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Neuroscience

के उच्च throughput और मल्टी पैरामीट्रिक मात्रा के लिए दो एल्गोरिदम Published: May 3, 2017 doi: 10.3791/55395
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 3,4, 3, 2,5, *1
1Department of Human Genetics, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center, 2Microscopical Imaging Centre (MIC), Radboud University Medical Center, 3Department of Biology, Universidad Autónoma de Madrid, 4Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 5Department of Pathology, Radboud University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

दो छवि विश्लेषण एल्गोरिदम, "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" और "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" बनाया गया था, स्वचालित रूप से ड्रोसोफिला neuromuscular जंक्शन (NMJ) के नौ रूपात्मक सुविधाओं अंदाजा लगाना।

Abstract

Synaptic आकृति विज्ञान कसकर synaptic प्रभावकारिता से संबंधित है, और कई मामलों में रूपात्मक अन्तर्ग्रथन दोष अंततः अन्तर्ग्रथनी खराबी के लिए सीसा। ड्रोसोफिला लार्वा neuromuscular जंक्शन (NMJ), ग्लूटामेटरगिक synapses के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल, बड़े पैमाने पर दशकों से अध्ययन किया गया है। NMJ रूपात्मक दोष के कारण उत्परिवर्तन की पहचान जीन है कि अन्तर्ग्रथन विकास और समारोह को विनियमित के एक प्रदर्शनों की सूची का पता चला। इनमें से कई बड़े पैमाने पर अध्ययन है कि ड्रोसोफिला NMJ की रूपात्मक असामान्यताएं पता लगाने के लिए गुणात्मक दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित में पहचान की गई। गुणात्मक विश्लेषण के एक दोष यह है कि कई सूक्ष्म NMJ आकृति विज्ञान के लिए योगदान दे खिलाड़ियों की संभावना किसी का ध्यान नहीं रहने के है। जबकि मात्रात्मक विश्लेषण सूक्ष्म रूपात्मक अंतर का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं, इस तरह के विश्लेषण नहीं अभी तक आमतौर पर किया जाता है क्योंकि वे श्रमसाध्य कर रहे हैं। यह प्रोटोकॉल विस्तार दो छवि विश्लेषण एल्गोरिदम में वर्णन "ड्रोसोफिला ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति ", फिजी संगत मैक्रो, ड्रोसोफिला NMJ की, मात्रात्मक सटीक और उद्देश्य morphometric विश्लेषण के लिए के रूप में उपलब्ध। यह पद्धति NMJ टर्मिनलों आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्कर के साथ immunolabeled विश्लेषण करने के लिए विकसित की है Dlg -1 और । BRP इसके अतिरिक्त, एचआरपी, सीएसपी और Syt के रूप में अन्य मार्करों के लिए इसके व्यापक आवेदन इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है मैक्रो नौ रूपात्मक NMJ सुविधाओं का आकलन कर रहे हैं:। NMJ क्षेत्र, NMJ परिधि, BOUTONS के नंबर, NMJ लंबाई, NMJ सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई, द्वीपों की संख्या, शाखाओं की संख्या, शाखाओं में अंक और NMJ टर्मिनल में सक्रिय क्षेत्रों की संख्या की संख्या।

Introduction

इस तरह के बौद्धिक विकलांगता, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और एक प्रकार का पागलपन के रूप में संज्ञानात्मक विकारों अक्सर असामान्य अन्तर्ग्रथनी समारोह 1, 2, 3 की विशेषता है। अन्तर्ग्रथन आकृति विज्ञान और समारोह कसकर गुंथी होती हैं; रूपात्मक दोष अन्तर्ग्रथनी खराबी पैदा कर सकता है और, विपरीत, असामान्य अन्तर्ग्रथनी संचरण अन्तर्ग्रथनी परिपक्वता और आकृति विज्ञान 4, 5, 6 को प्रभावित करेगा।

मॉडल जीवों की संख्या बेहतर अन्तर्ग्रथन जीव विज्ञान को समझते हैं और कैसे synaptic परिवर्तन स्वास्थ्य और रोग 7, 8, 9 में मस्तिष्क समारोह को प्रभावित पर प्रकाश डाला में नियोजित किया गया है। ड्रोसोफिला NMJ एक बड़े पैमाने पर अध्ययन किया जाता है और ग्लूटामेटरगिक एसवाई के लिए विवो मॉडल में अच्छी तरह से स्थापितnapse जीव विज्ञान 10, 11। पिछले दशकों में, इस मॉडल NMJs के बीच रूपात्मक अंतर का पता लगाने के लिए शारीरिक और जीन केंद्रित अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन के लिए, उद्देश्य के साथ। विशेष रूप से, आगे आनुवंशिक स्क्रीन कई महत्वपूर्ण नियामकों और तंत्र अन्तर्ग्रथन विकास अंतर्निहित पहचान की है और कार्य करते हैं 12, 13, 14, 15, 16 है। हालांकि, इन स्क्रीन के सबसे NMJ टर्मिनल आकृति विज्ञान के दृश्य आकलन पर और synaptic असामान्यताओं के गुणात्मक का पता लगाने या कुछ रूपात्मक सुविधाओं के अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग पर भरोसा किया। एक परिणाम के रूप में, बल्कि सूक्ष्म अन्तर्ग्रथनी रूपात्मक असामान्यताएं कि मानव आँख करने के लिए गैर स्पष्ट हैं आसानी से याद किया जाता है। आदेश में व्यापक मात्रात्मक मतभेद, पता लगाने के लिए सक्षम होने के लिएNMJ सही रूप में ब्याज की रूपात्मक मानकों के व्यवस्थित मात्रा द्वारा मूल्यांकन किया जाना है। NMJ सुविधाओं मापने मैन्युअल श्रमसाध्य है, खासकर जब वहाँ हित के कई NMJ सुविधाओं और / जब बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रदर्शन या हो रहा है,। आदेश multiparametric, उच्च प्रवाह क्षमता रूपात्मक विश्लेषण का समर्थन करने के उद्देश्य और मात्रा प्राप्त करने के लिए, दो मैक्रो "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" और "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" 17 विकसित किए गए। दोनों मैक्रो खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी 18 में चलाते हैं, और दोनों कोंफोकल और nonconfocal छवियों यों कर सकते हैं।

"ड्रोसोफिला NMJ आकृति" उपायों पोस्टअन्तर्ग्रथनी मार्कर डिस्क बड़े-1 (Dlg -1) या प्रीसानेप्टिक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के साथ immunostained NMJ टर्मिनल, सक्रिय क्षेत्र मार्कर bruchpilot (BRP) के साथ सह-लेबल। यह नौ रूपात्मक parame quantifiesमंत्रियों (आगे नीचे वर्णित): NMJ क्षेत्र, NMJ परिधि, BOUTONS के नंबर, NMJ लंबाई, NMJ सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई, द्वीपों की संख्या, शाखाओं की संख्या, शाखाओं में अंक और synaptic टर्मिनल में सक्रिय क्षेत्रों की संख्या की संख्या (चित्रा 1) । हालांकि BOUTONS के नंबर निर्धारित करने के लिए एक एल्गोरिथ्म इस मैक्रो में मौजूद है, यह सटीकता 17 के लिए मानदंडों को पूरा नहीं किया। ठीक से BOUTONS के नंबर का आकलन करने के लिए, यह "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" मैक्रो, जो विशेष रूप विरोधी Synaptotagmin (Syt) या विरोधी सिस्टीन स्ट्रिंग प्रोटीन (CSP) द्वारा immunostained NMJ तैयारी का उपयोग कर BOUTONS यों लिए बनाया गया है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, और BRP के साथ सह-immunolabeled। "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" मैक्रो quantifies निम्नलिखित मानकों: NMJ bouton क्षेत्र और सक्रिय zo की BOUTONS के नंबर, NMJ लंबाई, NMJ सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई, द्वीपों की संख्या, शाखाओं की संख्या, शाखाओं में अंकों की संख्या संख्याएनईएस (चित्रा 2)।

मैक्रो 3 उप मैक्रो से मिलकर बनता है: (I) "ढेर कन्वर्ट" सभी उपलब्ध छवि फ़ाइलों को दिखाता है और बनाता है जेड hyperstacks और दोनों चैनलों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों। उत्पादन के रूप में, इस मैक्रो "stack_image_name" और "flatstack_image_name" कहा जाता है अन्तर्ग्रथन प्रति दो नई फ़ाइलें उत्पन्न होगा। द्वितीय) "लागत पर लाभ को परिभाषित करें" लगातार सभी अधिकतम प्रक्षेपण छवियों "flatstack_image_name" खोलने के लिए और उन्हें अनुरोध मैन्युअल रूप से ब्याज (आरओआई) है, जिसमें ब्याज की विशिष्ट synaptic टर्मिनल मौजूद है के क्षेत्र को परिभाषित करने के साथ पेश करेंगे। इस आसन्न मांसपेशियों और / या (जैसे 1s के रूप में) अन्तर्ग्रथनी टर्मिनलों के अन्य प्रकार है कि छवियों 11 में मौजूद हो सकता है से कनेक्ट कर synapses के बहिष्कार अनुमति देने के लिए लागू किया गया था। (Iii) "विश्लेषण" पूरी तरह से लागत पर लाभ की सीमाओं के भीतर छवियों के सभी क्षेत्रों के लिए विश्लेषण स्वचालित लागू होता है। जैसा"Results.txt" जहां सभी संख्यात्मक माप एनोटेट किया जाएगा और एक "res_image_name.tif" जहां मैक्रो द्वारा उत्पादित अंतर्निहित छवि के सेगमेंटेशन सचित्र किया जाएगा: इस कदम का एक परिणाम, उपयोगकर्ता दो नई फ़ाइलें प्राप्त करेंगे। NMJ रूपरेखा, NMJ कंकाल, और BRP पॉजिटिव सक्रिय क्षेत्रों की संख्या: छवि विश्लेषण के दौरान तीन संरचनाओं प्रत्येक synaptic टर्मिनल से हुआ है। NMJ रूपरेखा NMJ क्षेत्र और इसके परिधि निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और बाद में एक वाटरशेड जुदाई BOUTONS के नंबर प्रदान करता है। कंकाल से, पांच NMJ सुविधाओं निष्कर्ष निकाला जाता है: कुल NMJ लंबाई, सबसे लंबे समय तक निरंतर किसी भी दो अंतिम बिंदुओं को जोड़ने पथ की लंबाई की राशि (सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई), NMJ प्रति असंबद्ध डिब्बों की संख्या ( "द्वीप" के रूप में भेजा ), शाखाओं की संख्या, और शाखाओं अंक (एक शाखाओं बिंदु तीन या अधिक शाखाओं जोड़ता है) की संख्या। सक्रिय क्षेत्रों की संख्या की गणना BRP चैनल में निर्धारित किया जाता हैBRP पॉजिटिव स्पॉट। एनोटेट NMJ रूपरेखा (पीली लाइन), NMJ कंकाल (नीली रेखा), और BRP पॉजिटिव सक्रिय क्षेत्र (सफेद फोकी द्वारा इंगित) की संख्या एक परिणाम चित्र में दिखाई देते हैं और मापदंडों का माप एक करने के लिए कार्रवाई की जाती है (। txt) आउटपुट फ़ाइल (चित्रा 3)।

ड्रोसोफिला NMJ आकृति "और" ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति "पहले वर्णित किया गया और बड़े पैमाने पर Nijhof एट अल। 17 द्वारा मान्य। यह पांडुलिपि कार्यप्रणाली पर केंद्रित मैक्रो का उपयोग कर NMJ आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए" ड्रोसोफिला NMJ आकृति "और" ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति "। फिर भी, मैक्रो की मदद से विश्लेषण करने से पहले, NMJ विच्छेदन और immunostainings प्रदर्शन किया जा करने की जरूरत है। ये महत्वपूर्ण कदम हैं, और इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए इस्तेमाल किया मार्करों के संयोजन मैक्रो विश्लेषण के लिए उपयुक्त की जरूरत है। ये कदम संक्षेप में उल्लेख कर रहे हैं में सेइस प्रोटोकॉल के ction 1 और प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन कर इन प्रक्रियाओं पर अमल के लिए संदर्भ के लिए उपयोगकर्ता प्रत्यक्ष।

Protocol

1. इमेज प्रोसेसिंग करने से पहले आवश्यकताओं

  1. तीसरे इनस्टार भटक लार्वा (एल 3) की ड्रोसोफिला खुली किताब की तैयारी, जैसा कि पहले 19 में वर्णित निष्पादित करें।
  2. सह immunolabel दो मार्कर के संयोजन का उपयोग ड्रोसोफिला NMJ टर्मिनलों: Dlg -1 या एचआरपी एक साथ एक साथ "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" 20 के साथ विश्लेषण के लिए "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" के साथ विश्लेषण के लिए BRP, और Syt या सीएसपी के साथ BRP साथ।
    नोट: एक ही प्रजाति से एंटीबॉडी ऐसे Zenon एलेक्सा लेबलिंग किट 17 के रूप में एक एंटीबॉडी संयुग्मन किट के साथ पूर्व लेबलिंग एक करके जोड़ा जा सकता है।
  3. छवि NMJ टर्मिनलों विकल्प है, जैसे, प्रतिदीप्ति (के साथ या बिना Apotome) या कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के एक खुर्दबीन के प्रयोग से।
    1. NMJ टर्मिनल के एक 2-चैनल छवि ढेर प्राप्त।
      1. एक तरीके से माइक्रोस्कोप सेटिंग्स समायोजित करें कि चैनल 1NMJ टर्मिनल NMJ टर्मिनल BRP के साथ immunolabeled 2 Dlg -1 (या एचआरपी, Syt, CSP) और चैनल के साथ immunolabeled प्राप्त कर लेता है।
      2. वैकल्पिक रूप से, मैक्रो के साथ (एक एंटीबॉडी के साथ immunolabeled synapses के) एक चैनल वाले चित्रों का विश्लेषण। छवि NMJs "ड्रोसोफिला NMJ आकृति", या Syt या सीएसपी "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति के लिए" के साथ विश्लेषण के लिए Dlg -1 या एचआरपी साथ विशिष्ट immunolabeled।
        नोट: यह केवल विरोधी BRP के साथ immunostained synapses विश्लेषण करने के लिए संभव नहीं है।
    2. अलग-अलग '.tiff फ़ाइलों के रूप में प्राप्त चित्रों में निर्यात करें। चैनल आदेश मैक्रो चल रहा है, तो के रूप में इंगित नहीं प्राप्त कर लिया करने से पहले उलट।

2. सॉफ्टवेयर आवश्यकताओं और स्थापना

  1. निम्नलिखित वेबसाइट से "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" और "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति": मैक्रो डाउनलोड https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
  2. फ़ोल्डर "मैक्रो अद्यतन 1" के लिए कर्सर ले जाएँ, और प्रदर्शित होने के विकल्प "देखें" पर क्लिक करें। इस फ़ोल्डर की सामग्री के साथ एक सूची दिखाई देगी। फ़ोल्डर मैक्रो "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" और "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" में शामिल है।
    नोट: दोनों मैक्रो फिजी संस्करणों 1.4 है, जो भी एक ही फ़ोल्डर में प्रदान की जाती है के साथ संगत कर रहे हैं। मैक्रो हाल के संस्करण पर नहीं चल सकते हैं। कृपया प्रदान की संस्करण 1.4 का उपयोग करें। यह एक और अधिक हाल फिजी संस्करण उपलब्ध के साथ इस संस्करण शुरू करने के लिए unproblematic है, यहां तक ​​कि कंप्यूटर पर।
  3. पर "सभी डाउनलोड" पर क्लिक करें। फ़ोल्डर सामग्री .zip फ़ाइल के रूप कंप्यूटर पर डाउनलोड कर दिया जाएगा। डाउनलोड की गई फ़ाइल अनज़िप।
  4. Fiji.app/plugins/ निर्देशिका के लिए ड्रोसोफिला _NMJ_Morphometrics.ijm और ड्रोसोफिला _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ। जब कार्यक्रम को पुन: प्रारंभ, मैक्रोज़ प्लगइन्स के निचले भाग में दिखाई देगाड्रॉप डाउन मेनू।

3. भागो उप मैक्रो जेड अनुमानों और NMJ छवियाँ की Hyperstacks बनाने के लिए "स्टैक में बदलें"

  1. टूलबार में प्लगइन्स का चयन करके ग्राफिकल इंटरफेस शुरू करें और ड्रॉप-डाउन मेनू में "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" चुनें।
  2. मैक्रो का ग्राफिकल इंटरफेस में "अद्वितीय फ़ाइल स्ट्रिंग" सेटिंग को परिभाषित करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर जब व्यक्ति '.tiff फ़ाइलों के रूप में ढेर भंडारण विमानों और चैनलों को व्यवस्थित करने के एक पहचान हस्ताक्षर का उपयोग करता है। दर्ज की गई अद्वितीय फ़ाइल स्ट्रिंग सेटिंग हस्ताक्षर सॉफ्टवेयर के द्वारा पहले चैनल के पहले विमान को सौंपा निर्दिष्ट करने के लिए की जरूरत है (महत्वपूर्ण: न्यूनतम विमान और चैनल संख्या की जरूरत संकेत दिया जा करने के लिए)।
  3. केवल उप मैक्रो और क्लिक करें "ठीक है" और फ़ोल्डर है जहाँ छवियों स्थित हैं चुनें "ढेर कन्वर्ट" चुनें। कई सबफ़ोल्डर के साथ एक मुख्य निर्देशिका चुना जाता है, सभी अलग-अलग '.tiff भीतर फाइलेंमुख्य निर्देशिका और सबफ़ोल्डर अद्वितीय फ़ाइल स्ट्रिंग मापदंड से मेल खाने कार्रवाई की जाएगी।
    1. z के ढेर केवल एक चैनल शामिल हैं, तो बॉक्स "चैनल 1 केवल" का चयन करें।
  4. ध्यान दें कि NMJ छवि प्रति दो नई फ़ाइलें, डिफ़ॉल्ट रूप से stack_image_name के रूप में कहा और flatstack_image_name दिखाई देगा। केवल आगे के विश्लेषण के लिए इन ढेर और flatstack संग्रहित करें। .tiff फ़ाइल श्रृंखला इस बिंदु पर हटाया जा सकता है, के लिए आवश्यक भंडारण क्षमता को कम करने और संभावित त्रुटि स्रोतों से परहेज।

4. भागो उप मैक्रो रुचि के NMJ टर्मिनल चित्रित करने के लिए "लागत पर लाभ को परिभाषित करें"

  1. "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" के ग्राफिकल इंटरफेस शुरू करो।
  2. "लागत पर लाभ को परिभाषित करें" और प्रेस "ठीक है" और जहां हकदार flatstack_name छवियों जमा हो जाती है और प्रेस "चुनें" मुख्य डायरेक्टरी का चयन केवल चेक बॉक्स चुनें। उप मैक्रो "लागत पर लाभ को परिभाषित करें" स्वचालित रूप से सभी उप-फ़ोल्डर के माध्यम से खोजचयनित मुख्य निर्देशिका के भीतर।
  3. पहले प्रक्षेपण खोलता है टूलबार में "मुक्तहस्त चयन" उपकरण का चयन करें। का उपयोग करते हुए माउस एक चयन है कि विशेष रूप से ब्याज की पूरी NMJ टर्मिनल होता है आकर्षित और खिड़की "टर्मिनल को परिभाषित करें" में "ठीक" क्लिक। मैक्रो अगले प्रक्षेपण के साथ आगे बढ़ना होगा।
  4. अगले आरओआई चित्रित करना और दोहराने जब तक सभी ROI को परिभाषित कर रहे हैं। लागत पर लाभ छवि फ़ाइल, "roi_image_name" नाम, संसाधित छवियों में से प्रत्येक के लिए पहले से उत्पन्न ढेर और प्रक्षेपण छवियों के रूप में एक ही निर्देशिका में संग्रहीत किया जाएगा। इस उप-मैक्रो के उत्पादन में एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर सफेद में लागत पर लाभ के एक द्विआधारी छवि है।

5. भागो उप मैक्रो "विश्लेषण" मात्रा ठहराना करने के लिए NMJ टर्मिनल विशेषताएं

  1. उपकरण पट्टी पर जाएँ, "प्लग इन" और उपयोग का चयन करें:
    "ड्रोसोफिला _NMJ_Morphometrics" जब विरोधी Dlg -1 या विरोधी एचआरपी (चैनल 1) के साथ immunolabeled synapses का विश्लेषण एक साथविरोधी BRP (चैनल 2), या "ड्रोसोफिला _NMJ_Bouton_Morphometrics" जब BRP साथ (चैनल 1) एक साथ विरोधी Syt या विरोधी सीएसपी के साथ immunolabeled synapses का विश्लेषण करने के साथ (चैनल 2)।
    1. एक चैनल छवि के ढेर का विश्लेषण किया जाए जब (संरचनात्मक चैनल Dlg -1 या एचआरपी "Drosophila_ NMJ_Morphometrics", या Syt या "ड्रोसोफिला _NMJ__Bouton_Morphometrics" के लिए सीएसपी के लिए), बॉक्स "चैनल 1 केवल" का चयन करें।
  2. पैमाने छवियों के लिए इसी समायोजित का विश्लेषण किया जाए। छवि में एक पिक्सेल 2.5 सुक्ष्ममापी से मेल खाती है, तो सुक्ष्ममापी = 2.5 में स्केल-पिक्सल = 1, स्केल-दूरी का संकेत मिलता है। मामले में दोनों सेटिंग 0 पर छोड़ दिया जाता है, NMJ क्षेत्र, परिधि, लंबाई और सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई पिक्सेल की संख्या में व्यक्त किया जाएगा।
  1. यदि आवश्यक हो, मैक्रो के डिफ़ॉल्ट विश्लेषण सेटिंग्स समायोजित करें। समायोजन केवल यदि उप मैक्रो "विश्लेषण" (असंतोषजनक परिणाम के साथ इस खंड, और देते प्रदर्शनधारा 6 में rmined बेहतर सेटिंग्स) रन हो गया है।
  2. चेक बॉक्स का चयन करें "का विश्लेषण करें" और "प्रतीक्षा करें" और "ओके" दबाएं।
    1. "प्रतीक्षा करें" चेक बॉक्स का चयन जब 2 चैनल वाले चित्रों पर उप मैक्रो "विश्लेषण" चल रहा है। अन्यथा सक्रिय क्षेत्र गिनती में त्रुटियों सीमित कंप्यूटर क्षमताओं की वजह से हो सकता है।
  3. एक नई विंडो के रूप में "चुनें कोई निर्देशिका" खोलता है, निर्देशिका, जहां चित्रों स्थित और प्रेस कर रहे हैं "का चयन करें" का चयन करें। मैक्रो यदि लागू हो, बाद में फ़ोल्डर (: stack_image_name, flatstack_image_name और roi_image_name पिछले उप मैक्रो को क्रियान्वित करने से तीन फ़ाइलों का उपयोग कर) मुख्य निर्देशिका में संग्रहीत सभी छवियों का विश्लेषण और, होगा। मैक्रो प्रक्रियाओं प्रत्येक छवि व्यक्तिगत रूप से और लगातार। यह (कंप्यूटर क्षमता के आधार पर) प्रति छवि ढेर में कई मिनट लग सकते हैं।
  4. मैक्रो चलाने के बाद, ध्यान दें कि एक नई छवि फ़ाइल से प्रत्येक के लिए नामित किया गया res_image_name विश्लेषण किया अन्तर्ग्रथन संग्रहीत बनाने की प्रक्रिया हो जाएगामाता पिता का फ़ोल्डर में टेड। मात्रात्मक मापन के रूप में "results.txt" फ़ाइल संग्रहीत किया जाएगा।
  5. का पता लगाने और विभाजन त्रुटियों के साथ चित्रों को बाहर करने के सभी परिणाम छवियों का निरीक्षण करें। संभावित विभाजन त्रुटियों तालिका 3 में वर्णित हैं, कैसे इन नाकाम करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करने के सलाह के साथ। इस तरह के विभाजन त्रुटियों के साथ परिणाम छवियों चित्र 4 में उदाहरण के रूप में प्रदान की जाती हैं।
    नोट: जब यूजर इंटरफेस में मनाया डिफ़ॉल्ट सेटिंग के साथ मैक्रो चल रहा है, वहाँ लगभग 95% की सटीकता था मैक्रो मूल्यांकन पुस्तिका मूल्यांकन 17 की तुलना में किया गया था जब।

6. छवियाँ करने के लिए मैक्रो सेटिंग समायोजित करें

  1. छवियों के 5% से अधिक विभाजन त्रुटियों दिखाई देती हैं, को परिभाषित / छवियों के लिए सबसे उपयुक्त मैक्रो सेटिंग्स का चयन करने के लिए विभिन्न एल्गोरिदम का पता लगाएं।
  2. रोलिंग गेंद त्रिज्या मूल्य समायोजित
    नोट: रोलिंग गेंद त्रिज्यासमारोह छवि की पृष्ठभूमि घटा देती है। इस समारोह महत्वपूर्ण महत्व का है जब प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर हासिल कर लिया छवियों के साथ काम कर रहा है और / या छवियों उच्च पृष्ठभूमि शोर है जब। पृष्ठभूमि के घटाव मैक्रो की स्वत: थ्रेशोल्डिंग चरणों में मदद NMJ टर्मिनलों की पर्याप्त विभाजन का उत्पादन करने होंगे।
    1. तीन NMJ जेड अनुमानों कि छवि डाटासेट के प्रतिनिधि हैं (उप-मैक्रो "ढेर कन्वर्ट" द्वारा उत्पन्न flatstack_image_name चित्र) का चयन करें।
    2. टूलबार में, चित्र का चयन करें | रंग | स्प्लिट चैनलों। दो छवियों बनाया जाएगा, एक चैनल 1 और अन्य चैनल 2 का प्रतिनिधित्व।
    3. केवल छवि 1 खुला चैनल, Dlg -1, एचआरपी, Syt या सीएसपी immunolabeling के लिए इसी, और छवि को बंद करके BRP चैनल छवि त्यागने से संबंधित रखें।
    4. ड्रॉप-डाउन मेनू में "प्रक्रिया" उपकरण पट्टी के बाद में "घटाना पृष्ठभूमि ..." का चयन करके फिल्टर "घटाना पृष्ठभूमि" चलाएँ।
    5. पॉप अप विंडो में पूर्वावलोकन चेकबॉक्स पर क्लिक करें और मूल्य है कि पैनल (चित्रा 5 ए ') के रूप में अन्तर्ग्रथन और पृष्ठभूमि के बीच विपरीत बढ़ाने के लिए रोलिंग गेंद त्रिज्या समायोजित करें।
      ध्यान दें: एक उदाहरण के लिए चित्रा 5 देखें। Figure5A में, अन्तर्ग्रथन के कुछ हिस्सों, पृष्ठभूमि के रूप में एक ही ग्रे स्तरों दिखा रहे हैं जबकि चित्रा 5 ए में ' "रोलिंग गेंद त्रिज्या" 500 करने के लिए सेट अन्तर्ग्रथन और पृष्ठभूमि के बीच एक मजबूत विपरीत उत्पन्न करता है।
    6. जब रोलिंग गेंद त्रिज्या के लिए उचित मान परिभाषित किया गया है, एक ही रोलिंग गेंद त्रिज्या मूल्य के साथ चयनित जेड अनुमानों पर "घटाना पृष्ठभूमि" एल्गोरिथ्म चलाने के लिए और उन्हें (किसी भी निर्देशिका में) को बचाने के।
      नोट: 8 बिट या आरजीबी छवियों के लिए रोलिंग गेंद त्रिज्या मूल्य छवि है कि पृष्ठभूमि का हिस्सा नहीं है में सबसे बड़ा पिंड की त्रिज्या के रूप में कम से कम के रूप में बड़े होना चाहिए। 16-बिट और 32-बिट छवियों के लिए त्रिज्या निवेश संबंधी निर्णय निर्माताओं किया जाना चाहिएersely पिक्सेल मूल्य रेंज 22 के लिए आनुपातिक।
  3. निर्धारित विभिन्न ऑटो थ्रेसहोल्ड कि उपयोग किया जाएगा
    1. पिछले चरण (6.2.6) में बचाया जेड अनुमानों खोलें और छवि का चयन करें | समायोजित करें | AutoThreshold | सभी की कोशिश करो।
    2. के रूप में एक द्विआधारी thresholded परिणाम छवि सभी विभिन्न ऑटो सीमा एल्गोरिदम के साथ दिखाई देंगे, छवियों के लिए सबसे उपयुक्त एल्गोरिथ्म निर्धारण करते हैं।
      1. जब बाद में मैक्रो चल रहा है, उसके अनुसार मैक्रो सेटिंग्स में सीमा बदल जाते हैं।
      2. सक्रिय क्षेत्रों का निर्धारण करने के इस तरह के "RenyiEntrophy" या NMJ रूपरेखा सीमा और इस तरह के "ली" के रूप में अधिक अनुमोदक थ्रेसहोल्ड NMJ कंकाल निर्धारित करने के लिए के रूप में "लम्हें", और "हुआंग" के रूप में अधिक प्रतिबंधात्मक थ्रेशोल्ड का उपयोग करें। जब छवियों कोई पृष्ठभूमि करने के लिए थोड़ा के साथ बहुत तेज कर रहे हैं, के रूप में "NMJ रूपरेखा सीमा" हुआंग "का उपयोग करें। अन्यथा अन्तर्ग्रथन के कुछ हिस्सों छवि विभाजन के बाद छूटे हुए हों।
      3. एक उदाहरण के लिए चित्रा 5 ब देखें। अन्तर्ग्रथन का उचित विभाजन ऑटो थ्रेसहोल्ड हरे बॉक्स से प्रकाश डाला के साथ प्राप्त की है। गैर उपयुक्त थ्रेसहोल्ड के कुछ उदाहरणों में लाल बॉक्स (उच्च आवर्धन पर synapses जांच) से प्रकाश डाला गया है। बाद में, अन्तर्ग्रथन के दोनों भागों याद कर रहे हैं या पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों शामिल किए गए हैं। संदर्भ 23 अधिक जानकारी के लिए देखें।
  1. छोटे कणों का अधिकतम आकार का निर्धारण
    नोट: यह समारोह है कि विश्लेषण से "छोटे कणों सेटिंग" में परिभाषित मान तुलना में छोटे होते NMJ रूपरेखा सीमा और कंकाल सीमा द्वारा पता लगाया सभी कणों को बाहर निकाल देगा। यह मान पिक्सल में परिभाषित किया गया है। यह फ़ंक्शन एक शोर फिल्टर के रूप में कार्य करता है और बहुत उपयोगी है जब गैर वर्दी पृष्ठभूमि की उच्च दर (जैसे क्रिस्टल / धूल के रूप में) प्राप्त चित्रों में मौजूद हैं।
    1. जेड अनुमानों कदम 6.2.6 में बचाया खोलें। और सेट करेंपैमाने विश्लेषण के माध्यम से पिक्सेल की संख्या का पता लगाने के | सेट स्केल। निम्न सेटिंग्स लागू करें: पिक्सेल में दूरी = 1, ज्ञात दूरी = 1, पिक्सेल आकार अनुपात = 1, लंबाई = पिक्सेल और प्रेस "ठीक है" की यूनिट। टूलबार में "ओवल चयन" उपकरण पर क्लिक करें।
    2. माउस का प्रयोग बारीकी से एकल कणों कि immunostaining में मौजूद हैं लेकिन NMJ से संबंधित नहीं आसपास के एक चयन आकर्षित। Windows उपयोगकर्ता या cmd + मैक उपयोगकर्ताओं के लिए मीटर के लिए Ctrl + M दबाएं। एक परिणाम विंडो खुलेगी, पिक्सेल की संख्या में चयनित कणों के क्षेत्र का संकेत है।
    3. छवियों में मौजूद सबसे बड़ी दूषणकारी कण / विरूपण साक्ष्य क्षेत्र निर्धारित करने के लिए कई कलाकृतियाँ साथ पिछले चरण में कई बार दोहराएँ। यह जब मैक्रो बाद में पर चल रहा है की स्थापना में स्थापित करने के लिए मूल्य होगा। जब मैक्रो सेट सबसे छोटा कण आकार मनाया मवाद के रूप में "छोटे कणों का आकार" 25% के अंतर चल रहा है।
    4. एक उदाहरण के लिए चित्रा 5D देखें। सबसे बड़ी क्रिस्टल का पता लगाने केएड 112 पिक्सल के एक क्षेत्र है। 150 - "छोटे कणों का आकार" सेटिंग, जब मैक्रो के साथ इस इमेज प्रोसेसिंग, to125 सेट किया जाना चाहिए।
  1. निर्धारित न्यूनतम bouton आकार
    नोट: यह समारोह है कि विश्लेषण से निर्धारित मान से छोटे हैं NMJ रूपरेखा सीमा द्वारा पता लगाया सभी BOUTONS बाहर निकाल देगा। यह मान पिक्सल में परिभाषित किया गया है।
    1. खंड 6.4 में वर्णित के रूप में एक ही चरणों का पालन करें, लेकिन इस मामले में सबसे छोटी NMJ टर्मिनल में मौजूद BOUTONS आसपास के एक चयन आकर्षित। सबसे छोटी क्षेत्र मापा लोगों की सबसे छोटी bouton से संबंधित उत्पाद चुनें। यह जब मैक्रो बाद में पर चल रहे न्यूनतम bouton आकार की स्थापना में स्थापित करने के लिए मूल्य है।
  1. परिभाषित मूल्य "मॅक्सिमा शोर सहिष्णुता खोजें"
    1. जेड hyperstacks खंड 6.2.1 में चयनित प्रयोग करें।
    2. टूलबार में, चित्र का चयन करें | रंग | बनाने की प्रक्रिया को विभाजित चैनलोंते 2 ढेर (चैनल 1 और चैनल के लिए 2) और BRP चैनल खुला करने के लिए इसी छवि रखने के लिए। यह बंद करके अन्य चैनल छवि त्यागें।
    3. , पॉपअप मेनू में प्लगइन्स टैब पर जाएँ प्रक्रिया का चयन करें | अधिकतम (3 डी), और जब maximum_image_name प्रकट होता है (जो कुछ ही मिनटों तक लग सकते हैं), मूल छवि ढेर बंद कर दें।
    4. का चयन करें ... अधिकतम image_name (प्राप्त छवि ढेर) और प्लगइन्स का चयन | प्रक्रिया | न्यूनतम (3 डी), अधिकतम ... image_name ढेर बंद कर दें।
    5. टूलबार में, चयन प्रक्रिया | मॅक्सिमा खोजें ...। एक नई विंडो "का पता लगाएं मॅक्सिमा ..." खुल जाएगा। चेकबॉक्स "पूर्वावलोकन बिंदु चयन ..." क्लिक करें और डिफ़ॉल्ट मैक्रो 50. मॅक्सिमा अंक की स्थापना थोड़ा पार के रूप में छवि में दर्शाया जाएगा के साथ "शोर सहिष्णुता" बॉक्स भरें।
      1. यदि एनोटेट सक्रिय क्षेत्रों, यानी पार है कि सक्रिय क्षेत्रों के शीर्ष पर नहीं हैं कि में हैं की एक अतिरिक्त अवलोकन "शोर सहिष्णुता" मूल्य में वृद्धिचयनित ढेर विमान, या गलत सक्रिय क्षेत्रों कि पृष्ठभूमि में पाया जाता है पर ध्यान केंद्रित।
        1. दूसरी ओर, यदि अधूरे सक्रिय क्षेत्रों एनोटेट अवलोकन, सक्रिय क्षेत्रों फोकस लेबल मान्यता प्राप्त नहीं किया जा रहा है, ie "शोर सहिष्णुता" मूल्य कम हो। इस प्रक्रिया के बाद जब तक पार उचित रूप से ध्यान केंद्रित करने में सक्रिय क्षेत्रों लेबलिंग विभिन्न मान कोशिश करते रहो। इस मान के साथ "का पता लगाएं मॅक्सिमा शोर सहिष्णुता" भरें।
        2. एक उदाहरण के लिए चित्रा 5C देखें। बहुत अधिक सक्रिय क्षेत्रों का पता चलता है। चित्रा 5C में 'केवल ध्यान केंद्रित करने में सक्रिय क्षेत्रों का पता चलता है।
    6. भागो उप मैक्रो कदम 5.1 में चयनित प्रतिनिधि छवियों के लिए "विश्लेषण", सेटिंग्स सभी पिछले चरणों में परिभाषित होती है।
  2. BRP-puncta लोअर और अपर सीमा को समायोजित करें
    1. ध्यान दें कि एक नई फ़ाइल मीटर चलाने के बाद प्रदर्शित होने दिया जाएगाकदम एक्रो अनुसार 6.6, कहा जाता 2_active_zone_stack_image_name। इस छवि में "मॅक्सिमा खोजें" समारोह के द्वारा पता लगाया प्रत्येक विमान में सफेद डॉट्स से दर्शाया जाता है सक्रिय क्षेत्रों टिके रहते हैं।
    2. खींचने और उपकरण पट्टी और चित्र का चयन में छोड़ने के द्वारा इस फ़ाइल को खोलने | ढेर | Zproject | प्रोजेक्शन प्रकार = योग स्लाइस। 2_active_zone_stack_image_name के एक प्रक्षेपण प्राप्त की जाएगी।
    3. चित्र का चयन करें | समायोजित करें | थ्रेसहोल्ड। एक नई विंडो "दहलीज" खुल जाएगा। ऊपरी बार एक सीमा मूल्य जहां, सभी वांछित फोकी / BRP पॉजिटिव स्पॉट लाल रंग में कल्पना कर रहे हैं चुनने के लिए स्लाइड।
      नोट: सीमा बहुत कम सेट है, तो सक्रिय क्षेत्रों की एक अतिरिक्त गिना जाएगा। यदि बहुत अधिक निर्धारित करते हैं, सक्रिय क्षेत्रों में से एक अंश छूट जाएँगी।
      1. एक उदाहरण के लिए चित्रा 5E देखें। सीमा 400 पर सेट होने पर, सक्रिय क्षेत्र (1 पिक्सेल फोकी के रूप में प्रतीक) के अधिकांश, विभाजन में शामिल नहीं हैं, क्योंकि वे लाल (चित्रा 5 में प्रकाश डाला नहीं कर रहे हैंई)। सीमा 50 के मान पर सेट है जब सभी सक्रिय क्षेत्रों लाल (चित्रा 5E ') में प्रकाश डाला है।
    4. न्यूनतम सीमा के रूप में इस मूल्य को परिभाषित करें। अधिकतम मूल्य पर छोड़ दो "ऊपरी puncta सीमा"।
    5. फिर से चलाएं उप मैक्रो सेटिंग्स इस खंड के सभी पिछले चरणों में परिभाषित के साथ प्रतिनिधि छवियों के लिए "विश्लेषण"। गंभीर जिसके परिणामस्वरूप छवि फ़ाइलों का मूल्यांकन करें और यह सुनिश्चित करें कि विभाजन ठीक से किया गया है। अगर ऐसा नहीं है विभाजन त्रुटियों के स्वरूप (चित्रा 4, 3 तालिका) के अनुसार सेटिंग फिर से समायोजित।

Representative Results

पाठ परिणाम फ़ाइल मुख्य निर्देशिका में प्रदर्शित होगा। यह छवि प्रति सभी मापा मानकों का सारांश है। परिणाम फ़ाइल नाम से जुड़े होते हैं और मानकों को बाद में टेबल्स 1 और 2 में संकेत क्रम में संक्षेप।

Res_image_name एक तीन छवि ढेर है। पहली छवि रूपरेखा और चैनल 1 के आधार पर मैक्रो द्वारा निर्धारित NMJ टर्मिनल के कंकाल (immunolabeling Dlg -1, एचआरपी, Syt, या CSP) पर प्रकाश डाला गया। दूसरी छवि पहली छवि की एक प्रति है और साथ ही पहचान BRP पॉजिटिव धब्बे कि schematized फोकी के रूप में चैनल 2 में पाया जाता है पता चलता है। तीसरे छवि पहचान BRP पॉजिटिव फोकी के साथ मिलकर दूसरे चैनल की अधिकतम प्रक्षेपण प्रदान करता है।

NMJ रूपरेखा सीमा मैक्रो उत्पादन परिणाम छवि में पीले रंग में प्रतिनिधित्व किया है। NMJ क्षेत्र, Perimeter और BOUTONS के नंबर इस सीमा से निष्कर्ष निकाला गया है।

NMJ कंकाल सीमा मैक्रो उत्पादन परिणाम छवि में नीले रंग में प्रतिनिधित्व किया है। NMJ लंबाई, सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई, शाखाओं की संख्या, अंक और द्वीपों शाखाओं में इस सीमा से निष्कर्ष निकाला गया है।

NMJ सक्रिय क्षेत्रों सीमा मैक्रो उत्पादन परिणाम छवि में प्रतिनिधित्व नहीं है। इस सीमा क्षेत्र है जहां BRP पॉजिटिव फोकी संभावित मैक्रो द्वारा सामना किया जा सकता है निर्धारित करता है। यह एक ऐसा क्षेत्र है जो NMJ NMJ रूपरेखा सीमा द्वारा परिभाषित एक की तुलना में थोड़ा बड़ा है बनाने के लिए है। जब एक भी प्रतिबंधक सीमा चुना जाता है, BRP पॉजिटिव अन्तर्ग्रथन के मार्जिन पर स्थित फोकी बाहर रखा जा सकता है। जब सीमा भी अनुमोदक है, पृष्ठभूमि शोर BRP पॉजिटिव धब्बे (- 2 आंकड़े 1) के रूप में गिना जा सकता है।

valida करने के लिएते "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" मैक्रो का प्रदर्शन, तीन उत्परिवर्ती की स्थिति है कि पहले से ही विभिन्न NMJ मानकों में synaptic दोष पेश करने के लिए वर्णित किया गया परीक्षण किया गया। प्रत्येक दोष के लिए एक अलग छवि विभाजन मैक्रो (NMJ रूपरेखा, कंकाल या सक्रिय क्षेत्रों में क्रमश: 17) द्वारा किया जाता प्रक्रिया द्वारा खोजा गया था। inducible आरएनएआई द्वारा ब्याज और प्रदर्शन विच्छेदन और L3 लार्वा के NMJ immunostaining की तीन जीन को निशाना बनाने के बाद, मैक्रो चलाया गया था। प्राप्त NMJ रूपात्मक माप तो जोड़ो में थे (अपने नियंत्रण बनाम आरएनएआई) एक टी परीक्षण का उपयोग कर की तुलना में। तीनों मामलों में सांख्यिकीय अंतर उत्परिवर्ती और पैरामीटर है कि पहले सूचना दी रूपात्मक दोष के साथ समझौते में हैं को प्रभावित करने वाले नियंत्रण के बीच पाए गए। यह पुष्टि करता है कि मैक्रो वास्तव में पर्याप्त रूप से ड्रोसोफिला NMJ में पहले बताए दोषों की पहचान कर सकते हैं।

Ankyrin 2 (Ank2, CG42734) उत्परिवर्ती जुड़े हुए BOUTONS और छोटे NMJs सहित अन्तर्ग्रथनी आकृति विज्ञान दोष, दिखाने के लिए जाना जाता है। इन दोषों Ank2 उत्परिवर्ती 24, 25 के लिए देखा गया और Ank2 नॉकडाउन मक्खियों 26। अखिल neuronal Ank2- आरएनएआई नॉकडाउन मक्खियों की NMJ टर्मिनलों (डब्ल्यू, यूएएस-पासा खेलनेवाला -2 / यूएएस-Ank2 आरएनएआई KK107238; elav-Gal4 / +) काफी छोटे NMJ क्षेत्र से पता चला है (मतलब = 339.25 सुक्ष्ममापी 2; टी परीक्षण पी = 2.18 x 10 -8) और परिधि (मतलब = 238.24 सुक्ष्ममापी, टी परीक्षण पी = 1.82 x 10 -3), आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण डाटासेट (डब्ल्यू की तुलना में, यूएएस-पासा खेलनेवाला -2 / यूएएस-KK60100; elav-Gal4 / + ) (मतलब = 451.95 सुक्ष्ममापी 2 और मतलब = 288.62 सुक्ष्ममापी, क्रमशः) "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" (आंकड़े 6A और 4 बी) चलाने के बाद।

GTPase Rab3 (CG7576) उचित bruchpilot वितरण के लिए आवश्यक है और rup उत्परिवर्ती सक्रिय जोनों 27 के एक काफी कम संख्या के साथ प्रस्तुत करता है। सक्रिय क्षेत्रों की संख्या में महत्वपूर्ण कमी पायी गयी, अखिल neuronal Rab3 नॉकडाउन मक्खियों (डब्ल्यू के NMJ टर्मिनलों में "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" मैक्रो द्वारा BRP पॉजिटिव फोकी मापने; यूएएस-पासा खेलनेवाला -2 / यूएएस-आरएनएआई KK100787; elav -Gal4)। Rab3 -RNAi में NMJ टर्मिनल प्रति सक्रिय क्षेत्रों की औसत संख्या 290 नियंत्रण डाटासेट (/ +) टी परीक्षण पी में पाया = 4.43 x 10 -29) (आंकड़े 6A और 4C) के विपरीत 138 था।

Highwire (hiw, CG32592) NMJ विकास का एक महत्वपूर्ण नियामक है, hiw जीन नेतृत्व में परिवर्तन ऊंचा हो जाना और NMJ टर्मिनलों 28 की शाखाओं में विस्तारित करने के लिए। मापने अखिल neuronal HIW -RNAi नॉकडाउन लाइन (डब्ल्यू के NMJ टर्मिनलों, यूके रूप में-पासा खेलनेवाला -2 / यूएएस-आरएनएआई-GD36085; elav-Gal4 / +) "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" के साथ, महत्वपूर्ण मतभेद कंकाल व्युत्पन्न मानकों में मनाया गया: लंबाई (मतलब = 147.36 सुक्ष्ममापी टी; नियंत्रण = 122.07 सुक्ष्ममापी मतलब टेस्ट पी = 7.31 x 10 -7), सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई (मतलब = 122.19 सुक्ष्ममापी; नियंत्रण मतलब = 105.65 सुक्ष्ममापी, टी परीक्षण पी = 4.62 x 10 -4) शाखाओं (मतलब = 7.69 की संख्या; मतलब को नियंत्रित = 5.74; टी परीक्षण पी = 2.52 x 10 -2) और शाखाओं अंक (मतलब = 2.73 की संख्या; मतलब को नियंत्रित = 1.79; टी परीक्षण पी = 3.31 x 10 -2)। इन सभी मानकों में काफी वृद्धि हुई किया गया (120 - 180%) आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण की तुलना (डब्ल्यू, यूएएस-पासा खेलनेवाला -2 / यूएएस-GD60000; elav-Gal4 / +) (आंकड़े 6A और 4D)।

आकृति 1
चित्र 1: ड्रोसोफिला _NMJ_Morphometrics माप Drosophi के 9 पैरामीटरला NMJ। बाईं तरफ Dlg -1 और BRP NMJ टर्मिनल, Apotome के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर imaged immunolabeled हैं। सही पर "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" चलाने के बाद परिणाम छवियाँ हैं। पैरामीटर क्षेत्र, परिधि और BOUTONS वृहद व्याख्या किए गए पीले रूपरेखा संकेत दिया प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। पैरामीटर्स लंबाई, सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई (LbL), शाखाओं, शाखाओं में अंक, और द्वीपों वृहद व्याख्या किए गए नीले रूपरेखा द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं। BRP-immunolabeled फोकी (सक्रिय क्षेत्र) परिणाम छवियों में सफेद धब्बे के रूप में मैक्रो का प्रतिनिधित्व कर रहे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति ड्रोसोफिला NMJ के 8 पैरामीटर माप। बाईं तरफSyt -1 और BRP NMJ टर्मिनल immunolabeled, Apotome के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर imaged हैं। सही पर "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" चलाने के बाद परिणाम छवियाँ हैं। पैरामीटर BOUTONS और bouton क्षेत्र वृहद व्याख्या किए गए पीले रूपरेखा का प्रतिनिधित्व कर रहे। पैरामीटर्स लंबाई, सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई (LbL), शाखाओं, शाखाओं में अंक, और द्वीपों वृहद व्याख्या किए गए नीले रूपरेखा द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं। BRP-immunolabeled फोकी (सक्रिय क्षेत्र) परिणाम छवियों में सफेद धब्बे के रूप में मैक्रो का प्रतिनिधित्व कर रहे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: फ़्लो चार्ट का प्रतिनिधित्व ड्रोसोफिला NMJ आकृति और ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति मैक्रो। पहले उप मैक्रो "कन्वर्ट टीओ ढेर "अनुमानों और imaged NMJs के hyperstacks पैदा करता है। दूसरा उप मैक्रो" परिभाषित करें आरओआई "मैन्युअल ब्याज की NMJ टर्मिनल का स्थान निर्दिष्ट करने इनपुट की आवश्यकता है। उप मैक्रो तीन," विश्लेषण ", उपायों सभी NMJ मानकों। एक पाठ मात्रात्मक मानों और एक परिणाम छवि फ़ाइल पैरामीटर चित्रण चित्रण युक्त फ़ाइल मैक्रो प्रदर्शन के उपयोगकर्ता के मूल्यांकन की सहायता के लिए बनाया जाता है। छवियों अलग अलग परिस्थितियों में प्राप्त कर लिया जाता है, तो मैक्रो सेटिंग्स का परीक्षण किया और सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना है। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्र 4: का अनुचित मैक्रो विभाजन परिणाम उदाहरण। चल रहा है "ड्रोसोफिला NMJ Morphometr के बाद परिणाम छवियोंआईसीएस "या" ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति "। synaptic टर्मिनल के पार्ट्स पीले रूपरेखा (ए) में शामिल नहीं हैं। पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों में पीले रूपरेखा (बी) द्वारा synaptic टर्मिनल में शामिल हैं। ब्लू कंकाल लाइन से परे फैली हुई synaptic टर्मिनल। (सी - डी) बहुत अधिक सक्रिय क्षेत्रों का पता चलता है (ई - ई ') (। कुछ सक्रिय क्षेत्रों विश्लेषण जी - जी) द्वारा चल पाता रहना'।। सक्रिय क्षेत्रों अन्तर्ग्रथन (एफ) गलत bouton विभाजन के बाहर का पता चलता है (केवल लागू जब ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति चल), BOUTONS याद किया जाता है (एच) या बहुत अधिक BOUTONS विभाजन (आई) द्वारा पता लगाया जाता है। इस तरह के एक कण क्रिस्टल या धूल कि पृष्ठभूमि के हिस्से के विभाजन में शामिल किए गए हैं (जे) । सेटिंग्स इन त्रुटियों से बचने के लिए बदलने के तरीके की जानकारी तालिका 3 में प्रदान की जाती हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: मैक्रो-सेटिंग समायोजन और छवि विभाजन के लिए उनके परिणामों के उदाहरण। (ए), जब "रोलिंग गेंद त्रिज्या" 20 (ए) या 500 (ए ') के लिए निर्धारित है एक Dlg -1 immunolabeled अन्तर्ग्रथन, Apotome के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर imaged की पृष्ठभूमि पूर्वावलोकन घटाएं। (बी) के उत्पादन छवियों छवि चलाने के बाद प्राप्त | समायोजित करें | ऑटो थ्रेसहोल्ड | सभी छवि का प्रयास करें 16 विभिन्न ऑटो सीमा एल्गोरिदम द्वारा प्राप्त छवि के सेगमेंटेशन को दिखाता है। (सी) पूर्वावलोकन जब 50 (सी) और 500 (सी ') पर "शोर सहिष्णुता" की स्थापना "मैक्सिमा खोजें"; एसीेश्य क्षेत्रों है कि विभाजन के द्वारा पता लगाया जाता है एक छोटे से पार से लेबल रहे हैं। (डी) "छोटे कणों" एक अन्त्रग्रंथन विरोधी एचआरपी साथ immunolabeled, एक confocal खुर्दबीन पर imaged की छवि पृष्ठभूमि में प्रदर्शित होने के मापन। (ई) "योग स्लाइस" प्रक्षेपण 2_active_zone_stack_ima-ge_name से प्राप्त। थ्रेसहोल्ड 400 (ई) में और 50 (ई) पर सेट है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: Dlg -1 और BRP पर "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" मैक्रो चलाने के बाद मैक्रो आकलन और मात्रा स्नायु 4. (ए) के परिणाम छवियों पर NMJs के NMJ टर्मिनलों immunolabeled। पैरामीटर क्षेत्र, परिधि और boutonरों वृहद व्याख्या किए गए पीले रूपरेखा का प्रतिनिधित्व कर रहे। पैरामीटर्स लंबाई, सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई (LbL), शाखाओं, शाखाओं में अंक, और द्वीपों वृहद व्याख्या किए गए नीले रूपरेखा द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं। BRP-immunolabeled फोकी (सक्रिय क्षेत्र) परिणाम छवियों में सफेद धब्बे के रूप में मैक्रो का प्रतिनिधित्व कर रहे। पैमाने बार 20 सुक्ष्ममापी इंगित करता है। (बी) Ankyrin2 आरएनएआई प्रदर्शनी एक छोटे NMJ क्षेत्र पछाड़ना और परिधि आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण की तुलना। (सी) Rab3 नॉकडाउन आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण की तुलना BRP पॉजिटिव सक्रिय क्षेत्रों में से एक कम संख्या के साथ NMJs में हुई। (डी) Highwire नॉकडाउन अब के परिणामस्वरूप, उच्च सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई, अधिक शाखाओं और आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण NMJs की तुलना में NMJ टर्मिनलों के प्रति अधिक शाखाओं में अंकों के साथ। त्रुटि सलाखों, संकेत मिलता है SEM ** p <0.01, दो पूंछ टी परीक्षण। वह क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कर रहे हैं।

पैरामीटर NMJ संरचना व्याख्या
क्षेत्र (μm2) NMJ रूपरेखा पूरा लेबल NMJ के क्षेत्र
परिधि (सुक्ष्ममापी) NMJ रूपरेखा परिधि क्षेत्र से संबंधित
#Boutons NMJ रूपरेखा synaptic BOUTONS ( 'एक स्ट्रिंग पर मोती') NMJ की की संख्या
लंबाई (सुक्ष्ममापी) कंकाल पूरा NMJ टर्मिनल की कुल लंबाई
सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई (सुक्ष्ममापी) कंकाल सबसे लंबे समय तक निरंतर पथ की लंबाई की राशि NMJ में से किसी दो समाप्ति बिंदुओं को जोड़ने
#डालीes कंकाल शाखाओं की कुल संख्या
#Branching अंक कंकाल अंक शाखाओं की संख्या (कई शाखाओं एक शाखाओं बिंदु से निकाले जाते हैं कर सकते हैं)
#Islands कंकाल गैर जुड़ा Dlg1 पॉजिटिव अन्तर्ग्रथनी डिब्बों की संख्या (या किसी अन्य धुंधला)
#Active क्षेत्रों BRP पॉजिटिव स्पॉट सक्रिय क्षेत्रों की संख्या, BRP धुंधला के आधार पर

तालिका 1: NMJ पैरामीटर "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" द्वारा मापा। "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" मैक्रो द्वारा मापा NMJ मापदंडों प्राप्त पाठ फ़ाइल में एक सूची के रूप में दिखाई देगा इस तालिका में वर्णित आदेश के बाद। इस तालिका में Nijhof एट अल से पुनः प्रकाशित कर रहा है। 17

पैरामीटर NMJ संरचना व्याख्या
BOUTONS NMJ रूपरेखा synaptic BOUTONS ( 'एक स्ट्रिंग पर मोती') NMJ की की संख्या
bouton क्षेत्र NMJ रूपरेखा सभी BOUTONS के कुल क्षेत्रफल
लंबाई (सुक्ष्ममापी) कंकाल पूरा NMJ टर्मिनल की कुल लंबाई
सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई (सुक्ष्ममापी) कंकाल NMJ के किसी भी दो अंतिम बिंदुओं को जोड़ने सबसे लंबा सतत पथ की लंबाई की राशि
#Branches कंकाल शाखाओं की कुल संख्या
#Branching अंक कंकाल गुअंक शाखाओं की ई संख्या (कई शाखाओं एक शाखाओं बिंदु से निकाले जाते हैं कर सकते हैं)
#Islands कंकाल गैर जुड़ा Dlg1 पॉजिटिव अन्तर्ग्रथनी डिब्बों की संख्या (या किसी अन्य धुंधला)
#Active क्षेत्रों BRP पॉजिटिव स्पॉट सक्रिय क्षेत्रों की संख्या, BRP धुंधला के आधार पर

तालिका 2: NMJ पैरामीटर "ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" द्वारा मापा। "ड्रोसोफिला _Bouton_NMJ_Morphometrics" मैक्रो द्वारा मापा NMJ मापदंडों प्राप्त पाठ फ़ाइल में एक सूची के रूप में दिखाई देगा इस तालिका में वर्णित आदेश के बाद। इस तालिका में Nijhof एट अल से पुनः प्रकाशित कर रहा है। 17

मनाया त्रुटियों </ Tr>
विभाजन उदाहरण आवश्यक समायोजन
NMJ क्षेत्र और परिधि (परिणाम छवि में पीले रूपरेखा द्वारा प्रतिनिधित्व) synaptic टर्मिनल के पार्ट्स या तो पीले रूपरेखा या पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों में शामिल नहीं हैं पीले रंग में उल्लिखित synaptic टर्मिनल में शामिल हैं। चित्रा 5 ए-बी 'रोलिंग गेंद त्रिज्या' मूल्य को समायोजित करें। खंड 6.1 देखें। 'NMJ रूपरेखा सीमा' को समायोजित करें। खंड 6.2 देखें।
NMJ लंबाई संबंधित मानकों (परिणाम छवि में नीले कंकाल लाइन द्वारा प्रतिनिधित्व) ब्लू कंकाल लाइन या तो परे फैली हुई है या पूरे synaptic टर्मिनल के साथ मौजूद नहीं है। चित्रा 5C-डी 'रोलिंग गेंद त्रिज्या' मूल्य को समायोजित करें। खंड 6.1 देखें। 'NMJ रूपरेखा सीमा' को समायोजित करें। खंड 6.2 देखें।
BRP पॉजिटिव puncta (परिणाम छवि में डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व) बहुत अधिक सक्रिय क्षेत्रों का पता चलता है। चित्रा 5E-ई ' 'मॅक्सिमा शोर सहिष्णुता खोजें' मूल्य में कटौती करें। खंड 6.5 देखें।
BRP पॉजिटिव puncta (परिणाम छवि में डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व) सक्रिय क्षेत्रों विश्लेषण द्वारा याद किया जाता है। चित्रा 5G-जी ' 'मॅक्सिमा शोर सहिष्णुता खोजें' मूल्य वृद्धि हुई है। खंड 6.5 देखें। घटाएँ 'BRP-puncta कम दहलीज'। खंड 6.6 देखें।
BRP पॉजिटिव puncta (परिणाम छवि में डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व) सक्रिय क्षेत्र कलाकृतियों synaptic टर्मिनल के बाहर पाया जाता है। चित्रा 5F 'सक्रिय जोन सीमा' अनुभाग 6.2 को समायोजित करें। 'BRP-puncta कम दहलीज' बढ़ाएँ। खंड 6.6 देखें।
छोटे कणों इस तरह के एक क्रिस्टल या धूल कणों कि पृष्ठभूमि का हिस्सा हैं विभाजन में शामिल किया जा दिखाई देते हैं। चित्रा 5J बॉक्स का चयन करें 'छोटे कणों निकालें'। खंड 6.3 देखें। छोटे कणों अधिकतम आकार निर्धारित करें। खंड 6.3 देखें।
bouton विभाजन गलत bouton विभाजन (ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति को केवल लागू; bouton विभाजन के लिए ड्रोसोफिला NMJ आकृति का उपयोग नहीं करते)। चित्रा 5H-मैं 'NMJ रूपरेखा सीमा' को समायोजित करें। खंड 6.1 देखें। निर्धारित 'न्यूनतम bouton आकार'। खंड 6.4 देखें।

तालिका 3: छवि विभाजन में त्रुटियाँ के विभिन्न प्रकार है कि मैक्रो द्वारा उत्पादित किया जा सकता है के लिए गाइड की समस्या का निवारण। इस तालिका के विभिन्न प्रकार का वर्णन करता हैछवि विभाजन त्रुटियों मैक्रो द्वारा निर्मित है। ये आसानी से परिणाम छवियों में पता लगाया जा सकता है। प्रत्येक त्रुटि प्रकार के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया जाता है। तालिका के "समायोजन अनुभाग" में, सेटिंग में बदलाव की जरूरत है कि हाइलाइट किया जाता है, और उपयोगकर्ता धारा 6 के महत्वपूर्ण उप कदम है, जो बताती हैं कि इन सेटिंग को समायोजित करने के लिए जाना जाता है।

Discussion

"ड्रोसोफिला NMJ आकृति" और "ड्रोसोफिला NMJ bouton आकृति" अन्तर्ग्रथन आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। NMJ मापदंडों के मैनुअल आकलन श्रमसाध्य है; / NMJ मैनुअल छवि विभाजन पर खर्च यह अनुमान है कि मैक्रो 15 मिनट के लिए एक अनुभवी शोधकर्ता ऊपर की बचत होगी। हालत या जीनोटाइप प्रति का मूल्यांकन synapses के एक से दो दर्जनों के साथ, इस जल्दी बचे समय की काफी मात्रा में करने के लिए, योग छोटे पैमाने पर अध्ययन में भी। जब बड़ी स्क्रीन प्रदर्शन, उच्च throughput विश्लेषण का उपयोग कर, मैनुअल मूल्यांकन और मात्रा की तुलना में लाभ, विशाल हो सकता है। वृद्धि की प्रवाह क्षमता के अलावा, मैक्रो आसानी उद्देश्य विश्लेषण प्रदान करते हैं; वे व्यक्तिगत पूर्वाग्रहों है कि अन्यथा अंधा प्रयोगों के साथ-साथ पारस्परिक मतभेद है कि हो जब कई शोधकर्ताओं ने विश्लेषण में शामिल हैं की आवश्यकता होती है शामिल नहीं है। अंत में, मैक्रो एक संवेदनशील और सटीक एक प्रदान करते हैंNMJ सुविधाओं के alysis, synaptic नियामकों कि बल्कि नाटकीय NMJ दोष से सूक्ष्म होता है और अब तक शोधकर्ता की आंखों से नाचीज को बने हुए हैं की पहचान के लिए अनुमति देता है। सत्यापन प्रक्रिया और एल्गोरिदम मैक्रो में उपयोग के बारे में विस्तृत जानकारी प्रकाशन Nijhof एट अल में पाए जाते हैं। 17।

मैक्रो की कार्यक्षमता को उचित रूप से बाद में पेशी 4. पर ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर NMJs की आकारिकी संबंधी विशेषताओं को मापने के लिए मान्य किया गया है, यह प्रदर्शन किया गया है कि मैक्रो भी इस जीव में अन्य मांसपेशियों में synapses विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त थे। यह संभावना है कि मैक्रो भी अन्य ड्रोसोफिला प्रजातियों और आगे कीड़ों सहित अन्य प्रजातियों में इसी तरह की संरचना के साथ NMJ की रूपात्मक मानकों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां तक कि NMJs विकास में बहुत दूर, जैसे, चूहों के NMJs, एक काफी समान संरचनात्मक रचना दिखाने के 29। मैक्रो अन्य प्रजातियों से NMJ तैयारी पर परीक्षण नहीं किया गया है, लेकिन संभावित उपयोगकर्ताओं ऐसे प्रयोजनों के लिए मैक्रो का परीक्षण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता।

यह बहुत महत्वपूर्ण है कि उपयोगकर्ता को परिभाषित / छवियों के लिए सबसे उपयुक्त मैक्रो सेटिंग्स का चयन करने के लिए विभिन्न ऑटो थ्रेसहोल्ड और एल्गोरिदम की पड़ताल। इन सेटिंग्स के साथ, जब मैक्रो मूल्यांकन पुस्तिका मूल्यांकन की तुलना में किया गया था लगभग 95% की सटीकता हासिल की है। मैक्रो सेटिंग समायोजित करना ठीक से खंड छवियों की 100% एक बहुत श्रमसाध्य या यहाँ तक कि असंभव प्रक्रिया किया जा सकता है। इसलिए, ठीक से विभाजित नहीं किया छवियों का बहिष्कार करता है, तो उनकी संख्या 5% से नीचे हैं सिफारिश की है। जाहिर है, अगर छवियों की गुणवत्ता कम है, मैक्रोज़ असंतोषजनक छवि के सेगमेंटेशन का अनुपात अधिक उत्पन्न होगा। कम गुणवत्ता वाले चित्रों इसी तरह पुस्तिका मूल्यांकन को प्रभावित करती है और इसलिए नहीं मैक्रो के प्रदर्शन से जोड़ा जा सकता। फिर भी मैक्रो बल्कि मजबूत के रूप में वे छवि के लिए डिजाइन किए गए थे हैंएक उच्च सामग्री माइक्रोस्कोप (एक स्वचालित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी नमूने की बड़ी संख्या के इमेजिंग की अनुमति देता है कि) 17 पर उत्पन्न रहा है।

एक महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयोगकर्ता नेत्रहीन मैक्रो द्वारा उत्पन्न सभी परिणाम छवियों का निरीक्षण है। यह पता लगाने और नाकाफी विभाजन के साथ चित्रों को बाहर करने की अनुमति देगा। इस प्रोटोकॉल की धारा 6 में, उपयोगकर्ता निर्देशित है कैसे जब उप मैक्रो चल "विश्लेषण" सही छवि विभाजन के लिए सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए। जल्दी से मैक्रो की आवश्यकताओं और कैसे मैक्रो सेटिंग्स नामक फ़ोल्डर "मैक्रो सेटिंग्स Examples_adjusting" को समायोजित करने के साथ परिचित करने के लिए मैक्रो भंडार https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a में शामिल है। तेरह सबफ़ोल्डर, (उच्च सामग्री / कोंफोकल / प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी) विभिन्न माइक्रोस्कोप प्लेटफार्मों पर प्राप्त उदाहरण छवियों और विभिन्न immunostainings के साथ प्रत्येक, प्रदान की जाती हैं। एक PDF जिसका शीर्षक था "उदाहरण मार्गदर्शिका" एक ही में शामिल हैजहां प्रत्येक उदाहरण के लिए आवश्यक सेटिंग्स की उम्मीद परिणाम और परिणामों में चित्र उपलब्ध कराने के एक पाठ दस्तावेज़ के साथ प्रदान की जाती हैं, फ़ोल्डर।

मैक्रो सहेजे गए चित्रों पर कार्रवाई करने के रूप में .tiff फ़ाइलें अलग डिजाइन किए गए थे, फिर भी कुछ उपयोगकर्ताओं को किसी अन्य प्रारूप में उनके चित्र बचाया है हो सकता है। और दस्तावेज़ विस्तृत निर्देशों के साथ "उदाहरण गाइड" कैसे मैक्रो में छवियों को आयात करने के लिए - निम्नलिखित वेबसाइट https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 "ड्रोसोफिला NMJ" जहां तीन उदाहरण फ़ाइलें (3 उदाहरण 1) नाम का एक फ़ोल्डर में शामिल है यदि .tiff अलग फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत नहीं भी एक ही फ़ोल्डर में पाया जा सकता है।

NMJ क्षेत्र, NMJ परिधि, BOUTONS के नंबर, NMJ bouton क्षेत्र, NMJ लंबाई, NMJ सबसे लंबे समय तक शाखा लंबाई, Isla की संख्या: एक साथ, "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" और "ड्रोसोफिला NMJ bouton आकृति" मैक्रो दस अलग NMJ सुविधाओं योंएनडीएस, शाखाओं की संख्या, शाखाओं में अंकों की संख्या और सक्रिय क्षेत्रों की संख्या। यह अब तक उपलब्ध उपकरण है कि केवल एक या कुछ अन्तर्ग्रथनी सुविधाओं 30, 31 का आकलन कर सकते पर एक महान लाभ प्रदान करता है। Multiparametric मात्रात्मक विश्लेषण नई खोजों, जैसे, के लिए महान क्षमता भालू उपन्यास नियामकों कि अन्तर्ग्रथन जीव विज्ञान के कई पहलुओं को एक को नियंत्रित पहचान करने के लिए। यह भी जीन है कि ठीक उसी या अतिव्यापी NMJ सुविधाओं coregulate और इस तरह आम आणविक मार्ग में काम करने की संभावना है निर्धारित करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान करता है। अंत में, यह जांच करने के लिए कैसे अलग synaptic मापदंडों अबाधित स्थिति 17 और जो जीन ऐसे समन्वित morphometric सहसंबंध सुनिश्चित में एक-दूसरे के साथ संबंध स्थापित संभावना को खोलता है।

एक साथ लिया, इस प्रोटोकॉल कैसे दो मैक्रो का उपयोग करने के लिए "ड्रोसोफिला NMJ आकृति" दिखाता है और"ड्रोसोफिला NMJ Bouton आकृति" है, जो एक उच्च throughput ढंग से दस रूपात्मक NMJ सुविधाओं के उद्देश्य और संवेदनशील मात्रा प्रदर्शन करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास कोई भी हितों के टकराव खुलासा करने के लिए नहीं थे।

Acknowledgments

हम ड्रोसोफिला उपभेदों प्रदान करने के लिए वियना ड्रोसोफिला संसाधन केंद्र और ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र (एनआईएच P40OD018537) स्वीकार करते हैं। हम इमेजिंग में विशेषज्ञ सहायता के लिए सूक्ष्म इमेजिंग सेंटर से जैक फ्रैनसेन धन्यवाद। इस अध्ययन VIDI और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) से टॉप अनुदान (917-96-346, 912-12-109) द्वारा समर्थित किया गया, दो DCN / Radboud विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर पीएचडी फैलोशिप द्वारा, जर्मन मानसिक मंदता नेटवर्क द्वारा शिक्षा और अनुसंधान (BMBF) की जर्मन संघीय मंत्रालय के NGFN + प्रोग्राम के द्वारा और के रूप में करने के लिए यूरोपीय संघ के FP7 बड़े पैमाने पर एकीकृत नेटवर्क Gencodys (स्वास्थ्य 241,995) द्वारा वित्त पोषित। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining Dilution
Mouse anti-discs large 1 Developmental Studies Hybridoma Bank AFFN-DLG1-4D6 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase Jackson IR 323-005-021 1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin Gift from Hugo Bellen Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein Developmental Studies Hybridoma Bank DCSP-1(ab49) 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) 
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Life technologies A11029 1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Life technologies A11011 1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit ThermoFisher Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36930
Material Company Catalog number Comments
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer Mac or Pc
Material Company Catalog number Comments
Software
FIJI

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 123 फिजी, NMJ मैक्रो अन्तर्ग्रथन छवि विभाजन morphometry
के उच्च throughput और मल्टी पैरामीट्रिक मात्रा के लिए दो एल्गोरिदम<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Neuromuscular जंक्शन आकृति विज्ञान
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Castells-Nobau, A., Nijhof, B.,… More

Castells-Nobau, A., Nijhof, B., Eidhof, I., Wolf, L., Scheffer-de Gooyert, J. M., Monedero, I., Torroja, L., van der Laak, J. A. W. M., Schenck, A. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. J. Vis. Exp. (123), e55395, doi:10.3791/55395 (2017).

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