Summary
To bildeanalysealgoritmer, "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ble opprettet, for automatisk å kvantifisere ni morfologiske trekk ved Drosophila neuromuskulære (NMJ).
Abstract
Synaptic morfologi er tett relatert til synaptisk effektivitet, og i mange tilfeller morfologiske synapse defekter til slutt føre til synaptisk funksjonsfeil. Drosophila larve neuromuskulær ledd (NMJ), en veletablert modell for glutamaterge synapser, er blitt grundig undersøkt i flere tiår. Identifikasjon av mutasjoner forårsaker NMJ morfologiske defekter avslørte et repertoar av gener som regulerer synapse utvikling og funksjon. Mange av disse ble identifisert i store studier som fokuserte på kvalitative metoder for å oppdage morfologiske abnormiteter i Drosophila NMJ. En ulempe med kvalitative analyser er at mange subtile spillere som bidrar til NMJ morfologi sannsynlig forbli ubemerket. Mens kvantitative analyser er nødvendige for å detektere de presise morfologiske forskjeller, er slike analyser er ikke ennå vanligvis utføres fordi de er arbeidskrevende. Denne protokollen beskriver i detalj to bildeanalysealgoritmer "Drosophila 'Drosophila NMJ Bouton Morphometrics', tilgjengelig som Fiji-kompatible makroer, for kvantitativ, nøyaktig og objektiv morfometrisk analyse av Drosophila NMJ. Denne metodikken er utviklet for å analysere NMJ terminaler immunolabeled med de vanlig brukte markører Dlg-1 og . BRP tillegg, dens videre anvendelse til andre markører, slik som HRP, Csp og SYT er presentert i denne protokollen De makroer er i stand til å vurdere ni morfologiske NMJ egenskaper:. NMJ område, NMJ perimeter, antall boutons, NMJ lengde, NMJ lengste gren lengde, antall øyer, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive soner i NMJ terminal.
Introduction
Kognitive forstyrrelser såsom utviklingshemming, autisme spektrum lidelse og schizofreni er ofte kjennetegnet ved unormal synaptiske funksjon 1, 2, 3. Synapse morfologi og funksjon er tett sammenknyttet; morfologiske defekter kan føre til feilfunksjon synaptiske og, omvendt, vil avvikende synaptisk transmisjon påvirke synaptiske modning og morfologi 4, 5, 6.
Et antall modellorganismer har vært anvendt for å bedre forstå synapse biologi og belyse hvordan synaptiske endringer påvirker funksjoner i hjernen hos helse og sykdom 7, 8, 9. Drosophila NMJ er et grundig studert og vel-etablert in vivo-modell for glutamatergisk synapse biologi 10, 11. I de siste tiårene har denne modellen har blitt brukt for fysiologiske og gen-fokusert undersøkelser, såvel som for storskala genetiske skjermer, med sikte på å detektere morfologiske forskjeller mellom NMJs. Spesielt har termin genetiske skjermer identifisert mange viktige regulatorer og mekanismene bak synapse utvikling og funksjon 12, 13, 14, 15, 16. Men de fleste av disse skjermene støttet seg på visuell vurdering av NMJ terminal morfologi og på kvalitativ påvisning av de synaptiske abnormaliteter eller semi-kvantitativ bedømmelse av noen morfologiske egenskaper. Som en konsekvens er heller subtile synaptiske morfologiske avvik som er ikke-opplagt for det menneskelige øyet lett savnet. For å være i stand til å detektere omfattende kvantitative forskjeller, erNMJ må være nøyaktig evalueres ved systematisk kvantifisering av de morfologiske parametere av interesse. Måling NMJ funksjonene manuelt er arbeidskrevende, særlig når det er flere NMJ trekk av interesse og / eller ved utførelse av store genetiske screeninger. For å støtte multiparametrisk, high-throughput morfologisk analyse og for å oppnå målet kvantifisering ble to makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" utviklet 17. Begge makroer kjøres i åpen kildekode bildeanalyse programvare Fiji 18, og kan kvantifisere både confocal og nonconfocal bilder.
"Drosophila NMJ Morphometrics" tiltak NMJ terminaler immunfarget med den postsynaptiske markør skiven stor-1 (Dlg-1) eller den presynaptiske pepperrot peroksidase (HRP), co-merket med den aktive sone markør bruchpilot (BRP). Det kvantifiserer ni morfologisk Parameters (nærmere beskrevet nedenfor): NMJ område, NMJ perimeter, antall boutons, NMJ lengde, NMJ lengste gren lengde, antall øyer, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive soner i den synaptiske terminal (Figur 1) . Selv om en algoritme for å bestemme antallet av boutons er til stede i denne makroen, gjorde det ikke kravene til nøyaktighet 17. For å vurdere antall boutons på riktig måte, er det nødvendig å bruke "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makro som er spesielt utviklet for å kvantifisere boutons ved hjelp NMJ preparater immunfarget med anti-Synaptotagmin (SYT) eller anti-Cystein streng protein (CSP), og co-immunolabeled med BRP. Den "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makro kvantifiserer de følgende parametre: antall boutons, NMJ bouton område, NMJ lengde, NMJ lengste gren lengde, antall øyer, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive zones (figur 2).
Makroene bestå av tre undermakroer: (I) "Konverter å stable" identifiserer alle tilgjengelige bildefiler og skaper Z-hyperstacks og maksimal intensitet projeksjoner av begge kanaler. Som utgang, vil denne makroen generere to nye filer per synapse kalt "stack_image_name" og "flatstack_image_name". II) "Definer roi" vil åpne alle maksimalprojeksjonsbildene "flatstack_image_name" etter hverandre, og presentere dem med anmodning om å definere området av interesse (ROI), hvor den spesifikke synaptiske terminal av interesse er til stede manuelt. Dette ble gjennomført for å tillate uttrekk av synapser kopling til tilstøtende muskler og / eller andre typer av synaptiske terminaler (for eksempel 1s) som kan være til stede i bildene 11. (III) "Analyse" gjelder fullt ut automatisert analyse for alle regioner av bildene innenfor grensene av avkastningen. Somet resultat av dette trinn, vil brukeren få to nye filer: "results.txt" hvor alle numeriske målingen skal bearbeides og et "res_image_name.tif" hvor underliggende bilde segmente som produseres av makro vil bli illustrert. Ved bildeanalyse tre strukturer er utledet fra hver synaptiske terminal: den NMJ disposisjon, den NMJ skjelett, og antallet BRP-positive aktive soner. Den NMJ omriss blir brukt til å bestemme den NMJ området og dets omkrets, og et påfølgende vannskille separasjon gir antall boutons. Fra skjelettet, blir fem NMJ funksjoner utledet: den totale NMJ lengde, idet summen av lengden av den lengste kontinuerlig bane som forbinder alle to endepunkter (lengste gren lengde), antallet ikke-bundne kamre pr NMJ (referert til som "øyer" ), antallet grener, og antallet forgreningspunkter (ett forgreningspunkt kobler tre eller flere grener). Antallet aktive soner bestemmes i BRP-kanal ved tellingBRP-positive flekker. Den kommenterte NMJ omriss (gul linje), den NMJ skjelett (blå linje), og antallet BRP-positive aktive soner (angitt med hvite foki) lagres i et resultater bilde og målingene av parameterne er behandlet til en (. txt) output file (figur 3).
Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ble først beskrevet og i stor utstrekning validert av Nijhof et al., 17. Dette manuskriptet fokuserer på metoden for å analysere NMJ morfologi ved hjelp av makroene "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Ikke desto mindre, forut for makro-assistert analyse, NMJ disseksjoner og immunostainings må utføres. Dette er avgjørende skritt, og en kombinasjon av markører benyttes for immunhistokjemi må være egnet for makro analyser. Disse trinn er kort nevnt i og for segDette skjer 1 av denne protokoll og sende brukeren til referanser som beskriver i detalj de protokoller for å utføre disse fremgangsmåtene.
Protocol
1. Krav Før Bildebehandling
- Utføre Drosophila åpen bok preparater av tredje instar vandrende larver (L3), som tidligere beskrevet 19.
- Co-immunolabel Drosophila NMJ terminaler ved hjelp av en kombinasjon av to markører: DLG-1 eller HRP sammen med Brp for analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", og SYT eller Csp sammen med Brp for analyse med "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" 20.
MERK: Antistoffer fra samme art kan kombineres med pre-merking med et antistoff-konjugeringsreagenssett eksempel Zenon Alexa Labelling Kit 17. - Bilde NMJ terminaler ved hjelp av et mikroskop av valg, for eksempel fluorescens (med eller uten ApoTome) eller konfokal mikroskopi.
- Erverve en to-kanals bilde stabel av NMJ terminal.
- Juster mikroskop innstillinger på en slik måte at en kanalovertar NMJ terminal immunolabeled med Dlg-1 (eller HRP, SYT, Csp) og kanal 2 er NMJ terminal immunolabeled med BRP.
- Eventuelt kan analysere en kanalsbilder (av synapser immunolabeled med et enkelt antistoff) med makroene. Bilde NMJs immunolabeled entydig med Dlg-1 eller HRP for analyse med "Drosophila NMJ Morphometrics", eller SYT eller Csp for "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
MERK: Det er ikke mulig å analysere synapser immunfarget med bare anti-BRP.
- Eksportere innhentet bildene som individuelle' TIFF-filer. Snu kanal orden før innkjøring makroene hvis ikke anskaffet som angitt.
- Erverve en to-kanals bilde stabel av NMJ terminal.
2.Programvarekrav og Installasjon
- Last makroene: "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" fra følgende nettside: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- Flytt markøren til mappen "Makroer oppdatering 1", og klikk på vises alternativet "visning". En liste med innholdet i denne mappen vil vises. Mappen inneholder makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
MERK: Begge makroer er kompatible med Fiji versjoner 1.4, som også leveres i samme mappe. Makroene kan ikke kjøre på nyere versjoner. Vennligst bruke den medfølgende versjon 1.4. Det er uproblematisk å starte denne versjonen, selv på datamaskiner med en nyere Fiji versjon tilgjengelig.- Klikk på "Last ned alle". Mappen innhold vil bli lastet ned til datamaskinen som en ZIP-fil. Pakk den nedlastede filen.
- Kopier Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm og Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm filer til Fiji.app/plugins/ katalogen. Når du starter programmet, vil makroene vises nederst på Pluginsnedtrekksmenyen.
- Flytt markøren til mappen "Makroer oppdatering 1", og klikk på vises alternativet "visning". En liste med innholdet i denne mappen vil vises. Mappen inneholder makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
3. Kjør Sub-makro "Konverter til Stable" for å lage Z-projeksjoner og Hyperstacks av NMJ Images
- Starte det grafiske grensesnittet ved å velge Plugins i verktøylinjen og velg "Drosophila NMJ Morphometrics" i rullegardinmenyen.
- Definer "Unik File String" -innstillingen i makro grafiske grensesnitt.
MERK: mikroskop programvaren bruker et identifikasjons signatur å organisere fly og kanaler ved lagring stabler som individuelle' TIFF-filer. Den angitte unike filen streng innstillingen må angi signaturen tildelt av programvaren til det første flyet av den første kanalen (viktig: Billigste fly og kanalnummer må oppgis). - Velg bare under makro "Konverter til stable" og klikk "ok" og velg mappen der bildene ligger. Hvis en hovedkatalog med flere undermapper er valgt, alle individuelle' TIFF-filer innenforhovedkatalogen og mappen samsvarer med de unike STRING kriterier vil bli behandlet.
- Hvis z-stakken inneholder bare én kanal, velger den box "Channel en eneste".
- Legg merke til at to nye filer per NMJ bilde, som standard betegnes som stack_image_name og flatstack_image_name vises. Lagre bare disse stabel og flatstack for videre analyse. TIFF fil serie kan slettes ved dette punktet, noe som minsker den nødvendige lagringskapasiteten og unngår potensielle feilkilder.
4. Kjør Sub-makro "Define ROI" for å avgrense NMJ Terminal av interesse
- Starte det grafiske grensesnittet til "Drosophila NMJ Morphometrics".
- Bare velge avkrysningsboksen "Definer ROI" og trykk "OK" og velg den viktigste katalogen der bildene rett flatstack_name lagres og trykk på "Velg". Under makro "Definer ROI" søker automatisk gjennom alle undermapperinnenfor det valgte hovedkatalogen.
- Som den første projeksjon åpnes, velg "Freehand utvalg" verktøyet i verktøylinjen. Ved hjelp av musen trekke et utvalg som utelukkende inneholder hele NMJ terminal av interesse, og klikk "OK" i vinduet "Definer terminal". Makroen vil fortsette med neste projeksjon.
- Avgrense neste ROI og gjenta til alle Rois er definert. ROI bildefil, kalt "roi_image_name", vil bli lagret i samme katalog som de tidligere genererte stabelen og projeksjonsbildene for hver av de behandlede bilder. Utgangen av denne under makro er et binært bilde av ROI i hvitt på svart bakgrunn.
5. Kjør Sub-makro "Analyze" for å kvantifisere NMJ Terminal Funksjoner
- Gå til verktøylinjen, velg "Plugins" og bruk:
"Drosophila _NMJ_Morphometrics" ved analyse av synapser immunolabeled med anti-Dlg-1 eller anti-HRP (kanal 1) sammenmed anti-Brp (kanal 2), eller "Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics" ved analyse av synapser immunolabeled med anti-SYT eller anti-Csp (kanal 1) sammen med Brp (kanal 2).- Når en kanal bildestakker skal analyseres (det strukturelle kanal Dlg-1 eller HRP for "Drosophila_ NMJ_Morphometrics", eller SYT eller Csp for "Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics"), velger den box "Channel en eneste".
- Juster skala svarende til bildene som skal analyseres. Hvis en piksel i bildet svarer til 2,5 um, indikerer Scale-piksler = 1, Scale-Avstand i um = 2,5. I tilfelle begge innstillingene er igjen på 0, blir NMJ areal, omkrets, lengde og lengste gren lengde vil bli uttrykt i antall piksler.
- Om nødvendig, juster standard analyseinnstillingene for makro. Utfør justeringer bare hvis sub-makro "analyse" (denne delen med utilfredsstillende resultater, og Determined bedre innstillinger i seksjon 6) er kjørt.
- Velg avmerkingsboksene "Analyze" og "vent" og trykk "OK".
- Velg "Vent" boksen når du kjører sub-makro "Analyser" på 2 kanals bilder. Ellers feil i aktive sonen telling kan oppstå på grunn av begrenset data kapasiteter.
- Som et nytt vindu "Velg en katalog" åpner, velg katalogen hvor bildene er plassert og trykk "velg". Makroen vil analysere alle bildene som er lagret i hovedboken og eventuelt påfølgende mapper (ved hjelp av de tre filene fra å kjøre de tidligere under makroer: stack_image_name, flatstack_image_name og roi_image_name). Makro prosesser hvert bilde enkeltvis og etter hverandre. Dette kan ta flere minutter per bilde stabel (avhengig av datamaskinen kapasitet).
- Etter å ha kjørt makroen, oppmerksom på at en ny bildefil heter res_image_name for hver analysert synapse lagret vil være created i foreldremappen. De kvantitative målinger blir lagret som "results.txt" fil.
- Inspiser alle resultat bildene for å oppdage og inkluderer bilder med segmentering feil. Mulige segmentering feil er beskrevet i tabell 3, sammen med råd hvordan du kan justere innstillingene for å omgå disse. Resultat bilder med slike segmenteringsfeil er gitt som eksempler i figur 4.
MERK: Når du kjører makroen med standardinnstillingene observert i brukergrensesnittet, det var en nøyaktighet på ca 95% når makrovurdering ble sammenlignet med manuell evaluering 17.
6. Juster Makroinnstillinger til bilder
- Når mer enn 5% av bildene viser segmentering feil, utforske de forskjellige algoritmer for å definere / velge de best egnede makroinnstillinger for bildene.
- Juster rullende ball radiusverdien
MERK: Den rullende ball radiusfunksjon subtraherer bakgrunns av bildet. Denne funksjonen er av avgjørende betydning når du arbeider med bilder ervervet på fluorescensmikroskoper og / eller når bildene har høy bakgrunnsstøy. Subtraksjon av bakgrunnen vil bidra til den makrorens automatiske Terskelverdier fremgangsmåten for å produsere tilstrekkelig segmentering av de NMJ terminalene.- Velg tre NMJ Z-fremspring (flatstack_image_name bilder generert ved sub-makro "Konverter til stack") som er representative for bildedatasettet.
- I verktøylinjen velger du Bilde | farge | Split kanaler. To bilder vil bli opprettet, en representerer en kanal, og den annen kanal 2.
- Behold bare det bilde som hører til kanal 1 åpne, tilsvarende Dlg-1, HRP, SYT eller Csp immunmerking, og forkaste BRP kanalbilde ved å lukke bildet.
- Kjør filteret "Trekk bakgrunn" ved å velge "Process" i verktøylinjen etterfulgt av "Trekk Bakgrunn ..." i rullegardinmenyen.
- Klikk på forhåndsvisnings boksen i popup-vinduet og juster rullende ball radius til verdien som øker kontrasten mellom synapse og bakgrunn som i panelet (figur 5A).
MERK: Se figur 5 for et eksempel. I Figure5A, blir deler av synapsen viser de samme grånivåer som bakgrunn, mens i figur 5A' den 'rullende kule radius' satt til 500 genererer en sterk kontrast mellom synapsen og bakgrunnen. - Når den aktuelle verdi for den rullende ball radius er definert, kjør "Trekk bakgrunn" algoritme på de valgte Z-fremspring med samme rullende kule radiusverdien og lagre dem (i en katalog).
NB: Den rullende ball radiusverdien for 8-bits RGB-bilder eller bør være minst like stor som radien til det største objektet i det bilde som ikke er en del av bakgrunnen. For 16-bits og 32-bits bilder radius bør inversely proporsjonal med pikselverdiområdet 22.
- Bestem de ulike auto-terskler som skal brukes
- Åpne Z-anslag er lagret i forrige trinn (6.2.6) og velg bilde | Juster | AutoThreshold | Prøv alt.
- Som et binært terskel resultat Bildet vises med alle forskjellige auto-terskel algoritmer, bestemme den mest passende algoritme for bildene.
- Når du kjører makroen senere, endre terskelen i makro innstillingene deretter.
- Bruk mer restriktive terskler som "RenyiEntrophy" eller "Øyeblikk" som NMJ omriss terskel og mer ettergivende terskler som "Li" for å bestemme den NMJ skjelett, og "Huang" for å bestemme aktive soner. Når bildene er veldig skarp med liten eller ingen bakgrunn, bruk "Huang" som" NMJ disposisjon terskel. Ellers deler av synapsen kan være savnet etter bildesegmentering.
- Se figur 5B for et eksempel. Hensiktsmessig segmentering av synapsen oppnås med auto-terskler markert med grønne bokser. Noen eksempler på egnede ikke-terskler er markert med røde bokser (sjekk synapser ved høy forstørrelse). I det siste tilfellet blir enten deler av synapsen mangler eller deler av bakgrunnen er inkludert. Se referere 23 for mer informasjon.
- Bestemme den maksimale størrelsen av de små partikler
NB: Denne funksjonen vil utelukke alle partikler som gjenkjennes av NMJ omriss terskel og skjelett terskel som er mindre enn den definerte verdi i "små partikler innstilling" fra analysen. Denne verdi er definert i piksler. Denne funksjon tjener som et støyfilter, og er meget nyttig når høy forekomst av ikke-ensartet bakgrunn (for eksempel krystaller / støv) er til stede i de oppnådde bildene.- Åpne Z-anslag er lagret i trinn 6.2.6. og angiskalaen for å oppdage antall piksler via Analyser | Set Scale. Anvende følgende innstillinger: avstand i piksler = 1, kjent avstand = 1, pikselsideforhold = 1, Lengdeenhet = piksel og trykk på "OK". Klikk på "Oval utvalg" verktøyet i verktøylinjen.
- Ved å bruke musen tegne et utvalg tett rundt enkeltpartikler som er tilstede i immunfarging, men ikke hører til den NMJ. Trykk Ctrl + m for en Windows-bruker eller cmd + m for Mac-brukere. Et resultat vindu åpnes, noe som indikerer området for de utvalgte i antall piksler partikler.
- Gjenta forrige trinn flere ganger med en rekke gjenstander som er tilstede i bildene for å bestemme den største kontaminerende partikkel / artefakt område. Dette vil være den verdien som skal settes i innstillingen når du kjører makroen senere. Når man kjører makro sette "små partikler Size" som den minste partikkelstørrelsen observert pus en margin på 25%.
- Se figur 5D for et eksempel. Den største krystall oppdageed har et areal på 112 piksler. Innstillingen "Liten partikkelstørrelse", ved behandling av dette bildet med makro, bør settes to125 - 150.
- Bestem minimum bouton størrelse
NB: Denne funksjonen vil utelukke alle boutons detektert av NMJ omrisset terskel som er mindre enn den definerte verdi fra analysen. Denne verdi er definert i piksler.- Følge samme fremgangsmåte som beskrevet i avsnitt 6.4, men i dette tilfelle trekke et utvalg som omgir de minste boutons stede i NMJ terminal. Velg den minste området som tilsvarer den minste bouton av de målte seg. Dette er verdien å sette i minimum bouton størrelsesinnstillingen når du kjører makroen senere.
- Definer "Finn maxima støy toleranse" value
- Bruk Z-hyperstacks valgt i avsnitt 6.2.1.
- I verktøylinjen velger du Bilde | farge | Split kanaler til Create 2 stabler (for kanal 1 og kanal 2) og holde bildet som svarer til BRP kanalen åpen. Kast den andre kanalbilde ved å lukke den.
- Gå til kategorien plugins på hurtigmenyen, velg Process | Maksimum (3D), og når maximum_image_name vises (som kan ta opptil et par minutter), lukker den opprinnelige bildestakk.
- Velg Maximum ... image_name (oppnådd bildestakk) og velg Plugins | Process | Minimum (3D), lukk Maximum ... image_name stabelen.
- På verktøylinjen, velg Process | Finn maxima .... Et nytt vindu "Finn maxima ..." vil åpne. Klikk på boksen "Preview punktvalg ..." og fyll "Noise toleranse" boksen med standard makroinnstilling 50. Maxima poeng vil bli vist i bildet som små kors.
- Øke "Noise toleranse" verdi hvis observere et overskudd av merkede aktive soner, det vil si kors som er ikke på toppen av aktive soner som befinner segfokusere på den valgte stabel planet, eller falske aktive soner som er detektert i bakgrunnen.
- På den annen side, hvis observasjon av ufullstendig annotert aktive soner, dvs. aktive soner i fokus ikke ble merket som gjenkjennes, redusere "Noise toleranse" verdi. Fortsett å prøve forskjellige verdier ved å følge denne fremgangsmåten til kryssene er hensiktsmessig merking aktive soner i fokus. Fyll "Finn maxima støy toleranse" med denne verdien.
- Se figur 5C for et eksempel. detekteres for mange aktive soner. På figur 5C' bare de aktive soner i fokus blir detektert.
- Øke "Noise toleranse" verdi hvis observere et overskudd av merkede aktive soner, det vil si kors som er ikke på toppen av aktive soner som befinner segfokusere på den valgte stabel planet, eller falske aktive soner som er detektert i bakgrunnen.
- Kjør sub-makro "Analyse" for de representative bilder som er valgt i trinn 5.1, med innstillingene definert i alle de foregående trinn.
- Juster Brp-puncta nedre og øvre terskel
- Legg merke til at en ny fil vil bli vist etter å ha kjørt mAcro i henhold til trinn 6.6, kalt 2_active_zone_stack_image_name. I dette bilde stabel de aktive soner som detekteres av "Finn maksima" funksjon, er angitt med hvite punkter i hvert plan.
- Åpne denne filen ved å dra og slippe den inn i verktøylinjen, og velg bilde | stable | Zproject | Projection type = Sum skiver. En projeksjon av de 2_active_zone_stack_image_name vil bli oppnådd.
- Velg bilde | Juster | Terskel. Et nytt vindu "Threshold" vil åpne. Skyv den øvre staven til å velge en terskelverdi, hvor alle ønskede foci / Brp-positive flekker er visualisert i rødt.
MERK: Dersom terskelen er for lav, vil et overskudd av aktive soner telles. Hvis den er for høy, blir en fraksjon av de aktive sonene bli savnet.- Se figur 5E for et eksempel. Når terskelverdien er satt til 400, er de fleste av de aktive soner (symbolisert som en 1 piksel foki) ikke inkludert i segmentering, siden de ikke er merket med rødt (figur 5E). Når terskelverdien er satt til en verdi av 50 alle de aktive soner er merket med rødt (figur 5E).
- Definere denne verdi som minimumsterskel. La "Øvre puncta terskel" på maksimumsverdien.
- Kjør sub-makro "Analyze" for de representative bilder med innstillingene som er definert i alle de foregående trinnene i denne delen. Kritisk vurdere de resulterende bildefiler og sørge for at segmenteringen er gjort riktig. Hvis dette ikke er tilfelle justere innstillingene i henhold til arten av de segmenteringsfeil (figur 4, tabell 3).
Representative Results
Teksten resultater filen vil vises i hovedkatalogen. Den oppsummerer alle de målte parametre per bilde. Resultatene er koplet til filnavnet og parametrene blir deretter oppsummert i den rekkefølge som er angitt i tabellene 1 og 2.
Res_image_name er en tre-bildestabelen. Det første bildet fremhever omrisset og skjelettet av NMJ terminalen bestemmes av makro basert på kanal 1 (immunmerking Dlg-1, HRP, SYT, eller Csp). Det andre bilde er en kopi av det første bildet og i tillegg viser de identifiserte BRP-positive flekker som påvises i kanal 2 som skjematisert foci. Den tredje bilde gir maksimal projeksjon av den andre kanalen sammen med identifiserte Brp-positive foci.
Den NMJ omriss terskel er vist i gult i makroutdataene resultat bilde. NMJ området, PerimEter og antall boutons utledes fra denne grensen.
Den NMJ skjelettet terskel er vist i blått i makroutdataene resultat bilde. NMJ lengde, lengste gren lengde, antall filialer, forgrening poeng og øyene er utledet fra denne grensen.
Den NMJ aktive soner terskel ikke er representert i den makroutdataene resultat bilde. Denne terskel bestemmer det område hvor BRP-positive foci potensielt kunne bli påtruffet ved hjelp av makro. Den er ment å skape et NMJ område som er litt større enn den som er definert ved den NMJ omriss terskel. Når en for restriktive terskel er valgt, kan Brp-positive foci plassert ved ytterkanten av den synapsen utelukkes. Når terskelen blir for ettergivende, kan bakgrunnsstøy bli regnet som Brp-positive flekker (figurene 1 - 2).
til validate utførelsen av "Drosophila NMJ Morphometrics" makro, tre mutante betingelser som allerede er beskrevet for å presentere synaptiske defekter i forskjellige NMJ parametere ble undersøkt. Hver defekten ble detektert ved et annet bilde segmentering prosedyre som utføres av den makro (NMJ omriss, skjelett eller aktive soner henholdsvis 17). Etter rettet mot tre gener av interesse av induserbar RNAi og utøvende disseksjoner og NMJ farging av L3 larver ble makroen kjøres. De oppnådde NMJ morfologiske målingene ble deretter parvis (RNAi versus kontroll) sammenlignet ved anvendelse av en t-test. I alle tre tilfeller ble statistiske forskjeller funnet mellom mutanter og kontroller som påvirker parametre som er i overensstemmelse med tidligere rapporterte morfologiske defekter. Dette bekrefter at makroene er faktisk i stand til i tilstrekkelig grad å identifisere tidligere beskrevne mangler ved Drosophila NMJ.
Ankyrin 2 (Ank2, CG42734) mutanter er kjent for å vise synaptiske morfologi feil, herunder sammensmeltede boutons og mindre NMJs. Disse defekter ble observert for Ank2 mutanter 24, 25 og Ank2 knockdown fluer 26. NMJ klemmene til pan-neuronale Ank2- RNAi knockdown fluer (vekt; UAS-dicer-2 / UAS-Ank2 RNAi KK107238; elav-Gal4 / +) viste betydelig mindre NMJ område (gjennomsnitt = 339,25 um 2; t-test, p = 2,18 x 10 -8) og omkretsen (gjennomsnitt = 238,24 um, t-test, p = 1,82 x 10 -3), i forhold til den genetiske bakgrunnen kontroll datasett (w; UAS-dicer-2 / UAS-KK60100; elav-Gal4 / + ) (gjennomsnitt = 451,95 um 2 og bety = 288,62 um, respektivt) etter å ha kjørt "Drosophila NMJ Morphometrics" (figurene 6A og 4B).
Den GTPase Rab3 (CG7576) er nødvendig for riktig bruchpilot fordeling og rup mutant presenterer med et vesentlig redusert antall aktive soner 27. Det ble observert en signifikant reduksjon i antall aktive soner ved måling Brp-positiv foci av "Drosophila NMJ Morphometrics" makro i NMJ terminalene til pan-neuronale Rab3 knockdown fluer (vekt; UAS-dicer-2 / UAS-RNAi KK100787; elav -Gal4). Det gjennomsnittlige antall aktive soner pr NMJ terminal i Rab3 -RNAi var 138 i motsetning til 290 detektert i kontrolldatasettet (/ +) t-test, p = 4,43 x 10 -29) (Figurene 6A og 4C).
Highwire (hiw, CG32592) er en viktig regulator av NMJ vekst; mutasjoner i hiw-genet fører til overvokse og utvidet forgrening av de NMJ terminaler 28. Måling NMJ klemmene til pan-neuronal hiw -RNAi knockdown linje (w; UAS-dicer-2 / UAS-RNAi-GD36085; elav-Gal4 / +) med "Drosophila NMJ Morphometrics", ble det observert signifikante forskjeller i skjelett-avledede parametere: lengde (gjennomsnitt = 147,36 um, kontroll bety = 122,07 um; t -test p = 7,31 x 10 -7), lengste gren lengde (gjennomsnitt = 122,19 um, kontroll bety = 105,65 um, t-test, p = 4,62 x 10 -4) antall grener (gjennomsnitt = 7,69; tak middel = 5,74; t-test, p = 2,52 x 10 -2) og antallet forgreningspunkter (gjennomsnitt = 2,73; tak middel = 1,79, t-test, p = 3,31 x 10 -2). Alle disse parametrene ble signifikant øket (120-180%) sammenlignet med de genetiske bakgrunnskontroller (W; UAS-dicer-2 / UAS-GD60000; elav-Gal4 / +) (Figurene 6A og 4D).
Figur 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics måler 9 Parametere av Drosophila NMJ. Til venstre er Dlg-1 og Brp immunolabeled NMJ terminaler, avbildes på en fluorescens-mikroskop med ApoTome. På høyre er resultatet bilder etter å ha kjørt "Drosophila NMJ Morphometrics". Parametere areal, omkrets og boutons er representert ved hjelp av makro-annotert gul omriss indikert. Parametere lengde, lengste gren lengde (LBL), grener, forgrenings-punktene, og øyer er presentert ved hjelp av makro-kommenterte blå kontur. BRP-immunolabeled foci (aktive soner) er representert ved hjelp av makro som hvite flekker i resultat bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Drosophila NMJ Bouton Morphometrics måler 8 Parametrene til Drosophila NMJ. Til venstreer SYT-1 og Brp immunolabeled NMJ terminal, avbildes på en fluorescens-mikroskop med ApoTome. På høyre er resultatet bilder etter å ha kjørt "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Parametere boutons og bouton område er representert ved hjelp av makro-kommenterte gul omriss. Parametere lengde, lengste gren lengde (LBL), grener, forgrenings-punktene, og øyer er presentert ved hjelp av makro-kommenterte blå kontur. BRP-immunolabeled foci (aktive soner) er representert ved hjelp av makro som hvite flekker i resultat bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: flytskjema som representerer Drosophila NMJ Morphometrics og Drosophila NMJ Bouton Morphometrics makroer. Den første under makro "Konverter to stack" skaper spring og hyperstacks av den avbildede NMJs. Den andre sub-makro 'definerer roi' krever manuell input definerer plasseringen av NMJ terminal er av interesse. Under makro tre, 'Analyse', måler alle NMJ parametere. En tekst fil som inneholder de kvantitative verdier og et resultat bildefil som viser parameteren avgrensningen er laget for å hjelpe brukeren til evaluering av makro ytelse. Når bildene er anskaffet under forskjellige betingelser, makro innstillinger skal testes og justeres for å sikre nøyaktig analyse. Trykk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempler på Uegnede Macro Segmentering resultater. Resultat bilder etter å ha kjørt "Drosophila NMJ Morphometrics" eller 'Drosophila NMJ Bouton Morphometrics'. Deler av synaptiske terminal er ikke inkludert i den gule omriss (A). Deler av bakgrunnen er inkludert i den synaptiske terminal av den gule omriss (B). Blå skjelett linje strekker seg utover synaptiske terminal. (C - D) for mange aktive soner er detektert (E - E '). Noen aktive soner uoppdaget ved analysen (G - G'). aktive soner er detektert utenfor synapsen (F) Feil bouton segmentering. (Gjelder bare ved kjøring av Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons er savnet (H) eller for mange boutons detekteres av segmenter (i). Partikler en slik krystaller eller støv som er en del av bakgrunnen er inkludert i segmenteringen (J) . Informasjon om hvordan du endrer innstillingene for å unngå disse feilene er gitt i tabell 3 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempler på Macro-innstillingen Justeringer og deres konsekvenser for bildesegmentering. (A) Trekk bakgrunn forhåndsvisning av en Dlg-1 immunolabeled synapse, avbildes på en fluorescens-mikroskop med ApoTome, når "Rullende ball radius" er satt til 20 (A) eller 500 (A'). (B) Utgang bildene innhentet etter å ha kjørt bilde | Juster | Auto-terskel | Prøve alle bilde illustrerer bildesegmente oppnådd ved de 16 forskjellige autoterskel algoritmer. (C) "Finn Maxima" forhåndsvisning ved å sette opp "Noise toleranse" ved 50 (C) og 500 (C'); active soner som er oppdaget av segmenteringen er merket med et lite kors. (D) Måling av de "små partikler" som opptrer i bildebakgrunnen av en synapse immunolabeled med anti-HRP, avbildes på et konfokalt mikroskop. (E) "Sum skiver" projeksjon oppnådd fra 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Grensen er satt til 400 (E) og 50 (E'). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Macro Vurdering og Kvantifisering av NMJs på muskel 4. (A) Resultatbilder etter å ha løpt "Drosophila NMJ Morphometrics" makro på Dlg-1 og Brp immunolabeled NMJ terminaler. Parametere areal, omkrets og boutons er representert ved hjelp av makro-kommenterte gul omriss. Parametere lengde, lengste gren lengde (LBL), grener, forgrenings-punktene, og øyer er presentert ved hjelp av makro-kommenterte blå kontur. BRP-immunolabeled foci (aktive soner) er representert ved hjelp av makro som hvite flekker i resultat bildene. Målestokken viser 20 um. (B) Ankyrin2 RNAi knockdown oppviser et mindre NMJ areal og omkrets i forhold til genetiske bakgrunnskontroller. (C) Rab3 knockdown resulterte i NMJs med et lavere antall BRP-positive aktive soner i forhold til genetiske bakgrunnskontroller. (D) Highwire knockdown resulterte i lengre tid, høyere lengste gren lengde, mer forgrenet og med flere forgreningspunkter pr NMJ terminaler sammenlignet med genetiske bakgrunn kontroll NMJs. Feilstolper indikerer SEM ** p <0,01, to-halet t-test. Klikk hanre for å se en større versjon av dette tallet.
| Parameter | NMJ struktur | Forklaring |
| Area (μm2) | NMJ disposisjon | Arealet av hele merket NMJ |
| Perimeter (um) | NMJ disposisjon | Omkretsen som hører til området |
| #Boutons | NMJ disposisjon | Antallet av synaptiske boutons ( 'perler på en snor') av NMJ |
| Lengde (mm) | Skjelett | Den totale lengden av den komplette NMJ terminal |
| Lengste gren lengde (mm) | Skjelett | Summen av lengden av den lengste kontinuerlig bane som forbinder alle to endepunkter NMJ |
| #Branches | Skjelett | Det totale antall grener |
| #Branching punkter | Skjelett | Antallet grenpunkt (flere grener kan utlede fra ett forgreningspunkt) |
| #Islands | Skjelett | Antallet ikke-tilkoblede Dlg1-positive synaptiske kammere (eller hvilken som helst annen farging) |
| #Active soner | BRP-positive flekker | Antallet aktive soner, basert på Brp farging |
Tabell 1: NMJ parametere som måles ved "Drosophila NMJ Morphometrics". De NMJ parametre som måles ved den "Drosophila NMJ Morphometrics" makro vil vises som en liste i den oppnådde tekstfilen, i den rekkefølgen som er beskrevet i denne tabellen. Denne tabellen er gjengitt fra Nijhof et al. 17
| Parameter | NMJ struktur | Forklaring |
| Boutons | NMJ disposisjon | Antallet av synaptiske boutons ( 'perler på en snor') av NMJ |
| Bouton område | NMJ disposisjon | Det totale arealet av alle boutons |
| Lengde (mm) | Skjelett | Den totale lengden av den komplette NMJ terminal |
| Lengste gren lengde (mm) | Skjelett | Summen av lengden av den lengste kontinuerlig bane som forbinder alle to endepunkter NMJ |
| #Branches | Skjelett | Det totale antall grener |
| #Branching punkter | Skjelett | the antall forgreningspunkter (flere grener kan utlede fra ett forgreningspunkt) |
| #Islands | Skjelett | Antallet ikke-tilkoblede Dlg1-positive synaptiske kammere (eller hvilken som helst annen farging) |
| #Active soner | BRP-positive flekker | Antallet aktive soner, basert på Brp farging |
Tabell 2: NMJ parametere som måles ved "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". De NMJ parametre som måles ved den "Drosophila _Bouton_NMJ_Morphometrics" makro vil vises som en liste i den oppnådde tekstfilen, i den rekkefølgen som er beskrevet i denne tabellen. Denne tabellen er gjengitt fra Nijhof et al. 17
| segmentering | Eksempel | nødvendige justeringer | ||
| NMJ areal og omkrets (representert ved gult omriss i resultat bilde) | Deler av den synaptiske terminal er enten ikke tatt med i den gule omrisset eller deler av bakgrunnen er inkludert i den synaptiske terminal skissert i gult. | Figur 5A-B | Adjust 'rullende ball Radius' verdi. Se pkt 6.1. | Juster 'NMJ disposisjon terskel'. Se pkt 6.2. |
| NMJ lengde relaterte parametere (representert ved blå skjelett linje i den resultater bilde) | Blå skjelett linje enten strekker seg utover eller er ikke til stede langs hele den synaptiske terminal. | Figur 5C-D | Adjust 'rullende ball Radius' verdi. Se pkt 6.1. | Juster 'NMJ disposisjon terskel'. Se pkt 6.2. | </ Tr>
| BRP-positive puncta (vist med prikker på resultater bilde) | detekteres for mange aktive soner. | Figur 5E-E' | Reduser 'Finn maxima støy toleranse' verdi. Se pkt 6.5. | |
| BRP-positive puncta (vist med prikker på resultater bilde) | Aktive soner er savnet av analysen. | Figur 5G-G' | Øke 'Finn maxima støy toleranse' verdi. Se pkt 6.5. | Reduser 'Brp-puncta lavere terskel'. Se pkt 6.6. |
| BRP-positive puncta (vist med prikker på resultater bilde) | Aktive sone gjenstander er detektert utenfor den synaptiske terminal. | Figur 5F | Juster 'Aktiv Zone terskel' punkt 6.2. | Øke 'Brp-puncta lavere terskel'. Se pkt 6.6. |
| små partikler | Partikler en slik krystaller eller støv som er en del av bakgrunnen komme til å bli inkludert i den segmentering. | Figur 5J | Velg boksen 'Fjern små partikler'. Se pkt 6.3. | Bestemme små partikler maksimal størrelse. Se pkt 6.3. |
| Bouton segmentering | Feil bouton segmentering (Gjelder bare Drosophila NMJ Bouton Morphometrics, ikke bruk Drosophila NMJ Morphometrics for bouton segmentering). | Figur 5H-I | Juster 'NMJ disposisjon terskel'. Se pkt 6.1. | Bestem 'minimum bouton størrelse'. Se pkt 6.4. |
Tabell 3: Feilsøking Guide for de forskjellige typer feil i bildesegmentering som kan produseres av makroer. Denne tabellen beskriver ulike typerimage segmentering feil produsert av makroer. Disse kan lett detekteres i resultatene bildene. Eksempler på hver feiltype er vist i figur 4. I "tilpasninger avsnittet" i tabellen, er de innstillinger som må justeres fremhevet, og brukeren blir referert til den kritiske undertrinn av seksjon 6, som beskriver hvordan å justere disse innstillinger.
Discussion
"Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" er kraftige verktøy for forskere som er interessert i å vurdere synapse morfologi. Manuell vurdering av NMJ parametre er arbeidskrevende; Det er anslått at makroene ville spare en erfaren forsker opp til 15 min / NMJ brukt på manuell bildesegmentering. Med en til to dusinvis av synapser evaluert per tilstand eller genotype, oppsummerer dette raskt opp til betydelige mengder spart tid, selv i små skala studier. Når man utfører store skjermer, gevinsten av å bruke høy gjennomstrømning analyse, sammenlignet med manuell vurdering og kvantifisering kan være enorm. I tillegg til øket gjennomstrømning, makroene gi lett objektiv analyse; de ekskluderer personlige fordommer som ellers krever blindet eksperimenter samt mellommenneskelige forskjeller som oppstår når flere forskere er involvert i analysen. Endelig makroene gir en følsom og nøyaktig enalysis av NMJ funksjoner, slik at identifisering av synaptiske regulatorer som forårsaker snarere subtil enn dramatiske NMJ defekter og har så langt holdt seg lite verdsatt av forskeren øye. Detaljert informasjon om validering prosedyrer og algoritmer som brukes i makroene finnes i publikasjonen Nijhof et al. 17.
Funksjonaliteten av makroene er validert for hensiktsmessig måle morfologiske trekk av Drosophila melanogaster NMJs ved muskel 4. Deretter ble det vist at makroene var også egnet for å analysere synapser på andre muskler i denne organisme. Det er sannsynlig at makroene kan også brukes til å måle morfologiske parametere av NMJ med lignende struktur i andre arter, inkludert andre Drosophila-arter og ytterligere insekter. Selv NMJs svært fjerne i utvikling, for eksempel, NMJs av musene, som viser en ganske lignende strukturell konformasjon 29. Makroene har ikke blitt testet på NMJ forberedelser fra andre arter, men potensielle brukere oppfordres til å teste makroer til slike formål.
Det er svært viktig at brukeren utforsker de forskjellige auto-terskler og algoritmer for å definere / velge de best egnede makroinnstillinger for bildene. Med disse innstillingene, er en nøyaktighet på ca 95% oppnås når makrovurdering ble sammenlignet med manuell evaluering. Justere makroinnstillinger til riktig segment 100% av bildene kan være en svært arbeidskrevende eller umulig prosedyre. Det anbefales derfor utelukkelse av bilder ikke riktig segmentert hvis deres tall er under 5%. Øyensynlig, hvis kvaliteten av bildene er lav, vil makroene generere høyere forhold på utilfredsstillende bilde segmentations. bilder lav kvalitet vil på samme måte påvirke manuell evaluering og kan derfor ikke være knyttet til utførelsen av makroene. Likevel makroene er ganske robuste som de var ment for bildes generert på et høyt innhold mikroskop (en automatisert fluorescens mikroskop som tillater avbildning av store antall prøver) 17.
Et kritisk punkt er at brukeren visuelt kontrollerer alle resultat bilder generert ved makroene. Dette vil tillate å oppdage og inkluderer bilder med utilfredsstillende segmentering. I kapittel 6 i denne protokoll, blir brukeren guidet hvordan å justere innstillingene for korrekt bilde segmentering når du kjører sub-makro "Analyze". Hvis du raskt kjent med kravene til makroer og hvordan du justerer makroinnstillinger en mappe som heter "Examples_adjusting makroinnstillinger" er inkludert i makro repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Tretten undermapper, hver med eksempler avbildninger som fremkommer ved forskjellige mikroskop plattformer (høyt innhold / konfokal / fluorescensmikroskoper) og forskjellige immunostainings, er gitt. En PDF tittelen “Eksempler guide” er inkludert i sammemappen hvor de nødvendige innstillingene for hvert eksempel er gitt, sammen med et tekstdokument som gir de forventede resultater og resultater bilder.
Makroene ble utviklet for å behandle bilder som er lagret som TIFF separerte filer, likevel enkelte brukere kan ha lagret bildene sine i et annet format. Følgende nettsted https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 inneholder en mappe som heter "Drosophila NMJ" der tre eksempelfiler (eksempel 1-3) og dokumentet "Eksempler Guide" med detaljerte instruksjoner hvordan du importerer bilder til makro om ikke lagret som TIFF-separerte filer kan også bli funnet i den samme mappen.
Sammen "Drosophila NMJ Morphometrics" og "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" makroer kvantifisere ti forskjellige NMJ funksjoner: NMJ området, NMJ omkrets, antall boutons, NMJ bouton området, NMJ lengde, NMJ lengste grenen lengde, antall islands, antall grener, antall forgreningspunkter og antall aktive soner. Dette gir en stor fordel over så langt tilgjengelige verktøy som kan vurdere bare ett eller noen få synaptiske funksjoner 30, 31. Multiparametrisk kvantitativ analyse bærer et stort potensial for nye funn, for eksempel, for å identifisere nye regulatorer som styrer en opp til mange aspekter av synapsen biologi. Det gir også den nødvendige oppløsning for å bestemme gener som coregulate nøyaktig de samme eller overlappende NMJ egenskaper og således er egnet til å operere i vanlige molekylære reaksjonsveier. Til slutt, åpnes det mulighet for å undersøke hvordan forskjellige parametre synaptiske korrelerer med hverandre i uforstyrrede betingelser 17 og som gener som sikrer slike koordinerte morfometriske korrelasjoner.
Til sammen illustrerer denne protokollen hvordan du bruker de to makroer "Drosophila NMJ Morphometrics" og"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", som utfører objektiv og følsom kvantifisering av ti morfologiske NMJ funksjoner i en high-throughput måte.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner Wien Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila lager senter (NIH P40OD018537) for å gi Drosophila stammer. Vi takker Jack Fransen fra mikroskopisk Imaging Center for kompetansestøtte i bildebehandling. Denne studien ble støttet av VIDI og topp tilskudd (917-96-346, 912-12-109) fra nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO), av to DCN / Radboud University Medical Centre Stipendiater, av den tyske mental retardasjon Network finansiert av NGFN + program for den tyske føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF) og av EUs FP7 storskala integrerte nettverks Gencodys (HELSE-241995) til AS. De organer hadde ingen rolle i studieutforming, datainnsamling og analyse, beslutning om å utgi, eller fremstillingen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
- Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
- van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
- Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
- Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
- Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
- Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
- Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
- Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
- Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
- Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
- Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
- Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
- Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
- Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
- Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
- Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902 (2013).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
