Summary
ここでは、遺伝子発現および寿命に関連して広範な範囲の食餌療法の制限するためのフレームワークを提案する.広い範囲の食餌療法の制限のため、このパラダイムの下での遺伝子発現の定量的影像化のためのプロトコルについて述べる。我々 はさらに食品センシングに関わる遺伝的回路の情報処理機能の基になるを明らかにする計算解析を概説します。
Abstract
感覚系は、検出、処理、およびその環境に対応する動物を許可します。豊富な食品は動物生理・行動に大きな影響を持つ環境のキューです。最近では、食料豊富で線虫線虫の寿命の変調はより複雑な以前は認識を示した。食品レベルの変化に寿命の応答性は、神経回路内の情報処理を制御することによって動作する特定の遺伝子によって決定されます。体制は、遺伝学的解析、ハイスループット定量イメージングおよび情報理論を組み合わせたものです。ここでは、我々 は食餌療法の制限の広い範囲に生理学的な関連性のある遺伝子を特徴付けるためのこれらのテクニックの使用方法について説明します。具体的には、このワークフローは興味の遺伝子が広い範囲の食餌療法の制限の下での寿命を調節する方法を明らかにするためです。その後、遺伝子の発現が食品レベルによってどのように変化するかを確立するにはそして最後に、食品環境の豊かさについて遺伝子発現によって伝えられる情報量の定量化と公平を提供します。いくつかの遺伝子は神経回路のコンテキストで同時に調べたところ、このワークフローは回路で採用されているコーディング戦略を検出できます。
Introduction
すべての生物は、感知し、彼らの生存を確保するため環境の変化に対応することができる必要があります。動物では、神経系は主な検出器と環境に関する情報のトランスデューサーし生物の生存1に影響を与える可能性があります変更する生理学的応答を調整します。豊富な食品は、環境的には複数のコンテキストでよく研究採餌2などの食品関連の動作を制御するだけでなく、動物の寿命にも影響します。食品豊富に変更による寿命の変調食餌療法の制限 (DR) と呼ばれる現象で、広範な進化的保存3。
線虫の線虫は、生物の基本的な質問に対処するため強力なモデル システムです。RNAi とin vivo遺伝子編集のテクニックなど、ワームのゲノムの操作を可能にする技術の茄多が開発されています。ワームとその光透過性の小さな物理サイズも両方の転写と並進蛍光レポーターの生体内イメージングとマイクロ4などの高速技術の有用性に自分自身を貸します。一緒に、これらのツールがどのように神経回路直接動物の動作を調べるに活きます。
線虫 c. エレガンスbacterivore、細菌濃度5,6,7,8 を操作することによって豊富な食品の正確な制御を可能にするいくつかの方法が公開されています。.線虫研究コミュニティの中で博士は、2 つの異なるコンテキストで研究されています。それは他の有機体で食品レベルの高いレスポンスで見られる変化をミラー、最初に '古典的な DR' を呼ぶことができます。このコンテキストで広告自由のレベルから食べ物豊富を減少、までの最適条件に達すると、このポイントの長寿食品6,7、さらなる削減と減少した後増加寿命の結果します。 9。DR は、線虫の研究されている 2 番目のコンテキストは、ワームの寿命を増加して、細菌食品ソース10,11の完全な除去して栄養不足です。これらの 2 つの異なるパラダイムに起因する DR の複雑さを調べることができますを示した Entchev ら (2015) で12、同時にコンテキストで '広い範囲 DR' と呼びます。以下のプロトコルを使用して、我々 は遺伝子の新しいクラスを識別 DR に関与する双方向食品豊富に寿命応答を調節して食品12 (図 1) を感覚神経回路に関与しています。
環境の変化への動物の応答を統合生理学環境情報を伝える複雑な規制の相互作用に感覚のシステムをリンクする生物学的プロセスのシーケンス。このような「情報の流れ」機構詳細はよく知られているが、遺伝学的ツールはさまざまな生物学的コンポーネント間で複雑な計算を編成する方法への洞察力を取得する使用できます。Daf-7 tph 1がc. の elegans12で寿命を調節する食品検知の神経回路を通して食べ物、豊かなに関する環境情報の伝送にかかわることを示した私たちの最近の作品,1314情報理論の数理的枠組を適用すると、 daf 7との遺伝子発現変動によって表されるビットの面での環境情報の量を定量化することができました 1 tph。異なる食品レベルにわたって特定のニューロン。これからができましたし、エンコードの戦略この神経回路とそれを制御する遺伝的方法で採用されている (図 2) を明らかにすること。
次のプロトコルでは、特定のニューロンで表現される興味のある遺伝子の影響とどのように彼らが食品情報の流れ寿命環境から参加を理解するための手順の概要を説明します。一般的に言えば、2 つ実験的プロトコルおよび計算ワークフロー体制に分割されます。実験的側面の変異を持つことが重要です広い範囲の下で検査することができます興味のある遺伝子の博士の忠実な転写記者がさまざまな食品のレベルで遺伝子の発現レベルを定量化する必要も。本手法で説明した計算の分析を実施することができる、データセット式分布の意味のある見積もりを提供する十分な大きさにする必要があります。にもかかわらず、解析のテンプレート ソース コードを提供する、ユーザーは、計算体制全体で広く使用する情報理論の言語に精通している必要があります。ソース コードは、R および C++ で書かれています。したがって、ある程度のプログラミング能力も有意義な方法でそれらを適用する必要です。
Protocol
1 細菌文化の準備、一般的なワーム培養用プレート
- 250 mL 瓶のホストゲノム スープ (LB) メディアの 100 mL を準備し、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。 。
- 大腸菌 株 OP50 の単一コロニーをボトルに接種、37 ° C で一晩インキュベートし、4 ° c まで必要な文化を格納します 。
- 滅菌 6 cm プラスチック シャーレに滅菌線虫成長の 5 L 中 (NGM) 寒天培地 15 そして因数 12 mL ボリュームを準備します 。
- 一晩を設定し、必要になるまで 4 ° C で保存する寒天を許可します 。
- シード NGM プレート冷蔵 OP50 文化の 225 μ L で使用する、少なくとも 3 日前までに。20 ° c まで必要な板を格納します 。
2。細菌文化および実験のための希薄の準備
- 2 L の三角フラスコに LB 媒体の 500 mL の 2 つのロットを準備し、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい 。
- OP50 単一コロニー各フラスコに接種し 37 ° c 前後 14 h の 200 rpm で揺れ成長
- は、50 μ g/mL の最終的な集中に抗生物質のストレプトマイシンと文化を補足します。37 ° C で 30 分で 15 分間氷の上を入れ、フラスコの揺れ続ける
- 個別滅菌遠心ボトル (理想的には 500 mL 容量瓶文化の分割を避けるために) に各文化の転送 450 mL。それが細菌の濃度を決定するためとしているが、氷の上残りの文化を保持します 。
- スピン ・ ダウン 4 ° C で 25 分間、冷却遠心機セットで 4500 x g でボトル破棄上清と氷のボトルを保存
- は、分光光度計のゼロに滅菌ポンドのポンド使用 1 mL の滅菌の 900 μ L で各フラスコから残っている文化の 100 μ L を希釈し、各カルチャの 10 倍希釈の OD 600 を決定します。たとえば、一晩かけて培養の 10 倍希釈の OD 600 が 0.28 なら文化が 2.8 の実際の外径 600 。
- 使用 1.12 x 10 の細菌の作業原液 10 OP50 セル/mL、56 の OD 600 に相当します。したがって、上から 2.8 の例外径 600 を使用するで再懸濁します 450 mL 文化からペレット 22.50 mL をこの場合は、元のボリュームの 20 番目。滅菌 S 基底溶液 50 μ g/mL (SB + 連鎖球菌) にストレプトマイシンを補充と細菌を再懸濁します 。
- 滅菌 SB + 連鎖球菌性の適切なボリュームでペレットを再懸濁します 。
- SB に在庫のシリアル希薄からの実験で使用されるすべての後続の濃度を作る + 表 1 に示す希釈倍率を使用して連鎖球菌 。
3。寿命実験を設定
注: 6 cm 処理培養 12 ml ストレプトマイシン、carbenicillin (NSC), 50 μ g/mL の最終的な集中の両方を添加した NGM 寒天の寿命試金されます。これらの組織培養プレート、ワームの板の壁に付着し、乾燥が大幅減ります、寿命試金なしでまたは非常に低細菌濃度も適しています。2 種類の抗生物質の使用は、プレートに細菌の濃度を制御するに重要である薬剤耐性を開発から OP50 ひずみを防ぎます。また、抗生剤は細菌を不活性で病原菌の感染 16 ワームの寿命に及ぼす影響を最小化します。これらの実験における細菌濃度の食品関連のコンポーネントのみを考慮することができます。多くの 線虫 の老化研究を補う化学フッ素 2 NGM プレート ′-デオキシウリジン大人を滅菌する (FUdR)。ただし、FUdR を使用することができますその使用は長寿の試金 17 , 18 , 19 , といくつかの交絡の問題を引き起こすことができます問題が発生します。 20, 21. Entchev ら (2015 年) 12 の 卵 5 22 , 23, 阻害する RNAi に L4 幼虫の暴露によってこの問題を回避、卵殻の形成をブロックすることによって卵子の胚遷移受精 線虫 卵母細胞の死の結果します
。 試金するが- c. の elegans 文化系統シード NGM プレート 20 ° c. を許可すべての動物の制服ファッションとの次世代影響を任意のアカウント可能性があります成長を確実にするうち餓死するプレート発達条件 。
- 転送が飢えたプレート滅菌メスを使用して、新しいプレートと呼ばれるプロセスでそれを下に置くから L1 幼虫を新しいシード NGM プレート寒天培地 (5 mm × 5 mm) の小さい部分を切り出して飢えた ' チャンク ' 線虫 研究通信で統一 15。ワームは、L4 の段階に達するまでに成長します。5 L4 幼虫ひずみが個々 のシード NGM プレートに転送し、20 ° C で保管これらの動物は、P0 世代を表す 。
- 使用 L4 F1 世代を設定する P0 世代の子孫。30 シード NGM プレートに野生型 N2 ひずみの F1 L4 幼虫を個別に配置します
。 注: 突然変異体の緊張のため、必要な枚数はその成長率に依存します。たとえば、daf-7(ok3125) 動物を受ける 20 ° C で一時的な期間直逮捕したがって、この株は少ない L4 幼虫ワームの N2 野生型のプレートよりもを生成します 。
- この違いを補うために前日までの daf-7(ok3125) プレートをセット N2 よりプレートし、大きい数で良い作業比率は 3:1 です 。
- 転送同期 L4 段 NGM プレートに 卵 5 遺伝子をターゲット dsRNA を表現する HT115 菌 225 μ L でシードされ、距離を置いて 1 mM IPTG と 50 μ G/ml carbenicillin (RNAi 板) を添加した F1 親の子孫20 ° C 24 時間。ひずみ、プレートあたり 15 動物の密度で保管につき、少なくとも 360 ワームは実験ごとに必要な 。
- 転送ワーム 卵 5 RNAi 治療後、NSC プレートに 20 ° C での追加 24 時間 2 x 10 9 セル/mL (表 1) の濃度でストレプトマイシン処理 OP50 の 225 μ L でシードこれおよびすべてのそれに続く転送中にワームに物理的な損傷を避けるためにそっとすくう動物から薄い非常に穏やかに曲げられたワームの選択を使用してワームの下に。新しいプレートの表面に置かれたフロート SB + 連鎖球菌の 10 μ L の液滴に浸すことによってワームを動物を選ぶ 。
- 次の日再配布食品レベル l のそれぞれを表す NSC プレート ワーム細菌を含まない NSC プレートのセットと同様に、表 1 で isted。細菌の関連性の高い濃度の 225 μ L をすべて NSC シードで 225 μ L SB + 連鎖球菌細菌無料 NSC プレートをシードします。ひずみあたりの餌料環境あたり少なくとも 4 つのプレートで、プレートごと 15 動物の密度でワームを維持します。プレートを所望の実験温度にシフトします 。
- 新鮮な NSC プレートに転送ワーム シード 表 2 に記載されているスケジュールに従って適切な食品の濃度と 。 針金で軽く催促した運動
- スコア動物を選ぶ。死としてスコアに応答に失敗します。動物すべての転送で死のポイントとし、毎日の後に得点最後の転送ポイントします 。
4。イメージング実験を設定
注: このセクションで説明する手順は、特定の温度で 1 つの実験的食状態をイメージングのための株あたり十分なワームを生成するのに十分な。このプロトコルは、任意の日にイメージングされる条件の数に合わせてスケールできます。ただし、期間は合理的と異なる系統間で動物イメージングの日に 12 時間以上の年齢差がないことを確保するのに実験的なデザインには注意が必要があります。これはもっと密接に遺伝子のネイティブの規制をよく似ているなど単一コピーの遺伝子組み換えをイメージされている転写記者には強くお勧めします。プロトコルを以下 の表 3 にまとめられても他の実験的ワークフローに使用することができます株の一致大きい同期年齢人口を取得するための合理化された方法を提供します
。- イメージング実験ワームの密度を増すように 10 cm 処理組織培養プレート上で動物の文化 (∼ プレートごと 100 動物) 寿命アッセイより 。
- クロスのような形成で冷蔵 OP50 文化 5 225 μ 因数と NGM 寒天と種子の 30 mL で 10 cm プレートを埋める 。
5。記者の文化系統の初期
に試金するが- c. の elegans 文化系統シード NGM プレート 20 ° c. を許可すべての動物の制服ファッションで、可能性のある任意のアカウントに成長を確実にするうち餓死するプレート発達条件による次世代影響します 。
- チャンク飢えた L1 幼虫に NGM プレートをシードし、L4 の段階に達するまでに成長します。20 ° C で 2 つのシード NGM プレートにひずみあたり 3 L4 幼虫を転送します。これらの動物は、P0 世代を表す 。
- では、P0 世代の L4 子孫を使用して、F1 世代を設定します。4 シード NGM プレートに野生型記者ひずみの F1 L4 幼虫を配置します。突然変異系統の必要枚数は、その成長率に依存します。Daf-7(ok3125) の前の例を使用して、このような背景で記者株 3 回ナンバー プレートを必要と、野生型記者株、成長率の違いを考慮する前に 2 日間を設定する必要があります 。
6。卵コレクションと同期の記者系統
注: 線虫 の老化研究コミュニティの興味のいくつかの遺伝子は、成長と変異、産卵の欠陥により困難になります。異なる遺伝子型の動物の大規模な同期集団を生成します。たとえば、daf-7(ok3125) 突然変異は、野生型 N2 ひずみと比較して厳しい産卵欠陥を引き起こします。したがって、十分なを取得する定量的イメージング実験のための異なる系統の同期の L4 幼虫数手動でワームを拾うよりもより強固な方法論が必要です。このため、転写レポーターは、亜塩素酸ナトリウム (NaClO) にさらされた/水酸化ナトリウム (NaOH) を破る妊娠大人の溶体化処理、動物を開き、産卵すると一般的に呼ばれるプロセスを解放する ' 漂白' 線虫 の研究コミュニティ 15
。- アカウントの成長の差の系統間料金し、各株の板必要があります収穫し、漂白するとき計算。野生型および daf-7(ok3125) の記者系統を漂白するときの例 表 3 を参照してください 。
- は連続 SB の 15 mL を使用して、該当する日を皿のある特定の緊張のワームを洗浄し、滅菌 15 mL チューブに収集します。自然堆積物に動物ができ 7 mL に液体の量を調整します 。 追加 2 mL 5 %naclo と妊娠の大人を含む管 5 M NaOH の 1 mL は
- 。3 min 以上室温で混合物を優しく揺する。NaClO は水酸化ナトリウム液に含まれている受精卵を解放をバラバラにしワームを引き起こすバクテリアや虫を殺すでしょう。胚の周り卵殻のキチンは露光時間が比較的短い限り、治療の影響からのそれらを保護します。渦 ~ 30 のチューブ 3 分培養後ワーム死体の崩壊をさらに容易にする s.
- 3 分孵化卵をペレットに 1 分間、1,000 x g で混合スピンダウン後。卵を邪魔しないように各管内 ~0.5 mL を残して真空フラスコに接続して滅菌ガラス ピペットを使用して上清のほとんどを離れて吸い出しなさい 。
- SB の 9.5 mL にペレットを再懸濁します、巻き上がり・遠心分離のステップ ステップ追加 2 回、卵は SB で合計 3 回洗浄されているを繰り返します 。
- 最終洗浄後から遠心分離を介して卵のペレット、上澄みの 0.5 mL 以外のすべてを破棄します。SB の 3 つのシード 10 cm NGM プレートに 100 μ L 分注し、残りの 0.5 mL で卵を再懸濁します。100 μ L を各プレート上すべての 5 細菌の芝生の上に均一に分散します。野生型株はプレートごと 200 を超える密度での堆積が卵ない。
- 48 h と L4 幼虫の非常に同種の人口を取得する 20 の ° C で保持プレート。遅延成長表現型を持つ系統は利用可能な多くの卵をデポジットし、インキュベーション時間を増やすことをお勧めします。たとえば、daf-7(ok3125) を保持-卵を孵化・ L4 段階に到達できるように ~ 64 h 20 ° C で記者系統を含むします 。
7。卵 5 RNAi とレポーターの治療
- 連続 SB の 15 mL を使用して 3 つの皿のワームを洗浄し、滅菌 15 ml チューブに液体を収集します。自然堆積する L4 幼虫を許可し、すべて ~0.5 mL の液体が吸引します。野生型のe 記者系統、この手順は任意の幼虫 L4 より若いを削除します。突然変異の背景でこのステップ エイズ daf-7(ok3125) 場合耐性など任意の逮捕された幼虫の除去します 。
- では、9 ml の SB のワームを再懸濁します。もう一度、L4 幼虫の沈降速度を監視し、L4 幼虫のほとんどが小球形一度 ~0.5 mL 上澄みだけ吸引します。このプロセスをもう一度繰り返します。L4 幼虫の大半が解決したら、以外のすべての液体の ~0.5 mL 吸引します 。
- 追加 10 μ L の滅菌 S 基底を 0.1% 添加したプルロニック F-127 (SB + Plu) L4 幼虫を含む液体。これは界面活性剤として機能し、幼虫がプラスチック ピペット チップの内部表面に付着することを防ぎます。
- は軽く 卵 5 RNAi 細菌の 5 x 225 μ L で p200 でも低保持ピペット チップとシードは、3 つの 10 cm RNAi プレートの上に 150 μ L 分注を使用して幼虫を再懸濁します。ワームはすべて 5 細菌芝生全体に均等に分散することを確認します 。
- 液体が寒天に吸収されて、手動でにそれらを選ぶことによって洗浄方法によって除去されなかったプレートから任意の非 L4 幼虫を削除します。20 ° C 24 時間でプレートを保存
8。広い範囲の DR の開始
注: 24 h 後 卵 5 RNAi 治療、プレート上に堆積したもともと L4 幼虫 1 日古い大人になっているでしょう
。- プレートに 1 日間の古い大人だけを残して、この段階でオフ前の手動削除手順をエスケープ任意の若い幼虫を狙い撃ちします 。
- 各緊張に 15 mL チューブに 15 ml の滅菌の SB + 連鎖球菌性の三つのプレートから生後 1 日大人を洗います。自然堆積するワームを許可して、上澄みの 0.5 mL だけを吸引します。9.5 ml SB + 連鎖球菌性のワームを再懸濁し、堆積作用と洗浄の手順を繰り返します 。
- 最終洗浄後、土砂にワームを可能にし、すべてが清の 0.5 mL 吸引します。10 μ L SB + Plu を追加し、軽く P200 ピペット チップと 5 x 225 μ L 細菌濃度 2 x 10 の 9 セル/mL でシード NSC プレート上に 100 μ L 分注して使用して幼虫を再懸濁します。
すべての 5 つの細菌の芝生の間で均等に
- 配布、100 μ L。顕微鏡下でプレート上に存在の動物数の推定: 目的との間に皿の上 100-150 ワームしています 。
- は、この範囲と、因数 2 つ追加プレート内にあるワームの密度を達成するために必要な液量を決定します。またこの範囲に該当し、20 ° C 24 時間でプレートを格納する最初のプレートにワームの数を調整
- 次の日、2 日間の古い大人を収集し、NSC プレートを新しい食品 (表 1) の目的の実験的濃度を播種手順 2 と 3 で説明する方法を再配布します。液体は寒天に吸収されて、24 時間の所望の実験温度にプレートをシフト
- 次の日、3 日の古い大人を収集し、新鮮な NSC 板 8.3、8.4 の手順で説明したメソッドを再利用する食品の実験的濃度が同じシードに配布。液体は、寒天に吸収される、プレート 48 h. の実験温度に戻ります
- は 5 日間の古い大人を収集し、新鮮な NSC 板 8.3、8.4 の手順で説明したメソッドを再利用する食品の実験的濃度が同じシードを配布します。液体は、寒天に吸収される、プレート 24 時間の実験の温度に戻る
9。レポーターのマイクロ イメージング系統
- 成人の 6 日、カスタム マイクロ流体プラットフォーム 24 , 25 を使用して動物をイメージします。物理的に三つのプレートの動物からピックアップし、SB + 連鎖球菌 4.5 mL を含む 5 mL クライオ チューブ内の中断します。
- 一度ワーム土砂以外のすべての上澄みの ~0.5 mL 吸引、SB + 連鎖球菌の 4 mL で動物を再懸濁します。この洗浄は、イメージングを妨げる可能性があります余分な細菌を削除します。ワームは、圧力駆動型フロー 24 , 25 を介してカスタム マイクロ流体デバイスに導入されます。デバイス内にある個々 のワームに指示し、カスタム ソフトウェアの制御の下でチップに弁の圧力駆動型 26 ゲート画像チャンネル内に閉じ込められた 。
- ワームは、イメージングのチャネルに頭から閉じ込められている、一度収集蛍光 z-スタック 2 μ m の手順、標準の落射蛍光顕微鏡を用いた石油目的 (1.3 NA) とカメラ X 40 で 50 のセクション。同時に発光スプリッターを使用して、分析のため保存されている転写記者のそれぞれの赤と緑の蛍光画像を収集します。カスタム ソフトウェアを使用して画像の取得を自動化します 。
- カスタム MATLAB スクリプト 27 (https://github.com/meizhan/SVMelegans で入手可能) を使用して自動的に画像を処理します。Z スタックは MATLAB に読み込まれ、ニューロンのペアと画像平面内の場所を識別するために分析します。最大の予測は計算し、およびしきい値処理アルゴリズムを利用して個々 の蛍光セルを検索します。相対距離とワーム内の場所に基づいて細胞の識別を計算 ' s 頭 。 レポーター蛍光を定量化する
- は、z スタックから各細胞の場所の周りの三次元ボリュームを抽出します。完全にすべてのケースでセル全体をカプセル化する最も明るいピクセルの一貫性のある数で強度を積分します 。 各動物の腸の自家蛍光の実験条件や固有ひずみ変化からの干渉を除去するために
- のモードの推定 (ADF および ASI) 腸に最も近いセルのペアの背景強度の計算、ニューロンのまわりの容積の震度分布。最終的な出力を得るため、蛍光からこの背景の輝度の値を減算します 。
10。データ アセンブリ
注: 画像処理ソフトウェアで分析したすべてのニューロンの蛍光強度は遺伝子の分布を推定するために使用するフィルター式データ ファイル (FED) に結合され式 (テンプレート R と C++ スクリプトが https://github.com/giovannidiana/templates で利用可能).
- チェックは各処理イメージを手動ですべてのセルの正しい本人確認をします。誤ったセルの識別とイメージは、除外ファイルに記録する必要があります。ダイアナら (2017 年) の 13 除外ファイルをバイナリ テーブルから成ります ' 0 ' の修正と ' 1 ' が正しくないセルの識別のため。テーブル内の行の数はワームの撮像撮像の各セルの列 (すなわち ASI、ADF と NSM) の数に等しいします 。
- FED ファイルを生成:
- 実行 bash スクリプト " gen_data + 時間 " セル固有のファイルを各ワームのイメージから得られた式の値の組み合わせを生成するフィルター除外ファイルを使用します。Bash スクリプトがアノテーション ファイルを読み取り、画像処理ソフトウェアによって生成された各フォルダーの < folderprefix > 実験の条件や除外ファイルを抽出する _EXP.txt < folderprefix > _X.csv 正しくのみを選択するにはニューロンを識別します。式の値がファイルから読み取られます < folderprefix > コントロール < ニューロン > .csv 。
- にすべてのファイルを連結 " FED_split.dat " 実験バッチ コードによって並べ替え、ワームのラベルおよびセル id 。
- 実行 " 種 " (C++ プログラム、使用量:./FED_split.dat FED_merged.dat を並べ替える) 非ゼロ蛍光セルごとにエントリを選択し、FED_merged.dat 内の単一の行に結合します 。
11。エンコードされた情報の推定
注: 次の手順は、どのように遺伝子発現のセットによってエンコードされた特定の環境条件に関する情報を定量化します。ダイアナ ら で(2017) 13 食品の豊富な環境でのエンコード情報を調べたところ、ただし、メソッド自体は環境状態の任意の離散数に該当します。情報エントロピー、冗長性などの情報論的変数を定量化する必要不可欠な要素が考慮設定環境刺激による神経の反応の結合確率分布。このような推定を実行するには、それはワームの人口にわたって応答の十分なサンプリングをして重要です。ガウス分布を比較的小さいサンプルから推定できます。ただし、信頼性の高い密度推定のための適切なサンプル サイズを定量化する発現分布の予想される形のアイデアを持っていることが重要です。複数の異なる試験やむを得ない変動によるそれは別の繰り返し同じ実験から得られる分布の中央値が体系的に再配置されないことを確認することが不可欠または統計的特徴量のいずれか、式の分布は、複数の試験大幅変更されません。それは裁判-裁判に影響を与えるそれらの環境/生物学的要因を平均する試験内のワームの数と試行数のバランスを取る重要な裁判-裁判の変動は、各試行内変動と互換性が、場合に変動します。情報理論的解析を大きくバイアスがこれらの要因をアンダー サンプリングします
。- として、R スクリプト " code3D.R " ファイルに基づく三次元密度を生成するためのテンプレートを提供します " FED_merged.dat "、特定の FED ヘッダー形式に従ってこのテンプレートを変更します。一覧 " HeaderNames " しながら給電ファイルの各フィールドの名前を表す " RONames " 読み出しのリストです。スクリプトは、R パッケージを使用して ' ks ' 28 , 29 GS と hypercubic グリッド内の多変量分布を推定するための最小値と最大値の間の範囲を分割する各ディメンションに大箱各読み出しのためのデータセット内の値。とき内部変数 " グループ " 密度推定用データはすべて 0 に設定されます。ときに、" グループ " ラベル 1 〜 5、データセットは 5 の切り離されたセットに分かれての間、5 つのセットの 1 つの除外に伴うデータの 80% から推定する式密度。この機能を後で不確実性の見積もりに使用します
。 メモ: code3D.R の使用法: Rscript code3D.R < GT > < 食品 > < GS > < outfolder > < ラベル > < グループ > < frac > GT を表す遺伝子型、食品、環境条件、outfolder は、既存フォルダー、分布が格納される、ラベルはファイル名プレフィックスであり frac は、使用されるデータセットの一部 。
- 各環境条件が異なるグリッドと多変量の分布を生成する GS (例えば 20,30,40 ビン) のサイズします。計算負荷を減らすためには、細かい解像度が大きく変化しない情報の推定と、GS の値が小さいほどお勧めします。遺伝子発現分布がフォルダーで書かれている < outfolder > ファイル名構造を持つ code3D.R が単一の列のテキスト ファイルを実行時に指定 < ラベル > _ < GT > _ < 食品 > _GS < GS > _group < グループ >. ダット
注: 上記の手順は、条件付き確率分布の見積もりを提供
ここ g を示しますすべての読み出しのベクトル、f は環境条件。ただし、遺伝子発現と環境 30 , 31 間相互情報を計算する
。
入力の配布必要があります
遺伝子発現の平均も決定する (入力-) 
。コーディング機能を特徴付けるための有意義な量はすべての可能な入力のディストリビューションでの相互情報量を最大化することによって得ることができるチャネル容量入力分布を直接使用できない場合 。
- システムのチャネル容量と環境の入力情報を最大化する分布を推定する有元 Blahut 32 アルゴリズムを適用遺伝子発現分布を用いたします。C++ プログラムのアルゴリズムの実装の例を見つけることができます " Ccap3D.cpp " 立体の遺伝子表現のコード分析ダイアナら (2017) 13。例: GT123 遺伝子型分布から得られる場合データ (グループ 3) グリッド サイズの 80% の 30 を等しいし、フォルダーに格納 "./pdf/" プレフィックス ラベルを使用して = " PDF "。GT123 バック グラウンドでエンコードされた情報を計算するコマンドです/Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
注: システムによってエンコードされた情報の推定は不確実性、密度推定の選択などの複数の光源による影響を受ける。アルゴリズムおよびサンプル サイズのバイアス。各アルゴリズムによって導入された組織的な先入観のサイズを評価する別の密度推定法を用いた 11.1 11.2 の手順を繰り返す必要があります 。
サンプル サイズによる不確かさを推定する - は、手順 11.1 11.2 から 1 〜 5 の間のグループの情報を再計算します。これら 5 つの独立したサンプリング データの 80% の間で変動情報推定に関するサンプル サイズの影響が反映されます 。
- の手順を使用して、情報を計算サンプル サイズ バイアスを修正する (手順 5) のようにデータの割合が増加する以上 11.1 11.2 (ジャック ナイフ法) 33.
ここ g を示しますすべての読み出しのベクトル、f は環境条件。ただし、遺伝子発現と環境 30 , 31 間相互情報を計算する 
遺伝子発現の平均も決定する (入力-) 
。コーディング機能を特徴付けるための有意義な量はすべての可能な入力のディストリビューションでの相互情報量を最大化することによって得ることができるチャネル容量入力分布を直接使用できない場合12。冗長性、ノイズと信号相関の計算
相互情報量を計算する最大の情報の推定から得られた- 使用、最適な入力分布
N 各ニューロンの入力と遺伝子発現との間。C++ ソース ファイル " GetMI1D.c " 共同確率分布から限界相互情報を取得するサンプル プログラムです 。
- チャネル容量を減算し、上記で入手した各ニューロンの相互情報の合計することで冗長性を計算します 。
- 計算、" シャッフル " 情報言葉
13 , 34。C++ のテンプレート ソース ファイルで見つけることができます " GetShuffle.c ". - 使用の " シャッフル " 信号とノイズの相関を計算する期間。シグナの我々 が持っている l 相関
、我々 が持っているノイズ相関 
. - の冗長性に不確実性ノイズを取得し、信号のデータの標準偏差 80% の複数採集から総情報 (前のセクションのステップ 11.3) に関しては相関します 。
N 各ニューロンの入力と遺伝子発現との間。C++ ソース ファイル " GetMI1D.c " 共同確率分布から限界相互情報を取得するサンプル プログラムです
13 , 34。C++ のテンプレート ソース ファイルで見つけることができます " GetShuffle.c ".
、我々 が持っているノイズ相関 
.Representative Results
野生型 N2 ひずみと共に興味の遺伝子の変異で寿命実験により、1 つは、これらの遺伝子が食品を幅広く DR に応えて役割を持っているかどうかを確立できます。野生型応答は、図 1Aに示されているものに匹敵する必要があります。不均一の効果によって食糧条件に反映されます、変異によってこの応答の任意の変調は、ポイントのさらなる調査で、食糧豊富で変化に正しく対応するワームの能力をこれらの遺伝子に影響を示します、広い範囲の DR にこれらの遺伝子の表現応答が保証されます。ただし、変異体の長寿応答を野生型と大きく異なるできない場合遺伝子いる平均寿命のレベルで少なくとも広い範囲博士の効果を伝達の役割。突然変異を引き起こす制服シフト全体の寿命の応答の遺伝子にある長寿の食品に依存しない効果を持っています。これは興味の遺伝子の発現が食品応答、情報がこれらの遺伝子によって運ばれる場合は寿命に転送されないの可能性を除外しません。
プロトコルの次の段階は、興味の遺伝子のため広い範囲 DR の下の表現のレベルの変更方法を決定することです。図 1Bには、ASI の感覚ニューロンの食品レベルでの変更への応答を示していますdaf-7の転写記者の表現のレベルをこのを示します。Daf-7(-)変異株における転写のレポーターの発現が変更されます。興味のある遺伝子が寿命のレベルで本当に食品反応 1 つは彼らの表現が食物と一緒にまた変更することを期待できます。同様に、変異の背景で転写記者は広い範囲の DR への応答発現プロファイルが必要です。しかし、それも野生型背景の興味の遺伝子の転写の記者式の中に、食品対応変更が表示されないことが可能です。このような状況で転写後調節作用このプロトコルの範囲外にある可能性があります。
ダイアナら (2017) で13ASI のdaf 7と ADF と NSM tph 1の式の値を抽出しました。図 2Aでは、与えられた餌レベルの ASI と ADF 式分布の推定を示しています。ワーム画像から複数の読み出しにしたことにより、各ニューロンも全神経回路 (図 2B 2 C) の組合せの情報が個別にエンコードされる情報の量だけではなく分析ができます。これらの 2 つの情報理論的手段を組み合わせた食品についての情報を伝えるニューロンで採用されているエンコードの戦略の観点からのシステムを特徴づけることができます。回路の冗長部分の量は、各ニューロンにおける相互情報量の和をとると、回路の組合せのリードアウトを考慮して得られた共同相互情報 (チャネル容量) を減算することによって取得できます。その差額の正の値は部品間で累積的な情報、全体の回路によってエンコードされた実際の情報より大きいためエンコード戦略の冗長な文字を表します。逆に負の値は、エンコードされた真の情報がそのコンポーネント (図 2B) の合計よりも大きいために、シナジー戦略を反映します。遺伝子発現制御、例えばダイアナらのより高い順序役割を探索する異なった遺伝子型の間で情報や冗長性を比較できます。(2017)13 daf 7突然変異の効果は相乗 (図 2C 2 D) に冗長] 状態からエンコード戦略を切り替えます。
図 1: 広い範囲博士の下で寿命と遺伝子発現の応答(A) 平均寿命野生型 N2 ひずみ (黒線) の広い範囲博士への複雑な応答が表示されます。この応答の大きさは (赤い線) daf 7遺伝子の null 変異で減衰します。誤差範囲は、Entchevらからプールされたデータ、平均値の標準誤差を表す(2015)12. 野生型バック グラウンド (黒線) でdaf 7遺伝子の転写記者の平均値 (B) 発現レベルはまた広い範囲の DR に複雑な非単調応答を表示します。Daf-7(-)遺伝的背景でこの転写レポーターの発現は高減衰率し、食品レベルの変化に少し応答を示しています。誤差範囲を表す、Entchevらで一つの試験からのデータの平均の標準誤差(2015)12.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:手法。グリッド寸法 30 × 30 を使用して 'ks' R パッケージから得られる ASI の ADF とdaf 7式のtph 1式の二次元密度推定の (A) のイラスト。Tph 1とdaf 7 (全体) の共同表現でエンコードされた情報の (B) の可視化と個別に (部品の合計) の ADF、ASI、NSM ニューロン。エンコーディングの冗長と相乗効果の文字は右側、積み上げ棒グラフの高さと完全な回路によってエンコードされる情報の違いによって表されます。(C) daf-7(-)変異体と野生型の動物でエンコードされた食品情報比較変異体にみられる相互情報の削減 (D) 相乗エンコーディングへスイッチと一緒に伴われます。パネル B ~ D ダイアナらから適応されます。(2017)13.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 細菌濃度 (セル/ml) | 光学濃度 (600 ナノメートル) | 希釈倍率 (前期) |
| 1.12E + 10 | 56.000 | 0.00 |
| 2.00E + 09 | 10.000 | 5.60 |
| 6.32E + 08 | 3.160 | 3.16 |
| 6.32E + 07 | 0.316 | 10.00 |
| 2.00E + 07 | 0.100 | 3.16 |
| 0 (基底 S) | 0.000 | NA |
表 1: 食品レベルと幅広い博士で使用希釈倍率細菌l 濃度 (セル/mL) 広い範囲 DR プロトコル、それぞれ外径600測定と前から各濃度を達成するために必要な希釈倍率で使用します。
| 寿命の実験の温度 | |||||||
| 日 | 12.5 ° C | 15 ° C | 17.5 ° C | 20 ° C | 22.5 ° C | 25 ° C | 27.5 ° C |
| -12 | NGM プレートに新鮮なすべての株をチャンクし、20 ° C で維持 | ||||||
| -11 | |||||||
| -10 | Daf-7(-) 系統の P0 生成を設定し、20 ° c (プレートごと 1 L4、5 の板) を維持 | ||||||
| -9 | 野生型株の P0 生成を設定し、20 ° c (プレートごと 1 L4、5 の板) を維持 | ||||||
| -8 | |||||||
| -7 | |||||||
| -6 | |||||||
| -5 | Daf-7(-) 系統の F1 世代を設定し、20 ° c (プレートごと 1 L4、90 板) を維持 | ||||||
| -4 | 野生型株の F1 世代を設定し、20 ° c (プレートごと 1 L4, 30 プレート) を維持 | ||||||
| -3 | |||||||
| -2 | |||||||
| -1 | |||||||
| 0 | F2 L4 幼虫を選ぶ > 卵 5 RNAi プレートし、20 ° c (24 プレート プレートあたり 15 L4) を維持 | ||||||
| 1 | 1 日間の古い大人を NSC プレート 2.0 e + 9 セル/ml 食品レベルでシードに移動し、20 ° C で維持 | ||||||
| 2 | NSC プレート移動 2 日間の古い大人シードに関する実験条件と実験的な温度 | ||||||
| 3 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 |
| 4 | |||||||
| 5 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 |
| 6 | |||||||
| 7 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 |
| 8 | |||||||
| 9 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 |
| 10 | |||||||
| 11 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | |
| 12 | |||||||
| 13 | |||||||
| 14 | 転送 | 転送 | 転送 | 転送 | |||
| 15 | |||||||
| 16 | |||||||
| 17 | |||||||
| 18 | 転送 | 転送 | |||||
| 19 | |||||||
| 20 | |||||||
| 21 | |||||||
| 22 | 転送 | ||||||
表 2: 異なる温度で寿命のスケジュールを実施します。幅広い DR 寿命実験例としてdaf-7(-)と野生型株を使用して異なる温度に設定するための手順の概略です。各実験食品レベルの新鮮な板への転送は、温度の上昇とともに減少します。これは高温動物はより急速に老化しているという事実とこれ以上のアカウントには転送ごとの物理的な損傷になりやすい。
| 日 | Ima |
テーブル 3: イメージング パイプラインのスケジュール。イメージング実験例として、異なる温度でdaf-7(-)と野生型の背景に蛍光転写記者系統を用いた広帯域博士のセットアップに必要な手順の概略。
Discussion
ここでは、食事制限以前に公開されたプロトコルよりも食品の濃度のはるかに広い範囲をカプセル化するための新しい方法を提案する.このメソッドはc. の elegans博士文学に見られる 2 つの別々 であった現象をリンク、細菌の剥奪とする両方の栄養効果を許可する古典的な食餌療法の制限 1 つのプロトコルを検討しました。広い範囲 DR パラダイムを使用すると、特定環境のキューに対して単一細胞遺伝子発現を調べることと、この細胞が情報をエンコードする方法を決定するための一般的なフレームワークを提案する.我々 のフレームワークは、それぞれ寿命と定量的イメージングを実行する方法を示す 2 つの実験的プロトコルの広い範囲の下でこれらの実験のプロトコルから博士データで提供されている計算解析で調べて、このフレームワーク条件が異なる食品遺伝子の発現量や寿命の変化によってコード化された情報を定量化します。
広い範囲 DR パラダイムを用いた寿命実験を含む六つの異なる食品レベル (表 1)。これは食物剥奪10,11などの少ない食品レベルで寿命を調べることや、食べる 2遺伝的背景35を使用してよりもより労働集約的なアプローチを必要とします。ただし、1 つの条件の下での寿命で調べて DR の遺伝子の役割の解釈を制限できます。たとえば、我々 は最近、12 (図 1 a) 野生型動物に比べて食品の濃度への応答の双方向の減衰があるdaf 7変異を示した。食品がない場合は、 daf 7変異株は野生型動物と比較して、寿命の短縮を表示します。場合我々 はのみ食餌剥奪を検討していたと解釈しているが実はdaf 7の役割がより複雑な場合のみ寿命延長,のため必要なものとしてdaf 7遺伝子。したがって、プロトコルのこの部分の重要な結果は興味の遺伝子かどうかを確立する食品豊富に変化に対する寿命の全体的な応答を調節に関与しています。
他の方法と比較してこのプロトコルの主要な利点の 1 つは、寿命分析を受けている動物の子孫の生産を除去するために手法を使用することです。ほとんどの研究は、滅菌のレンダリングに大人の生殖細胞系列の増殖を抑制するのに薬物 FuDR を使用します。しかし、最近の研究は、FuDR 治療が寿命17,18,19,20,21, への呼び出しに条件と遺伝子特定結果を示しています。汎用性に質問します。このプロトコルで無くすための子孫のを通じたは 24 h RNAi のキチン卵殻の形成を阻害する卵 5遺伝子をターゲットと動物の治療受精線虫卵母細胞の結果、死22,23。この方法の利点は、それは非常に遅い演技線虫の寿命の主要な調節因子である生殖細胞系列に干渉しないので。
広い範囲 DR プロトコルの 1 つの潜在的な注意点は、細菌濃度の厳格な管理を確保するための細菌の増殖を抑える抗生物質の使用に依存です。ワームの腸内細菌の増殖はc. の elegans16の死の主要な原因として知られています。したがって、NGM 寒天培地での carbenicillin などの静菌性の抗生物質の使用は細菌の増殖を防ぐことができます、非抗生物質コントロール16と比較してワームの寿命を増加させます。細菌への影響とは関係なく線虫の寿命を延ばす抗生物質リファンピシン36およびテトラサイクリン家族37,38, のメンバーなどの特定の種類が示されています。増殖。ただし、carbenicillin またはストレプトマイシンが細菌増殖への影響とは関係なく長寿を高めることができる文献の証拠はないです。
寿命は環境については、神経回路網の遺伝子発現によるルーティング、生理学から送信する複雑な計算の出力として見なすことができます。私たちプロトコルがどのように特定の遺伝子を理解する方法論を提供しますこの環境情報の流れに影響を与えます。この問題に対処する信頼性の高い画像処理を単一細胞レベルでの遺伝子発現応答の分布を決定する必要があります。見積もることができる平均応答遺伝子の発現の変化食品の豊富なだけでなく、また大規模な集団から完全に統計的分布、本手法の適用性のための重要な要件を表します。食品豊富に遺伝子発現応答の正確な説明では、神経回路で採用されているコーディングの作戦と同様、特定のニューロンで符号化される情報を定量化する情報理論の適用ことができます。
このプロトコルで説明されているメソッドのイメージングおよび計算の側面は、生物学的文脈のより大きいセットに適用されます。私たちの仕事ではセンシング, しかし、情報処理機能の解析に限定されない特定のセルタイプまたは特定の環境手がかり小規模ニューラル ネットの食品に関与に着目。将来は、これらの方法論は多様な入力変数は、任意の生理学的な出力に影響する可能性のある拡張できます。これらのアプローチは遺伝子調節ネットワークがどのようにエンコードするか、プロセスのより良い理解に貢献し、情報を発信します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
試薬の Bargmann とホロビッツの実習に感謝いたします。いくつかの系統は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。我々 はまた原稿のコメントを M. 交響楽団をありがちましょう。この研究は、Wellcome の信頼 (Q.C. にプロジェクト助成金 087146)、BBSRC (BB/H020500/1 と Q.C. に BB/M00757X/1)、欧州研究評議会 (Q.C. に NeuroAge 242666)、米国国立衛生研究所 (R01AG035317、HL を R01GM088333) および米国によって支えられました。全米科学財団 (HL、M.Z. を 0946809 GRFP を 0954578)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
| Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
| di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
| Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
| Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
| LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
| Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
| CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
| Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
| Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
| Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |
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