Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kvantifisering av informasjonen kodet av Gene Expression nivåer under levetid modulering Under bredt kosttilskudd restriksjon i C. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en ramme å relatere bredt kosttilskudd restriksjon genuttrykk og levetid. Vi beskriver protokoller for bredt kosttilskudd restriksjon og kvantitative bildebehandling av genuttrykk under dette paradigmet. Vi ytterligere skissere beregningsformelen analyser for å vise underliggende informasjon behandling funksjoner av genetisk kretser involvert i mat-sensing.

Abstract

Sensorisk systemer tillater dyr å oppdage, behandle og svare på miljøet. Mat overflod er en miljømessig stikkordet som har dyptgripende virkninger på dyr fysiologi og atferd. Nylig viste vi at modulering av levetid i Rundormer Caenorhabditis elegans av mat overflod er mer kompleks enn tidligere inntektsført. Responsen til levetiden til endringer i mat nivå bestemmes av bestemte gener som fungerer ved å kontrollere informasjonsbehandling i en neural krets. Vårt rammeverk kombinerer genetisk analyse, høy gjennomstrømming kvantitative bildebehandling og informasjon teori. Her beskriver vi hvordan disse teknikkene kan brukes til å karakterisere alle genet som har en fysiologisk relevans til bredt kosttilskudd restriksjon. Spesielt er denne arbeidsflyten utformet for å avdekke hvordan en genet av interesse regulerer levetid under bredt kosttilskudd restriksjon; så å etablere hvordan uttrykket av genet varierer med mat nivå; og til slutt å gi en objektiv kvantifisering av mengden informasjon som formidles av genuttrykk om mat overflod i miljøet. Når flere gener undersøkes samtidig i forbindelse med en neural krets, kan denne arbeidsflyten avdekke koding strategi ansatt av kretsen.

Introduction

Alle organismer må kunne forstand og svare på endringer i miljøet for å sikre deres overlevelse. I dyr, nervesystemet er den primære detektoren og svinger av informasjon om miljøet og koordinerer endringer som kan påvirke den organismes overlevelse1fysiologiske svaret. Mat overflod er en miljømessig indikator som er godt studert i flere sammenhenger som ikke bare regulerer mat-relaterte atferd, som foraging2, men også påvirker levetiden til et dyr. Modulering av levetid av endringer i mat overflod er et fenomen kjent som kosttilskudd restriksjon (DR), og har bred evolusjonære bevaring3.

Rundormer Caenorhabditis elegans er en effektiv modell for adressering grunnleggende biologisk spørsmål. En mengde teknikker har blitt utviklet som tillater manipulering av ormen genomet, som RNAi og i vivo genet redigering teknikker. Den fysiske størrelsen av ormen og dens optisk gjennomsiktighet egner seg også til i vivo avbildning av både transcriptional og translasjonsforskning fluorescerende journalister og nytten av høy gjennomstrømming teknologier som microfluidics4. Sammen kan disse verktøyene bli brukt for å undersøke hvordan nevrale kretser direkte dyr oppførsel.

C. elegans er en bacterivore og flere metoder har blitt publisert som tillater presis kontroll av mat overflod ved å manipulere bakteriell konsentrasjon5,6,7,8 . I C. elegans forskning samfunnet, har DR vært studert i to forskjellige sammenhenger. Først kan kalles 'klassisk DR', som det gjenspeiler endringene sett Svar å redusere mat nivåer i andre organismer. I denne sammenheng, redusere mat overflod fra ad libitum nivåer resulterer i en økt levetid frem til en optimal nås, etter dette punktet levetid reduseres med ytterligere reduksjon av mat6,7, 9. Andre sammenheng som DR har vært studert i C. elegans er kosttilskudd deprivasjon som lang av ormer økes med fullstendig fjerning av noen bakteriell mat kilde10,11. I Entchev et al. (2015)12, vi viste at kompleksiteten i DR som følge av disse to ulike paradigmer kan undersøkes samtidig under en sammenheng vi term 'bredt DR'. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet nedenfor, vi identifisert en ny klasse av gener involvert i DR at bidirectionally modulerer levetid svaret mat overflod og er involvert i nevrale kretser som forstand mat12 (figur 1).

Responsen av et dyr endringer i miljøet integrerer en rekke biologiske prosesser som kobler Sanseorganer til komplekse juridiske interaksjoner formidle miljøinformasjon til fysiologi. Selv om mekanistisk detaljer om slike «informasjonsflyt"er ofte ukjente kan genetisk verktøy brukes å skaffe seg innblikk i hvordan denne komplekse beregningen er organisert blant ulike biologiske komponenter. I vårt siste arbeid viste vi at daf-7 og tph-1 er involvert i overføring av miljøinformasjon om mat overflod gjennom en mat-sensing nevrale krets som modulerer levetid i C. elegans12 , 13. ved å bruke matematiske rammen av Informasjonsteori14, kunne vi kvantifisere mengden miljøinformasjon, i biter, som representeres av gene expression endringene i daf-7 og tph-1 i bestemte neurons over annen mat nivåer. Fra dette var vi så kunne avdekke koding strategi ansatt av denne nevrale kretsen og hvordan er det genetisk kontrollert (figur 2).

I følgende protokollen skissere vi trinnene som kreves for å forstå hva effekten av gener av interesse uttrykt i bestemte neurons er og hvordan de delta på informasjonsflyten mat fra miljøet til levetid. Forstand, vårt rammeverk er delt i to eksperimentell protokoller og en beregningsformelen arbeidsflyt. For eksperimentelle aspekter, er det avgjørende å ha mutanter av genene severdigheter som kan undersøkes under bredt DR. Faithful transcriptional journalister er også nødvendig å kvantifisere hvilket uttrykk genene på forskjellig mat nivåer. For å kunne utføre beregningsorientert analyse i vår metode, må dataset være av tilstrekkelig størrelse å gi meningsfylt anslag over uttrykk distribusjoner. Selv om vi gir malen kildekoder for analysene, må brukeren være fortrolig med språket av Informasjonsteori som brukes mye i hele vårt beregningsorientert rammeverk. Kildesporene er skrevet i C++ og R. Derfor er en viss programmering ferdigheter også nødvendig for å bruke dem på en meningsfylt måte.

Protocol

1. forberedelse av bakteriekulturer og plater General Worm kultur

  1. forberede 100 mL lysogeny kjøttkraft (LB) medier i en 250 mL glassflaske og sterilisere av autoklavering.
  2. Vaksinere flaske med en enkelt koloni Escherichia coli belastningen OP50 ruge på 37 ° C over natten, og deretter lagre kultur på 4 ° C inntil.
  3. Forberede 5 L sterilt Rundormer vekst medium (NGM) agar 15 og aliquot 12 mL volumer i sterilt 6 cm plast Petri retter.
  4. Tillate agar sette over natten og deretter lagre på 4 ° C inntil.
  5. Frø NGM plater minst 3 dager før bruk med 225 μL nedkjølt OP50 kultur. Lagre platene på 20 ° C til nødvendig.

2. Utarbeidelse av bakteriekulturer og fortynninger for eksperimenter

  1. forberede to masse 500 mL LB medier i en 2 L Erlenmeyer kolbe og sterilisere av autoklavering.
  2. Vaksinere hver kolbe med en enkelt koloni av OP50 og vokse på 37 ° C rister på 200 rpm for rundt 14 h.
  3. Supplement kulturer med antibiotika streptomycin til en siste konsentrasjon av 50 μg/mL. Fortsette risting for 30 min på 37 ° C plasser i flasker på is 15 min.
  4. Overføre 450 mL i hver kultur i separate sterilt sentrifuge flasker (ideelt 500 mL kapasitet flasker å unngå splitting kulturer). Beholde leftover kulturen på is, som brukes til å bestemme konsentrasjonen av bakteriene.
  5. Nedspinning flaskene 4500 x g i et nedkjølt sentrifuge ved 4 ° C i 25 min. Forkast nedbryting og lagre flaskene på ice.
  6. Fortynne 100 μL leftover kultur fra hver kolbe i 900 μL sterilt lb bruk 1 mL steril LB til null i spektrofotometer, og kontroller deretter OD 600 av 10 ganger fortynning i hver kultur. Hvis for eksempel OD 600 av 10 ganger fortynning av natten kultur er 0.28 så kulturen hadde en faktisk OD 600 av 2.8.
  7. Bruker en fungerende lager løsning av bakterier av 1.12 x 10 10 OP50 celler/mL, som tilsvarer en OD 600 av 56. Derfor bruker eksempel OD 600 av 2.8 ovenfra, resuspend pellets fra 450 mL kulturen i en 20 th av originale volumet, som i dette tilfellet er 22.50 mL. Resuspend bakterier med en bakteriefri S basale løsning med streptomycin til 50 μg/mL (SB + strep).
  8. Resuspend pellet i riktig volum av sterile SB + strep.
  9. Gjør alle etterfølgende konsentrasjoner forsøk fra føljetong fortynninger av arbeider aksjen i SB + strep bruker fortynning faktorer oppført i tabell 1.

3. Innstilling opp levetid eksperimenter

Merk: levetid analyser utføres på 6 cm behandlet vev kultur fylt med 12 mL NGM agar supplert med streptomycin og carbenicillin (NSC), både på en siste konsentrasjon av 50 μg/mL. Disse vev kultur platene er godt egnet for levetid analyser uten eller svært lav bakteriell konsentrasjoner som ormer er betydelig mindre utsatt for stikker til veggen av platen og desiccating. Bruk av to forskjellige antibiotika hindrer OP50 belastningen i å utvikle resistens, som er avgjørende i å kontrollere bakteriell konsentrasjonen på tallerkenen. Også ved å inaktivere bakterier med antibiotika, minimere vi virkningene på ormen levetid på grunn av patogene infeksjon 16. Dette tillater oss å vurdere bare mat-relaterte komponentene av bakteriell konsentrasjon i disse eksperimentene. Mange C. elegans aldring studier supplement NGM plater med kjemiske fluoro-2 ′-deoxyuridine (FUdR) å gjengi voksne sterilt. Men kan bruk av FUdR være problematisk bruk kan forårsake flere forvirrende problemer med levetid analyser 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al. (2015) 12 circumvented problemet ved eksponering for L4 Larvene RNAi egg-5 22 , 23, som hemmer den oocyte til fosteret overgangen ved å blokkere dannelsen av eggeskall av befruktet C. elegans oocytes resulterer i deres død.

  1. Kultur C. elegans stammer som vil bli assayed på seeded NGM platene på 20 ° C. tillate platene å sulte ut for å sikre at alle dyrene er dyrket på en ensartet måte og potensielt kontoen for eventuelle transgenerational effekter av utviklingsmessige forhold.
  2. Overføring sultet L1 Larvene til nye seeded NGM plater ved å kutte ut en liten bit av agar (5 x 5 mm) fra starved platen bruker et sterilt skalpell og legge det ned på en ny plate, en prosess som kalles ' chunking ' av C. elegans forskning comm enhet 15. Vokse ormer før de når L4 scenen. Fem L4 Larvene per belastning deretter overført til trykkplatene seeded NGM og holdt på 20 ° C. Disse dyrene representerer P0 generasjon.
  3. Bruk L4 avkom av P0 generasjon definere F1 generasjon. Individuelt sted F1 L4 larver av vill-type N2 belastningen på 30 seeded NGM plater.
    Merk: Mutant stammer, antall plater som er påkrevd avhenger deres vekst. For eksempel gjennomgå daf-7(ok3125) dyr en forbigående dauer arrest på 20 ° C. Derfor denne stammen produserer mindre L4 Larvene enn en tallerken med N2 vill type ormer.
  4. For å kompensere for denne forskjellen, sette opp daf-7(ok3125) platene opp en dag tidligere enn N2 plater og et større antall, takknemlig arbeider er 3:1.
  5. Overføring synkronisert L4-trinns avkom av F1 foreldrene til NGM plater med 1 mM IPTG og 50 µg/mL carbenicillin (RNAi plater) som var sådd med 225 µL HT115 bakterier uttrykke dsRNA målretting egg-5 genet og holdt på 20 ° C i 24 timer. Minst 360 ormer per belastning, holdt på en tetthet av 15 dyr per plate, trengs per forsøk.
  6. Etter den egg-5 RNAi behandling, overføre ormer til NSC plater plantet med 225 µL av streptomycin-behandlet OP50 i en konsentrasjon av 2 x 10 9 celler/mL (tabell 1) for ytterligere 24 timer på 20 ° C. For å unngå fysisk skade ormer under dette og alle påfølgende overføringer, forsiktig scoop dyr fra under ormen bruker en svært tynn forsiktig buet orm plukke. Float dyrene av ormen plukke ved å leve det i en 10 µL dråpe SB + strep plassert på overflaten av den nye platen.
  7. Neste dag, videredistribuere ormer til NSC plater som representerer hver av mat nivåer listed i tabell 1 i tillegg til en rekke NSC plater som inneholder ingen bakterier. Frø alle NSC plater med 225 µL av relevante konsentrasjonen av bakterier, og frø bakterier-free NSC platene med 225 µL SB + strep. Opprettholde ormer på en tetthet av 15 dyr per plate, resulterer i minst fire plater per mat tilstand per belastning. Skifte platene til ønsket eksperimentelle temperatur.
  8. Overføring ormer til frisk NSC plater seeded med riktig mat konsentrasjon i henhold til planen i tabell 2.
  9. Score dyr for bevegelse av forsiktig prodding med en ledning plukke. Unnlatelse av å reagere er scoret som død. Score dyr for død ved hver overføring punkt og deretter daglig etter den siste overføring.

4. Innstilling opp Imaging eksperimenter

Merk: fremgangsmåten i denne delen er tilstrekkelig til å generere nok ormer per påkjenning for imaging en eksperimentell mat betingelse i en gitt temperatur. Denne protokollen kan tilpasses for antallet som blir vist på en gitt dag. Imidlertid bør man være forsiktig i eksperimentell design å sikre at tidsrammen er rimelig og at dyr over ulike stammer ikke har en aldersforskjell mer enn 12 timer på dagen for bildebehandling. Det anbefales sterkt at transcriptional journalister blir fotografert er enkelt-kopi transgenics, som dette vil mer ligner den opprinnelige reguleringen av genet. Protokollen beskrevet nedenfor, og oppsummert i tabell 3, gir også en strømlinjeformet metode for å få store synkron alder matchet bestander av stammer, som kan brukes til andre eksperimentelle arbeidsflyter.

  1. Kultur dyr i imaging eksperimenter på 10 cm behandlet vev kultur plater å tillate en høyere tetthet av ormer (∼ 100 dyr per plate) enn levetid analyser.
  2. Fylle 10 cm plater med 30 mL av NGM agar plater og frø med fem 225 µL dele nedkjølt OP50 kultur i en kryss-lignende formasjon.

5. Første kultur av Reporter stammer

  1. kultur C. elegans stammer som vil bli assayed på seeded NGM platene på 20 ° C. tillate platene å sulte ut for å sikre at alle dyrene er dyrket på en ensartet måte og potensielt konto for transgenerational effekter av utviklingsmessige.
  2. Blings starved L1 larvae å seeded NGM plater og vokse til de når L4 scenen. Overføre tre L4 Larvene per belastning til to seeded NGM platene på 20 ° C. Disse dyrene representerer P0 generasjon.
  3. Bruk L4 avkommet til P0 generasjon til å definere F1 generasjon. Plass F1 L4 larver av vill type reporter belastningen på 4 seeded NGM plater. For mutant stammer avhenger hvor mange plater som kreves av deres vekst. Bruke forrige eksempel av daf-7(ok3125), reporter stammer i denne bakgrunnen krever tre ganger nummerskilt og må defineres to dager før de vill type reporter stammene, hensyn til forskjeller i tilvekst.

6. Egg-samling og synkronisering av Reporter stammer

Merk: noen gener interesse C. elegans aldring forskning samfunnet føre til vekst og egg-legging feil når muterte, som gjør det vanskeligere å generere synkron folkerike av dyr på ulike genotyper. For eksempel forårsaker daf-7(ok3125) mutasjon en alvorlig egg-legging defekt sammenlignet med vill-type N2 belastning. Derfor, for å få tilstrekkelig antall synkrone L4 larver av ulike stammer for kvantitative tenkelig eksperimenter krever en mer robust metode enn manuelt ormer. Derfor transcriptional reporter stammer ble utsatt for en natriumhypokloritt (NaClO) / natriumhydroksid (NaOH) løsning behandling av gravid voksne å bryte åpne dyrene og frigjøre egg, en prosess som vanligvis omtales som ' bleking ' av C. elegans forskning samfunnet 15.

  1. Konto for forskjeller i vekst priser mellom stammer og beregne når plater hver stamme skal høstes og bleket. Et eksempel på når wild type og daf-7(ok3125) reporter stammer er bleket se tabell 3.
  2. Serielt vask ormer gitt belastning av fra platene, på den aktuelle dagen, med 15 mL SB og samle i et sterilt 15 mL tube. Tillat dyr til naturlig sedimenter og deretter justere volumet av væske 7 mL.
  3. Legge 2 mL 5% NaClO og 1 mL av 5 M NaOH til røret som inneholder gravid voksne. Forsiktig rock blandingen ved romtemperatur i mer enn 3 minutter. NaClO vil drepe bakterier og ormer, mens NaOH forårsaker ormer til å bryte ut noen befruktede egg de inneholder i væsken. Kitin eggeskallet rundt embryoene beskytter dem fra effekten av behandlingen, som eksponeringstiden forblir relativt kort. Etter 3-min incubation, vortex tube for ~ 30 å lette videre oppløsningen av ormen skrottene.
  4. Etter 3-minutter inkubasjon spinn ned blandingen på 1000 x g for 1 min til pellets eggene. Sug opp vekk de fleste av nedbryting bruker en steril glass pipette koblet til en vakuum kolbe, forlater ~0.5 mL i hver retning, for ikke for å forstyrre eggene.
  5. Resuspend pellets med 9,5 mL SB og gjenta sentrifugering trinn og rørets trinn ytterligere to ganger slik at egg har blitt vasket med SB totalt tre ganger.
  6. Etter finalen vaske, pellets eggene gjennom sentrifugering og deretter kaste alle men 0,5 mL nedbryting av. Resuspend egg i den gjenværende 0,5 mL SB og deretter aliquot 100 µL på tre 10 cm seeded NGM plater. Distribuere 100 µL like over alle fem bakteriell plener på hver plate. For vill type stammer, egg bør ikke settes på tettheter større enn 200 per plate.
    1. Oppbevare platene på 20 ° C for 48 timer og få svært homogen innbyggere L4 larver. For stammer med forsinket vekst fenotyper anbefales det å sette inn så mange egg som tilgjengelig og øke inkubasjon. For eksempel, holde daf-7(ok3125)-som inneholder reporter stammer ved 20 ° C i ~ 64 h å tillate eggene klekkes og nå L4 scenen.

7. Behandling av Reporter stammer med egg-5 RNAi

  1. serielt vaske ormer av tre plater med 15 mL SB og samle væske i et sterilt 15 ml rør. Tillate L4 Larvene til naturlig sediment, og deretter Sug opp alle unntatt ~0.5 mL væske. I vill type reporter stammer, dette trinnet fjerner noen larver yngre enn L4. I mutant bakgrunner, dette trinnet hjelpemidler fjerning av noen arrestert larver som dauers ved daf-7(ok3125).
  2. Resuspend ormer med 9 mL SB. Igjen, overvåke sedimentering hastighet på L4 larvene og deretter Sug opp alle unntatt ~0.5 mL nedbryting av når de fleste av L4 Larvene har pelleted. Gjenta denne prosessen igjen. Deretter Sug opp alle unntatt ~0.5 mL væske når fleste L4 Larvene har avgjort.
  3. Legge 10 µL av sterile S basale supplert med 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) til væske som inneholder L4 larvene. Dette fungerer som en surfactant og hindrer at larvene stikker til overflaten av plast pipette-spisser.
    1. Resuspend forsiktig Larvene bruker et P200 lav oppbevaring pipette tips og deretter aliquot 150 µL på tre 10 cm RNAi plater som er sådd med 5 x 225 µL av egg-5 RNAi bakterier. Sikre at ormer fordeles likt mellom alle fem bakteriell plener.
  4. Når væsken har absorbert agar, fjerne eventuelle ikke-L4 larver fra platene som ikke ble eliminert av vask av manuelt plukke dem. Deretter lagre platene på 20 ° C i 24 h.

8. Initiering av bredt DR

Merk: etter 24 h egg-5 RNAi behandling, L4 Larvene som var opprinnelig avsatt på platene har blitt 1 - dagers gammel voksne.

  1. Plukke av noen unge larver som rømte tidligere manuell fjerning trinn av på dette stadiet, avreise bare 1 - dagers gammel voksne platene.
  2. For hver stamme, vask 1 dag gammel voksne fra tre plater med 15 mL steril SB + strep i en 15 mL tube. Tillate ormer til naturlig sediment, og deretter Sug opp alle men 0,5 mL nedbryting av. Resuspend ormer med 9,5 mL SB + strep og gjenta sedimentering og vask.
  3. Etter finalen vaske, tillate ormer til sedimenter og deretter Sug opp alle men 0,5 mL av nedbryting. Legge til 10 µL SB + Plu og forsiktig resuspend Larvene bruker et P200 pipette tips og deretter aliquot 100 µL på en NSC plate seeded med 5 x 225 µL bakterier på en konsentrasjon 2 x 10 9 celler/mL.
    1. Fordel 100 µL jevnt over alle fem bakteriell plener. Under et mikroskop anslå antall dyr på platen: målet er å ha mellom 100-150 ormer på tallerkenen.
    2. Bestemmer volumet av væske kreves for å oppnå en orm tetthet i dette området og deretter aliquot på to flere plater. Justere antall ormer på den første platen falle i dette området og deretter lagre platene på 20 ° C i 24 h.
  4. Neste dag, samle 2 dagers gammel voksne og distribuere til nye NSC plater plantet med ønsket eksperimentelle konsentrasjonen av mat (tabell 1), gjenbruk av metodene beskrevet i trinn 2 og 3. Når væsken absorberes agar, skifte platene til ønsket eksperimentelle temperatur for 24 h.
  5. Neste dag, samle 3 dagers gammel voksne og distribuere til frisk NSC plater plantet med samme eksperimentelle konsentrasjonen av mat, bruke metodene som er nevnt i trinn 8.3 og 8.4. Når væsken absorberes agar, tilbake platene til den eksperimentelle temperaturen for 48 h.
  6. Samle 5 dagers gammel voksne og distribuere til frisk NSC plater plantet med samme eksperimentelle konsentrasjonen av mat, bruke metodene som er nevnt i trinn 8.3 og 8.4. Når væsken absorberes agar, tilbake platene til den eksperimentelle temperaturen for 24 h.

9. Microfluidic Imaging av Reporter stammer

  1. på dag 6 voksen, bilde dyr med en egendefinert microfluidic plattform 24 , 25. Fysisk plukke av dyr fra tre plater og avbryte en 5 mL kryogene rør som inneholder 4,5 mL SB + strep.
    1. En gang ormer sedimenter og Sug opp alle unntatt ~0.5 mL nedbryting av og resuspend dyrene i 4 mL av SB + strep. Denne vask fjerner overflødig bakterier som ellers kan forstyrre bildebehandling. Ormer er innført i et egendefinert microfluidic apparat via press drevet flyt 24 , 25. I enheten, personlige ormer er rettet inn og fanget i en tenkelig kanal Portes av press-drevet på prosessoren ventiler 26 under kontroll av tilpasset programvare.
  2. Når en orm er fanget hodestups i tenkelig kanalen, samle en fluorescerende z-stabel, med 50 seksjoner i 2 µm-trinn, bruker standard epifluorescence mikroskop med en 40 X oljeobjektiv (1,3 NA) og et kamera. Samle røde og grønne fluorescerende bilder for hver av transcriptional journalister samtidig med et utslipp splitter og lagres for analyse. Bildeopptak er automatisert med tilpasset programvare.
  3. Behandle bildet automatisk med egendefinerte MATLAB skript 27 (tilgjengelig på https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-stabler er lastet inn i MATLAB og analysert for å identifisere Nevron-parene og deres plasseringer i tenkelig fly. Maksimal anslagene beregnes deretter, og en terskelverdi algoritme benyttes for å finne fluorescerende enkeltceller. Cellen identifikasjon beregnes deretter basert på relative distanser og posisjoner innenfor ormen ' s leder.
  4. å kvantifisere reporter fluorescens, ekstra tredimensjonale volumet rundt hver mobilnettet plassering fra z-stakken. Integrere intensiteten over de smarteste pikslene, som fullt innkapsle hele cellen i alle tilfeller konsekvent flere.
  5. å fjerne støy fra experimental tilstand-spesifikke eller stamme-spesifikke endringer i tarmen auto-fluorescens av hvert dyr, beregne bakgrunn intensiteten for cellen parene nærmeste tarmen (ADF og ASI) via estimering av den intensitet distribusjon i et volum rundt Nevron. Trekk fra denne bakgrunnen intensitetsverdien fra den integrerte fluorescensen å få det endelige resultatet.

10. Data montering

Merk: fluorescens intensiteter av alle neurons analysert av bildebehandlingen kombineres i filtrert uttrykk datafilen (FED) som brukes til å beregne distribusjon profiler av genet uttrykk (mal R og C++ skript er tilgjengelig på https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Manuelt Sjekk hver behandlet bilde å bekrefte riktig identifikasjon for alle celler. Bilder med cellen med feil identifisering må registreres i en utelukkelse. I Diana et al. (2017) 13 utelukkelse filen består av en binær tabell med ' 0 ' for riktig og ' 1 ' for feil celle identifikasjon. Antall rader i tabellen er lik antall ormer fotografert med en kolonne for hver celle fotografert (i.e ASI, automatisk dokumentmater og NSM).
  2. Generere FED filen:
    1. kjøre bash script " gen_data + tid " til å generere celle-spesifikke filer kombinere uttrykk verdiene fra hver orm fotografert filtrert bruke filen utelukkelse. For hver mappe som genereres av bildebehandlingen, bash skriptet leser merknadsfilen < folderprefix > _EXP.txt å trekke ut eksperimentelle forhold og Ekskluderingsfilen < folderprefix > _X.csv å velge bare riktig identifisert neurons. Uttrykket verdier leses fra filer < folderprefix > _data_ < neuron > CSV.
    2. Sette sammen alle filer i " FED_split.dat " og sortere det av eksperimentet satsvise koden, ormen etikett og cellen.
    3. Kjøre " form " (C++-program, bruk:. / sortere FED_split.dat FED_merged.dat) å velge poster med null fluorescens for hver celle og kombinere dem til én rader i FED_merged.dat.

11. Estimering av informasjonen kodet

Merknad: følgende prosedyre beskriver hvordan kvantifisere informasjon om bestemte miljøforhold kodet av settet med gene uttrykk. I Diana et al. (2017) 13, informasjonen kodet om mat overflod i miljøet ble undersøkt, men metoden selv gjelder diskret flere miljømessige stater. Den viktige ingrediensen å kvantifisere informasjon teoretisk variabler som informasjon entropies eller redundans er felles sannsynlighetsfordelingen av nevrale svarene under Angi miljømessige stimuli vurdert. For å utføre slike estimering, er det avgjørende å ha et tilstrekkelig utvalg av svaret i populasjoner av ormer. Gaussian distribusjoner kan estimeres fra relativt liten prøver; Det er imidlertid viktig å ha en idé om forventet form av uttrykk fordelingen å kvantifisere riktig utvalgsstørrelsen for en pålitelig tetthet estimering. Fordi uunngåelig variasjon på tvers av ulike studier, er det viktig å kontrollere at verdiene av distribusjoner fra ulike gjentakelser av samme eksperimentet ikke systematisk forskyves, eller at noen av de statistiske funksjonene i den uttrykket distribusjon er ikke betydelig endret over prøvelser. I tilfelle prøveversjon-å-prøve variasjon er kompatibel med variasjon i hvert forsøk, er det avgjørende å balansere forsøk mot antall ormer i studier for å jevne ut de miljømessige/biologiske faktorene som påvirker prøveversjon-å-prøve variasjon. Undersampling disse faktorene kan sterkt skjevhet i informasjon-teoretisk analyse.

  1. Som R skriptet " code3D.R " gir en mal for å generere tredimensjonale tettheter basert på filen " FED_merged.dat ", endre malen etter den bestemte FED topptekstformat. Listen " HeaderNames " representerer navnene på hvert felt i filen FED mens " RONames " er listen over lettleselig. Skriptet bruker R pakken ' ks ' 28 , 29 å anslå multivariabel distribusjoner i et hypercubic rutenett GS hyller i hver dimensjon subdividing området mellom minimum og maksimum verdier i datasettet for hver avlesning. Når variabelen interne " gruppe " settes til 0 alle data brukes for tetthet estimering. Når den " gruppen " etiketten er mellom 1 til 5 datasettet er delt inn i 5 usammenhengende sett, og uttrykket tettheter er beregnet fra 80% dataene som følge av en av de fem settene. Denne funksjonen brukes senere til å anslå usikkerhet.
    Merk: Bruk av code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < mat > < GS > < outfolder > < etiketten > < gruppe > < frac > der GT representerer genotype, maten er betingelsen miljø, outfolder er eksisterende mappen der distribusjonene vil bli lagret, etiketten er et filnavnprefiks og frac er en brøkdel av datasettet brukt.
  2. For hver miljøtilstand generere multivariabel distribusjoner med forskjellige rutenett størrelser GS (f.eks 20,30,40 hyller). For å redusere beregningsorientert laste, er mindre verdier av GS å foretrekke når finere oppløsninger ikke endres vesentlig informasjon estimering. Genuttrykk distribusjon er skrevet i mappen < outfolder > angitt når du kjører code3D.R som én kolonne tekstfiler med filnavn strukturen < etiketten > _ < GT > _ < mat > _GS < GS > _group < gruppen >. dat.
    Merk: trinnene gi anslaget av betinget sannsynlighetsfordelinger Equation 1 der g angir vektoren for alle read-outs og f er betingelsen miljø. Men å beregne gjensidig informasjonen mellom genuttrykk og miljø 30 , 31.
    Equation 2
    vi trenger fordelingen av input Equation 3 som bestemmer også den (inndata-) gjennomsnitt genuttrykk < img-alt = "Ligningen 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Når input distribusjon ikke er direkte tilgjengelig, en meningsfull antallet å karakterisere koding funksjonene er kanal kapasitet, som kan fås ved å maksimere gjensidig informasjon på tvers av alle mulige input distribusjoner.
  3. Genuttrykk distribusjon, bruk Arimoto-Blahut 32 algoritmen å anslå kanal kapasitet av systemet og distribusjon av miljømessige inndataene som maksimerer informasjon. Et eksempel på implementering av algoritmen kan finnes i C++-program " Ccap3D.cpp " for den tredimensjonale genuttrykk koden analysert i Diana et al. (2017) 13. Eksempel: Hvis distribusjoner fra genotype GT123 hentes fra 80% dataene (gruppe 3) med Rutenettstørrelse lik 30 og lagret i mappen ". /pdf/ " med en prefiks etikett = " PDF ". Kommandoen til å beregne informasjonen kodet i bakgrunnen GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Merk: estimering av informasjonen kodet av systemet påvirkes av flere kilder til usikkerhet, herunder valg av tetthet estimering algoritmen og prøven størrelsen skjevhet. Trinn 11.1-11.2 skal gjentas med ulik tetthet beregningsmetoder for å vurdere størrelsen på systematisk bias introdusert av hver algoritmen.
  4. å anslå usikkerhet på grunn av utvalgsstørrelsen, oppdatere informasjon fra trinn 11.1-11.2 med grupper mellom 1 til 5. Variasjon over disse fem uavhengige prøvetaking av de 80% dataene vil reflektere virkningen av utvalgsstørrelsen på informasjon estimering.
  5. Utregninger benytter skritt 11.1-11.2 over økende brøkdel av data (som i trinn 5) korrigere utvalgsstørrelsen bias (Jack-knife metoden) 33.

12. Beregningen av redundans, støy og Signal sammenheng

  1. Bruk den optimale input distribusjoner innhentet fra anslaget maksimal informasjon til å beregne gjensidig informasjonen Equation 5 mellom inndata og gene uttrykk respons av hver Nevron N. C++ kildefil " GetMI1D.c " er et prøveprogram hente marginale gjensidig informasjon fra joint sannsynlighetsfordelinger.
  2. Beregne redundans ved å ta summen av gjensidig informasjonen for hver Nevron fikk over og deretter trekke fra kanal kapasitet.
  3. Beregner den " shuffle " informasjon begrep Equation 6 13 , 34. En mal C++ kildefil finnes i " GetShuffle.c ".
  4. Bruk det " shuffle " sikt å beregne signal og støy korrelasjon. For signal sammenheng har vi Equation 7 og støy sammenhengen vi har Equation 8.
  5. Usikkerhet på redundans, få støy og signalisere sammenheng den totale informasjon (trinn 11.3 i forrige del) fra flere prøvetaking av de 80% dataene og tar standardavviket.

Representative Results

Ved å gjennomføre levetid eksperimenter på mutanter av genene rundt sammen med wild type N2 belastning, kan en opprette om disse genene har en rolle i mat svaret bredt DR. Wild type svaret skal sammenlignes med en avbildet i figur 1A. Noen modulering av dette svaret av mutanter, reflekteres av en ikke-uniform effekt over mat forhold, angir at disse genene påvirker muligheten for ormen å riktig, svarer på endringer i mat overflod, på hvilket punkt videre undersøkelser av den uttrykket svarene på disse genene til bredt DR er garantert. Hvis imidlertid levetid responsen av mutanter ikke er vesentlig forskjellig fra vill-type deretter har genene ingen rolle i transducing effekten av bredt DR, i hvert fall på nivået av gjennomsnittlig levetid. Hvis mutasjoner forårsake en jevn endring av hele levetiden svaret så har genene en mat-uavhengig effekten på levetid. Dette utelukker ikke muligheten for at uttrykket av gener av interesse er mat-responsiv, i da informasjonen båret av disse genene overføres ikke til levetid.

Den neste fasen av protokollen er å avgjøre hvordan uttrykk nivåer endre under bredt DR for arvestoffet rundt. I figur 1Billustrerer vi dette gjennom uttrykk nivåer av transcriptional reporter daf-7, som viser en respons på endringer i mat nivå i ASI sensoriske neurons. I en daf-7(-) mutant endres uttrykket svar transcriptional reporter. Hvis genene rundt er virkelig mat svarer på nivå med levetid, kan man forvente at deres uttrykk endres også med mat. Tilsvarende bør transcriptional reporter i mutant bakgrunnen ha en endret uttrykk profil svar på bredt DR. Men er det også mulig at transcriptional reporteren av genet av interesse i vill type bakgrunn ikke viser mat-responsive endringer i uttrykk. I denne situasjonen, kan det indikere en post-transcriptional regulerende effekt som faller utenfor omfanget av denne protokollen.

I Diana et al. (2017)13, vi hentet uttrykk verdier for daf-7 i ASI og tph-1 i automatisk dokumentmater og NSM. I figur 2Aillustrere vi estimering av uttrykket fordelingen i ASI og automatiske Dokumentmateren for et gitt mat nivå. Å ha flere readouts fra enkelt ormen bilder tillater oss å analysere ikke bare mengden informasjon kodet uavhengig av hver Nevron men også kombinasjon informasjonen av hele nevrale kretsen (figur 2B-2 C). Kombinere disse to informasjonsteoretisk tiltak tillater oss å karakterisere systemet koding strategi ansatt av neurons å formidle informasjon om mat. Hvor mye redundans i kretsen kan fås ved å ta summen av gjensidig informasjonen for hver Nevron og trekke felles gjensidig informasjonen (kanal kapasitet) ved å vurdere kombinasjon readouts av kretsen. En positiv verdi slik forskjell angir en overflødig karakter av koding strategien fordi den kumulative informasjonen mellom delene er større enn den faktiske informasjonen kodet hele kretsen. Omvendt gjenspeiler en negativ verdi en synergistisk strategi fordi den sanne opplysninger kodet er større enn summen av komponentene (figur 2B). Informasjon og redundans kan sammenlignes over ulike genotyper å utforske mulig høyere orden roller av genet regulering, for eksempel i Diana et al. (2017) 13 effekten av daf-7 mutasjon bytter koding strategien fra overflødig å synergistisk (figur 2C-2D).

Figure 1
Figur 1 : Svar levetid og gene uttrykk under bredt DR. (A) gjennomsnittet levetid av wild type N2 belastning (svart linje) viser komplekse svar til bredt DR. Omfanget av dette svaret er svekket i en null mutant av daf-7 genet (rød linje). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt, grupperte data fra Entchev et al. (2015) 12. (B) gjennomsnittet uttrykk nivåer av transcriptional reporter for daf-7 genet i vill type bakgrunn (svart linje) også vise komplekse ikke-monotoniske svar til bredt DR. I daf-7(-) genetisk bakgrunn uttrykk for denne transcriptional reporter er svært svekket og viser lite respons på endringer i mat nivå. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt, data fra en enkelt rettssak i Entchev et al. (2015) 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Beregningsorientert metodikk. (A) illustrasjon av todimensjonal tetthet estimering av tph-1 uttrykk i automatisk dokumentmater og daf-7 uttrykk ASI som hentes fra 'ks' R pakken ved hjelp av et rutenett dimensjonen 30 x 30. (B) visualisering av informasjonen kodet av felles uttrykk for tph-1 og daf-7 (hele) og individuelt (summen av deler) for automatisk dokumentmater, ASI og NSM neurons. Overflødig og synergistiske tegnene i kodingen representeres av forskjellen mellom høyden på de stablede liggende stolpediagrammer til høyre og informasjonen kodet hele kretsen. (C) sammenligning mellom mat informasjon kodet av vill type dyr og daf-7(-) mutanter. (D) reduksjon av gjensidig informasjon i mutantene er ledsaget av en bryter mot synergistisk koding. Paneler B-D er tilpasset fra Diana et al. (2017) 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bakteriell konsentrasjon (celler/ml) Optisk tetthet (600nm) Fortynningsfaktoren (fra forrige)
1.12E + 10 56.000 0,00
2.00E + 09 10.000 5.60
6.32E + 08 3.160 3.16
6.32E + 07 0.316 10.00
2.00E + 07 0.100 3.16
0 (S basale) 0.000 NA

Tabell 1: mat nivåer og fortynning faktorene som brukes i bredt DR. Bakterierl konsentrasjoner (celler/mL) brukes i bredt DR protokollen, samt deres respektive OD600 målinger og fortynningsfaktoren kreves for å oppnå hver konsentrasjonen fra forrige.

Eksperimentell temperatur levetid
Dag 12.5° C 15° C 17.5° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27.5° C
-12 Blings alle belastninger til frisk NGM plater og opprettholde ved 20° C
-11
-10 Definere P0 generasjon daf-7(-) stammer og vedlikeholde ved 20° C (1 L4 per plate, 5 plater)
-9 Definere P0 generasjon av vill type stammer og vedlikeholde ved 20° C (1 L4 per plate, 5 plater)
-8
-7
-6
-5 Definere F1 generasjon daf-7(-) stammer og vedlikeholde ved 20° C (1 L4 per plate, 90 plater)
-4 Definere F1 generasjon av vill type stammer og vedlikeholde ved 20° C (1 L4 per plate, 30 plater)
-3
-2
-1
0 Plukke F2 L4 Larvene til > egg-5 RNAi plater og vedlikeholde ved 20° C (15 L4 per plate, 24 tallerkener)
1 Flytte 1 - dagers gammel voksne til NSC plater seeded med 2.0E + 9 celler/ml mat nivå og vedlikeholde ved 20 ° C
2 Flytte 2 - dagers gammel voksne NSC plater seeded med eksperimentelle mat forhold og eksperimentelle temperatur
3 Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre
4
5 Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre
6
7 Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre
8
9 Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre
10
11 Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre Overføre
12
13
14 Overføre Overføre Overføre Overføre
15
16
17
18 Overføre Overføre
19
20
21
22 Overføre

Tabell 2: tidsplan for lifespans utført ved forskjellige temperaturer. Skjematisk oversikt over trinnene for å definere bredt DR levetid eksperimenter ved forskjellige temperaturer med daf-7(-) og vill type stammer som eksempler. Antall overføringer til frisk plater nivåene eksperimentelle mat avtar med økende temperatur. Dette er å ta hensyn til det faktum at dyr ved høyere temperaturer er aldrende raskere og så mer utsatt for skade per overføring.

Dager IMA
ging rørledning -14 Del reporter stammer i daf(-) bakgrunn. Opprettholde på 20 ° C. -13 Del reporter stammer i vill type bakgrunn. Opprettholde på 20 ° C. -12 Definere P0 generasjon daf-7(-) reporter stammer. Bruk 3 L4 Larvene per 10cm NGM plate. Bruke 2 plater og vedlikeholde på 20 ° C. -11 -10 Definere P0 generasjon av vill type reporter stammer. Bruk 3 L4 Larvene per 10cm NGM plate. Bruke 2 plater og vedlikeholde på 20 ° C. -9 -8 Definere F1 generasjon daf-7(-) reporter stammer. Bruk 3 L4 Larvene per 10cm NGM plate. Bruke 12 plater og vedlikeholde på 20 ° C. -7 -6 Definere F1 generasjon av vill type reporter stammer. Bruk 3 L4 Larvene per 10cm NGM plate. Bruke 4 tallerkener og vedlikeholde på 20 ° C. -5 -4 -3 Bleach daf-7(-) reporter stammer i ettermiddag (~ 5 pm) og innskudd egg på 3 10cm NGM plater og opprettholde på 20 ° C. -2 Bleach vill type reporter stammer i morgen (~ 10 er) og innskudd egg på 3-10 cm NGM plater og vedlikeholde på 20 ° C. -1 0 Vask L4 til 10 cm egg-5 RNAi plater. Bruke 3 plater per belastning og vedlikeholde på 20 ° C. 1 Vask 1-dags voksne NSC plater plantet med 2.0E + 9 celler / ml. bruke 3 plater per belastning og vedlikeholde på 20 ° C. 2 Vask 2 day voksne NSC plater seeded med eksperimentelle mat nivåer. Bruk 3 plater per belastning og Skift til eksperimentelle temperatur. 3 Overføre til frisk NSC plater. Bruke 3 plater per belastning og vedlikeholde eksperimentelle temperatur. 4 5 Overføre til frisk NSC plater. Bruke 3 plater per belastning og vedlikeholde eksperimentelle temperatur. 6 Velg dyr av plater og forberede seg for tenkelig.

Tabell 3: tidsplan for imaging rørledning. Skjematisk oversikt over trinnene for å definere bredt DR imaging eksperimenter med fluorescerende transcriptional reporter stammer i daf-7(-) og vill type bakgrunn ved forskjellige temperaturer som eksempler.

Discussion

Her presenterer vi en ny metode for kosttilskudd restriksjon som omslutter et mye bredere utvalg for mat enn tidligere publiserte protokoller. Denne metoden linker to tidligere separate fenomener i C. elegans DR litteratur, bakteriell deprivasjon og klassisk kosttilskudd restriksjon, slik at begge kosttilskudd effekter å bli studert under ett protokollen. Bruker det nye bredt DR paradigmet, presenterer vi et generelt rammeverk for å undersøke enkeltcelle genuttrykk svar på et bestemt miljø stikkord og bestemme hvordan denne cellen koder informasjonen. Vårt rammeverk består av to eksperimentell protokoller som illustrerer hvordan å utføre lifespans og kvantitative bildebehandling, henholdsvis, under bredt DR. Data fra disse eksperimentelle protokollene kan deretter undersøkes med de beregningsformelen analysene i denne rammen å kvantifisere informasjonen kodet av endringer i gene expression nivåer eller lifespans over annen mat forhold.

Levetid eksperimenter bruker bredt DR paradigmet innebære seks forskjellige mat nivåer (tabell 1). Dette nødvendiggjør en mer arbeidskrevende tilnærming enn å undersøke levetid under færre mat nivåer, for eksempel kosttilskudd deprivasjon10,11 eller bruke de spise-2 genetiske bakgrunn35. Imidlertid kan undersøke på levetid under én betingelse begrense tolkninger av et gen rolle i DR. For eksempel viste vi nylig at daf-7 mutanter har en toveis demping av responsen på mat konsentrasjon sammenlignet med vill type dyr12 (figur 1A). I fravær av mat vise daf-7 mutanter en forkortelse av deres levetid sammenlignet med vill type dyr. Hvis vi hadde bare vurdert kosttilskudd deprivasjon, vi ville har tolket som daf-7 genet som livslengden utvidelse, bare når daf-7 rolle er faktisk mer komplisert. Kritisk utfallet av denne delen av protokollen er derfor å etablere om en genet av interesse er involvert i modulerende den generelle responsen levetid endringer i mat overflod.

En stor fordel med denne protokollen sammenliknet med annen metoder er at den bruker en ny metode for å eliminere avkom produksjon i dyr gjennomgår levetid analyse. De fleste studier bruker stoffet FuDR for å hindre spredning av germline hos voksne gjør dem sterile. Men har nyere studier vist FuDR behandling kan ha tilstand - og gen-spesifikke effekter på levetid17,18,19,20,21, ringer til spørsmålet brukbarheten generelt. I denne protokollen, eliminering av avkom produksjon er oppnådd gjennom en 24-timers behandling av dyr med RNAi målretting egg-5 genet, som hemmer chitin eggeskall av befruktet C. elegans oocytes resulterer i deres død22,23. Fordelen med denne metoden er at det er veldig sent-fungerende og så ikke påvirke germline, som er en viktig regulator av levetid i C. elegans.

En potensiell påminnelse bredt DR protokollen er sin avhengighet av bruk av antibiotika å kontrollere bakteriell spredning slik stram kontroll over bakteriell konsentrasjon. Bakteriell spredning i tarmen av ormen er kjent som en viktig dødsårsak i C. elegans16. Dermed bruk av bakteriostatisk antibiotika, som carbenicillin, i NGM agar hindrer bakteriell spredning og øker levetiden av ormer sammenlignet med ikke-antibiotikaresistens kontroller16. Visse typer antibiotika, som og36 og medlemmer av tetracycline familie37,38, vist seg å forlenge levetid i C. elegans uavhengig av deres effekt på bakteriell spredning. Men er det ingen bevis i litteraturen at enten carbenicillin eller streptomycin kan øke levetid uavhengig av deres effekt på bakteriell spredning.

Levetid kan vises som resultatet av en kompleks beregning der miljøinformasjon, rutes av genuttrykk i nevrale nettverk, overføres til fysiologi. Våre protokollen gir en metode for å forstå hvordan bestemte gener påvirker denne flyten av miljøinformasjon. For å løse dette spørsmålet, må vi pålitelig bildebehandling for å fastslå fordelingen av gene expression svar på encellede nivå. Å kunne anslå ikke bare til gjennomsnittlig svartid av genuttrykk til endringer i mat overflod, men også full statistisk distribusjon fra store befolkningsgrupper representerer en viktig forutsetning for anvendelsen av vår metode. Dette nøyaktig beskrivelse av gene expression svar til mat overflod kan anvendelsen av Informasjonsteori til kvantifisere informasjonen kodet av bestemte neurons samt koding strategi ansatt av nevrale krets.

De tenkelig og beregningsorientert aspektene av metodene beskrevet i denne protokollen gjelder for et større sett med biologiske sammenhenger. I vårt arbeid fokuserte vi på et lite nettverk involvert i mat sensing, men analyser av informasjonsbehandling funksjoner er ikke begrenset til en bestemt celle type eller bestemte miljømessige signaler. I fremtiden, kan disse metodene potensielt utvides til en større variasjon av input variabler, påvirker fysiologiske utdata. Disse vil bidra til en større forståelse av hvordan genet regulatoriske nettverk kode, prosess og overføre informasjon.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Bargmann og Horvitz labs for reagenser. Noen stammer ble levert av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi takker også M. Lipovsek for kommentarer på manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av Wellcome Trust (Project Grant 087146 til Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 og BB/M00757X/1 Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 til Q.C.), oss National Institutes of Health (R01AG035317 og R01GM088333 til H.L.) og amerikanske National Science Foundation (0954578 til hl, 0946809 GRFP til M.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

Genetikk problemet 126 kosttilskudd restriksjon høy gjennomstrømming Imaging Informasjonsteori nevrovitenskap Microfluidics Neural koding genuttrykk
Kvantifisering av informasjonen kodet av Gene Expression nivåer under levetid modulering Under bredt kosttilskudd restriksjon i <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter