Summary
ويصف هذا البروتوكول منهجية الفائق للشاشة وظيفيا للإرث القائم على البروتين في S. cerevisiae.
Abstract
ترميز المعلومات البيولوجية التي يمكن الوصول إليها لأجيال المستقبل عموما يتحقق عن طريق إدخال تغييرات على تسلسل الحمض النووي. الوراثة المعمرة المشفرة في البروتين المطابقة (بدلاً من تسلسل) منذ فترة طويلة وتعتبر تحول النموذج ولكن نادرة. أفضل الأمثلة تتسم هذه عناصر جينية هي البريونات، التي تمتلك سلوكاً ذاتيا تجميع التي يمكن أن تدفع بمظاهر جديدة تعمل الموروثة. البريونات التوراتية العديد من عرض تحيز تسلسل N/Q-الأغنياء ملفتة للنظر وتجميع في حظيرة اميلويد. وقد أبلغت هذه الميزات غير عادية معظم جهود الفحص لتحديد جديد بريون البروتينات. ومع ذلك، عدم إيواء ثلاثة على الأقل البريونات المعروفة (بما في ذلك بريون المؤسسين، الحزب الثوريSc) هذه الخصائص البيوكيميائية. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب بديل للتحقيق في نطاق الإرث القائم على البروتين يستند إلى خاصية العمل الجماعي: overexpression عابرة من بروتينات بريون يزيد التردد الذي يحصلون تكيف قولبة المتمتعة بالحكم الذاتي. وتصف هذه الورقة أسلوباً لتحليل قدرة الخميرة أورفيومي للحصول على الإرث القائم على البروتين. باستخدام هذه الاستراتيجية، وجدنا سابقا أن > 1% بروتينات الخميرة يمكن أن تغذي ظهور الصفات البيولوجية التي كانت طويلة الأمد ومستقرة، وقد نشأ أكثر من الطفرات الوراثية. يمكن استخدام هذا النهج في إنتاجية عالية عبر أورفيوميس كامل أو كنموذج فحص المستهدف للشبكات الجينية المحددة أو المحفزات البيئية. مثلما شاشات الجينية إلى الأمام تعريف المسارات الإنمائية وإشارات عديدة، تقدم هذه التقنيات منهجية للتحقيق في تأثير الوراثة على أساس البروتين في العمليات البيولوجية.
Introduction
كثيرا ما تواجه النظم البيولوجية تقلبات عابرة في وفرة البروتين. لم يتضح ما إذا كانت هذه يكون لها تأثير دائم في تشكيل النمط الظاهري للكائن الحي أو للأجيال المقبلة. الحالات الأكثر شهرة من هذه الأحياء تشمل فئة نادرة من البروتينات، البريونات، التي تدفع ظهور السمات الموروثة دون تعديل الجينوم. بدلاً من ذلك، يحيل هذه الجسيمات فيكتيوس تيناسيوس و في بروتعمل عن طريق تغييرات مستديمة للبروتين المطابقة1،2. تم اكتشاف هذا النوع من الميراث كسبب لأنماط الإرث غير عادية من مرض الأعصاب المدمرة. ومع ذلك، أظهرت الدراسات في الكائنات الحية بدءاً من الفطريات للثدييات4،3،5،7،،من68،،من910 منذ ذلك الحين أن عناصر مثل بريون يمكن أن يضفي قيمة تكيفية. ومع ذلك، قد يعتبر البريونات رائعة لكنها نادرة غرائب البيولوجية.
ويعقد هذه الحكمة السائدة في الجزء لتوصيف الإرث القائم على البروتين طويلة قد تم تقييدها من قبل مجموعة صغيرة من الأمثلة. جهود الفحص المنهجي الأخيرة اتسعت هذه الصورة إلى حد كبير بتحديد عدة البريونات حسن النية الجديدة11 والبروتين تقريبا أربعة وعشرين المجالات12 مع القدرة على تحويل الوقود مثل بريون conformational. ومع ذلك، نظراً لأن هذه النهج قد تركز عموما على التحيزات القائمة على تسلسل الأحماض الأمينية القوية، البريونات التي تم اكتشافها تشترك في الخصائص البيوكيميائية للمؤسسين الخميرة البريونات [هذه المبادرة+]13،14و [URE3]15، و11،[RNQ+]16. وتشمل هذه: 1) وحدات المجالات التي هي غنية في البوليمر طويلة تمتد من الهليونين (N) والجلوتامين (Q)، 2) الجمعية إلى اميلويد [بريون+] تكيف17،،من1819، و 3) إكمال الاعتماد على ديساجريجاسي الدالة Hsp104 لإكثار المؤمنين من الأم إلى الابنة13،،من2021. والواقع أن الكثير من حسن النية البريونات، بما في ذلك [غار+]، [Het-s]، وحتى بريون الأصلي (PrPاتفاقية استكهولم)، سوف تضيع تحت هذه المعايير الصارمة. وربما الأهم من ذلك، أنهم سيكون غير قادر على التقاط أي آليات جديدة من الإرث القائم على البروتين22. وهكذا، قد يكون اتساع هذه الظواهر البيولوجية الحقيقية الآن أكثر شيوعاً في الطبيعة مما يفترض مسبقاً.
للتحقيق في هذه المسألة، كان يعمل في استراتيجية الفائق والبروتين على نطاق المنظومة. من السمات مميزة البريونات كافة، بما في ذلك الحزب الثورياتفاقية استكهولم، [غار+]، و [Het-s]، أن overexpression عابرة من البروتينات المسببة بشدة يزيد معدل بريون اقتناء15،،من2324،،من2526. وقد اتخذنا الاستفادة من هذه الميزة أن تسأل بشكل منهجي، عبر الكامل الخميرة أورفيومي، إذا كانت الدول المستندة إلى البروتين، وجينيه مستقرة يمكن الشروع في طريق عابر حمل overexpression البروتينات الفردية. ومن المعروف جيدا أن overexpression البروتين يمكن أن يغير تعمل27. ومع ذلك، بروتينات بريون غير عادية لعلى الإفراط في إنتاج مؤقت ينتج تغيير في النمط الظاهري هو الموروثة لعدة مئات من الأجيال بعد أوفيريكسبريشن الأولى. وقد لاحظنا سابقا الاستفادة من هذه الميزة، فضلا عن أنماط الإرث غير عادية من العناصر الوراثية المستندة إلى البروتين، التعرف على العشرات من البروتينات التي قادرة على هيريتابلي إعادة الأسلاك المظهرية المناظر الطبيعية دون تغيير الجينوم28. على الرغم من أن بعض التعرف على البروتينات كانت معروفة سابقا البريونات، معظم لم تكن، مما يؤكد قوة هذا النهج للكشف عن أشكال جديدة من الإرث القائم على البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وحددت البريونات الخميرة الأولى تعمل غير عادية وأنماط محيرة من الميراث. خصائص هذه البريونات ثم استخدمت لبناء الخوارزميات والأدوات الحاسوبية للشاشة لبروتينات بريون إضافية. الأسلوب الموصوفة هنا، على النقيض من ذلك، التجريبية وتعتمد على overexpression عابرة لإنشاء دائم التغير في ثابت ترميز الدولة في تشكيل البروتين. ومع ذلك، إذا كفاءة "بذر" بريون الجمعية التي أوفيريكسبريشن لأي بروتين معين منخفض جداً، ستخرج هذا البروتين باستمرار كصورة سلبية كاذبة في شاشات overexpression من هذا النوع. واحد مثل هذا التعديل لتصحيح هذا سيكون استخدام بلازميد ميكرون 2 للبروتين أوفيريكسبريشن في المستقبل والتجارب. وأخيراً، كل بريون المستحث لديها مجموعة فريدة من نوعها للنمو تعمل وسوف لا يكون واضحا في كل حالة جزيئي. وهكذا، يحد من العدد من الظروف المختلفة وجرعات اختبار عدد مرات الدخول.
الأهم من ذلك، ليست كافة أنواع الإرث القائم على البروتين سيتم أيضا استرداد باستخدام هذا الأسلوب. البروتينات التي لا يمكن أن أوفيريكسبريسيد كفاءة أو دون السمية ومن الواضح أن استمرار سيفتقد. ابدأ أن نشر عناصر ميتوتيكالي غير مستقرة، مثل "منيمونس"، للبنات بعد أوفيريكسبريشن الأولى22. في المقابل، يمكن نظرياً الناجم عن أنواع أخرى من رموز التبديل بيستابل المعمرة عبر overexpression عابر42،43. ومع ذلك، هذه الدول ليست عادة تعتمد على البروتين التماثل الساكن إليه أو التي تنتقل عن طريق البروتينات "المصنف". وبالإضافة إلى ذلك، سوف تفشل البريونات التي تعتمد على مرافقين (خارج Hsp70 و Hsp104) أو غيرها من الأسلحة الإضافية لشبكة البروتين التوازن لإكثار فحوصات وصي-التبعية الموصوفة هنا. أخيرا، قد يكون وفرة منخفضة بروتينات التي تشكل أيضا اميلويد معدلات العدوى الحد الأدنى للكشف في الإعداد تحول البروتين.
ويصف هذا البروتوكول تقنية لحمل الدول جينية مستقرة القائم على البروتين بواسطة overexpression البروتين، فضلا عن اتخاذ مزيد من الخطوات النهائية للتحقق من صحة ما إذا كان كل فعل الدولة جينية بريون حسن النية . المثال المعروضة في هذه الورقة، Psp1، هو مثال على البروتين الذي يعرض تحيز "بريون--مثل" من الأحماض الأمينية ويمكن من الناحية النظرية يمكن استردادها مسبقاً باستخدام وضع خوارزميات bioinformatic. ومع ذلك، عجز Psp1 لتشكيل اميلويد واعتمادها وصي غير عادية (Hsp104) سوف يكون بسرعة من أهلية المزيد من التحليلات وبالتالي القضاء عليه من النظر بريون. ومع ذلك، فحص التقنيات المعروضة في هذه الورقة هم أدري بهذه الافتراضات وبدلاً من التركيز على أنماط الوراثة الكامنة وكفاية البروتين وحدها أن تحيل تعمل المقابلة. في الواقع، كان الغالبية العظمى من الإرث القائم على البروتين استردادها مع هذا الأسلوب خاليا من التحيز تسلسل N/Q-الأغنياء.
تم استخدام هذا الأسلوب للتحقيق الخميرة كامل أورفيومي لقدرته على الحصول على الإرث القائم على البروتين بطريقة غير منحازة استخدام سوى عدد صغير من عوامل الإجهاد (كلوريد الكادميوم 25 مم، كلوريد الكوبالت 1 مم، كبريتات النحاس 2 مم، دياميدي 1 مم، الفلوكونازول 0.2 مم، هيدروكسيوريا 50 مم، وكلوريد المنغنيز 20 مم، بركات 0.75 مم، 50 مم راديسيكول، 80 ي/م2 إشعاع الأشعة فوق البنفسجية ، وسلفات الزنك 10 ملم). بيد يمكن بسهولة تعديل هذا النهج إلى شاشة شبكات الوراثية أو الاستجابات الخلوية محددة بطريقة أكثر استهدافاً. للمثال، البروتينات ذات الصلة وظيفيا أو جميع البروتينات وينظم يمكن المستحث عن طريق عابر overexpression شبكة إرسال إشارات منفصلة وفرزهم مع عوامل الإجهاد التي تتصل بوظيفتها البيولوجية. وفي المقابل، يمكن فرز مجموعة أكبر من البروتينات مع مجموعة أكثر شمولاً من عوامل الإجهاد للتحقيق في ما إذا كانت الاستجابات الخلوية محددة تطورت بطبيعة الحال ميناء تبديل بريون. وأخيراً، على الرغم من أننا قد أجريت هذه الدراسات في الخميرة، جوانب عديدة من التجارب (مثل البروتين عابر التعبير، وصي "علاج"، إلخ) يمكن تعميمها على سائر نظم نموذجية في المستقبل. على سبيل المثال، زراعة أنسجة الثدييات قابلة ل overexpression عبر الأنظمة المستندة إلى بلازميد، والبؤر الأسفار يمكن أن تستخدم أيضا كقراءات الموروثة التجميع الذاتي، كما وصف سابقا28. وعلاوة على ذلك، يمكن أن أعرب في الخميرة متواليات ترميز البروتين من الكائنات الحية الأخرى واختبار لقدرتهم على الحصول على الإرث بريون-مثل استخدام الأساليب الموضحة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر تشاكرابورتي سوني وساندرا جونز وديفيد غارسيا، بولار بهوبيندر، تشانغ إميليا، أنها ريتشارد وسوزان لندكست لمساعدتها في تطوير الاختبارات المستخدمة في هذه الورقة، فضلا عن المراجعين لتعليقاتهم مدروس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
