Summary
To billedanalyse algoritmer, "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" blev skabt, til automatisk at kvantificere ni morfologiske træk af Drosophila neuromuskulære overgang (NMJ).
Abstract
Synaptisk morfologi er tæt relateret til synaptisk effektivitet, og i mange tilfælde morfologiske synapse defekter sidste ende føre til synaptisk funktionsfejl. Drosophila larve neuromuskulære junction (NMJ), en veletableret model for glutamaterge synapser, er blevet grundigt undersøgt i årtier. Identifikation af mutationer, der forårsager NMJ morfologiske defekter afslørede et repertoire af gener, der regulerer synapse udvikling og funktion. Mange af disse blev identificeret i store undersøgelser, der fokuserede på kvalitative metoder til at opdage morfologiske abnormiteter i Drosophila NMJ. En ulempe ved kvalitative analyser er, at mange subtile spillere bidrager til NMJ morfologi sandsynligvis forblive ubemærket. Ud fra følgende betragtninger kvantitative analyser er forpligtet til at registrere de finere morfologiske forskelle, sådanne analyser er endnu ikke almindeligvis udføres, fordi de er besværlige. Denne protokol beskriver i detaljer to billedanalyse algoritmer "Drosophila 'Drosophila NMJ Bouton Morphometrics', tilgængelig som Fiji-kompatible makroer, til kvantitativ, præcis og objektiv morfometrisk analyse af Drosophila NMJ. Denne metode er udviklet til at analysere NMJ terminaler immunolabeled med de almindeligt anvendte markører Dlg-1 og . BRP Derudover dens bredere anvendelse til andre markører, såsom Hrp, Csp og SYT præsenteres i denne protokol makroerne er i stand til at vurdere ni morfologiske NMJ funktioner:. NMJ område, NMJ perimeter, antal boutons, NMJ længde, NMJ længste gren længde, antal øer, antal grene, antal forgreningspunkter og antal aktive zoner i NMJ terminalen.
Introduction
Kognitive lidelser, såsom mental retardering, autisme spektrum forstyrrelse og skizofreni er ofte kendetegnet ved unormal synaptisk funktion 1, 2, 3. Synapse morfologi og funktion er tæt sammenflettet; morfologiske defekter kan forårsage synaptisk funktionsfejl og, omvendt, vil afvigende synaptisk transmission påvirke synaptisk modning og morfologi 4, 5, 6.
En række modelorganismer har været anvendt med henblik på at bedre at forstå synapse biologi og kaste lys over, hvordan synaptiske ændringer påvirker hjernens funktion i sundhed og sygdom 7, 8, 9. Drosophila NMJ er et grundigt undersøgt og veletableret in vivo model for glutamaterge synapse biologi 10, 11. I de seneste årtier har denne model blevet anvendt til fysiologiske og gen-fokuserede undersøgelser, samt til storskala genetiske skærme, med det formål at detektere morfologiske forskelle mellem NMJs. Især har forward genetiske skærme identificeret mange vigtige regulatorer og mekanismer bag synapse udvikling og funktion 12, 13, 14, 15, 16. De fleste af disse screeninger påberåbte visuel vurdering af NMJ terminal morfologi og på kvalitativ påvisning af de synaptiske abnormiteter eller semikvantitativ scoring af nogle morfologiske træk. Som en konsekvens, er temmelig subtile synaptiske morfologiske abnormiteter, der ikke er indlysende for det menneskelige øje nemt gå glip af. For at kunne omfattende detektere kvantitative forskelle, deNMJ skal præcist evalueret af systematisk kvantificering af de morfologiske parametre af interesse. Måling NMJ funktioner manuelt er besværlig, især når der er flere NMJ træk af interesse og / eller når der udføres omfattende genetiske screeninger. For at understøtte multiparametric, high-throughput morfologisk analyse og for at opnå objektiv kvantificering blev to makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" udviklet 17. Begge makroer køres i open source billede analyse software Fiji 18, og kan kvantificere både konfokale og nonconfocal billeder.
"Drosophila NMJ Morphometrics" foranstaltninger NMJ terminaler immunofarvede med den postsynaptiske markør disk stor-1 (Dlg-1) eller den præsynaptiske peberrodsperoxidase (HRP), co-mærket med den aktive zone markør bruchpilot (BRP). Det kvantificerer ni morfologiske Parameters (yderligere beskrevet nedenfor): NMJ område, NMJ perimeter, antal boutons, NMJ længde, NMJ længste gren længde, antal øer, antal grene, antal forgreningspunkter og antal aktive zoner i den synaptiske terminal (figur 1) . Selvom en algoritme til at bestemme antallet af boutons er til stede i denne makro, har den ikke opfylder kriterierne for nøjagtighed 17. Til at vurdere antallet af boutons, er det nødvendigt at bruge "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makro, som er specielt designet til at kvantificere boutons anvender NMJ præparater immunofarvede af anti-synaptotagmin (SYT) eller anti-cystein streng protein (CSP), og co-immunomærket med BRP. Den "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makro kvantificerer følgende parametre: antal boutons, NMJ bouton område, NMJ længde, NMJ længste gren længde, antal øer, antal afdelinger, antallet af forgreningspunkter og antallet af aktive zoian (figur 2).
De makroer består af 3 sub-makroer: (I) "Konverter at stable" identificerer alle tilgængelige billedfiler og skaber Z-hyperstacks og maksimale projektioner af begge kanaler intensitet. Som output, vil denne makro generere to nye filer pr synapse kaldet "stack_image_name" og "flatstack_image_name". II) "Define ROI" vil åbne alle maksimale projektionsbilleder "flatstack_image_name" fortløbende og præsentere dem med anmodning om at manuelt definere regionen af interesse (ROI), hvori den specifikke synaptiske terminal af interesse er til stede. Dette blev gennemført for at muliggøre udelukkelse af synapser forbinder til tilstødende muskler og / eller andre typer af synaptiske terminaler (såsom 1s), der kan være til stede i billederne 11. (III) "Analyser" gælder fuldt automatiseret analyse til alle regioner af billederne inden for grænserne af ROI. Somet resultat af dette trin, vil brugeren få to nye filer: "results.txt", hvor al den numeriske målinger vil blive kommenteret og en "res_image_name.tif", hvor det underliggende billede segmenter produceret af makroen vil blive illustreret. Under billedanalyse tre strukturer er afledt fra hver synaptiske terminal: den NMJ omrids, den NMJ skelet, og antallet af BRP-positive aktive zoner. Den NMJ omrids anvendes til at bestemme den NMJ området og dets omkreds og en efterfølgende vendepunkt adskillelse giver antallet af boutons. Fra skelettet, er fem NMJ funktioner udledes: den totale NMJ længde, summen af længden af den længste sammenhængende sti, der forbinder to vilkårlige endepunkter (længste gren længde), antallet af usammenhængende rum pr NMJ (benævnt "øer" ), antallet af filialer, og antallet af forgrening punkter (ét forgreningspunkt forbinder tre eller flere grene). Antallet af aktive zoner bestemmes på BRP-kanal ved at tælleBRP-positive pletter. Den kommenterede NMJ omrids (gul linje), den NMJ skelet (blå linie), og antallet af BRP-positive aktive zoner (angivet med hvide foci) vises i en resultaterne billede og målingerne af parametrene forarbejdes til en (. txt) outputfil (figur 3).
Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" blev først beskrevet og udførligt valideret af Nijhof et al. 17. Dette håndskrift fokuserer på metode til at analysere NMJ morfologi hjælp af makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". ikke desto mindre, før makro-assisteret analyser, NMJ dissektioner og immunofarvninger skal udføres. Dette er afgørende skridt, og kombinationen af markører anvendes til immunhistokemi skal være egnet til makro analyser. Disse trin er kort omtalt i sektion 1 i denne protokol og lede brugeren til referencer, der beskriver i detaljer de protokoller til at udføre disse procedurer.
Protocol
1. Krav Før Billedbehandling
- Udføre Drosophila åben bog præparater af tredje stadie vandrer larver (L3), som tidligere beskrevet 19.
- Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaler ved hjælp af en kombination af to markører: DLG-1 eller HRP sammen med BRP til analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", og SYT eller Csp sammen med BRP til analyse med "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" 20.
BEMÆRK: Antistoffer fra den samme art kan kombineres ved præ-mærkning én med et antistof-konjugering kit såsom Zenon Alexa Mærkning Kits 17. - Dette billede er NMJ terminaler ved hjælp af et mikroskop af valg, fx fluorescens (med eller uden ApoTome) eller konfokal mikroskopi.
- Erhverve en 2-kanals billedstak af NMJ terminalen.
- Justere indstillingerne mikroskop på en måde, kanal 1erhverver NMJ terminal immunolabeled med DLG-1 (eller Hrp, SYT, Csp) og kanal 2 den NMJ terminalen immunolabeled med BRP.
- Eventuelt analysere en-kanal billeder (af synapser immunmærket med et enkelt antistof) med makroer. Dette billede er NMJs immunolabeled entydigt med DLG-1 eller Hrp til analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", eller SYT eller Csp for "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
BEMÆRK: Det er ikke muligt at analysere synapser immunofarvet med kun anti-BRP.
- Eksporter de opnåede billeder som individuelle' .tiff-filer. Vend kanal orden, inden du kører makroer, hvis ikke erhvervet som angivet.
- Erhverve en 2-kanals billedstak af NMJ terminalen.
2. Krav til software og installation
- Download makroer: "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" fra følgende websted: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- Flyt markøren til mappen "makroer opdatering 1", og klik på vises indstillingen "visning". En liste med indholdet af denne mappe vises. Mappen indeholder makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
BEMÆRK: Begge makroer er kompatible med Fiji-versioner 1.4, som også leveres i den samme mappe. De makroer kan ikke køre på nyere versioner. Venligst udnytte forudsat version 1.4. Det er uproblematisk at starte denne version, selv på computere med en nyere Fiji version tilgængelig.- Klik på "Download alle". indhold Mappen vil blive downloadet til computeren som en .zip-fil. Pak den downloadede fil.
- Kopier Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm og Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm filer til Fiji.app/plugins/ mappe. Ved genstart af programmet, vil de makroer vises nederst på pluginsDrop down menu.
- Flyt markøren til mappen "makroer opdatering 1", og klik på vises indstillingen "visning". En liste med indholdet af denne mappe vises. Mappen indeholder makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
3. Kør Sub-makro "Konverter til Stack" oprettes Z-fremskrivninger og Hyperstacks af NMJ billeder
- Start den grafiske brugerflade ved at vælge plugins på værktøjslinjen og vælg "Drosophila NMJ Morphometrics" i rullemenuen.
- Definer indstillingen "Unik File String" i makro grafiske brugerflade.
BEMÆRK: mikroskop software bruger en identifikation signatur til at organisere fly og kanaler, når opbevaring stakke som individuelle' .tiff-filer. Den indtastede unikke fil snor indstilling skal angive signaturen tildelt af softwaren til det første fly af den første kanal (vigtigt: laveste flyet og kanalnummer skal angives). - Vælg kun sub-makro "Konverter til stable" og klik på "ok" og vælg den mappe, hvor billederne er placeret. Hvis der vælges en primær mappe med flere undermapper, alle individuelle' .tiff-filer ide vigtigste bibliotek og undermappe matchende streng kriterier de unikke fil vil blive behandlet.
- Hvis z-stak kun indeholder én kanal, skal du markere feltet "Kanal 1 kun".
- Bemærk, at to nye filer pr NMJ billede, som standard betegnes som stack_image_name og flatstack_image_name vises. Opbevar kun disse stakken og flatstack til yderligere analyse. Den .tiff fil serien kan slettes på dette tidspunkt, hvilket minimerer den nødvendige lagerkapacitet og undgå potentielle fejlkilder.
4. Kør Sub-makro "Define ROI" at afgrænse NMJ Terminal of Interest
- Start den grafiske brugerflade af "Drosophila NMJ Morphometrics".
- Vælg kun afkrydsningsfeltet "Definer ROI" og tryk på "OK" og vælg den vigtigste mappe, hvor billederne er berettiget flatstack_name gemmes, og tryk på "Vælg". Den sub-makro "Definer ROI" søger automatisk gennem alle undermapperinden for den valgte primære mappe.
- Som den første projektion åbner, skal du vælge "Freehand valg" værktøj på værktøjslinjen. Ved hjælp af musen trække en markering, der udelukkende indeholder den komplette NMJ terminalen af interesse, og klik på "OK" i vinduet "Definér terminal". Makroen vil fortsætte med den næste projektion.
- Afgrænse den næste ROI og gentag indtil alle ROI'er defineres. Den ROI billedfil, med navnet "roi_image_name", vil blive gemt i samme mappe som de tidligere genererede stack og projektion billeder for hver af de behandlede billeder. Resultatet af denne sub-makro er et binært billede af ROI i hvidt på en sort baggrund.
5. Kør Sub-makro "Analyze" For at kvantificere NMJ Terminal Egenskaber
- Gå til værktøjslinjen, skal du vælge "Plugins" og brug:
"Drosophila _NMJ_Morphometrics" når man analyserer synapser immunmærket med anti-Dlg-1 eller anti-HRP (kanal 1) sammenmed anti-BRP (2 kanal), eller "Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics" i analysen synapser immunmærket med anti-SYT eller anti-Csp (kanal 1) sammen med BRP (kanal 2).- Når en kanal billedstakke skal analyseres (det strukturelle kanal Dlg-1 eller HRP for "Drosophila_ NMJ_Morphometrics", eller SYT eller Csp efter "Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics"), skal du markere feltet "Kanal 1 kun".
- Justere skalaen svarende til billeder, der skal analyseres. Hvis en pixel i billedet svarer til 2,5 um, angiver Scale-Pixels = 1, Scale-Distance i um = 2,5. I tilfælde begge indstillinger efterlades ved 0, så NMJ areal, omkreds, længde og længste gren længde vil blive udtrykt i antal pixels.
- Hvis det er nødvendigt, justeres standardindstillingerne analyse af makroen. Udfør justeringer kun hvis sub-makro "Analyse" (dette afsnit med utilfredsstillende resultater, og determined bedre indstillinger i afsnit 6) er blevet kørt.
- Marker afkrydsningsfelterne "Analyser" og "Wait" og tryk på "OK".
- Vælg "Wait" afkrydsningsfelt, når du kører sub-makro "Analyse" på 2 kanals billeder. Ellers fejl i aktive zone optælling kan opstå på grund af begrænsede computer kapacitet.
- Som et nyt vindue "Vælg en mappe" åbner, skal du vælge den mappe, hvor billederne er placeret, og tryk på "Vælg". Makroen vil analysere alle billeder gemt i de vigtigste bibliotek, og hvis herunder efterfølgende mapper (ved hjælp af de tre filer fra at udføre de tidligere sub-makroer: stack_image_name, flatstack_image_name og roi_image_name). De makro processer hver billede individuelt og fortløbende. Dette kan tage flere minutter pr billedstak (afhængig af computerens kapacitet).
- Efter at have kørt makroen, opmærksom på, at et nyt billede fil med navnet res_image_name for hver analyserede synapse gemt vil være kreated i forældrenes mappe. De kvantitative målinger gemmes som "results.txt" fil.
- Undersøg alle resultere billeder til at opdage og eksklusive billeder med segmentering fejl. Mulige segmentering fejl er beskrevet i tabel 3, sammen med råd til, hvordan at justere indstillingerne for at omgå disse. Søgningen billeder med sådanne segmentering fejl er tilvejebragt som eksempler i figur 4.
BEMÆRK: Når du kører makroen med standardindstillingerne observeret i brugergrænsefladen, der var en nøjagtighed på ca. 95%, når makro vurdering blev sammenlignet med manuel evaluering 17.
6. Juster Macro Indstillinger til billederne
- Når mere end 5% af billeder viser segmentering fejl, udforske de forskellige algoritmer til at definere / vælge de bedst egnede makroindstillinger for billederne.
- Juster rullende bold radius værdi
BEMÆRK: Den rullende bold radiusFunktionen trækker baggrunden af billedet. Denne funktion er af afgørende betydning, når der arbejdes med billeder, der er erhvervet på fluorescens mikroskoper og / eller når billeder har høj baggrundsstøj. Den subtraktion af baggrunden vil hjælpe makro auto-tærsklingsparametre skridt til at producere tilstrækkelig segmentering af NMJ terminaler.- Vælg tre NMJ Z-projektioner (flatstack_image_name billeder genereret af sub-makro "Konverter at stable"), der er repræsentative for billedets datasæt.
- I værktøjslinjen, vælge Billede | Farve | Split kanaler. To billeder vil blive oprettet, en repræsenterende kanal 1 og den anden kanal 2.
- Hold kun billedet fra kanal 1 åben, svarende til Dlg-1 HRP, SYT eller Csp immunolabeling, og kassér BRP kanal billedet ved at lukke billedet.
- Kør filteret "Træk baggrund" ved at vælge "processen" i værktøjslinjen efterfulgt af "Fratræk Baggrund ..." i rullemenuen.
- Klikke på preview-afkrydsningsfelt i pop op-vinduet og justere den rullende bold radius til den værdi, forøge kontrasten mellem synapsen og baggrund som i panelet (figur 5A).
BEMÆRK: I figur 5 et eksempel. I Figure5A er dele af synapsen viser de samme grå niveauer som baggrunden, mens det i figur 5A' 'rullende bold radius' indstillet til 500 genererer en stærk kontrast mellem synapsen og baggrunden. - Når den passende værdi for den rullende kugle radius er defineret, skal du køre "Træk baggrund" algoritme på de udvalgte Z-projektioner med samme rullende bold radius værdi og gemme dem (i enhver mappe).
BEMÆRK: Den rullende bold radius værdi for 8-bit eller RGB-billeder skal være mindst lige så stor som den radius af det største objekt i billedet, som ikke er en del af baggrunden. For 16-bit og 32-bit-billeder skal inv radiusersely proportional med pixelværdi intervallet 22.
- Bestem de forskellige auto-tærskler der vil blive anvendt
- Åbn Z-fremskrivninger, der er gemt i det forrige trin (6.2.6) og Vælg billede | Juster | AutoThreshold | Prøv alle.
- Som et binært tærsklingsbehandlet resultat billedet vises med alle de forskellige auto-tærskel algoritmer, bestemme den mest passende algoritme for billederne.
- Når du kører makroen senere, ændre tærsklen for makroindstillinger i overensstemmelse hermed.
- Anvende mere restriktive tærskler såsom "RenyiEntrophy" eller "øjeblikke" som omridset tærskel NMJ og mere tolerante tærskler såsom "Li" at bestemme NMJ skelet, og "Huang" for at bestemme aktive zoner. Når billeder er meget skarpe med lidt at ingen baggrund, bruge "Huang" som" NMJ skitse tærskel. Ellers dele af synapsen mangler muligvis efter billedet segmentering.
- Se figur 5B for et eksempel. Passende segmentering af synapsen opnås med auto-tærskler fremhævet af grønne kasser. Nogle eksempler på ikke-egnede tærskelværdier er fremhævet med røde kasser (check synapser ved stor forstørrelse). I sidstnævnte, er enten dele af synapsen mangler eller dele af baggrunden er inkluderet. Se referere 23 for yderligere oplysninger.
- Den maksimale størrelse af de små partikler
BEMÆRK: Denne funktion vil udelukke alle partikler detekteret af omridset tærskel NMJ og skelet tærskel, der er mindre end den definerede værdi i "små partikler indstilling" fra analysen. Denne værdi er defineret i pixels. Denne funktion tjener som et støjfilter og er meget nyttigt, når høje uensartet baggrund (såsom krystaller / støv) er til stede i de opnåede billeder.- Åbn Z-projektioner gemt i trin 6.2.6. og sætskalaen til at registrere antallet af pixels via Analyse | Set Scale. Anvend følgende indstillinger: afstand i pixel = 1, kendt afstand = 1, pixelforhold = 1, Enhed for længde = pixel og tryk på "Ok". Klik på "Oval markering" værktøj på værktøjslinjen.
- Ved hjælp af musen trække en markering der tæt omgiver enkelte partikler, der er til stede i immunfarvning men ikke tilhører den NMJ. Tryk på Ctrl + m for en Windows-bruger eller cmd + m for Mac-brugere. Et resultat vindue åbnes, hvilket indikerer området af de udvalgte i antallet af pixels partikler.
- Gentag de foregående trin flere gange med flere artefakter til stede i billederne for at bestemme den største kontaminerende partikel / artefakt område. Dette vil være den værdi, til at sætte i indstillingen, når du kører makroen senere. Når du kører makroen indstille "små partikler Size" som den mindste partikelstørrelse observeret pus en margin på 25%.
- Se figur 5D for et eksempel. Den største krystal opdageed har et areal på 112 pixels. Indstillingen "Små partikler størrelse", ved behandling af dette billede med makroen, skal sættes to125 - 150.
- Bestemme minimum bouton størrelse
BEMÆRK: Denne funktion vil udelukke alle boutons opdaget af omrids tærsklen for NMJ, der er mindre end den definerede værdi fra analysen. Denne værdi er defineret i pixels.- Følge de samme trin som beskrevet i afsnit 6.4, men i dette tilfælde tegne en markering omkring de mindste boutons stede i NMJ terminalen. Vælg det mindste areal, der svarer til den mindste bouton af de målte dem. Dette er den værdi, der indstilles i størrelse indstilling minimum bouton når du kører makroen senere.
- Definer "Find maksima støj tolerance" værdi
- Brug Z-hyperstacks udvalgt i afsnit 6.2.1.
- I værktøjslinjen, vælge Billede | Farve | Split kanaler til kreate 2 stabler (for kanal 1 og kanal 2) og holde billedet svarende til BRP kanal åben. Kassér den anden kanal billedet ved at lukke det.
- Gå til fanen plugins i popup-menuen, skal du vælge Proces | Maksimum (3D), og når maximum_image_name vises (som kan tage op et par minutter), lukke det oprindelige billede stakken.
- Vælg den maksimale ... image_name (den opnåede billedstak) og vælg Plugins | proces | Minimum (3D), lukke Maksimum ... image_name stakken.
- I værktøjslinjen skal du vælge Proces | Find maksima .... Et nyt vindue "Find maksima ..." vil åbne. Klik på afkrydsningsfeltet "Vis eksempel punktvalg ..." og udfylde feltet "Noise tolerance" med defaultmakroen indstilling 50. maxima punkter vil fremgå af billedet som små kors.
- Øge "Noise tolerance" værdi, hvis observere et overskud af kommenterede aktive zoner, dvs. kors, der ikke oven på aktive zoner, der er ifokusere på den valgte stabel flyet, eller falske aktive zoner, der detekteres i baggrunden.
- På den anden side, hvis observere ufuldstændigt kommenteret aktive zoner, dvs. aktive zoner i fokus ikke blive stemplet genkendt, mindske "Støj tolerance" værdi. Hold prøve forskellige værdier efter denne procedure indtil krydsene er passende mærkning aktive zoner i fokus. Fyld "Find maksima støj tolerance" med denne værdi.
- Se figur 5C for et eksempel. For mange aktive zoner detekteres. I figur 5C' kun de aktive zoner i fokus detekteres.
- Øge "Noise tolerance" værdi, hvis observere et overskud af kommenterede aktive zoner, dvs. kors, der ikke oven på aktive zoner, der er ifokusere på den valgte stabel flyet, eller falske aktive zoner, der detekteres i baggrunden.
- Kør sub-makro "Analyze" for de repræsentative billeder er valgt i trin 5.1, med de indstillinger, der er defineret i de alle de foregående trin.
- Justere BRP-puncta nedre og øvre tærskelværdi
- Bemærk, at en ny fil vil blive vist efter at have kørt macro ifølge trin 6.6, kaldet 2_active_zone_stack_image_name. I dette billede stable aktive zoner opdaget af "Find maksima" funktionen er angivet med hvide prikker i hvert plan.
- Åbn denne fil ved at trække og slippe det i værktøjslinjen og vælge Billede | stak | Zproject | Projection type = Sum skiver. Et fremspring på 2_active_zone_stack_image_name vil opnås.
- Vælg billede | Juster | Grænseværdi. Et nyt vindue "Threshold" vil åbne. Skub den øverste bar for at vælge en tærskelværdi, hvor alle ønskede foci / BRP-positive pletter visualiseres med rødt.
BEMÆRK: Hvis tærsklen er sat for lavt, vil et overskud af aktive zoner tælles. Hvis indstillet for højt, vil en fraktion af de aktive zoner blive savnet.- Se figur 5E for et eksempel. Når tærsklen er fastsat til 400, er de fleste af de aktive zoner (symboliseret som en 1 pixel foci) ikke inkluderet i segmentering, eftersom de ikke er fremhævet med rødt (figur 5E). Når tærsklen er sat til en værdi af 50 alle de aktive zoner er fremhævet med rødt (figur 5E).
- Definer denne værdi som minimumsgrænse. Lad "Øvre puncta tærskel" på den maksimale værdi.
- Gentag sub-makro "Analyze" for de repræsentative billeder med de indstillinger, der er defineret i alle de foregående trin i denne sektion. Kritisk vurdere de resulterende billedfiler og sørg for, at segmenteringen er gjort ordentligt. Hvis dette ikke er tilfældet justere indstillingerne ifølge beskaffenheden af de segmentering fejl (figur 4, tabel 3).
Representative Results
Teksten resultater fil vises i hovedbiblioteket. Den sammenfatter alle de målte parametre pr billede. Resultaterne er knyttet til filnavnet og parametrene efterfølgende sammenfattet i angivet i tabel 1 og 2 ordre.
Res_image_name er en tre-billedstak. Det første billede fremhæver omridset og skelettet af NMJ terminal bestemmes af makro baseret på kanal 1 (immunolabeling Dlg-1, Hrp, SYT eller Csp). Det andet billede er en kopi af det første billede, og derudover viser de identificerede BRP-positive pletter, der afsløres i kanal 2 som skematiseret foci. Det tredje billede tilvejebringer den maksimale projektion af den anden kanal sammen med identificerede BRP-positive foci.
skitse Tærsklen for NMJ er repræsenteret i gult i makro output resultat billedet. NMJ område, Perimeter og antal boutons er udledt fra denne tærskel.
skelet Tærsklen for NMJ er repræsenteret i blåt i makro output resultat billedet. NMJ længde, længste gren længde, antal grene, der forgrener point og øer er udledt fra denne tærskel.
Den NMJ Aktive zoner tærskel ikke er repræsenteret i den makro output resultat billedet. Denne tærskel bestemmer det område, hvor BRP-positive foci potentielt kan blive udsat for makro. Det er meningen, at skabe et NMJ område, der er lidt større end den er defineret af NMJ skitse tærskel. Når en for restriktiv grænse er valgt, kan BRP-positiv foci placeret i marginen af synapsen udelukkes. Når tærsklen er for eftergivende, kan baggrundsstøj regnes som BRP-positive pletter (figur 1 - 2).
Til validate udførelsen af "Drosophila NMJ Morphometrics" makro blev tre mutante betingelser, der allerede var beskrevet at præsentere synaptiske defekter i forskellige NMJ parametre testet. Hver defekt blev påvist ved et andet billede segmentering udført med makro (NMJ omrids, skelet eller aktive zoner, henholdsvis 17). Efter at målrette de tre gener af interesse ved inducerbare RNAi og udfører dissektioner og NMJ immunfarvning af L3 larver, blev makroen køres. De opnåede NMJ morfologiske målinger blev derefter parvist (RNAi versus dets kontrol), sammenlignet under anvendelse af en t-test. I alle tre tilfælde blev fundet statistiske forskelle mellem mutanter og kontroller, der påvirker parametre, der er i overensstemmelse med de tidligere rapporterede morfologiske defekter. Dette bekræfter, at makroer er faktisk i stand til tilstrækkeligt at identificere tidligere beskrevne defekter på Drosophila NMJ.
Ankyrin 2 (Ank2, CG42734) mutanter er kendt for at vise synaptiske morfologi defekter, herunder fusionerede boutons og mindre NMJs. Disse defekter blev observeret for Ank2 mutanter 24, 25 og Ank2 knockdown fluer 26. NMJ klemmer pan-neuronale Ank2- RNAi knockdown fluer (vægt; UAS-Dicer-2 / UAS-Ank2 RNAi KK107238; elav-Gal4 / +) viste signifikant mindre NMJ område (middelværdi = 339,25 gm 2; t-test p = 2,18 x 10 -8) og omkreds (middelværdi = 238,24 um; t-test p = 1,82 x 10 -3), sammenlignet med den genetiske kontrol baggrund datasæt (vægt; UAS-Dicer-2 / UAS-KK60100; elav-Gal4 / + ) (middelværdi = 451,95 pm2 og middelværdi = 288,62 um henholdsvis) efter kører "Drosophila NMJ Morphometrics" (figur 6A & 4B).
GTPase Rab3a (CG7576) kræves for korrekt bruchpilot distribution og RUP mutanten præsenterer med en betydeligt reduceret af aktive zoner 27. Der blev iagttaget en signifikant fald i antallet af aktive zoner, når der måles BRP-positive foci af "Drosophila NMJ Morphometrics" makro i NMJ terminaler i pan-neuronale Rab3a knockdown fluer (vægt; UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi KK100787; elav -Gal4). Det gennemsnitlige antal aktive zoner pr NMJ terminal i Rab3a -RNAi var 138 i modsætning til 290 påvist i kontrol datasæt (/ +) t-test p = 4,43 x 10 -29) (figur 6A & 4C).
Highwire (HIW, CG32592) er en vigtig regulator af NMJ vækst; mutationer i HIW genet fører til at vokse og udvides forgrening af de NMJ terminaler 28. Måling NMJ terminaler i pan-neuronal HIW -RNAi knockdown linje (w; UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi-GD36085; elav-Gal4 / +) med "Drosophila NMJ Morphometrics", blev der observeret signifikante forskelle i skelettet-afledte parametre: længde (middelværdi = 147,36 um; kontrol middel = 122,07 um; t -test p = 7,31 x 10 -7), længste gren længde (middelværdi = 122,19 um; kontrol middel = 105,65 um; t-test p = 4,62 x 10 -4) antal grene (middelværdi = 7,69; styre middelværdi = 5,74; t-test p = 2,52 x 10 -2) og antallet af forgreningspunkter (middelværdi = 2,73; styre middelværdi = 1,79; t-test p = 3,31 x 10 -2). Alle disse parametre blev signifikant forøget (120 - 180%) sammenlignet med de genetiske baggrundskontroller (w; UAS-Dicer-2 / UAS-GD60000; elav-Gal4 / +) (figur 6A & 4D).
Figur 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics Måler 9 parametre i Drosophila NMJ. Til venstre er Dlg-1 og BRP immunmærket NMJ terminaler, afbildes på et fluorescensmikroskop med ApoTome. Til højre er resultatet billeder efter at have kørt "Drosophila NMJ Morphometrics". Parametre areal, omkreds og boutons er repræsenteret ved makro-kommenteret gul omrids angivet. Parametre længde, længste gren længde (LBL), grene, forgrening punkter og øer er fremlagt af makro-kommenteret blå omrids. BRP-immunmærket foci (aktive områder) er repræsenteret ved makro som hvide pletter i resultatet billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Drosophila NMJ Bouton Morphometrics Måler 8 parametre i Drosophila NMJ. Til venstreer SYT-1 og BRP immunmærket NMJ terminal, afbildes på et fluorescensmikroskop med ApoTome. Til højre er resultatet billeder efter at have kørt "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Parametre boutons og bouton område er repræsenteret ved makro-kommenteret gul omrids. Parametre længde, længste gren længde (LBL), grene, forgrening punkter og øer er fremlagt af makro-kommenteret blå omrids. BRP-immunmærket foci (aktive områder) er repræsenteret ved makro som hvide pletter i resultatet billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flowdiagram Representing Drosophila NMJ Morphometrics og Drosophila NMJ Bouton Morphometrics makroer. Det første sub-makro "Konverter to stak" skaber fremspring og hyperstacks af de afbildede NMJs. Det andet sub-makro 'Definer ROI' kræver manuel input, som definerer placeringen af NMJ terminal af interesse. Sub-makro tre, 'Analyser', måler alle NMJ parametre. En tekst fil, der indeholder de kvantitative værdier og et resultat billedfil viser parameter afgrænsning er skabt til at hjælpe brugeren vurdering af makro ydeevne. Når billeder er erhvervet under forskellige betingelser, de makroindstillinger skal testes og justeres for at sikre nøjagtig analyse. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempler på Uhensigtsmæssige Makro Segmentering Resultater. Søgningen billeder efter at have kørt "Drosophila NMJ Morphometrics" eller 'Drosophila NMJ Bouton Morphometrics'. Dele af den synaptiske terminal er ikke inkluderet i den gule omrids (A). Dele af baggrunden er inkluderet i den synaptiske terminal af den gule omrids (B). Blå skelet linje strækker sig ud over . detekteres - (D C) for mange aktive zoner (E - E ') synaptiske terminal. Nogle aktive zoner forbliver uopdaget af analysen (G - G'). aktive zoner detekteres uden synapsen (F) Forkert bouton segmentering. (gælder kun, når der køres Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons udebliver (H) eller for mange boutons detekteres af segmentering (i). Partikler sådan krystaller eller støv, som er en del af baggrunden er inkluderet i segmentering (J) . Information, hvordan du ændrer indstillinger for at undgå disse fejl findes i tabel 3 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempler på Makro-indstilling Justeringer og deres konsekvenser for Billede segmentering. (A) Træk preview-baggrund af en Dlg-1 immunmærket synapse, afbildes på et fluorescensmikroskop med ApoTome, når "Rullende kugle radius" er indstillet til 20 (A) eller 500 (A'). (B) Output billeder opnået efter at have kørt Billede | Juster | Auto-Threshold | Prøv alle billedet illustrerer billedfiler segmentations opnået af de 16 forskellige auto-tærskel algoritmer. (C) "Find Maxima" preview ved opsætning "Støj tolerance" ved 50 (C) og 500 (C'); active zoner, som registreres af segmenteringen mærkes af et lille kors. (D) Måling af de "små partikler", i baggrundsbilledet af en synapse immunolabeled med anti-HRP, afbildes på et konfokalt mikroskop. (E) "Sum skiver" projektion opnået fra 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Tærsklen er fastsat til 400 (E) og ved 50 (E'). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Makro Vurdering og Kvantificering af NMJs på Muscle 4. (A) Søgningen billeder efter kører "Drosophila NMJ Morphometrics" makro på Dlg-1 og BRP immunmærket NMJ terminaler. Parametre areal, omkreds og boutons er repræsenteret ved den makro-kommenteret gul omrids. Parametre længde, længste gren længde (LBL), grene, forgrening punkter og øer er fremlagt af makro-kommenteret blå omrids. BRP-immunmærket foci (aktive områder) er repræsenteret ved makro som hvide pletter i resultatet billeder. Skalalinjen angiver 20 pm. (B) Ankyrin2 RNAi knockdown udviser et mindre NMJ areal og omkreds i forhold til genetiske baggrundskontroller. (C) Rab3a knockdown resulterede i NMJs med et lavere antal BRP-positive aktive zoner sammenlignet med genetiske baggrundskontroller. (D) Highwire knockdown resulterede i længere tid, højere længste gren længde, mere forgrenet og med mere forgreningspunkter pr NMJ terminaler sammenlignet med genetiske kontrol baggrund NMJs. Fejlsøjler angiver SEM, ** p <0,01, tohalet t-test. Klik hanre for at se en større version af dette tal.
| Parameter | NMJ struktur | Forklaring |
| Samarbejdsområde (pm2) | NMJ skitse | Det område af komplette mærket NMJ |
| Omkreds (um) | NMJ skitse | Omkredsen tilhører området |
| #Boutons | NMJ skitse | Antallet af synaptiske boutons ( 'perler på en snor') af NMJ |
| Længde (um) | Skelet | Den samlede længde af det komplette NMJ terminal |
| Længste gren længde (um) | Skelet | Summen af længden af den længste kontinuerlig vej tilslutning af to endepunkter NMJ |
| #Afdelinges | Skelet | Det samlede antal af filialer |
| #Branching punkter | Skelet | Antallet af forgrening punkter (flere grene kan stamme fra et forgreningspunkt) |
| #Islands | Skelet | Antallet af ikke-forbundne Dlg1-positive synaptiske rum (eller enhver anden farvning) |
| #Active zoner | BRP-positive pletter | Antallet af aktive zoner, baseret på BRP farvning |
Tabel 1: NMJ parametre målt ved "Drosophila NMJ Morphometrics". De NMJ parametre målt ved "Drosophila NMJ Morphometrics" makro vises som en liste i den opnåede tekstfil, efter den er beskrevet i denne tabel rækkefølge. Denne tabel er genoptrykt fra Nijhof et al. 17
| Parameter | NMJ struktur | Forklaring |
| Boutons | NMJ skitse | Antallet af synaptiske boutons ( 'perler på en snor') af NMJ |
| Bouton område | NMJ skitse | Det samlede areal af alle boutons |
| Længde (um) | Skelet | Den samlede længde af det komplette NMJ terminal |
| Længste gren længde (um) | Skelet | Summen af længden af den længste sammenhængende sti, der forbinder to vilkårlige endepunkter af NMJ |
| #Grene | Skelet | Det samlede antal af filialer |
| #Branching punkter | Skelet | the antal forgreningspunkter (flere grene kan stamme fra et forgreningspunkt) |
| #Islands | Skelet | Antallet af ikke-forbundne Dlg1-positive synaptiske rum (eller enhver anden farvning) |
| #Active zoner | BRP-positive pletter | Antallet af aktive zoner, baseret på BRP farvning |
Tabel 2: NMJ parametre målt ved "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". De NMJ parametre målt ved "Drosophila _Bouton_NMJ_Morphometrics" makro vises som en liste i den opnåede tekstfil, efter den er beskrevet i denne tabel rækkefølge. Denne tabel er genoptrykt fra Nijhof et al. 17
| Segmentering | Eksempel | Nødvendige justeringer | ||
| NMJ areal og omkreds (Repræsenteret af gul omrids i resultat billede) | Dele af den synaptiske terminal er enten ikke inkluderet i den gule omrids eller dele af baggrunden er inkluderet i den synaptiske terminal skitseret i gul. | Figur 5A-B | Juster 'Rolling Ball Radius' værdi. Se afsnit 6.1. | Juster 'NMJ skitse tærskel'. Se afsnit 6.2. |
| NMJ længde parametre (Repræsenteret af blå skelet linje i resultater billede) | Blå skelet linje enten strækker sig ud over eller ikke er til stede langs hele synaptiske terminal. | Figur 5C-D | Juster 'Rolling Ball Radius' værdi. Se afsnit 6.1. | Juster 'NMJ skitse tærskel'. Se afsnit 6.2. | </ Tr>
| BRP-positiv puncta (Repræsenteret af prikker i resultaterne billede) | For mange aktive zoner detekteres. | Figur 5E-E' | Reducer 'Find maksima støj tolerance' værdi. Se afsnit 6.5. | |
| BRP-positiv puncta (Repræsenteret af prikker i resultaterne billede) | Aktive zoner er savnet af analysen. | Figur 5G-G' | Øg 'Find maksima støj tolerance' værdi. Se afsnit 6.5. | Formindsk 'BRP-puncta lavere tærskel'. Se afsnit 6.6. |
| BRP-positiv puncta (Repræsenteret af prikker i resultaterne billede) | detekteres aktive zone artefakter uden for den synaptiske terminal. | Figur 5F | Juster 'Aktiv zone tærskel' afsnit 6.2. | Øg 'BRP-puncta lavere tærskel'. Se afsnit 6.6. |
| små partikler | Partikler sådan krystaller eller støv, der er en del af baggrunden synes at indgå i segmentering. | Figur 5J | Marker boksen 'Fjern små partikler'. Se afsnit 6.3. | Bestemme små partikler maksimale størrelse. Se afsnit 6.3. |
| Bouton segmentering | Forkert bouton segmentering (Gælder kun for Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; brug ikke Drosophila NMJ Morphometrics for bouton segmentering). | Figur 5H-I | Juster 'NMJ skitse tærskel'. Se afsnit 6.1. | Bestem 'minimum bouton størrelse'. Se afsnit 6.4. |
Tabel 3: Fejlfinding Guide for de forskellige typer af fejl i Billede Segmentering, der kan produceres af makroer. Denne tabel beskriver forskellige former forbillede segmentering fejl produceret af makroer. Disse kan nemt påvises i resultaterne billeder. Eksempler på hver fejltype er vist i figur 4. I "justeringer afsnittet" af bordet, bliver de indstillinger, der skal justeres fremhævet, og brugeren henvises til det kritiske sub-trin i afsnit 6, der beskriver, hvordan man justere disse indstillinger.
Discussion
"Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" er stærke værktøjer til forskere interesseret i at evaluere synapse morfologi. Manuel vurdering af NMJ parametre er besværlig; det skønnes, at makroerne ville spare en erfaren forsker op til 15 min / NMJ brugt på manuel billede segmentering. Med en til to snesevis af synapser evalueret pr tilstand eller genotype, dette hurtigt opsummerer til betydelige mængder af sparet tid, selv i studier i lille målestok. Når der udføres store skærme, gevinsten ved at anvende high throughput analyse, i forhold til manuel vurdering og kvantificering, kan være enorme. Ud over øget kapacitet, makroerne let tilvejebringe objektiv analyse; de udelukker personlige fordomme, der ellers kræver blindede eksperimenter samt interpersonelle forskelle, der opstår, når flere forskere er involveret i analysen. Endelig makroerne giver en følsom og præcis enANALYSE af NMJ funktioner, som muliggør identifikation af synaptiske regulatorer, der forårsager temmelig subtil end dramatiske NMJ defekter og har hidtil ligget unappreciated af forskeren øje. Detaljerede oplysninger om validering procedurer og algoritmer anvendes i makroer findes i publikationen Nijhof et al. 17.
Funktionaliteten af makroer er valideret på passende måle morfologiske træk af Drosophila melanogaster NMJs på muskel 4. Efterfølgende blev det påvist, at makroerne var også velegnet til at analysere synapser på andre muskler i denne organisme. Det er sandsynligt, at makroerne også kan anvendes til at måle morfologiske parametre af NMJ med lignende struktur i andre arter, herunder andre Drosophila arter og yderligere insekter. Selv NMJs meget fjerne i evolutionen, f.eks NMJs af mus, viser en helt lignende strukturel kropsbygning 29. De makroer er ikke blevet testet på NMJ præparater fra andre arter, men potentielle brugere opfordres til at teste de makroer til sådanne formål.
Det er meget vigtigt, at brugeren udforsker de forskellige auto-tærskler og algoritmer til at definere / vælge de bedst egnede makroindstillinger for billederne. Med disse indstillinger, opnås en nøjagtighed på ca. 95%, når makro vurdering blev sammenlignet med manuel evaluering. Justering af makroindstillinger til korrekt segment 100% af billederne kan være en meget besværlig eller endog umulig procedure. Derfor udelukkelse af billederne ikke er ordentligt segmenteret anbefales, hvis deres antal er under 5%. Åbenbart, hvis kvaliteten af billederne er lavt, vil makroerne generere højere forhold mellem utilfredsstillende billede segmentations. billeder af lav kvalitet vil ligeledes have indflydelse manuel evaluering og kan derfor ikke være knyttet til udførelsen af makroer. Ikke desto mindre makroerne er temmelig robust som de var designet til billedets genereres på et højt indhold mikroskop (en automatiseret fluorescensmikroskop, der tillader billeddannelse af et stort antal prøver) 17.
Et kritisk punkt er, at brugeren visuelt inspicerer alle resultat billeder genereret af makroer. Dette vil gøre det muligt at opdage og udelukke billeder med utilfredsstillende segmentering. I afsnit 6 i denne protokol, føres brugeren, hvordan du justerer indstillingerne for rigtige billede segmentering, når du kører sub-makro "Analyze". Hvis du hurtigt fortrolig med kravene i de makroer og hvordan du justerer makroindstillinger en mappe kaldet "Examples_adjusting makroindstillinger" er inkluderet i den makro repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Tretten undermapper, hver med eksempler billeder opnået ved forskellige mikroskop platforme (højt indhold / konfokal / fluorescensmikroskoper) og forskellige immunfarvninger er tilvejebragt. En PDF titlen ”Eksempler guide” er inkluderet i den sammemappe, hvor de nødvendige indstillinger for hvert eksempel er forudsat, sammen med et tekstdokument giver de forventede resultater og resultater billeder.
De makroer var designet til at behandle billeder gemt som .tiff adskilte filer, ikke desto mindre nogle brugere kunne have reddet deres billeder i et andet format. Følgende hjemmeside https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 indeholder en mappe med navnet "Drosophila NMJ", hvor tre eksempler på filer (eksempel 1 - 3) og dokumentet "Eksempler Guide" med detaljerede instruktioner hvordan at importere billeder ind i makroen hvis ikke gemmes som .tiff adskilte filer kan også findes i den samme mappe.
Sammen "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" makroer kvantificere ti forskellige NMJ funktioner: NMJ område, NMJ perimeter, antal boutons, NMJ bouton område, NMJ længde, NMJ længste gren længde, antal islaNDS, antal afdelinger, antallet af forgreningspunkter og antallet af aktive zoner. Dette giver en stor fordel i forhold til hidtil tilgængelige værktøjer, der kan vurdere kun en eller nogle få synaptiske funktioner 30, 31. Multiparametric kvantitativ analyse bærer stort potentiale for nye opdagelser, for eksempel til at identificere nye regulatorer, der styrer en op til mange aspekter af synapse biologi. Det giver også den krævede opløsning for at bestemme gener, coregulate nøjagtig de samme eller overlappende NMJ funktioner og således kan forventes at operere i offentlige molekylære veje. Endelig åbner mulighed for at undersøge, hvordan forskellige synaptiske parametre korrelerer med hinanden i uberørte forhold 17 og hvilke gener sikrer sådanne samordnede morfometriske korrelationer.
Tilsammen denne protokol illustrerer, hvordan man bruger de to makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", som udfører objektiv og følsomme kvantificering af ti morfologiske NMJ funktioner i en high-throughput måde.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender Wien Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila lager centre (NIH P40OD018537) for at give Drosophila-stammer. Vi takker Jack Fransen fra mikroskopisk Imaging Center for ekspertbistand i billedbehandling. Denne undersøgelse blev støttet af VIDI og TOP tilskud (917-96-346, 912-12-109) fra Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO), ved to DCN / Radboud University Medical Centre ph.d.-stipendier, af den tyske mental retardering Netværk finansieret af NGFN + -programmet af det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF) og af den Europæiske Unions FP7 stor skala integrerede netværk Gencodys (SUNDHED-241995) til AS. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
- Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
- van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
- Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
- Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
- Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
- Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
- Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
- Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
- Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
- Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
- Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
- Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
- Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
- Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
- Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
- Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902 (2013).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
