMJ скелета, а также числа BRP-позитивных активных зон. Контур НМСА используется для определения NMJ области и ее периметра и последующее разделение обеспечивает водосбор число бутонов. От скелета, пять NMJ функции выводится: общая NMJ длиной, сумма длины самой длинной непрерывной траектории, соединяющей любые две конечных точек (длинная длина ветви), количество несвязанных отсеков в НМС (упоминаются как «острова» ), количество ветвей, а число точек ветвления (одна точка ветвления соединяет три или более ветвей). Количество активных зон определяются в BRP-канале путем подсчетаBRP-положительные пятна. Аннотированный НМС контур (желтая линия), скелет НМСА (синяя линия), а число BRP-позитивных активных зон (обозначено белыми очаги) отображаются в виде изображения результатов и измерение параметров обрабатывается для апа (. TXT) выходной файл (рисунок 3).
Дрозофилы НМС морфометрия»и„дрозофила НМС Бутон морфометрия“были впервые описаны и широко подтверждены Nijhof и др. 17. Эта рукопись фокусируется на методологии анализ NMJ морфологии с использованием макросов„дрозофила НМС морфометрия“и„дрозофила НМС Бутон морфометрия“. тем не менее, до макро-анализов помощь, НМС и диссекция immunostainings должны быть выполнены. Эти важные шаги, и сочетание маркеров используется для иммуногистохимии должен быть пригоден для макро-анализа. Эти шаги кратко упомянуто в себе1 их этот протокол и направить пользователь на ссылки, описывающих подробно протоколы для выполнения этих процедур.
Protocol
1. Требования До обработки изображений
- Выполнение Drosophila открытой книги препараты третьего возрастной стадии блуждающих личинок (L3), как описано выше 19.
- Со-immunolabel дрозофилы NMJ терминалы , использующие комбинацию двух маркеров: DLG-1 или HRP вместе с BRP для анализа с «Drosophila NMJ морфометрии», и сыть или СНТ вместе с BRP для анализа с «Drosophila NMJ Bouton морфометрии» 20.
Примечание: Антитела из одних и тех же видов , могут быть объединены путем предварительной маркировки с одним комплектом антитело-конъюгации , такие как Зенон Alexa Labeling Kits 17. - Image НМС терминалы с помощью микроскопа выбора, например, флуоресценции (с или без ApoTome) или конфокальной микроскопии.
- Приобретение 2-канальный стек изображений терминала NMJ.
- Настройка параметров микроскопа таким образом, чтобы канал 1приобретает терминал NMJ immunolabeled с Dlg-1 (или HRP, сыть, Csp) и канал 2 терминала NMJ immunolabeled с BRP.
- Необязательно, анализировать одноканальные изображения (синапсов immunolabeled с одним антителом) с макрокоманд. НМС Image immunolabeled однозначно с Dlg-1 или HRP для анализа с «Drosophila NMJ морфометрии», или сыть или СНТ для «Drosophila NMJ Bouton морфометрии».
Примечание: Это не представляется возможным анализировать синапсы иммуноокрашиванию только с анти-BRP.
- Экспорт полученных изображений в виде отдельных».tiff файлов. Обратить порядок каналов до запуска макросов, если не усваиваются, как указано.
- Приобретение 2-канальный стек изображений терминала NMJ.
2. Требования к программному обеспечению и установка
- Скачать макросы: «Drosophila NMJ морфометрии» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрии» со следующего сайта: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- Переместить курсор в папку «Макросы обновление 1», и нажмите на появившуюся опцию «вид». Появится список с содержимым этой папки. Папка содержит макросы «Drosophila NMJ морфометрию» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрию».
Примечание: Оба макроса совместимы с версиями Фиджи 1.4, который также поставляется в той же папке. Макросы не могут работать на последние версии. Пожалуйста, используйте прилагаемую версию 1.4. Это беспроблемное, чтобы начать эту версию, даже на компьютеры с более поздней версией Фиджи доступен.- Нажмите на кнопку «Загрузить все». Содержимое папки будет загружено на компьютер в виде файла .zip. Разархивируйте загруженный файл.
- Скопируйте файлы Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm и Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm в каталог Fiji.app/plugins/. При повторном запуске программы, макросы будут отображаться в нижней части плагиноввыпадающее меню.
- Переместить курсор в папку «Макросы обновление 1», и нажмите на появившуюся опцию «вид». Появится список с содержимым этой папки. Папка содержит макросы «Drosophila NMJ морфометрию» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрию».
3. Выполнить Sub-макро «Преобразовать в стек» Создание Z-проекции и Hyperstacks из НМС изображений
- Запустите графический интерфейс, выбрав плагин в панели инструментов и выберите «Drosophila НМС морфометрию» в раскрывающемся меню.
- Определение параметра «Уникальная строка файла» в графическом интерфейсе макроса.
Примечание: Программное обеспечение микроскоп использует идентификационную подпись для организации самолетов и каналов при хранении штабеля в виде отдельных».tiff файлов. Введенный уникальный параметру строки файла необходимо указать сигнатуру с помощью программного обеспечения для первой плоскости первого канала (важно: низкая плоскость и номер канала должны быть указаны). - Выберите только субмакроблока «Преобразовать в стек» и нажмите «ОК» и выберите папку, в которой изображения расположены. Если основной каталог с несколькими подпапок выбран, все индивидуальные».tiff файлов восновной каталог и вложенная соответствия критериев струнных уникальный файла будут обработаны.
- Если г-стек содержит только один канал, выберите поле «Канал только 1».
- Обратите внимание на то, что два новых файла в НМС изображения, по умолчанию называется как stack_image_name и flatstack_image_name появится. Хранить только эти стеки и flatstack для дальнейшего анализа. Серия .tiff файл может быть удалена в этом пункте, сводя к минимуму необходимых мощностей для хранения и избежать потенциальных источников ошибок.
4. Выполнить Sub-макро «Определить ROI» очертить NMJ Terminal Интереса
- Запустите графический интерфейс «Drosophila НМС морфометрии».
- Выберите только флажок «Определить ROI» и нажмите «OK» и выберите основной каталог, в котором изображения озаглавленных flatstack_name сохраняется и нажмите «Выбрать». Субмакроблока «Определение ROI» автоматический поиск всех подкаталоговв пределах выбранного основного каталога.
- Как открывается первая проекция, выберите «Freehand SELECTIONS» инструмент на панели инструментов. С помощью мыши нарисуйте выделение, что только содержит полный NMJ терминал интереса и нажмите кнопку «OK» в окне «Define терминал». Макрос будет переходить к следующему проекции.
- Очертить следующий ROI и повторять, пока все трансформировании не определены. Файл изображения ROI, названный «roi_image_name», будет сохранен в том же каталоге, ранее сформированный стек и проекционных изображения для каждого из обработанных изображений. Выходной сигнал этого суб-макро двоичный образ ROI в белом на черном фоне.
5. Выполнить Sub-макро «Анализ», чтобы Количественно Особенности NMJ терминалов
- Перейти на панель инструментов, выберите «Плагины» и использование:
"Дрозофила _NMJ_Morphometrics" при анализе синапсы immunolabeled с анти-Dlg-1 или анти-HRP (1 канал) вместес анти-BRP (канал 2), или "Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics" при анализе синапсы immunolabeled с анти-SYT или анти-СНТ (канал 1) вместе с BRP (канал 2).- Когда один стеки канала изображения должны быть проанализированы (структурный канал Dlg-1 или ПХ для «Drosophila_ NMJ_Morphometrics», или сыть или СНТ для «Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics»), выберите поле «Канал только 1».
- Отрегулируйте шкалу, соответствующую к изображениям, которые будут проанализированы. Если один пиксель в изображении соответствует 2,5 мкм, указывают Scale-пикселей = 1, масштаб расстояния в мкм = 2,5. В случае, если оба параметра остаются на 0, площадь НМС, периметр, длина и длина самой длинной ветви будет выражаться в количестве пикселей.
- При необходимости, настроить параметры анализа по умолчанию макроса. Выполните настройку только если субмакроблок «Analyze» (этот раздел с неудовлетворительными результатами, и сетrmined лучшие настройки в разделе 6) была запущена.
- Установите флажки «Анализ» и «Wait» и нажмите «OK».
- Выберите «Wait» флажок при выполнении субмакроблока «Анализ» на 2-канальных изображений. В противном случае ошибка в активной зоне подсчета может произойти из-за ограниченные вычислительные мощности.
- В новом окне «Выбрать каталог» открывает, выберите каталог, в котором изображения расположены и нажмите «выбрать». Макрос будет анализировать все изображения, хранящиеся в главном каталоге и, если это применимо, последующие папки (с использованием трех файлов с выполнением предыдущих вложенных макросов: stack_image_name, flatstack_image_name и roi_image_name). Макрос обрабатывает каждый образ по отдельности и последовательно. Это может занять несколько минут в стек изображений (в зависимости от мощности компьютера).
- После запуска макроса, обратите внимание, что новый файл изображения с именем res_image_name для каждого проанализированного синапса хранится будет CREATed в родительской папке. Количественные измерения будут сохранены в файле «results.txt».
- Проверьте все результирующие изображения для обнаружения и исключения изображений с ошибками сегментации. Возможные ошибки сегментации описаны в таблице 3, а также советы , как настроить параметры , чтобы обойти их. Результат изображение с такими ошибками сегментации приводятся в качестве примеров на рисунке 4.
Примечание: При запуске макроса с настройками по умолчанию , наблюдаемых в пользовательском интерфейсе, была точность около 95% , когда сравнивали с ручной оценкой 17 макро оценки.
6. Отрегулируйте Macro Настройки на Изображения
- Когда более 5% изображения показывают ошибки сегментации, исследовать различные алгоритмы для определения / выбрать наиболее подходящие настройки для макро изображений.
- Регулировка подвижного значение радиуса шарика
Примечание: роликовая радиус шарафункция вычитает фон изображения. Эта функция имеет решающее значение при работе с изображениями, полученных на флуоресцентных микроскопов и / или когда изображения имеют высокий фоновый шум. Вычитание фона поможет шагам автоматических пороговых значений макроса для получения адекватной сегментации НМСА терминалов.- Выберите три NMJ Z-проекции (flatstack_image_name изображения, генерируемые субмакроблока «Преобразование в стек»), которые являются репрезентативными набора данных изображения.
- В панели инструментов выберите изображение | Цвет | Разделение каналов. Два изображения будут созданы, одна из которых представляет канал 1, а другой канал 2.
- Хранить только изображение, принадлежащее к каналу 1 открытых, соответствующий Dlg-1, HRP, сыти или Csp иммунноокрашиванию, и отбросить канал изображения BRP, закрывая изображение.
- Запустите фильтр «Вычитание фона», выбрав «Process» на панели инструментов, затем «Subtract фон ...» в раскрывающемся меню.
- Нажмите на флажке предварительного просмотра в всплывающем окне и отрегулировать радиус качения шарика к значению , которые увеличивают контраст между синапсом и фоном , как и в панели (рисунок 5А»).
Примечание: См рисунок 5 для примера. В Figure5A, части синапса показывают те же самые уровни серого в качестве фона, в то время как на фиг.5А»The„Прокатка радиус шара“установлен в положение 500 создает сильный контраст между синапса и фоном. - Когда соответствующее значение для подвижного радиуса шарика определяются, запустить «Вычитание фона» алгоритм на выбранных Z-проекциях с тем же шаровой прокаткой значением радиуса и сохранить их (в любом каталоге).
Примечание: Прокатный шар значение радиуса для 8-битовых RGB или изображений должно быть по крайней мере, столь же большое как радиус наибольшего объекта в изображении, который не является частью фона. Для 16-битных и 32-битных изображений радиус должен быть INVersely пропорционально диапазон 22 значений пикселей.
- Определить различные автоматические пороги , которые будут использоваться
- Открыть Z-проекцию, сохраненную на предыдущем этапе (6.2.6) и выберите изображение | Отрегулировать | AutoThreshold | Пробовать все.
- Как двоичное пороговый результат появляется изображение со всеми различными авто-пороговых алгоритмами, определить наиболее подходящий алгоритм для изображений.
- При запуске макроса позже, изменения порога в макро-настройки соответственно.
- Использование более ограничительные пороговые значения, такие как «RenyiEntrophy» или «Моменты» в качестве порогового значения контура NMJ и более разрешающих пороговых значений, таких как «Ли», чтобы определить, скелет NMJ, и «Huang» для определения активных зон. Когда изображения очень острые с практически без фона, используйте «Хуан», как»НМС порог контура. В противном случае часть синапса может отсутствовать после сегментации изображений.
- Смотрите рисунок 5B для примера. Надлежащая сегментация синапса получается с авто-порогами отмеченных зелеными коробками. Некоторые примеры не подходящих пороги выделены красными коробки (проверить синапсы при большом увеличении). В последнем случае, либо части синапса отсутствуют или части фона включены. См ссылка 23 для получения дополнительной информации.
- Определить максимальный размер мелких частиц
Примечание: Эта функция будет исключить все частицы, обнаруженные у порога контура NMJ и порога Скелет, которые меньше, чем заданное значение в параметре «Настройка» мелких частиц из анализа. Это значение задается в пикселях. Эта функция служит в качестве фильтра шума и очень полезно, когда высокий уровень неравномерного фона (таких как кристаллы / пыль) присутствует в полученных изображениях.- Открыть Z-проекцию, сохраненную на этапе 6.2.6. и установитьшкала для определения количества пикселей через анализ | Set Scale. Применяют следующие параметры: расстояние в пикселях = 1, известное расстояние = 1, пикселя с соотношением сторон = 1, единица длины = пикселя и нажмите кнопку «ОК». Нажмите на кнопку «Овальный выбора» инструмент на панели инструментов.
- С помощью мыши нарисуйте выделение близко окружающее отдельные частицы, которые присутствуют в иммунном, но не принадлежат к НМСУ. Нажмите Ctrl + M для пользователя Windows, или Cmd + м для пользователей Mac. Окно результата откроется, обозначающая площадь частиц, выбранных в количестве пикселей.
- Повторите предыдущие несколько раз шага с несколькими артефактами, присутствующими в изображениях, чтобы определить наибольшую площадь загрязняющих частиц / артефакта. Это будет значение, чтобы установить в настройках при запуске макроса позже. При запуске макроса установки «малых частиц Размер» в качестве наименьшего размера частиц наблюдается гной запасом в 25%.
- Смотрите рисунок 5D для примера. Самый большой кристалл обнаружитье изд имеет площадь 112 пикселей. Параметр «размера Малых частиц», при обработке изображения с макро, должен быть установлен to125 - 150.
- Определить минимальный размер бутона
Примечание: Эта функция будет исключить все бутоны обнаруженного порога контура NMJ, которые меньше, чем заданное значение из анализа. Это значение задается в пикселях.- Выполните те же шаги, как описано в разделе 6.4, но в этом случае сделать выбор, окружающий самые маленькие бутоны, присутствующие в терминале NMJ. Выберите самую маленькую область, соответствующую наименьшей бутон из измеренных. Это значение устанавливается в настройке размера минимальной Bouton при запуске макроса позже.
- Определение «Найти шум допуска максимумов» значение
- Используйте Z-hyperstacks, выбранный в разделе 6.2.1.
- В панели инструментов выберите изображение | Цвет | Split каналов на CREAт.е 2 стеки (для канала 1 и канала 2) и сохранить изображение, соответствующее каналу BRP открытым. Откажитесь от другого канала изображения, закрывая его.
- Перейдите на вкладку плагинов в контекстном меню, выберите процесс | Максимум (3D), а также при появлении maximum_image_name (который может занять несколько минут), закройте исходный стек изображений.
- Выберите Maximum ... имя_образ (полученный стек изображений) и выберите Плагин | Процесс | Минимум (3D), закройте Максимальный ... имя_образа стек.
- В панели инструментов выберите Process | Найти максимумы .... Новое окно «Найти максимумы ...» откроется. Нажмите на «выбор точки Preview ...» флажка и заполнить «допуск шума» коробочку с заходящим 50. Точки максимумов будут указано на изображении как крестики макроса по умолчанию.
- Увеличение «допуск шума» значение , если наблюдать избыток аннотированных активных зон, то есть кресты, которые не на верхней части активных зон , которые находятся всосредоточиться на выбранной плоскости стека, или ложных активных зон, которые обнаруживаются в фоновом режиме.
- С другой стороны, если наблюдающая неполностью аннотированные активные зоны, т.е. активных зоны в фокусе не маркирован признается, уменьшение «допуск шума» значение. Продолжайте пробовать различные значения после этой процедуру до крестиков соответствующим мечения активных зон в фокусе. Заполните «Найти допуск максимумов шума» с этим значением.
- Смотрите рисунок 5C для примера. Слишком много активных зон обнаружены. На рисунке 5С»только активные зоны в фокусе будут обнаружены.
- Увеличение «допуск шума» значение , если наблюдать избыток аннотированных активных зон, то есть кресты, которые не на верхней части активных зон , которые находятся всосредоточиться на выбранной плоскости стека, или ложных активных зон, которые обнаруживаются в фоновом режиме.
- Запуск субмакроблока «Анализ» для репрезентативных изображений, выбранных на шаге 5.1, с параметрами, заданными в всех предыдущих шагах.
- Регулировка BRP-Puncta нижний и верхний порог
- Обратите внимание на то, что новый файл будет появляться после запуска макро согласно шагу 6.6, называемый 2_active_zone_stack_image_name. В этом изображении стек активных зон, обнаруженных с помощью функции «Поиск максимумов», обозначены белыми точками в каждой плоскости.
- Откройте этот файл с помощью перетаскивания его в панели инструментов и выберите Image | стек | Zproject | тип проекции = Sum ломтиков. будет получена проекция 2_active_zone_stack_image_name.
- Выберите изображение | Отрегулировать | Порог. Новое окно «Порог» откроется. Наденьте верхнюю планку, чтобы выбрать пороговое значение, где все желаемое фокусов / BRP-положительные пятна визуализируются в красном цвете.
Примечание: Если пороговое значение слишком низкое, избыток активных зон будет учитываться. Если установлено слишком высоко, доля активных зон будет пропущена.- Смотрите Рисунок 5E для примера. Когда пороговое значение равно 400, большинство из активных зон (символизируемых как 1 пиксель очагов) не включены в сегментации, так как они не выделены красным цветом (фиг.5E). Когда пороговое значение устанавливается в значение 50 все активные зоны выделяются красным цветом (Рис 5E»).
- Определить это значение в качестве минимального порогового значения. Оставить «порог Puncta Верхний» на максимальное значение.
- Перезапустите суб-макро «Анализ» для репрезентативных изображений с параметрами, определенными на всех предыдущих этапах этого раздела. Критически оценить получившиеся файлы изображений и убедитесь, что сегментация сделана правильно. Если это не так , скорректировать параметры в зависимости от характера ошибок сегментации (фиг.4, таблица 3).
Representative Results
Файл результатов текста будет отображаться в главном каталоге. В нем кратко все измеренные параметры для каждого изображения. Результаты связаны с именем файла и параметры затем суммируются в порядке , указанном в таблицах 1 и 2.
Res_image_name это стек три-изображения. Первое изображение подчеркивает контур и скелет терминала NMJ определяется макро, основанный на канале 1 (иммунноокрашивания Dlg-1, HRP SYT или Csp). Второе изображением является копией первого изображения и дополнительно показывает, выявленный BRP-позитивных пятна, которые обнаруживаются в канале 2, как схематизированные очаги. Третье изображение обеспечивает максимальную проекцию второго канала вместе с идентифицированным BRP-позитивными очагами.
Порог контура НМСА представлен в желтом цвете в макро выхода результирующего изображения. НМС область, ПеримЭтери и количество бутонов выведены из этого порога.
Пороговый скелет НМС представлен синим цветом в макро выходного результата изображения. НМС длина, длина самой длинной ветви, количество ветвей, точки ветвления и острова выведены из этого порога.
Порог активных зон НМСА не представлен в макро-вывод результирующего изображения. Этот порог определяет область, где Brp-позитивные очаги могут потенциально встречаемый макрос. Он предназначен для создания NMJ области, которая немного больше, чем определенное порогом НМСА контура. При выборе слишком ограничительный порог, BRP-положительные фокусы расположен на краю синапса, могут быть исключены. Когда порог слишком разрешающий, фоновый шум может быть расценен как BRP-положительным пятно ( На рисунках 1 - 2).
Для Валидат.е выполнение макрокоманды «дрозофила НМС морфометрии», были испытаны три мутантные условия , которые уже были описаны , чтобы представить синаптические дефекты в различных NMJ параметров. Каждый дефект был обнаружен другой процедурой сегментации изображения , выполняемой с помощью макро (NMJ контура, скелет или активных зон, соответственно 17). После ориентации трех генов, представляющего интереса по индуцируемому RNAi и исполняющих вскрытия и NMJ иммунных личинок L3, макро был запущен. Полученные NMJ морфологические измерения были затем попарно (RNAi в сравнении с его контролем) по сравнению с использованием критерия Стьюдента. Во всех трех случаях статистические различия были обнаружено между мутантами и управлением, влияющим на параметры, которые находятся в согласии с ранее сообщенными морфологическими дефектами. Это подтверждает , что макросы действительно способны адекватно определить , описанные ранее дефекты на Drosophila НМСЕ.
анкириновых 2 (ank2, CG42734) мутанты , как известно, показывают синаптические дефекты морфологии, в том числе конденсированных бутонов и небольших НМС. Эти дефекты наблюдались для ank2 мутантов 24, 25 и ank2 нокдаун мух 26. NMJ терминалы пан-нейрональных Ank2- RNAi нокдаун мух (ш; БАС-шпигорезка-2 / БАС-ank2 иРНК KK107238; Elav-GAL4 / +) , показали значительно меньшую площадь NMJ (среднее = 339.25 мкм 2; Т-тест р = 2.18 х 10 -8) и периметр (среднее = 238,24 мкм; Т-тест р = 1,82 × 10 -3), по сравнению с генетическим контролем фона набора данных (Вт; UAS-Dicer-2 / БАС-KK60100; Elav-GAL4 / + ) (среднее = 451.95 мкм 2 , и среднее значение = 288,62 мкм, соответственно) после запуска "Drosophila NMJ морфометрии" (Фигуры 6A и 4В).
GTPase Rab3 (CG7576) необходимо для правильного распределения bruchpilot и RUP мутант представляет со значительно уменьшенным количеством активных зон 27. Наблюдалось значительное снижение числа активных зон при измерении BRP-положительного фокусы на макро «дрозофила НМС морфометрии» в NMJ терминалах пан-нейрональных Rab3 нокдаун мух (ш; БАС-шпигорезка-2 / БАС-RNAi KK100787; Elav -Gal4). Среднее количество активных зон на NMJ терминала в Rab3 -RNAi было 138 , в отличие от 290 обнаруженных в контрольной наборе данных (/ +) Т-тест р = 4,43 × 10 -29) (Фигуры 6А и 4С).
Highwire (HIW, CG32592) является важным регулятором роста NMJ; мутации в гене HIW приводят к зарастают и расширенные разветвления НМС терминалов 28. Измерение NMJ терминалы пан-нейронов бросовой линии HIW -RNAi (ш; UAS-шпигорезка-2 / БАС-RNAi-GD36085; Elav-GAL4 / +) , с "Drosophila NMJ морфометрии", существенные различия наблюдались в скелете , полученных параметров: длина (среднее значение = 147.36 мкм; контроль среднее значение = 122.07 мкм; т -test р = 7,31 × 10 -7), длина самой длинной ветви (среднее = мкм 122.19; контроль среднее значение = 105.65 мкм; Т-тест р = 4,62 × 10 -4) количество ветвей (среднее значение = 7,69; контролировать среднее = 5,74; Т-тест р = 2,52 х 10 -2) и число точек ветвления (среднее значение = 2,73; контролировать средний = 1,79; Т-тест р = 3,31 × 10 -2). Все эти параметры были значительно увеличены (120 - 180%) по сравнению с генетическим фоном управления (со; БАС-шпигорезка-2 / UAS-GD60000; Elav-GAL4 / +) , (6А и 4D).
Рисунок 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics Меры 9 параметров Drosophiл НМС. Слева Dlg-1 и Brp immunolabeled NMJ терминалы, отображается на флуоресцентном микроскопе с ApoTome. Справа результат изображения после запуска «Drosophila НМС морфометрии». Параметры площадь, периметр и Boutons представлены макро-аннотированные желтый контур указанного. Длина Параметры, длина самой длинной ветви (LBL), ветви, точки ветвления и острова представлены макро-аннотированные синим контуром. BRP-immunolabeled очаги (активные зоны) представлены макрокоманды в виде белых пятен в результирующих изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: дрозофила НМС Бутон морфометрия Меры 8 параметров Drosophila НМС. Налевоявляются сыть-1 и Brp immunolabeled NMJ терминал, отображается на флуоресцентном микроскопе с ApoTome. Справа результат изображения после запуска «Drosophila NMJ Bouton морфометрии». Параметры бутоны и область Bouton представлены макро-аннотированный желтый контур. Длина Параметры, длина самой длинной ветви (LBL), ветви, точки ветвления и острова представлены макро-аннотированные синим контуром. BRP-immunolabeled очаги (активные зоны) представлены макрокоманды в виде белых пятен в результирующих изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Схема потока Представление Drosophila NMJ морфометрии и дрозофилы NMJ BOUTON морфометрии макрокоманд. Первый суб-макро «Преобразование то стек»создает прогнозы и hyperstacks изображаемого НМСА. Вторые суб-макро„Определить ROI“требует ручного ввода, определяющего местоположение терминала НМСА интереса. субмакроблок три,„Анализ“, измеряет все НМСЫ параметров. А текст файл , содержащий количественные значения и файл результат изображения с изображением обрисовки параметров создано , чтобы помочь оценить пользователь макро производительности. Когда изображения получены в разных условиях, макро настройки должны быть проверены и отрегулировано для обеспечения точного анализа. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Рисунок 4: Примеры неприемлемых Макра результатов сегментации. Результат изображения после запуска "Drosophila NMJ MorphometrИКС»или„дрозофила НМС Бутон морфометрия“. Части синаптического терминал не включены в желтом контуре (A). Части фона включены в синаптическом терминале по желтому контуру (B). Голубой скелет линия выходит за пределами синаптический терминал. (C - D) Слишком много активных зон обнаружены (Е - Е «). Некоторые активные зоны остаются незамеченными при анализе (G - G»). активные зоны обнаруживаются за пределами синапса (F) Неправильная сегментации Bouton. (только при работе Drosophila NMJ BOUTON морфометрии), Boutons пропущены (H) или слишком много Boutons обнаруживаются сегментации (I). Частицы такая кристаллы или пыли , которые являются частью фона включены в сегментации (J) . информация о том , как изменить настройки , чтобы избежать этих ошибок, представлены в таблице 3 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Примеры макросов Настройка параметров и их последствий для изображения сегментации. (А) Вычитание фона предварительный просмотр immunolabeled синапсе Dlg-1, изображаемого на флуоресцентный микроскоп с ApoTome, когда "Прокатка радиус шара" установлен в положение 20 (A) или 500 (А»). (B) Выходные изображения , полученные после запуска изображения | Отрегулировать | Auto-Threshold | Попробуйте все изображение иллюстрирует сегментирование изображения, полученное с помощью 16 различных авто-пороговых алгоритмов. (C) "Найти Maxima" предварительный просмотр при настройке "толерантности" шума при 50 (С) и 500 (C»); переменный токTIVE зоны, которые обнаруживаются с помощью сегментации помечены крестиком. (D) Измерение «мелких частиц» , появляющихся в изображении фоне синапсе immunolabeled с анти-HRP, изображаемого на конфокальной микроскопии. (Е) "ломтики Sum" проекция получается из 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Порог устанавливается при 400 (Е) и на 50 (Е»). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Макро Оценка и Количественное NMJs на мышцы 4. (А) Результат изображений после запуска «дрозофила НМС морфометрии» макро на Dlg-1 и BRP immunolabeled NMJ терминалов. область Параметры, периметр и Boutonы представлены макро-аннотированные желтый контур. Длина Параметры, длина самой длинной ветви (LBL), ветви, точки ветвления и острова представлены макро-аннотированные синим контуром. BRP-immunolabeled очаги (активные зоны) представлены макрокоманды в виде белых пятен в результирующих изображений. Шкала полоса указывает на 20 мкм. (Б) Ankyrin2 RNAi нокдаун , обнаруживают меньшую площадь NMJ и периметр по сравнению с генетическим фоном управления. (С) Rab3 нокдаун в результате NMJs с меньшим количеством BRP-позитивных активных зон по сравнению с генетическим фоном контроля. (D) Highwire нокдаун в результате больше, более длинная длина ветви, более разветвленная и с более точками ветвления на НМС терминалов по сравнению с генетическим фоном NMJs управления. Столбики ошибок указывают SEM, ** р <0,01, два Стьюдента-тест. Пожалуйста , нажмите онповторно просмотреть большую версию этой фигуры.
| параметр | структура NMJ | объяснение |
| Область (мкм2) | НМС контур | Площадь полной меченого NMJ |
| Периметр (мкм) | НМС контур | Периметра, принадлежащие к области |
| #Boutons | НМС контур | Число синаптических бутонов ( «жемчужины на нитке») от НМС |
| Длина (мкм) | остов | Общая длина полного терминала NMJ |
| Наибольшая длина ветви (мкм) | остов | Сумма длины самого длинного пути непрерывного соединения любых двух конечных точек НМС |
| #Филиалэс | остов | Общее количество филиалов |
| #Branching точки | остов | Число точек ветвления (несколько ветвей можно вывести из одной точки ветвления) |
| #Islands | остов | Количество не соединенных Dlg1-положительных синаптических отсеков (или любое другое окрашивание) |
| #Active зоны | BRP-позитивные пятна | Количество активных зон, на основе BRP окрашивания |
Таблица 1: НМС Параметры Измеренные по «Drosophila НМС морфометрии». НМС параметры , измеренные с помощью макроса «Drosophila NMJ морфометрии» появится в виде списка в полученном текстовом файле, в соответствии с порядком , описанной в этой таблице. Эта таблица перепечатаны из Nijhof и соавт. 17
| параметр | структура NMJ | объяснение |
| Boutons | НМС контур | Число синаптических бутонов ( «жемчужины на нитке») от НМС |
| Bouton область | НМС контур | Общая площадь всех бутонов |
| Длина (мкм) | остов | Общая длина полного терминала NMJ |
| Наибольшая длина ветви (мкм) | остов | Сумма длины самой длинной непрерывной траектории, соединяющей любые две конечные точки NMJ |
| #Ветви | остов | Общее количество филиалов |
| #Branching точки | остов | Thе число точек ветвления (несколько ветвей можно вывести из одной точки ветвления) |
| #Islands | остов | Количество не соединенных Dlg1-положительных синаптических отсеков (или любое другое окрашивание) |
| #Active зоны | BRP-позитивные пятна | Количество активных зон, на основе BRP окрашивания |
Таблица 2: НМС Параметры Измеренные по «Drosophila НМС Bouton морфометрии». НМС параметры , измеренные с помощью макроса «Drosophila _Bouton_NMJ_Morphometrics» появится в виде списка в полученном текстовом файле, в соответствии с порядком , описанной в этой таблице. Эта таблица перепечатаны из Nijhof и соавт. 17
| сегментация | пример | Необходимые корректировки | ||
| НМС Площадь и периметр (представлен желтым контуром в результате изображения) | Части синаптического терминал либо не включены в желтом контуре или частях фона включены в синаптическом терминале, описанном в желтом цвете. | Фигура 5А-Б | Отрегулируйте значение «катящегося шара Radius». Смотрите раздел 6.1. | Исправьте «NMJ порог контура». Смотрите раздел 6.2. |
| Параметры, относящиеся к NMJ длина (представлены синим скелет линия на изображении результатов) | Синий скелет линии либо выходит за рамки или не присутствует вдоль всей синаптической терминала. | Рисунок 5C-D | Отрегулируйте значение «катящегося шара Radius». Смотрите раздел 6.1. | Исправьте «NMJ порог контура». Смотрите раздел 6.2. | </ TR>
| BRP-положительный Puncta (представлены точками в найденном изображении) | Слишком много активных зон обнаружены. | Рисунок 5E-Е» | Уменьшение «Найти толерантности максимумов шума» значение. Смотрите раздел 6.5. | |
| BRP-положительный Puncta (представлены точками в найденном изображении) | Активные зоны пропущено анализа. | Рисунок 5G-G» , | Увеличение «Найти толерантности максимумов шума» значение. Смотрите раздел 6.5. | Уменьшение 'Brp-Puncta нижнего порога'. Смотрите раздел 6.6. |
| BRP-положительный Puncta (представлены точками в найденном изображении) | Активные зоны артефакты обнаружены за пределами синаптического терминала. | Рисунок 5F | Отрегулировать раздел «порога активной зоны» 6.2. | Увеличение 'Brp-Puncta нижнего порога'. Смотрите раздел 6.6. |
| Мелкие частицы | Частицы такой кристаллы или пыль, которые являются частью фона по всей видимости, будут включены в сегментации. | Рисунок 5J | Установите флажок "Удалить мелкие частицы. Смотрите раздел 6.3. | Определение малых частиц максимального размера. Смотрите раздел 6.3. |
| сегментация Bouton | Неправильная сегментация Bouton (Только для дрозофилы НМС Bouton морфометрии, не используйте Drosophila NMJ морфометрии для сегментации Bouton). | Рисунок 5H-я | Исправьте «NMJ порог контура». Смотрите раздел 6.1. | Определение «минимального размера бутона». Смотрите раздел 6.4. |
Таблица 3: Руководство по устранению неисправностей для различных видов ошибок в изображениях Сегментации , которые могут быть произведены с помощью макрокоманд. В данной таблице приведены различные видыОшибки сегментации изображения, полученные с помощью макросов. Они могут быть легко обнаружены в изображениях результатов. Примеры каждого типа ошибок показаны на рисунке 4. В «Корректировки разделе» таблицы, параметры, которые должны быть отрегулированы выделены, и пользователь, называется критической подэтапа раздела 6, которые описывают, как настроить эти параметры.
Discussion
«Drosophila NMJ морфометрия» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрия» является мощным инструментом для исследователей , заинтересованных в оценке синапсов морфологии. Ручная оценка НМС параметров является трудоемким; предполагается, что макрос будет сохранить опытного исследователя до 15 мин / НМС провел на сегментации изображения вручную. С одного до двух десятков синапсов оцененных в состояние или генотип, это быстро подводит итог значительного количества экономии времени, даже в небольших масштабах исследований. При выполнении больших экранов, коэффициент усиление с использованием высокого анализа пропускной способностью, по сравнению с ручной оценкой и количественным определением, может быть огромным. В дополнение к увеличению пропускной способности, макросы легко обеспечить объективный анализ; они исключают личные предубеждения, которые в противном случае требуют ослепленных экспериментов, а также межличностных различий, которые возникают, когда несколько исследователей участвуют в анализе. Наконец, макросы обеспечивают чувствительное и точное А.Нalysis особенностей НМС, что позволяет идентифицировать синаптических регуляторов, которые вызывают довольно тонкие, чем драматические NMJ дефектов и до сих пор оставались недооценивают глазом исследователя. Более подробная информация о процедурах проверки и алгоритмов , используемых в макросов найдены в публикации Nijhof и соавт. 17.
Функциональность макросов была подтверждена соответствующим образом измерить морфологические особенности дрозофилы NMJs на мышцах 4. Впоследствии было показано , что макросы также были пригодны для анализа синапсов на других мышцах в этом организме. Вполне вероятно , что макросы также могут быть использованы для измерения морфологических параметров NMJ с аналогичной структурой у других видов, в том числе других видов Drosophila и дальнейших насекомых. Даже NMJs очень далекие в эволюции, например, НМС мышей, показывают весьма похожую структурную конформацию 29, Макросы не были протестированы на НМС препаратов из других видов, но потенциальные пользователи рекомендуются проверить макросы для таких целей.
Это очень важно, чтобы пользователь исследует различные автоматические пороги и алгоритмы для определения / выбрать наиболее подходящие настройки для макро изображений. С помощью этих установок, точность примерно 95% достигается тогда, когда макро оценка была по сравнению с ручной оценкой. Настройка параметров макросов правильно сегмент 100% изображений может быть очень трудоемкой или даже невозможно процедурой. Таким образом, исключение из изображений не правильно сегментированных рекомендуется, если их количество составляет менее 5%. Очевидно, что если качество изображения является низким, макросы будут генерировать более высокие коэффициенты неудовлетворительных сегментаций изображения. Низкие качество изображения будет так же влиять на ручную оценку и поэтому не могут быть связаны с выполнением макросов. Тем не менее макросы достаточно надежны, как они были разработаны для изображенияы генерируется на высоком содержании микроскопа (автоматизированный флуоресцентный микроскоп , что позволяет визуализации большого числа образцов) 17.
Критическая точка является то, что пользователь визуально проверяет все изображения результата, генерируемые с помощью макросов. Это позволит обнаружить и исключить снимки с неудовлетворительной сегментацией. В разделе 6 настоящего протокола, пользователь руководствуется, как настроить параметры для правильной сегментации изображений при запуске субмакроблока «Анализ». Чтобы быстро ознакомиться с требованиями макросов и как настроить параметры макро папки под названием «Examples_adjusting настройки макроса» включен в макро хранилища https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Тринадцать вложенных папок, каждая из которых с примерами изображений, полученных на различных платформах микроскопа (высокое содержание / конфокальное / флуоресцентные микроскопы) и различные immunostainings, предоставляется. PDF-право «Примеры руководство» входит в тот жепапка, в которой параметры, необходимые для каждого примера представлены, наряду с текстовым документом, обеспечивающего ожидаемые результаты и результаты изображения.
Макросы были предназначены для обработки изображений, сохраненных в .tiff разделенных файлов, тем не менее, некоторые пользователи могли бы спасти свои изображения в другом формате. Следующий сайт https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 содержит папку с именем «Drosophila НМС» , где три файлы примеров (пример 1 - 3) и «Руководство Примеры» документ с подробными инструкциями , как импортировать изображения в макро если не хранится в виде отдельных файлов .tiff также можно найти в той же папке.
Вместе «Drosophila НМС морфометрия» и «Drosophila NMJ Bouton морфометрия» макросы количественно десять различной НМС функции: НМС площадь, НМС по периметру, количество бутонов, площадь Bouton НМСА, НМС длины, НМС длинной длины ветви, число ИслоНСР, число ветвей, число точек ветвления и количество активных зон. Это дает большое преимущество над до сих пор доступных инструментов , которые могут оценить только один или несколько синаптических функций 30, 31. Многопараметрический количественный анализ имеет большой потенциал для новых открытий, например, для идентификации новых регуляторов , которые контролируют один до многочисленных аспектов синаптической биологии. Она также обеспечивает требуемое разрешение, чтобы определить, что гены coregulate точно такую же или перекрывающийся NMJ функции и, таким образом, вероятно, будет действовать в общих молекулярных путях. И, наконец, открывает возможность исследовать , как различные синаптические параметры коррелируют друг с другом в ненарушенных условиях 17 и какие гены обеспечивают такие скоординированные морфометрические корреляции.
Взятые вместе, этот протокол показывает , как использовать два макроса «Drosophila NMJ морфометрия» и«Дрозофила НМС Бутон морфометрия», которые выполняют объективную и чувствительную количественную оценку десяти морфологических признаков NMJ в высокой пропускной образом.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем , фондовый центр Вены Drosophila Resource Center и Блумингтон дрозофилы (NIH P40OD018537) для обеспечения штаммов дрозофилы. Мы благодарим Джек Франсен из микроскопических изображений Центра экспертной поддержки в визуализации. Это исследование было поддержано VIDI и ТОП грантов (917-96-346, 912-12-109) от Нидерландской организации научных исследований (NWO), два докторских стипендий DCN / Radboud University Medical Center, немецкой умственной отсталостью сети финансируется программой NGFN + немецкого Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF) и FP7 крупномасштабных интегрированных сетевых Gencodys Европейского Союза (HEALTH-241995) в AS. В спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
- Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
- van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
- Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
- Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
- Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
- Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
- Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
- Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
- Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
- Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
- Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
- Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
- Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
- Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
- Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
- Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902 (2013).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
