Summary
Två bildanalysalgoritmer, "Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" skapades för att automatiskt kvantifiera nio morfologiska funktioner i Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ).
Abstract
Synaptic morfologi är tätt relaterad till synaptiska effekt, och i många fall morfologiska synaps defekter i slutändan leda till synaptiska fel. Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen (NMJ), en väl etablerad modell för glutamaterga synapser, har i stor utsträckning studerats under årtionden. Identifiering av mutationer som orsakar NMJ morfologiska defekter avslöjade en repertoar av gener som reglerar synaps utveckling och funktion. Många av dessa identifierades i storskaliga studier som fokuserade på kvalitativa metoder för att upptäcka morfologiska avvikelser i Drosophila NMJ. En nackdel med kvalitativa analyser är att många subtila spelare som bidrar till NMJ morfologi sannolikt förbli obemärkt. Medan kvantitativa analyser krävs för att upptäcka subtila morfologiska skillnader sådana analyser är ännu inte allmänt utföras eftersom de är arbetskrävande. Detta protokoll beskriver i detalj två bildanalysalgoritmer "Drosophila 'Drosophila NMJ Bouton Morfometri', tillgänglig som Fiji-kompatibla makron, för kvantitativ, korrekt och objektiv morfometrisk analys av Drosophila NMJ. Denna metod har utvecklats för att analysera NMJ terminaler immunomärkta med de vanligen använda markörer Dlg-1 och . brp Dessutom dess bredare tillämpning till andra markörer såsom HRP, Csp och Syt presenteras i detta protokoll De makron kan bedöma nio morfologiska NMJ funktioner:. NMJ area, NMJ omkrets, antal boutons, NMJ längd, NMJ längsta gren längd, antal öar, antal förgreningar, antalet förgreningspunkter och antalet aktiva zoner i NMJ terminalen.
Introduction
Kognitiva störningar såsom utvecklingsstörning, autism och schizofreni är ofta kännetecknas av onormal synaptisk funktion 1, 2, 3. Synapse morfologi och funktion är tätt sammanflätade; morfologiska defekter kan orsaka synaptisk felaktig funktion och, omvänt, kommer avvikande synaptisk transmission påverka synaptiska mognad och morfologi 4, 5, 6.
Ett antal modellorganismer har använts för att bättre förstå synaps biologi och belysa hur synaptiska förändringar påverkar hjärnans funktion vid hälsa och sjukdom 7, 8, 9. Drosophila NMJ är ett omfattande studerat och väletablerad in vivo modell för glutamaterg synapse biologi 10, 11. Under de senaste decennierna har denna modell använts för fysiologiska och gen-fokuserade studier, liksom för storskaliga genetiska skärmar, med syftet att detektera morfologiska skillnader mellan NMJs. I synnerhet, har framåt genetiska skärmar identifierade många avgörande regulatorer och mekanismerna bakom synaps utveckling och funktion 12, 13, 14, 15, 16. Dock de flesta av dessa skärmar lättnad på visuell bedömning av NMJ terminal morfologi och på kvalitativ detektering av de synaptiska abnormiteter eller semikvantitativ poängsättning av några morfologiska särdrag. Som en konsekvens är ganska subtila synaptiska morfologiska avvikelser som inte är självklart för det mänskliga ögat lätt missas. För att kunna omfattande upptäcka kvantitativa skillnader, deNMJ måste noggrant utvärderas genom systematisk kvantifiering av de morfologiska parametrar av intresse. Mätning NMJ funktioner manuellt är arbetskrävande, speciellt när det finns flera NMJ särdrag av intresse och / eller vid utförande storskaliga genetiska screeningar. För att stödja multiparametrisk, hög genomströmning morfologisk analys och för att uppnå målet kvantifiering har två makron "Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" utvecklade 17. Båda makron körs i öppen källkod mjukvara för bildanalys Fiji 18 och kan kvantifiera både konfokala och nonconfocal bilder.
"Drosophila NMJ Morfometri" åtgärder NMJ terminaler immunofärgades med den postsynaptiska markörskivan stor-1 (Dlg-1) eller den presynaptiska pepparrotsperoxidas (HRP), sam-märkt med den aktiva zonen markör bruchpilot (Brp). Det kvantifierar nio morfologiska Parameters (beskrivs vidare nedan): NMJ area, NMJ omkrets, antal boutons, NMJ längd, NMJ längsta gren längd, antal öar, antal grenar, antalet förgreningspunkter och antalet aktiva zoner i den synaptiska terminalen (Figur 1) . Även en algoritm för att bestämma antalet boutons förekommer i denna makro, gjorde det inte uppfyller kriterierna för noggrannhet 17. Att korrekt bedöma antalet boutons, är det nödvändigt att använda "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" makro, som är speciellt utformad för att kvantifiera boutons använder NMJ preparat immunofärgades med anti-synaptotagmin (Syt) eller anti-cystein sträng protein (CSP), och co-immunolabeled med Brp. Den "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" makro kvantifierar följande parametrar: antal boutons, NMJ bouton område, NMJ längd, NMJ längsta grenlängd, antal öar, antal förgreningar, antalet förgreningspunkter och antalet aktiva zoian (Figur 2).
Makron består av tre under makron: (I) "Konvertera till stapla" identifierar alla tillgängliga bildfiler och skapar Z-hyperstacks och maximal intensitet projektioner av båda kanalerna. Som produktion, kommer detta makro generera två nya filer per synaps kallas "stack_image_name" och "flatstack_image_name". II) "Definiera ROI" kommer att öppna alla maximala projektionsbilder "flatstack_image_name" konsekutivt och presentera dem med en begäran att manuellt definiera regionen av intresse (ROI) i vilken den specifika synaptiska terminalen av intresse är närvarande. Detta genomfördes för att medge uteslutning av synapser som ansluter till intilliggande muskler och / eller andra typer av synaptiska terminaler (såsom 1s) som kan vara närvarande i bilderna 11. (III) "Analysera" gäller helt automatiserad analys till alla regioner i bilderna inom gränserna för ROI. Somett resultat av detta steg kommer användaren få två nya filer: "results.txt" där alla mätetalet kommer att kommenteras och en "res_image_name.tif" där den underliggande bilden segmente som produceras av makro kommer att illustreras. Under bildanalys tre strukturerna är härledda från varje synaptisk terminal: NMJ kontur, NMJ skelett, och antalet Brp-positiva aktiva zoner. NMJ kontur används för att bestämma NMJ området och dess omkrets och en efterföljande vattendelare separation ger antalet boutons. Från skelettet, är fem NMJ funktioner härledas: den totala NMJ längd, varvid summan av längden på den längsta sammanhängande bana som förbinder två godtyckliga ändpunkter (längsta gren längd), antalet osammanhängande fack per NMJ (hänvisad till som "öar" ), antalet grenar, och antalet förgreningspunkter (en förgreningspunkt ansluter tre eller flera grenar). Antalet aktiva zoner bestäms i BRP-kanalen genom att räknaBRP-positiva fläckar. Den kommenterade NMJ kontur (gul linje), NMJ skelett (blå linje), och antalet Brp-positiva aktiva zoner (som anges med vita foci) visas i ett resultat bild och de mätningar av de parametrar bearbetas till en (. txt) utfil (Figur 3).
Drosophila NMJ Morfometri" och 'drosophila NMJ Bouton Morfometri' beskrevs först och i stor utsträckning validerats av Nijhof et al. 17. Detta manuskript fokuserar på den metod för att analysera NMJ morfologi med användning av de makron 'Drosophila NMJ Morfometri' och 'drosophila NMJ Bouton Morfometri'. icke desto mindre, före makroassisterade analyser, NMJ dissektioner och immunfärg behöver utföras. Dessa är viktiga steg, och kombinationen av markörer som används för immunohistokemi måste vara lämplig för makro analyser. Dessa steg kortfattat nämns i och för sigInsatser 1 av detta protokoll och dirigera användaren till referenser som beskriver i detalj protokollen för att utföra dessa förfaranden.
Protocol
1. Krav Före Image Processing
- Utföra Drosophila öppen bok beredningar av tredje stadiet vandrande larver (L3), såsom tidigare beskrivits 19.
- Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaler med användning av en kombination av två markörer: dlg-1 eller HRP tillsammans med Brp för analys med "Drosophila NMJ Morfometri", och Syt eller Csp tillsammans med Brp för analys med "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" 20.
OBS: Antikroppar från samma art kan kombineras genom förmärkning en med ett antikropp-konjugering kit såsom Zenon Alexa Märkning Kits 17. - Bild NMJ terminaler med användning av ett mikroskop av val, t ex fluorescens (med eller utan ApoTome) eller konfokalmikroskopi.
- Förvärva en 2-kanals bildstapel av NMJ terminalen.
- Justera inställningarna mikroskop på ett sätt som kanal 1förvärvar NMJ terminalen immunolabeled med Dlg-1 (eller HRP, Syt, Csp) och kanal 2 NMJ terminalen immunolabeled med Brp.
- Eventuellt, analysera en kana bilder (av synapser immunomärkta med en enda antikropp) med makron. Bild NMJs immunolabeled unikt med Dlg-1 eller HRP för analys med "Drosophila NMJ Morfometri" eller Syt eller Csp för "Drosophila NMJ Bouton Morfometri".
OBS: Det är inte möjligt att analysera synapser immun med endast anti-Brp.
- Exportera de erhållna bilderna som enskilda' TIFF-filer. Invertera kanalordningen före körning av makron, om inte förvärvat såsom anges.
- Förvärva en 2-kanals bildstapel av NMJ terminalen.
2. Programvarukrav och installation
- Ladda ner makron "Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" från följande webbplats: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- Flytta markören till mappen "Makron uppdateringen 1", och klicka på visas alternativet "Visa". En lista med innehållet i denna mapp visas. Mappen innehåller makron "Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri".
OBS: Båda makron är kompatibla med Fiji versionerna 1.4, som också tillhandahålls i samma mapp. De makron kan inte köras på de senaste versionerna. Vänligen utnyttja den medföljande version 1.4. Det är oproblematiskt att starta denna version, även på datorer med en nyare Fiji version tillgänglig.- Klicka på "Hämta alla". Innehållet mappen hämtas till datorn som en .zip-fil. Packa upp den nedladdade filen.
- Kopiera Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm och Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm filer till Fiji.app/plugins/ katalog. När du startar programmet kommer makron visas längst ned på Pluginsrullgardinsmenyn.
- Flytta markören till mappen "Makron uppdateringen 1", och klicka på visas alternativet "Visa". En lista med innehållet i denna mapp visas. Mappen innehåller makron "Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri".
3. Kör Sub-makro "Konvertera att stapla" Skapa Z-projektioner och Hyperstacks av NMJ Images
- Starta det grafiska gränssnittet genom att välja Plugins i verktygsfältet och välj "Drosophila NMJ Morfometri" i rullgardinsmenyn.
- Definiera "Unique File String" inställningen i makro grafiska gränssnitt.
OBS: mikroskop Programvaran använder ett identifierings signatur för att organisera flygplan och kanaler vid lagring högar som enskilda' TIFF-filer. Det angivna unika fil sträng inställning måste ange signaturen tilldelas av mjukvaran till det första planet av den första kanalen (viktigt: stigande plan och kanalnummer måste anges). - Välj bara under macro "Konvertera att stapla" och klicka på "OK" och välj den mapp där bilderna finns. Om en huvudkatalog med flera undermappar väljs alla individens .tiff filer inomhuvudkatalogen och undermapp matchar unik fil kriterierna sträng kommer att behandlas.
- Om z-stack endast innehåller en kanal, markera rutan "Channel endast 1".
- Lägg märke till att två nya filer per NMJ bild som standard kallas stack_image_name och flatstack_image_name visas. Förvara endast dessa stack och flatstack för vidare analys. Den .tiff fil serien kan tas bort vid denna punkt, vilket minimerar kapacitet som krävs för lagring och undvika potentiella felkällor.
4. Kör Sub-macro "Definiera ROI" att beskriva NMJ Terminal of Interest
- Starta det grafiska gränssnittet i "Drosophila NMJ Morfometri".
- Välj bara kryssrutan "Definiera ROI" och tryck på "OK" och välj huvudkatalogen där bilderna rätt flatstack_name lagras och tryck på "Välj". Under macro "Definiera ROI" söker automatiskt igenom alla undermapparinom det valda huvudkatalogen.
- Som den första projektionen öppnas, välj "Freehand val" verktyg i verktygsfältet. Använda musen rita en markering som enbart innehåller den fullständiga NMJ terminalen av intresse och klicka på "OK" i fönstret "Definiera terminal". Makrot kommer att fortsätta med nästa projektion.
- Avgränsa nästa ROI och upprepa tills alla ROI definieras. ROI bildfil med namnet "roi_image_name", kommer att lagras i samma katalog som de tidigare genererade konsol och projektionsbilder för vart och ett av de bearbetade bilderna. Utgången av denna under makro är en binär bild av ROI i vitt mot en svart bakgrund.
5. Kör Sub-macro "Analysera" för att kvantifiera NMJ Terminal Funktioner
- Gå till verktygsfältet, välj "Plugins" och användning:
"Drosophila _NMJ_Morphometrics" vid analys synapser immunomärkta med anti-Dlg-1 eller anti-HRP (kanal 1) tillsammansmed anti-Brp (2 kanal), eller "Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics" vid analys synapser immunomärkta med anti-Syt eller anti-CSP (kanal 1) tillsammans med Brp (kanal 2).- När en kanal bildstaplar skall analyseras (den strukturella kanalen Dlg-1 eller HRP för "Drosophila_ NMJ_Morphometrics", eller Syt eller Csp för "Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics"), markera rutan "Channel endast ett".
- Justera skalan som motsvarar bilderna som ska analyseras. Om en pixel i bilden motsvarar 2,5 um, indikerar Scale-Pixlar = 1, Scale-Avstånd i pm = 2,5. Vid båda inställningarna är kvar på 0, NMJ area, omkrets, längd och längsta gren längd kommer att uttryckas i antalet pixlar.
- Vid behov justera standardinställningarna för analys av makrot. Utför justeringar endast om under makrot "Analysera" (detta avsnitt med otillfredsställande resultat och determined bättre inställningar i avsnitt 6) har körts.
- Markera kryssrutorna "Analysera" och "vänta" och tryck på "OK".
- Välj "Wait" kryssrutan när du kör under macro "Analysera" på 2 kanalbilder. Annars fel i aktiv zon räkning kan uppstå på grund av begränsad kapacitet dator.
- Som ett nytt fönster "Välj en katalog" öppnas, välj den katalog där bilderna finns och tryck på "Välj". Makrot kommer att analysera alla bilder som finns lagrade i huvudkatalogen och i förekommande fall, efterföljande mappar (med hjälp av de tre filerna från att utföra de tidigare under makron: stack_image_name, flatstack_image_name och roi_image_name). Makro processer varje bild individuellt och i följd. Detta kan ta flera minuter per bildstapel (beroende på datorkapacitet).
- Efter att ha kört makrot notera att en ny bildfil som heter res_image_name för varje analyserat synaps lagras blir created i föräldramappen. De kvantitativa mätningar kommer att lagras som "results.txt" fil.
- Inspektera alla resultat bilder för att upptäcka och exkludera bilder med segmente fel. Eventuella segmente fel beskrivs i tabell 3, tillsammans med råd hur man justerar inställningarna för att kringgå dessa. Resultat bilder med sådana segmente fel tillhandahålls som exempel i figur 4.
OBS: När du kör makrot med standardinställningarna som observerats i användargränssnittet, det fanns en noggrannhet på ungefär 95% när makro bedömning jämfört med manuell utvärdering 17.
6. Justera Makro inställningarna till bilder
- När mer än 5% av bilder visar segmente fel, utforska de olika algoritmer för att definiera / välja den mest lämpliga makroinställningar för bilderna.
- Justera rullande kula radievärde
OBS: Den rullande boll radieFunktionen subtraherar bakgrunden av bilden. Denna funktion är av avgörande betydelse när man arbetar med bilder som förvärvats på fluorescens mikroskop och / eller när bilderna har hög bakgrundsljud. Subtraktion av bakgrunden kommer att hjälpa makro auto-tröskelsteg för att producera tillräckligt segmentering av NMJ terminaler.- Välj tre NMJ Z-projektioner (flatstack_image_name bilder som genereras av sub-makro "Konvertera att stapla") som är representativa för bild dataset.
- I verktygsfältet väljer bild | färg | Split kanaler. Två bilder kommer att skapas, en som representerar kanal 1 och den andra kanalen 2.
- Hålla endast bilden som tillhör kanal 1 öppen, motsvarande Dlg-1, HRP, Syt eller Csp immunomärkning, och kassera Brp kanalbild genom att stänga bilden.
- Kör filter "Subtrahera bakgrund" genom att välja "process" i verktygsfältet följt av "Subtrahera bakgrund ..." i rullgardinsmenyn.
- Klicka på Visa kryssrutan i popup-fönstret och justera rullande kula radie till det värde som ökar kontrasten mellan synapsen och bakgrund som i panelen (figur 5A).
OBS: Se figur 5 för ett exempel. I Figure5A, är delar av synapsen som visar samma grånivåer som bakgrund, medan i fig 5A' den 'rullande boll radie' satt till 500 genererar en stark kontrast mellan synapsen och bakgrunden. - När lämpligt värde för den rullande bollen radien definieras, köra "Subtrahera bakgrund" algoritm på de valda Z-projektioner med samma rullande kula radievärde och spara dem (i valfri katalog).
OBS: Den rullande boll radievärde för 8-bitars eller RGB-bilder bör vara minst lika stor som radien av den största objektet i bilden som inte är en del av bakgrunden. För 16-bitars och 32-bitars bilder radien bör inversely proportionell mot pixelvärdeområdet 22.
- Bestäm olika auto-trösklar som kommer att användas
- Öppna Z-projektioner sparas i föregående steg (6.2.6) och Välj bild | justera | autotröskel | Prova alla.
- Som en binär tröskel resultat bilden visas med alla olika auto-tröskelalgoritmer bestämma den mest lämplig algoritm för bilderna.
- När du kör makrot senare ändrar tröskeln i makro inställningar därefter.
- Använda mer restriktiva trösklar som "RenyiEntrophy" eller "ögonblick" som NMJ kontur tröskeln och mer tillåtande tröskelvärden såsom "Li" för att bestämma NMJ skelett, och "Huang" för att bestämma aktiva zoner. När bilderna är mycket skarp med liten eller ingen bakgrund, använder "Huang" som" NMJ kontur tröskeln. I annat fall delar av synapsen kan saknas efter bildsegmentering.
- Se figur 5B för ett exempel. Lämplig segmentering av synapsen erhålls med auto-trösklar belysts av gröna rutor. Några exempel på icke-lämpliga tröskelvärden är markerade med röda lådor (kolla synapser vid hög förstoring). I det senare, är antingen delar av synapsen saknas eller delar av bakgrunden är inkluderade. Se referens 23 för mer information.
- Bestämma den maximala storleken hos de små partiklarna
OBS: Denna funktion kommer att utesluta alla partiklar upptäckts av NMJ konturen tröskeln och skelett tröskel som är mindre än det definierade värdet i "små partiklar inställningen" från analysen. Detta värde definieras i pixlar. Denna funktion fungerar som ett brusfilter och är mycket användbar när höga hastigheter av icke-enhetlig bakgrund (såsom kristaller / damm) är närvarande i de erhållna bilderna.- Öppna Z-projektioner sparas i steg 6.2.6. och ställa inskalan för att upptäcka antalet pixlar via Analysera | Set Scale. Tillämpa följande inställningar: avståndet i pixlar = 1, känt avstånd = 1, pixelproportioner = 1, enheten med längd = pixel och tryck på "OK". Klicka på "Oval val" verktyg i verktygsfältet.
- Med hjälp av musen dra ett urval tätt omgivande enstaka partiklar som finns i immunfärgning men inte hör till NMJ. Tryck på Ctrl + m för en Windows-användare eller cmd + m för Mac-användare. Ett resultat fönster öppnas, vilket indikerar området av de partiklar valda i antalet pixlar.
- Upprepa föregående steg flera gånger med flera artefakter som finns i bilderna för att bestämma den största förorenande partikel / artefakt området. Detta kommer att vara det värde som anges i inställningen när du kör makrot senare. När man kör makrot ställa in "Small Particles Size" som den minsta partikelstorlek observer pus en marginal på 25%.
- Se figur 5D för ett exempel. Den största kristallen upptäckaEd har en yta på 112 pixlar. Inställningen "Små partiklar storlek", när de behandlar denna bild med makro, bör sättas to125 - 150.
- Bestäm minimum bouton storlek
OBS: Denna funktion kommer att utesluta alla boutons upptäckts av konturen tröskeln NMJ som är mindre än det definierade värdet från analysen. Detta värde definieras i pixlar.- Följ samma steg som beskrivs i avsnitt 6,4, men i detta fall rita en markering kring de minsta boutons närvarande i NMJ terminalen. Välj den minsta areal som motsvarar den minsta Bouton av de uppmätta sådana. Detta är det värde som ligger i storleksinställningen minimi Bouton när du kör makrot senare.
- Definiera "Hitta maxima buller tolerans" värde
- Använd Z-hyperstacks valts i avsnitt 6.2.1.
- I verktygsfältet väljer bild | färg | Delade kanaler till create 2 staplar (för kanal 1 och kanal 2) och hålla bilden som motsvarar den Brp kanalen öppen. Kasta den andra kanalen bilden genom att stänga den.
- Gå till fliken plugins i popupmenyn väljer Process | Maximum (3D) och när maximum_image_name visas (vilket kan ta upp några minuter), stäng originalbilden stacken.
- Välj Maximum ... image_name (den erhållna bildstapel) och välj Insticksprogram | process | Minimum (3D), stäng Maximum ... image_name stack.
- I verktygsfältet väljer Process | Hitta maxima .... Ett nytt fönster "Hitta maxima ..." öppnas. Klicka på kryssrutan "Preview punkt val ..." och fyll "Noise tolerans" box med standardmakroinställning 50. maxima punkterna kommer att anges i bilden som små kors.
- Öka värdet "Noise tolerans" om att observera ett överskott av kommenterade aktiva zoner, det vill säga kors som inte ovanpå aktiva zoner som finns ifokusera på den valda stapeln planet, eller falskt aktiva zoner som detekteras i bakgrunden.
- Å andra sidan, om att observera ofullständigt kommenterad aktiva zoner, dvs aktiva zoner i fokus inte är märkt erkänns minska värdet "Noise tolerans". Fortsätt att försöka olika värden som följer denna procedur tills kors lämpligt märkning aktiva zoner i fokus. Fyll "Hitta maxima buller tolerans" med detta värde.
- Se figur 5C för ett exempel. Alltför många aktiva zoner detekteras. I figur 5C' endast de aktiva zonerna i fokus detekteras.
- Öka värdet "Noise tolerans" om att observera ett överskott av kommenterade aktiva zoner, det vill säga kors som inte ovanpå aktiva zoner som finns ifokusera på den valda stapeln planet, eller falskt aktiva zoner som detekteras i bakgrunden.
- Kör sub-makro "Analysera" för representativa bilder som valts i steg 5,1, med inställningarna definierade i alla tidigare steg.
- Justera Brp-puncta lägre och övre tröskel
- Lägg märke till att en ny fil kommer att visas efter att ha kört macro enligt steg 6,6, kallas 2_active_zone_stack_image_name. I denna bild stapla de aktiva zonerna detekterade av "Hitta maxima" funktion anges med vita prickar i varje plan.
- Öppna filen genom att dra och släppa den i verktygsfältet och välj Image | stack | Zproject | Projektionstyp = Sum skivor. En projektion av 2_active_zone_stack_image_name kommer att erhållas.
- Välj bild | justera | Tröskel. Ett nytt fönster "Threshold" öppnas. Skjut den övre bommen för att välja ett tröskelvärde, där alla önskade foci / Brp-positiva fläckar visualiseras i rött.
OBS: Om tröskeln sätts för lågt kommer ett överskott av aktiva zoner räknas. Om satt för högt, kommer en del av de aktiva zoner missas.- Se figur 5E för ett exempel. När tröskelvärdet satt till 400, de flesta av de aktiva zoner (symboliserade som en 1 pixel foci) ingår inte i den segmente, eftersom de inte är markerade i rött (Figur 5E). När tröskelvärdet sätts till ett värde av 50 alla de aktiva zonerna markeras i rött (Figur 5E).
- Definiera detta värde som minimigräns. Lämna "Övre puncta tröskel" på det högsta värdet.
- Kör under makrot "Analysera" för representativa bilder med inställningarna som definieras i alla de tidigare stegen i detta avsnitt. Kritiskt utvärdera de resulterande bildfiler och se till att segmente görs på rätt sätt. Om detta inte är fallet justera inställningarna i enlighet med naturen av de segmenterings fel (Figur 4, Tabell 3).
Representative Results
Texten resultatfilen kommer att visas i huvudkatalogen. Den sammanfattar alla de uppmätta parametrarna per bild. Resultaten kopplas till filnamnet och parametrarna därefter sammanfattade i den ordning som anges i tabellerna 1 och 2.
Res_image_name är en tre-image stack. Den första bilden belyser kontur och skelettet av NMJ terminalen bestämd av makro baserat på kanal 1 (immunomärkning Dlg-1, HRP, Syt eller Csp). Den andra bilden är en kopia av den första bilden och dessutom visar de identifierade BRP-positiva fläckar som detekteras i kanal 2 som schematiseras foci. Den tredje bilden ger den maximala projektionen av den andra kanalen tillsammans med identifierade Brp-positiva foci.
NMJ kontur tröskeln är representerad i gult i makro output resultatet image. NMJ området, PerimEter och antalet boutons härleds från denna tröskel.
NMJ skelett tröskeln är representerad i blått i makro output resultatet image. NMJ längd, längsta grenlängd, antal förgreningar, förgreningspunkter och öar skall dras från detta tröskelvärde.
NMJ aktiva zoner tröskeln inte är representerad i makro output resultatet image. Denna tröskel bestämmer det område där BRP-positiva fokus skulle kunna uppstå genom makrot. Det är tänkt att skapa ett NMJ område som är något större än en definierad av NMJ konturen tröskeln. När en alltför restriktiv tröskelvärde väljs kan Brp-positiva foci placerad vid marginalen av synapsen uteslutas. När tröskeln är för tillåtande, kan bakgrundsbrus att räknas som Brp-positiva fläckar (figurerna 1 - 2).
till validate utförandet av "Drosophila NMJ Morfometri" makro, tre mutanta betingelser som redan beskrivits att presentera synaptiska defekter i olika NMJ parametrar testades. Varje defekt detekterades genom en annan bild segmenteprocedur som utförs av makrot (NMJ disposition, skelett eller aktiva zoner, respektive 17). Efter att rikta de tre gener av intresse genom inducerbar RNAi och utför dissektioner och NMJ immunfärgning av L3 larver var makrot körs. De erhållna NMJ morfologiska mätningar gjordes sedan parvis (RNAi mot dess kontroll) jämfördes med användning av ett t-test. I samtliga tre fall har statistiska skillnader mellan mutanter och kontroller som påverkar parametrar som är i överensstämmelse med tidigare rapporterade morfologiska defekter. Detta bekräftar att makron verkligen kunna adekvat identifiera tidigare beskrivna defekter på Drosophila NMJ.
ankyrin 2 (Ank2, CG42734) mutanter är kända för att visa synaptiska morfologi defekter, inklusive sammansmälta boutons och mindre NMJs. Dessa defekter observerades för Ank2 mutanter 24, 25 och Ank2 knockdown flyger 26. NMJ klämmorna hos pan-neuronala Ank2- RNAi knockdown flugor (w; UAS-Dicer-2 / UAS-Ank2 RNAi KK107238; elav-Gal4 / +) uppvisade signifikant mindre NMJ area (medelvärde = 339,25 ^ m 2; t-test p = 2,18 x 10 -8) och omkrets (medelvärde = 238,24 ^ m; t-test p = 1,82 x 10 -3), jämfört med den genetiska bakgrunden styr dataset (w; UAS-Dicer-2 / UAS-KK60100; elav-Gal4 / + ) (medelvärde = 451,95 ^ m 2 och medelvärde = 288,62 ^ m, respektive) efter att ha kört "Drosophila NMJ Morfometri" (figurerna 6A & 4B).
GTPas Rab3 (CG7576) krävs för korrekt bruchpilot fördelningen och rup mutanten presenteras med en signifikant reducerad antal aktiva zoner 27. En signifikant minskning av antalet aktiva zoner observerades vid mätning Brp-positiva foci av "Drosophila NMJ Morfometri" makro i NMJ terminalerna hos pan-neuronala Rab3 knockdown flugor (w; UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi KK100787; elav -Gal4). Det genomsnittliga antalet aktiva zoner per NMJ terminalen i Rab3 -RNAi var 138 i motsats till 290 detekteras i styrdatauppsättningen (/ +) t-test p = 4,43 x 10 -29) (figurerna 6A & 4C).
Highwire (hiw, CG32592) är en viktig regulator av NMJ tillväxt; mutationer i hiw genen leder till växa över och utvidgas förgrening av de NMJ terminalerna 28. Mätning NMJ terminalerna hos pan-neuronala hiw -RNAi knockdown linje (w, UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi-GD36085; elav-Gal4 / +) med "Drosophila NMJ Morfometri", signifikanta skillnader observerades i parametrarna skelett härledda: längd (medelvärde = 147,36 ^ m;: kontrollmedelvärde 122,07 ^ m; t -test p = 7,31 x 10 -7), längsta grenlängd (medelvärde = 122,19 ^ m;: kontrollmedelvärde 105,65 ^ m; t-test p = 4,62 x 10 -4) antal grenar (medelvärde = 7,69; styra medelvärde = 5,74; t-test p = 2,52 x 10 -2) och antalet förgreningspunkter (medelvärde = 2,73; styra medelvärde = 1,79; t-test p = 3,31 x 10 -2). Alla dessa parametrar ökade signifikant (120-180%) jämfört med den genetiska bakgrunden kontroller (w; UAS-Dicer-2 / UAS-GD60000; elav-Gal4 / +) (figurerna 6A & 4D).
Figur 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics Mäter 9 Parametrar i Drosophila NMJ. Till vänster finns Dlg-1 och Brp immunolabeled NMJ terminaler, avbildade på ett fluorescensmikroskop med ApoTome. Till höger är resultatbilder efter att ha kört "Drosophila NMJ Morfometri". Parametrar area, omkrets och boutons representeras av makro kommenterad gul kontur anges. Parametrar längd, längsta grenlängd (LBL), är grenar, förgreningspunkter, och öar presenteras av makro kommenterad blå kontur. BRP-immunomärkta foci (aktiva områden) representeras av makrot som vita fläckar i resultatbilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Drosophila NMJ Bouton Morfometri Mäter 8 Parametrar för Drosophila NMJ. Till vänsterär Syt-1 och Brp immunolabeled NMJ terminal, avbildas på ett fluorescensmikroskop med ApoTome. Till höger är resultatbilder efter att ha kört "Drosophila NMJ Bouton Morfometri". Parametrar boutons och Bouton område representeras av makro kommenterad gul kontur. Parametrar längd, längsta grenlängd (LBL), är grenar, förgreningspunkter, och öar presenteras av makro kommenterad blå kontur. BRP-immunomärkta foci (aktiva områden) representeras av makrot som vita fläckar i resultatbilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: flödesschema som representerar Drosophila NMJ Morfometri och Drosophila NMJ Bouton Morfometri Makron. Den första under macro "Konvertera to stack" skapar prognoser och hyperstacks av avbildade NMJs. Den andra under makro 'Definiera ROI' kräver manuell inmatning som definierar platsen för NMJ terminalen av intresse. Sub-makro tre, 'Analysera' åtgärder alla NMJ parametrar. En text fil som innehåller kvantitativa värden och ett resultat bildfil som skildrar parameter avgränsning skapas för att hjälpa användaren utvärdering av makro prestanda. När bilder förvärvas under olika förhållanden, makro inställningarna måste testas och justeras för att säkerställa korrekt analys. klicka här för en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på Olämpliga Macro Segmente Resultat. Resultat bilder efter att ha kört "Drosophila NMJ Morphometrics" eller 'Drosophila NMJ Bouton Morfometri'. Delar av den synaptiska terminalen ingår inte i den gula kontur (A). Delar av bakgrunden är inkluderade i den synaptiska terminalen av den gula kontur (B). Blå skelett linje sträcker sig förbi den synaptiska terminalen. (C - D) för många aktiva zoner detekteras (E - E '). Vissa aktiva zoner förblir oupptäckt av analysen (G - G'). är aktiva zoner detekteras utanför synapsen (F) Felaktig bouton segmentering. (Endast tillämpligt när man kör Drosophila NMJ Bouton Morfometri), boutons missas (H) eller för många boutons detekteras av segmente (i). Partiklar sådan kristaller eller damm som är en del av bakgrunden är inkluderade i segmente (J) . Information om hur du ändrar inställningarna för att undvika dessa fel finns i tabell 3 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på makroinställnings Justeringar och deras konsekvenser för bildsegmentering. (A) Subtrahera bakgrund förhandsgranskning av en Dlg-1 immunolabeled synaps, avbildas på ett fluorescensmikroskop med ApoTome, när "rullande boll radie" är satt till 20 (A) eller 500 (A'). (B) Utgångs bilder som erhållits efter att ha kört bild | justera | Auto-Threshold | Prova alla bilden illustrerar bildsegmente erhållna genom de 16 olika auto-tröskelalgoritmer. (C) "Hitta Maxima" preview vid inställning "Buller tolerans" vid 50 (C) och 500 (C'); Växelströmtiva zoner som detekteras av segmente är märkta med ett litet kors. (D) Mätning av de "små partiklar" som uppträder i bildens bakgrund av en synaps immunolabeled med anti-HRP, avbildas på ett konfokalt mikroskop. (E) "Sum skivor" projektion erhålls från 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Tröskel är satt till 400 (E) och vid 50 (E'). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Makro bedömning och kvantifiering av NMJs på Muscle 4. (A) Resultatbilder efter att ha kört "Drosophila NMJ Morfometri" makro på Dlg-1 och Brp immunolabeled NMJ terminaler. Parametrar area, omkrets och Boutons representeras av den makro kommenterad gul kontur. Parametrar längd, längsta grenlängd (LBL), är grenar, förgreningspunkter, och öar presenteras av makro kommenterad blå kontur. BRP-immunomärkta foci (aktiva områden) representeras av makrot som vita fläckar i resultatbilder. Skalstrecket indikerar 20 ^ m. (B) Ankyrin2 RNAi knockdown uppvisar en mindre NMJ area och omkrets jämfört med genetiska bakgrundskontroller. (C) Rab3 knockdown gav NMJs med ett lägre antal Brp-positiva aktiva zoner jämfört med genetiska bakgrundskontroller. (D) Highwire knockdown resulterade i längre, högre längsta gren längd, mer grenade och med mer förgreningspunkter per NMJ terminaler jämfört med genetiska bakgrundskontroll NMJs. Felstaplar indikerar SEM, ** p <0,01, tvåsvansat T-test. Klicka hanre för en större version av denna figur.
| Parameter | NMJ struktur | Förklaring |
| Område (μm2) | NMJ kontur | Området hela märkt NMJ |
| Omkrets (| im) | NMJ kontur | Omkretsen hör till området |
| #Boutons | NMJ kontur | Antalet synaptiska boutons ( 'pärlor på ett snöre') av NMJ |
| Längd (| im) | Skelett | Den totala längden av den kompletta NMJ terminalen |
| Längsta gren längd (^ m) | Skelett | Summan av längden av den längsta sammanhängande bana som förbinder två godtyckliga ändpunkter NMJ |
| #Grenes | Skelett | Det totala antalet grenar |
| #Branching punkter | Skelett | Antalet förgreningspunkter (flera grenar kan härleda från en förgreningspunkt) |
| #Islands | Skelett | Antalet icke-anslutna Dlg1-positiva synaptiska fack (eller någon annan färgning) |
| #Active zoner | BRP-positiva fläckar | Antalet aktiva zoner, baserat på Brp färgning |
Tabell 1: NMJ parametrar som mäts med "Drosophila NMJ Morfometri". NMJ parametrar som mäts av "Drosophila NMJ Morfometri" macro visas som en lista i den erhållna textfil i den ordning som beskrivs i den här tabellen. Denna tabell är omtryckt från Nijhof et al. 17
| Parameter | NMJ struktur | Förklaring |
| boutons | NMJ kontur | Antalet synaptiska boutons ( 'pärlor på ett snöre') av NMJ |
| Bouton area | NMJ kontur | Den totala ytan av alla boutons |
| Längd (| im) | Skelett | Den totala längden av den kompletta NMJ terminalen |
| Längsta gren längd (^ m) | Skelett | Summan av längden av den längsta sammanhängande bana som förbinder två godtyckliga ändpunkter NMJ |
| #Branches | Skelett | Det totala antalet grenar |
| #Branching punkter | Skelett | the antalet förgreningspunkter (flera grenar kan härleda från en förgreningspunkt) |
| #Islands | Skelett | Antalet icke-anslutna Dlg1-positiva synaptiska fack (eller någon annan färgning) |
| #Active zoner | BRP-positiva fläckar | Antalet aktiva zoner, baserat på Brp färgning |
Tabell 2: NMJ parametrar som mäts med "Drosophila NMJ Bouton Morfometri". NMJ parametrar som mäts av "Drosophila _Bouton_NMJ_Morphometrics" macro visas som en lista i den erhållna textfil i den ordning som beskrivs i den här tabellen. Denna tabell är omtryckt från Nijhof et al. 17
| segmente~~POS=TRUNC | Exempel | Nödvändiga justeringar | ||
| NMJ Area och omkrets (ombud gul kontur i resultat bild) | Delar av den synaptiska terminalen är antingen inte i gula kontur eller delar av bakgrunden är inkluderade i den synaptiska terminalen som skisseras i gult. | Figur 5A-B | Justera 'Rolling Ball Radius' värde. Se avsnitt 6.1. | Justera 'NMJ kontur tröskel'. Se avsnitt 6.2. |
| NMJ längdrelaterade parametrar (representeras av blue skelett linje i resultaten bild) | Blå skelett linje sträcker sig antingen utanför eller inte är närvarande längs hela synaptiska terminalen. | Figur 5C-D | Justera 'Rolling Ball Radius' värde. Se avsnitt 6.1. | Justera 'NMJ kontur tröskel'. Se avsnitt 6.2. | </ Tr>
| BRP-positiva puncta (ombud prickar i resultat bild) | Alltför många aktiva zoner detekteras. | Figur 5E-E' | Minska 'Hitta maxima buller tolerans' värde. Se avsnitt 6.5. | |
| BRP-positiva puncta (ombud prickar i resultat bild) | Aktiva zoner missas av analysen. | Figur 5G-G' | Öka 'Hitta maxima buller tolerans' värde. Se avsnitt 6.5. | Minska 'Brp-puncta lägre tröskel'. Se avsnitt 6.6. |
| BRP-positiva puncta (ombud prickar i resultat bild) | Aktiva zon artefakter detekteras utanför den synaptiska terminalen. | Figur 5F | Justera 'aktiva zonen tröskel' avsnitt 6.2. | Öka 'Brp-puncta lägre tröskel'. Se avsnitt 6.6. |
| små partiklar | Partiklar sådan kristaller eller damm som är en del av bakgrunden förefaller ingå i segmentering. | Figur 5J | Markera rutan 'Ta bort små partiklar'. Se avsnitt 6.3. | Bestäm små partiklar maximal storlek. Se avsnitt 6.3. |
| Bouton segmente | Felaktig bouton segmente (Gäller endast Drosophila NMJ Bouton Morfometri, använd inte Drosophila NMJ Morfometri för Bouton segmente). | Figur 5H-I | Justera 'NMJ kontur tröskel'. Se avsnitt 6.1. | Bestäm 'minimi Bouton storlek'. Se avsnitt 6.4. |
Tabell 3: Felsökning Guide för de olika typer av fel i bildsegmentering som kan produceras av makron. Denna tabell beskriver olika typer avbildsegmente fel producerade av makron. Dessa kan lätt upptäckas i resultaten bilderna. Exempel på varje feltyp visas i Figur 4. I "justeringar avsnittet" i tabellen, är de inställningar som behöver justeras markeras och användaren hänvisas till den kritiska under steg i avsnitt 6, som beskriver hur man justerar inställningarna.
Discussion
"Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" är kraftfulla verktyg för forskare som är intresserade av att utvärdera synaps morfologi. Manuell bedömning av NMJ parametrar är arbetskrävande; Det uppskattas att makron skulle spara en erfaren forskare upp till 15 min / NMJ spenderas på manuell bildsegmentering. Med en till två dussintals synapser utvärderas per tillstånd eller genotyp, sammanfattar detta snabbt upp till stora mängder sparad tid, även i småskaliga studier. När du utför stora skärmar, vinsten med att använda hög genomströmning analys jämfört med manuell bedömning och kvantifiering kan bli enorma. I tillägg till ökad genomströmning, makron ger lätt objektiv analys; de utesluter personliga fördomar som annars kräver förblindade experiment samt interpersonella skillnader som uppstår när flera forskare är involverade i analysen. Slutligen makron ger en känslig och exakt enALYS av NMJ funktioner, vilket gör att identifieringen av synaptiska regulatorer som orsakar ganska subtila än dramatisk NMJ defekter och har hittills varit föga uppskattad av forskarens öga. Detaljerad information om förfaranden validering och de algoritmer som används i makrona är finns i publikationen Nijhof et al. 17.
Funktionaliteten av makron har validerats för att på lämpligt sätt mäta morfologiska funktioner i Drosophila melanogaster NMJs på muskel 4. Därefter visade det sig att de makron var också lämpligt att analysera synapser på andra muskler i denna organism. Det är sannolikt att makrona även kan användas för att mäta morfologiska parametrar för NMJ med liknande struktur i andra arter, innefattande andra Drosophila-arter och ytterligare insekter. Även NMJs mycket avlägsna i evolutionen, t.ex. NMJs av möss, visar en ganska liknande strukturell konformation 29. Makron har inte testats på NMJ förberedelser från andra arter, men potentiella användare uppmanas att testa makron för sådana ändamål.
Det är mycket viktigt att användaren utforskar de olika auto-trösklar och algoritmer för att definiera / välja den mest lämpliga makroinställningar för bilderna. Med dessa inställningar är en noggrannhet på ungefär 95% uppnås när makro bedömning jämfört med manuell utvärdering. Justera makroinställningar för att korrekt segment kan 100% av bilderna vara en mycket mödosam eller omöjligt förfarande. Därför är uteslutande av bilderna inte korrekt segmente rekommenderas om deras antal är under 5%. Uppenbarligen, om kvaliteten på bilderna är låg, kommer makron generera högre förhållanden mellan otillfredsställande bildsegmente. bildkvalitet låg kommer på samma sätt påverka manuell utvärdering och kan därför inte kopplas till utvecklingen av makron. Ändå makron är ganska robusta som de var avsedda för bilds genereras på en hög halt mikroskop (en automatiserad fluorescensmikroskop som tillåter avbildning av ett stort antal prover) 17.
En kritisk punkt är att användaren granskar visuellt alla resultat bilder som genereras av makron. Detta gör det möjligt att upptäcka och exkludera bilder med otillfredsställande segmentering. I avsnitt 6 i detta protokoll, användaren styrs hur man justerar inställningarna för korrekt bildsegmentering när du kör under makrot "Analysera". För att snabbt bekanta med kraven i makron och hur man kan justera makroinställningar en mapp som heter "Examples_adjusting makroinställningar" ingår i makro arkiv https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Tretton mappar, alla med exempel bilder erhållna vid olika mikroskop plattformar (högt innehåll / konfokal / fluorescensmikroskop) och olika immunfärg, tillhandahålls. En PDF med titeln ”Exempel guide” ingår i sammamapp där de inställningar som krävs för varje exempel finns, tillsammans med ett textdokument som ger de förväntade resultaten och resultatbilder.
Makron var utformade för att bearbeta bilder som sparats som TIFF separerade filer ändå vissa användare kan ha sparat sina bilder i ett annat format. Följande webbplats https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 innehåller en mapp som heter "Drosophila NMJ" där tre exempelfiler (exempel 1-3) och dokumentet "Exempel Guide" med detaljerade instruktioner hur du importerar bilder till makrot om inte lagras som TIFF separerade filer kan också hittas i samma mapp.
Tillsammans "Drosophila NMJ Morfometri" och "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" makron kvantifiera tio olika NMJ funktioner: NMJ område, NMJ omkrets, antal boutons, NMJ Bouton området, NMJ längd, NMJ längsta gren längd, antal islands, antal förgreningar, antalet förgreningspunkter och antalet aktiva zoner. Detta ger en stor fördel gentemot hittills tillgängliga verktyg som kan bedöma endast en eller ett fåtal synaptiska funktioner 30, 31. Multiparametrisk kvantitativ analys bär en stor potential för nya upptäckter, t ex för att identifiera nya regulatorer som styr en upp till flera aspekter av synaps biologi. Det ger också den erforderliga upplösningen för att fastställa gener som coregulate exakt samma eller överlappande NMJ funktioner och därmed sannolikt att arbeta i gemensamma molekylära vägar. Slutligen öppnar möjligheten att undersöka hur olika synaptiska parametrar korrelerar med varandra i ostörda förhållanden 17 och vilka gener säkerställa en sådan samordnade morfometriska korrelationer.
Sammantaget visar detta protokoll hur man använder de två makron "Drosophila NMJ Morfometri" och"Drosophila NMJ Bouton Morfometri", som utför objektiv och känsliga kvantifiering av tio morfologiska NMJ funktioner i en hög genomströmning sätt.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Vi erkänner Wien Drosophila Resource Center och Bloomington Drosophila lager centrum (NIH P40OD018537) för att ge Drosophila stammar. Vi tackar Jack Fransen från den mikroskopiska Imaging Center for expertstöd i avbildning. Denna studie stöddes av VIDI och TOP bidrag (917-96-346, 912-12-109) från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), av två DCN / Radboud University Medical Center doktorandstipendier, av den tyska Mental Retardation Network finansieras av NGFN + -programmet det tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF) och EU: s FP7 storskaliga integrerade nätverks Gencodys (HEALTH-241995) till AS. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
- Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
- van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
- Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
- Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
- Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
- Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
- Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
- Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
- Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
- Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
- Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
- Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
- Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
- Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
- Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
- Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902 (2013).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
