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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Quantificação da informação codificada pelo Gene expressão níveis durante a vida útil modulação sob vasta gama dietéticas restrição em c. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um quadro para relacionar a restrição dietética de vasta gama de expectativa de vida e expressão gênica. Descrevemos os protocolos para a vasta gama de restrição dietética e para a imagem latente quantitativa da expressão do gene sob esse paradigma. Nós esboçamos mais análises computacionais para revelar subjacentes recursos de processamento de informações dos circuitos genéticos envolveram na detecção comida.

Abstract

Os sistemas sensoriais permitem animais detectar, processar e responder ao seu ambiente. Abundância de comida é uma sinalização ambiental que tem profundos efeitos no comportamento e fisiologia animal. Recentemente, nós mostramos que modulação de longevidade no nematódeo Caenorhabditis elegans , pela abundância de comida é mais complexa do que anteriormente reconhecido. A capacidade de resposta de recuperação às alterações no nível de comida é determinada por genes específicos que agem controlando informações de processamento dentro de um circuito neural. Nosso quadro combina análise genética, elevado-throughput imagem quantitativa e teoria da informação. Aqui, descrevemos como essas técnicas podem ser usadas para caracterizar qualquer gene que tem uma relevância fisiológica a vasta gama de restrição dietética. Especificamente, este fluxo de trabalho destina-se a revelar como um gene de interesse regula a expectativa de vida sob a vasta gama de restrição dietética; em seguida, estabelecer como a expressão do gene varia com o nível de alimentos; e finalmente fornecer uma quantificação imparcial a quantidade de informação veiculada pela expressão do gene sobre a abundância de comida no ambiente. Quando vários genes são examinados simultaneamente sob o contexto de um circuito neural, este fluxo de trabalho pode revelar a estratégia de codificação utilizada pelo circuito.

Introduction

Todos os organismos precisam ser capazes de perceber e responder às mudanças no ambiente para garantir sua sobrevivência. Em animais, o sistema nervoso é o principal detector e transdutor de informação sobre o ambiente e coordena a resposta fisiológica a qualquer mudança que pode afetar sobrevivência1 do organismo. Abundância de comida é uma sinalização ambiental que está bem estudada em vários contextos que não só regula comportamentos relacionados com os alimentos, tais como forrageamento2, mas também os impactos a longevidade de um animal. A modulação da expectativa de vida por mudanças na abundância de comida é um fenômeno conhecido como restrição dietética (DR) e tem ampla conservação evolutiva3.

O nemátodo Caenorhabditis elegans é um sistema poderoso modelo para abordar questões biológicas fundamentais. Foram desenvolvidas uma infinidade de técnicas que permitem a manipulação do genoma do verme, como gene RNAi e na vivo , técnicas de edição. O pequeno tamanho físico do worm e sua transparência óptica também se prestam a na vivo de imagem de ambos os repórteres fluorescentes transcriptional e translacionais e utilitário de tecnologias de alta produtividade como microfluídica4. Juntas, essas ferramentas podem ser aproveitadas para examinar o comportamento animal direto como neural de circuitos.

C. elegans é um bacterivore e foram publicados vários métodos que permitem o controle preciso da abundância de alimentos através da manipulação de concentração bacteriana5,6,7,8 . Dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans , DR tem sido estudado em dois contextos diferentes. O primeiro pode ser denominado 'DR clássica', como reflete as alterações observadas em resposta à diminuição dos teores de alimentos em outros organismos. Neste contexto, diminuindo a abundância de alimento de ad libitum níveis resulta em uma crescente expectativa de vida até uma ótima é alcançada, depois deste ponto longevidade diminui com a redução de alimentos6,7, 9. O segundo contexto em que o DR tem sido estudada em c. elegans é privação dietética em que a longevidade dos vermes é aumentada pela remoção completa de qualquer fonte de alimento bacteriana10,11. Em Entchev et al. (2015)12, mostramos que a complexidade em DR resultantes destes dois paradigmas diferentes pode ser examinada simultaneamente sob um contexto chamamos 'vasta gama DR'. Usando o protocolo descrito abaixo, identificamos uma nova classe de genes envolvidos no DR que bidirecionalmente modulam a resposta de expectativa de vida de abundância de alimento e estão envolvido em circuitos neurais que detetam alimentos12 (Figura 1).

A resposta de um animal para mudanças no ambiente integra uma sequência de processos biológicos que ligam o sistema sensorial para interações complexas regulamentares, transmissão de informações ambientais para a fisiologia. Embora os detalhes mecanicistas do tal "fluxo de informações" estão, frequentemente, desconhecidos, ferramentas genéticas podem ser usadas para adquirir uma visão sobre como esse cálculo complexo é organizado entre diferentes componentes biológicos. Em nosso recente trabalho, mostramos que a daf-7 e tph-1 estão envolvidos na transmissão de informações ambientais sobre a abundância de alimentos através de um circuito neural que modula a expectativa de vida em c. elegans12 sensor de comida , 13. aplicando a estrutura matemática da teoria da informação14, fomos capazes de quantificar a quantidade de informação ambiental, em termos de bits, que é representada pelas alterações de expressão de gene em daf-7 e tph-1 em neurônios específicos em níveis diferentes de comida. A partir disso, então fomos capazes de descobrir a codificação estratégia utilizada por este circuito neural e como é geneticamente controlada (Figura 2).

No protocolo a seguir, descrevem as etapas necessárias para compreender quais são os efeitos de genes de interesse expressado em neurônios específicos e como eles participam para o fluxo de informação sobre os alimentos do ambiente a expectativa de vida. Em termos gerais, nossa estrutura é dividida em dois protocolos experimentais e um fluxo de trabalho computacional. Para os aspectos experimentais, é essencial dispor de mutantes dos genes de interesse que podem ser examinadas sob vasta gama repórteres transcriptional Faithful Dr. também são necessários para quantificar o nível de expressão dos genes em níveis diferentes de alimentos. Para ser capaz de efectuar a análise computacional, discutida em nosso método, o conjunto de dados precisa ser de tamanho suficiente para fornecer estimativas significativas das distribuições de expressão. Mesmo que nós fornecemos códigos de fonte de modelo para as análises, o usuário precisa estar familiarizado com a linguagem da teoria da informação que é usada extensivamente em toda a nossa estrutura computacional. Os códigos-fonte são escritos em R e C++. Portanto, um certo nível de proficiência de programação também é necessário para aplicá-las de uma forma significativa.

Protocol

1. preparação de culturas bacterianas e placas para cultura de Worm geral

  1. preparar 100 mL de lisogenia caldo (LB) meios de comunicação em um frasco de vidro de 250 mL e esterilizar em autoclave.
  2. Inocular a garrafa com uma única colônia da estirpe Escherichia coli OP50 e incubar a 37 ° C durante a noite e então armazenar cultura a 4 ° C até ser necessário.
  3. Preparar 5 L de crescimento nematoide estéril médio (NGM) ágar 15 alíquota mL 12 volumes e em placas de Petri plástico estéril de 6 cm.
  4. Permitir o agar para definir durante a noite e em seguida armazenar a 4 ° C até ser necessário.
  5. Semente NGM placas de pelo menos 3 dias antes de usar com 225 μL da cultura OP50 refrigerada. Armazenar as placas a 20 ° C até ser necessário.

2. Preparação de diluições para experiências e culturas bacterianas

  1. preparar dois lotes de 500 mL de LB mídia em um Erlenmeyer de 2 L e esterilizar em autoclave.
  2. Inocular cada balão com uma única colônia de OP50 e crescer a 37 ° C, agitando a 200 rpm para cerca de 14 h.
  3. Complementar as culturas com a antibiótica estreptomicina para uma concentração final de 50 μg/mL. Continuar a agitação por 30 min a 37 ° C, em seguida, colocar os frascos no gelo por 15 min.
  4. Transferência de 450 mL de cada cultura em frascos separados centrífuga estéril (idealmente capacidade garrafas de 500ml para evitar a divisão das culturas). Manter a cultura de sobra no gelo, como ele será usado para determinar a concentração das bactérias.
  5. Gire para baixo as garrafas a 4500 x g em um conjunto de centrífuga refrigerada a 4 ° C por 25 min. Discard sobrenadante e armazenar as garrafas no gelo
  6. Diluir 100 μL da cultura de sobra de cada frasco em 900 μL de estéril lb uso 1 mL de LB estéril para zero do espectrofotómetro e em seguida determinar o OD 600 de diluição 10 vezes de cada cultura. Se, por exemplo, o OD 600 de 10 vezes diluição da cultura durante a noite é 0,28 Então a cultura tinha uma real OD 600 de 2.8.
  7. Usar uma solução de trabalho de ações de bactérias de 1,12 x 10 10 OP50 células/mL, que equivale a uma OD 600 de 56. Portanto, usando o exemplo OD 600 de 2.8 de cima, resuspenda o pellet da cultura 450 mL em um 20 th do volume original, que neste caso é 22,50 mL. Resuspenda as bactérias com uma solução estéril de S basal suplementada com estreptomicina 50 μg/ml (SB + estreptococos).
  8. Resuspenda o pellet no volume apropriado de estéril SB + estreptococos.
  9. Fazer todas as subsequentes concentrações usadas em experimentos de diluições de série da unidade populacional de trabalho em SB + strep usar os fatores de diluição listados na tabela 1.

3. Configuração a expectativa de vida experiências

Nota: vida útil ensaios são realizados em cultura de tecido de 6cm Tratado preenchida com 12 mL de ágar NGM suplementado com estreptomicina e carbenicilina (NSC), ambos em uma concentração final de 50 μg/mL. Estas placas de cultura de tecidos são adequadas para ensaios de vida útil sem nenhum ou muito baixa concentrações bacterianas, como as minhocas são significativamente menos propensas a furar a parede da placa e ressecando. O uso de dois antibióticos diferentes impede que a estirpe OP50 desenvolver resistência aos medicamentos, que é fundamental para controlar a concentração bacteriana na placa. Também, por inactivar bactérias com antibióticos, podemos minimizar os efeitos sobre worm expectativa de vida devido a infecção patogénica 16. Isso nos permite considerar apenas os componentes relacionados com os alimentos de concentração bacteriana nestas experiências. Muitos estudos de envelhecimento de c. elegans suplementam placas NGM com o químico fluoro-2 ′-desoxiuridina (FUdR) para processar os adultos estéreis. No entanto, o uso de FUdR pode ser problemático, pois seu uso pode causar vários problemas de confusão com longevidade ensaios 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al (2015) 12 contornado esse problema pela exposição de larvas L4 de RNAi de ovo-5 22 ,, 23, que inibe a transição do oócito-para-embrião, bloqueando a formação da casca da ovo de fertilizados oócitos de c. elegans, resultando em sua morte.

Estirpes de
  1. cultura da c. elegans que vão ser analisadas na semearam placas NGM a 20 ° C. permitir que as placas de fome para fora para garantir que todos os animais são cultivados de forma uniforme e potencialmente responsáveis por qualquer efeito transgeracional da condições do desenvolvimento.
  2. Transferência de larvas L1 de fome novas placas NGM semeadas cortando um pequeno pedaço de ágar (5 mm x 5 mm) da placa de fome usando um bisturi estéril e depositá-la em um prato novo, um processo conhecido como ' a fragmentação ' pelo comm de investigação de c. elegans unidade 15. Crescem os vermes até atingirem o estágio de L4. Cinco larvas L4 por tensão são então transferidas para pratos individuais de NGM semeados e mantidas a 20 ° C. Estes animais representam a geração P0.
  3. Uso L4 progênie da geração P0 para configurar a geração F1. Coloque individualmente larvas L4 de F1 da estirpe selvagem tipo N2 para 30 placas NGM semeadas.
    Nota: Para estirpes mutantes, o número de placas necessárias varia de acordo com sua taxa de crescimento. Por exemplo, daf-7(ok3125) os animais passam por uma detenção dauer transitória a 20 ° C. Assim, esta cepa produz menos L4 larvas de vermes de uma placa de tipo selvagem de N2.
  4. Para compensar esta diferença, configurar placas de daf-7(ok3125) um dia mais cedo do que N2 placas e em maior número, uma boa relação de trabalho é de 3:1.
  5. Transferência sincronizada de progênie L4-palco dos pais para placas NGM suplementados com 1 mM IPTG e 50 carbenicilina µ g/mL (placas de RNAi) que foram semeados com 225 µ l de bactérias HT115, expressando dsRNA como alvo o gene 5-ovo e manteve na F1 20 ° C por 24 h. Pelo menos 360 vermes por estirpe, mantidos em uma densidade de 15 animais por prato, são necessários por experimento.
  6. Após o ovo-5 tratamento de RNAi, transferir os vermes para placas NSC semeadas com 225 µ l do OP50 tratados com estreptomicina na concentração de 2 x 10 9 células/mL (tabela 1) para um adicional de 24 horas a 20 ° C. Para evitar danos físicos para os vermes durante esta e todas as transferências subsequentes, suavemente colher animais de debaixo do worm usando um verme muito fino delicadamente curvado escolher. Flutuador os animais fora o worm escolher por imersão em uma gota de 10 µ l de SB + estreptococos colocado na superfície da placa nova.
  7. No dia seguinte, redistribuir os vermes para placas NSC, representando cada um da comida níveis listed na tabela 1, bem como um conjunto de placas NSC que não contêm nenhuma bactéria. Todas as placas NSC com 225 µ l da concentração de bactérias relevante da semente e propagar as placas NSC com 225 µ l SB + estreptococos, livre de bactérias. Manter os vermes em uma densidade de 15 animais por placa, resultando em pelo menos quatro placas por condição de comida por estirpe. Deslocar as placas à temperatura desejada experimental.
  8. Transferência minhocas frescas placas NSC semearam com concentração de alimentação adequada, de acordo com o cronograma descrito na tabela 2.
  9. Animais de Pontuação para o movimento por cutucando suavemente com um fio de escolher. Falha em responder é marcada como a morte. Marcar os animais para morte em cada transferência de ponto e então diariamente após o último ponto de transferência.

4. Configuração acima da imagem latente experiências

Nota: as etapas descritas nesta seção são suficientes para gerar suficiente vermes por estirpe de imagem a uma condição de comida experimental a uma dada temperatura. Este protocolo pode ser dimensionado para caber o número de condições que vai ser fotografada em qualquer dia. No entanto, deve-se ter cuidado no projeto experimental para garantir que o prazo é razoável e que animais através de diferentes estirpes não têm uma diferença de idade superior a 12 horas no dia da imagem latente. É altamente recomendável que os repórteres transcriptional sendo fotografados são transgenics de cópia única, como isto será mais se assemelham o nativo regulamento do gene. O protocolo descrito abaixo e resumidos na tabela 3, também fornece um método simplificado para obtenção de populações de grande idade síncrono correspondida de tensões, que podem ser usadas para outros fluxos de trabalho experimentais.

  1. Cultura de animais em experimentos em placas de cultura de tecidos Tratado de 10 cm para permitir uma maior densidade de minhocas por imagens (∼ 100 animais por placa) do que a expectativa de vida ensaios.
  2. Preencher as placas de 10 cm com 30 mL de placas de ágar NGM e sementes com alíquotas de 5 225 µ l de refrigerados OP50 cultura em uma cruz, como formação.

5. Inicial cultura de repórter cepas

  1. cultura da c. elegans cepas que vão ser analisadas na semearam placas NGM a 20 ° C. permitir que as placas de fome para fora para garantir que todos os animais são cultivados de forma uniforme e potencialmente responsáveis por qualquer transgeracional efeitos das condições do desenvolvimento.
  2. Bolão o L1 esfomeado larvas para semearam placas NGM e crescem até atingirem o estágio de L4. Transferir três larvas L4 por estirpe para duas placas NGM semeadas a 20 ° C. Estes animais representam a geração P0.
  3. Usar a progenitura de L4 da geração P0 para configurar a geração F1. Coloque as larvas L4 de F1 da estirpe selvagem tipo repórter para 4 placas NGM semeadas. Para cepas mutantes, o número de placas necessárias varia de acordo com sua taxa de crescimento. Usando o exemplo anterior de daf-7(ok3125), cepas de repórter neste plano requer três vezes as chapas de matrícula e precisa ser definidas até dois dias antes das estirpes de tipo selvagem repórter, para explicar as diferenças na taxa de crescimento.

6. Recolha de ovos e sincronização de repórter cepas

Nota: alguns genes de interesse da comunidade de pesquisa de c. elegans envelhecimento resultam em crescimento e defeitos de postura quando uma mutação, que torna mais difícil para gere grandes populações síncronas de animais de diferentes genótipos. Por exemplo, a mutação daf-7(ok3125) provoca um defeito de postura severo em comparação com o selvagem-tipo N2 estirpe. Portanto, para obter suficientes números de larvas de L4 síncronos de diferentes estirpes para experimentos quantitativos de imagem requer uma metodologia mais robusta do que manualmente pegar vermes. Por esta razão, cepas transcriptional repórter foram submetidas a um hipoclorito de sódio (NaClO) / tratamento de solução de hidróxido de sódio (NaOH) de gravid adultos para quebrar abrir os animais e libertar seus ovos, um processo conhecido como ' branqueamento ' pelo c. elegans pesquisa Comunidade 15.

  1. Conta as diferenças em crescimento taxas entre estirpes e calcular quando as placas de cada estirpe devem ser colhidas e descoradas. Para obter um exemplo de quando as estirpes de tipo selvagem e daf-7(ok3125) repórter são branqueadas ver quadro 3.
  2. , Serialmente, lave os vermes de uma determinada pressão sobre as placas, no dia apropriado, usando 15 mL de SB e coletar em um tubo estéril 15 mL. Permitir que os animais de sedimentos naturalmente e em seguida, ajuste o volume de líquido a 7 mL.
  3. , Adicionar 2 mL de 5% NaClO e 1 mL de 5 M NaOH ao tubo contendo os gravid adultos. Agitar suavemente a mistura à temperatura ambiente para não mais de 3 min. O NaClO vai matar as bactérias e vermes, enquanto o NaOH faz com que os vermes separar liberando qualquer ovos fertilizados, eles contêm no líquido. A quitina da casca em torno os embriões protege-los contra os efeitos do tratamento, enquanto o tempo de exposição permanece relativamente curto. Após a incubação de 3-min, vórtice do tubo para ~ 30 s para facilitar ainda mais a separação das carcaças worm.
  4. Após o spin de incubação de 3-min a mistura a 1.000 x g por 1 min para os ovos de Pelotas. Aspire o a maioria fora do líquido sobrenadante com uma pipeta de vidro estéril conectada a um balão de vácuo, deixando ~0.5 mL em cada tubo, para não perturbar os ovos.
  5. Resuspenda o pellet com 9,5 mL de SB e em seguida, repita a etapa de centrifugação e ressuspensão passos adicionais duas vezes para que os ovos foram lavados com SB um total de três vezes.
  6. Depois de lavar a final, os ovos através de centrifugação de pelotas e depois descartar tudo, mas 0,5 mL do sobrenadante. Resuspenda os ovos no restante 0,5 mL de SB e então alíquota 100 µ l para três placas NGM semeado de 10 cm. Distribua a 100 µ l igualmente entre todos os cinco gramados bacterianos em cada prato. Para as estirpes de tipo selvagem, ovos não devem ser depositados em densidades maiores que 200 por placa.
    1. Placas de manter a 20 ° C por 48 h e obter uma população altamente homogênea de larvas L4. Para linhagens com fenótipos de atraso de crescimento, é aconselhável para depositar ovos como muitos como disponível e aumentar o tempo de incubação. Por exemplo, manter daf-7(ok3125)-contendo cepas de repórter a 20 ° C ~ 64 h permitir que os ovos eclodem e chegar à fase de L4.

7. Tratamento de cepas de repórter com ovo-5 RNAi

  1. serialmente lavar os vermes fora as três placas com 15 mL de SB e recolher o líquido em um tubo estéril 15 ml. Permitem que as larvas L4 de sedimentos naturalmente e em seguida aspirar tudo mas ~0.5 mL do líquido. No selvagem typcepas de repórter e, nesta etapa remove qualquer larvas mais jovens que L4. Em contextos mutantes, esta etapa auxilia a remoção de qualquer presas larvas como dauers no caso de daf-7(ok3125).
  2. Resuspenda os vermes com 9 mL de SB. Novamente, monitorar a taxa de sedimentação das larvas L4 e depois Aspire todos ~0.5 mL do sobrenadante, mas uma vez que a maioria das larvas L4 tem peletizado. Repita este processo mais uma vez. Então Aspire todos, mas ~0.5 mL do líquido, uma vez que a maioria das larvas L4 instalaram.
  3. Adicionar 10 µ l de estéril S basal suplementado com 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) para o líquido contendo as larvas L4. Isto funciona como um surfactante e impede que as larvas de furar a superfície interior das pontas de pipetas plásticas.
    1. Ressuspender delicadamente as larvas usando uma ponta de pipeta de baixa retenção P200 e então alíquota 150 µ l em três placas de RNAi 10 cm que são semeados com 225 x 5 µ l de ovo-5 bactérias de RNAi. Certifique-se de que os vermes estão igualmente distribuídos em todos os cinco gramados bacterianos.
  4. Uma vez que o líquido tenha absorvido o ágar-ágar, retire qualquer não-L4 larvas as chapas que não foram eliminadas pelo procedimento de lavagem por escolhendo-las manualmente. Em seguida, armazenar as placas a 20 ° C por 24 h.

8. Iniciação de vasta gama DR

Nota: após as 24h ovo-5 tratamento de RNAi, as larvas L4 que originalmente foram depositadas nas placas terá se tornado adultos 1 - velhos dias.

  1. Apanhar qualquer larvas jovens que escaparam a etapa prévia remoção manual fora nesta fase, deixando somente os adultos 1 - velhos dias nas placas.
  2. Para cada estirpe, lave os adultos 1 dias de idade das três placas com 15 mL de estéril SB + estreptococos em um tubo de 15 mL. Permitem que os vermes de sedimentos naturalmente e em seguida aspirar todos menos 0,5 mL do sobrenadante. Resuspenda as minhocas com 9,5 mL de SB + estreptococos e repita as etapas de sedimentação e lavar.
  3. Depois de lavagem final, permitem que os vermes de sedimentos e depois Aspire todos menos 0,5 mL do sobrenadante. Adicionar 10 µ l SB + Plu e ressuspender delicadamente as larvas usando uma ponta de pipeta P200 e então alíquota µ l 100 em uma placa de NSC inoculada com bactérias 5 x 225 µ l em uma concentração de 2 x 10 9 células/mL.
    1. Distribuir a 100 µ l uniformemente em todos os cinco gramados bacterianos. Sob um microscópio, estimar o número de animais presentes na placa: o objetivo é ter entre 100-150 vermes no prato.
    2. Determinar o volume de líquido necessário para atingir uma densidade de verme dentro deste intervalo e, em seguida, a alíquota em duas placas adicionais. Ajustar o número de vermes no primeiro prato também se enquadram nesta faixa e em seguida armazenar as placas a 20 ° C por 24 h.
  4. No dia seguinte, coletar os adultos 2 dias de idade e distribuir para novas placas NSC semeadas com a concentração desejada de experimental de alimentos (tabela 1), reutilizando os métodos indicados nas etapas 2 e 3. Uma vez que o líquido é absorvido o ágar-ágar, deslocar as placas à temperatura desejada experimental por 24 h.
  5. No dia seguinte, coletar os adultos 3 dias de idade e distribuir às placas de NSC frescas semeadas com a mesma concentração experimental de comida, reutilizando os métodos indicados nas etapas 8.3 e 8.4. Uma vez que o líquido é absorvido o ágar-ágar, retornar as placas à temperatura experimental por 48 h.
  6. Coletar os adultos 5 dias de idade e distribuir às placas de NSC frescas semeadas com a mesma concentração experimental de comida, reutilizando os métodos indicados nas etapas 8.3 e 8.4. Uma vez que o líquido é absorvido o ágar-ágar, retornar as placas à temperatura experimental por 24 h.

9. Microfluidic Imaging da repórter cepas

  1. no dia 6 de idade adulta, imagem animais usando um personalizado microfluidic plataforma 24 , 25. Fisicamente, abater animais das três placas e suspender em um tubo criogênico de 5 mL contendo 4,5 mL de SB + estreptococos.
    1. Uma vez os vermes sedimento, aspirar tudo mas ~0.5 mL do sobrenadante e ressuspender os animais em 4 mL de SB + estreptococos. Esta lavagem remove bactérias em excesso que caso contrário podem interferir com a imagem. Os vermes são introduzidos em um dispositivo microfluidic personalizado via pressão conduzido fluxo 24 , 25. Dentro do dispositivo, worms individuais são dirigidas para e presos dentro de um canal de imagens bloqueado por controlado por pressão em-microplaqueta válvulas 26 sob o controle de software personalizado.
  2. Uma vez uma minhoca é prendida cabeça no canal de imagens, recolher uma pilha-z fluorescente, com 50 seções em 2 etapas de µm, usando um microscópio de epifluorescência padrão com um 40 X objetivo de óleo (NA 1.3) e uma câmera. Recolha imagens fluorescentes vermelhas e verdes para cada um dos repórteres transcriptional simultaneamente usando um divisor de emissão e armazenadas para análise. Aquisição de imagens é automatizada usando software personalizado.
  3. Processo a imagem automaticamente usando personalizado MATLAB scripts 27 (disponível em https://github.com/meizhan/SVMelegans). Os Z-pilhas são carregadas no MATLAB e analisados para identificar pares de neurônio e suas localizações dentro do plano de imagem. As projecções máximos então são computadas e um algoritmo de limiarização é utilizado para localizar as células fluorescentes individuais. Identificação de célula é então calculada baseado em distâncias relativas e locais dentro do worm ' cabeça de s.
  4. Para quantificar fluorescência de repórter, extrair o volume tridimensional em torno de cada localização celular da z-pilha. Integrar a intensidade sobre um número consistente de pixels mais brilhantes, que encapsulam inteiramente toda a célula em todos os casos.
  5. Para eliminar a interferência de alterações de condição-cepa específica ou experimentais na barriga autofluorescência de cada animal, calcular a intensidade de fundo para os pares de celular mais próxima do intestino (ADF e ASI) através da estimativa do modo do distribuição de intensidade em um volume ao redor do neurônio. Subtrair esse valor de intensidade de fundo de fluorescência integrada para obter a saída final.

10. Conjunto de dados

Nota: as intensidades de fluorescência de todos os neurônios analisados pelo software de processamento de imagem são combinadas em arquivo de dados de expressão filtrada (FED), que é usado para estimar os perfis de distribuição do gene expressão (modelo R e C++ scripts estão disponíveis em https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Imagem de cheque cada processada manualmente para confirmar a correta identificação de todas as células. Imagens com identificação errônea da célula devem ser gravadas em um arquivo de exclusão. Em Diana et al. (2017) 13, o arquivo de exclusão consiste em uma tabela binária com ' 0 ' para corrigir e ' 1 ' para identificação de célula incorreta. O número de linhas na tabela é igual ao número de vermes fotografada com uma coluna para cada célula fotografada (i. e ASI, ADF e NSM).
  2. Gerar o arquivo do FED:
    1. executar o bash script " gen_data + tempo " gerar arquivos específicos de célula, combinando os valores de expressão obtidos de cada worm fotografada filtrado usando o arquivo de exclusão. Para cada pasta gerada pelo software de processamento de imagem, o bash script lê o arquivo de anotação < folderprefix > _EXP.txt para extrair as condições experimentais e o arquivo de exclusão < folderprefix > _X.csv para selecionar somente corretamente identificados os neurônios. Valores de expressão leitura dos arquivos de < folderprefix > _data_ < neurônio >. csv.
    2. Concatenar todos os ficheiros para " FED_split.dat " e classificá-lo pelo código de lote do experimento, worm identidade rótulo e célula.
    3. Executar " tipo " (programa de C++, uso:. / classificar FED_split.dat FED_merged.dat) para selecionar as entradas com fluorescência não-zero para cada célula e combiná-los em linhas simples, em FED_merged.dat.

11. Estimativa de informações codificadas

Nota: O procedimento a seguir descreve como quantificar as informações sobre condições ambientais específicas, codificado por um conjunto de expressões de gene. Em Diana et al. (2017) 13, as informações codificadas sobre a abundância de comida no ambiente foi examinada, no entanto, o próprio método é aplicável a qualquer número discreto de Estados ambientais. O ingrediente essencial para quantificar variáveis teórico de informação como entropias informações ou redundância é a distribuição conjunta de probabilidades das respostas neurais sob os estímulos do ambiente conjunto considerados. Para realizar essa estimativa, é crucial ter uma amostragem suficiente da resposta do outro lado as populações de minhocas. Distribuições gaussianas podem ser estimadas a partir de amostras relativamente pequenas; no entanto, é importante ter uma ideia da forma esperada da distribuição expressão para quantificar o tamanho de amostra adequado para uma estimativa confiável de densidade. Devido à variabilidade inevitável através de ensaios diferentes, é essencial verificar que os valores centrais das distribuições obtidas em diferentes repetições do mesmo experimento não são sistematicamente deslocados ou que qualquer dos recursos estatísticos do distribuição de expressão não são significativamente alteradas através de ensaios. No caso da variabilidade de julgamento-para-julgamento é compatível com a variabilidade dentro de cada julgamento, é crucial equilibrar o número de ensaios versus o número de vermes dentro de ensaios a média desses fatores ambientais/biológicas que afetam o julgamento-para-julgamento variabilidade. Undersampling esses fatores poderia viés fortemente a análise teórica informações.

  1. Script como o R " code3D.R " fornece um modelo para a geração de densidades tridimensionais baseadas no arquivo " FED_merged.dat ", modificar este modelo de acordo com o formato de cabeçalho específico do FED. A lista " HeaderNames " representa os nomes de cada campo no arquivo FED enquanto " RONames " é a lista de avisos. O script usa o pacote R ' ks ' 28 , 29 para estimar distribuições multivariadas dentro de uma rede de hipercúbico com GS escaninhos em cada dimensão, subdividindo o intervalo entre o mínimo e máximo valores no conjunto de dados para cada leitura. Quando a variável interna " grupo " é definido como 0, todos os dados são usados para a estimativa da densidade. Quando o " grupo " rótulo é entre 1 a 5, o dataset é dividido em 5 Conjuntos disjuntos, e as densidades de expressão são estimadas dos 80% dos dados resultantes da exclusão de um dos cinco conjuntos. Esse recurso é usado mais tarde para estimar incertezas.
    Nota: Uso de code3D.R: code3D.R Rscript < GT > < comida > < GS > < outfolder > < rótulo > < grupo > < frac > onde GT representa o genótipo, a comida é a condição ambiental, outfolder é o pré-existente pasta onde serão armazenadas as distribuições, rótulo é um prefixo de nome de arquivo e frac é a fração do dataset usado.
  2. Para cada condição ambiental gerar as distribuições multivariadas com grade diferente tamanhos GS (por exemplo, 20,30,40 caixas). Para reduzir a carga computacional, menores valores de GS são preferíveis quando melhores resoluções não alteram significativamente a estimativa de informações. Distribuição de expressão gênica são escritos na pasta < outfolder > especificado ao executar code3D.R como simples arquivos de texto da coluna com o nome do arquivo estrutura < rótulo > _ < GT > _ < comida > _GS < GS > _group < grupo >. dat.
    Nota: as etapas anteriores fornecem a estimativa das distribuições de probabilidade condicional Equation 1 onde g denota o vetor de todas as leituras e f é a condição ambiental. No entanto, para calcular a informação mútua entre a expressão do gene e o ambiente 30 , 31.
    Equation 2
    temos a distribuição da entrada Equation 3 que também determina o (entrada-) em média a expressão do gene < img alt = "Equação 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Quando a distribuição de entrada não é diretamente disponível, uma quantidade significativa para caracterizar os recursos de codificação é a capacidade do canal, que pode ser obtida através da maximização da informação mútua entre todas as distribuições possíveis de entrada.
  3. Usando a distribuição de expressão gênica, aplicar o algoritmo de 32 Arimoto-Blahut para estimar a capacidade de canais do sistema e a distribuição da entrada ambiental que maximiza a informação. Um exemplo de implementação do algoritmo pode ser encontrado no programa C++ " Ccap3D.cpp " para a expressão do gene tridimensional código analisado na Diana et al. (2017) 13. Exemplo: se as distribuições a partir do genótipo GT123 são obtidas a partir de 80% dos dados (grupo 3) com o tamanho da grade igual a 30 e armazenados na pasta ". /pdf/ " usando um rótulo de prefixo = " PDF ". É o comando para calcular as informações codificadas no fundo GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Nota: A estimativa da informação codificada pelo sistema é afectada por várias fontes de incerteza, incluindo a escolha da estimativa de densidade viés de tamanho de algoritmo e amostra. 11.1-11.2 de etapas devem ser repetidas usando métodos de estimativa de densidade diferentes para avaliar o tamanho da polarização sistemática introduzida por cada algoritmo.
  4. Para estimar a incerteza devido ao tamanho da amostra, recalcular informações da escadaria 11.1-11.2 com grupos entre 1 a 5. A variabilidade entre estas cinco amostragens independentes dos 80% dos dados irá refletir o impacto do tamanho da amostra na estimativa informações.
  5. Calcular informações usando etapas 11.1-11.2 sobre aumento da fração dos dados (como na etapa 5) para corrigir para o tamanho da amostra viés (Jack-Knife método) 33.

12. Cálculo de redundância, ruído e correlação de sinal

  1. uso o ideal entradas distribuições obtidos da estimativa da máxima informação para calcular a informação mútua Equation 5 entre a entrada e gene resposta de expressão de cada neurônio N. O arquivo de origem C++ " GetMI1D.c " é um programa de exemplo para obter informação mútua marginal da distribuição conjunta de probabilidades.
  2. Calcular redundância tomando a soma da informação mútua para cada neurônio obtida acima e em seguida, subtrair a capacidade de canal.
  3. Calcular o " shuffle " termo informações Equation 6 13 , 34. Um arquivo de origem C++ de modelo pode ser encontrado em " GetShuffle.c ".
  4. Uso o " shuffle " termo para calcular a correlação de sinal e ruído. Para a signacorrelação de l, temos Equation 7 e para a correlação de ruído, temos Equation 8.
  5. Incertezas na redundância, obter o ruído e correlação quanto a informação total (etapa 11.3 da seção anterior) de coletas múltiplas dos 80% dos dados e tomar o desvio padrão de sinal.

Representative Results

Realizando experiências de vida útil sobre os mutantes dos genes de interesse ao lado o tipo selvagem N2 tensão, pode-se estabelecer se estes genes têm um papel na resposta de comida ao DR vasta gama. A resposta de tipo selvagem deve ser comparável ao representado na Figura 1A. Qualquer modulação da resposta pelos mutantes, refletido por um efeito de não-uniforme através de condições de alimentação, indica que estes genes afetam a capacidade do worm para responder correctamente às mudanças em abundância de comida, no qual ponto outras investigações do respostas de expressão destes genes a vasta gama DR é garantido. Se, no entanto, a resposta de longevidade dos mutantes não é significativamente diferente do tipo selvagem, então os genes não tem nenhum papel no transducing os efeitos da vasta gama DR, pelo menos ao nível da esperança média de vida. Se as mutações causam uma mudança uniforme da expectativa de vida de toda resposta então os genes têm um efeito independente de comida sobre a longevidade. Isto não exclui a possibilidade de que a expressão dos genes de interesse é comida-responsivo, em cujo caso as informações transportadas por estes genes não é transmitido a expectativa de vida.

A próxima etapa do protocolo é determinar como os níveis de expressão mudam sob DR vasta gama para os genes de interesse. Na Figura 1B, podemos ilustrar isso através dos níveis de expressão de um repórter transcriptional do daf-7, que mostra uma resposta às mudanças no nível de comida nos neurônios sensoriais ASI. Em um mutante de daf-7(-) , a resposta da expressão do transcriptional repórter é alterada. Se os genes de interesse são verdadeiramente comida-responsivo ao nível de expectativa de vida em seguida pode-se esperar que sua expressão também vai mudar com a comida. Correspondentemente, um repórter transcriptional no fundo mutante deve ter um perfil de expressão alterada em resposta a vasta gama de DR. No entanto, também é possível que o repórter transcricional do gene de interesse em um plano de tipo selvagem não mostra qualquer alimento-sensível a mudanças na expressão. Nessa situação, isso pode indicar um efeito regulatório pós-transcricional que cai fora do âmbito do presente protocolo.

Em Diana et al. (2017)13, extraímos a expressão valores para daf-7 na ASI e tph-1 no ADF e NSM. Na Figura 2,podemos ilustrar a estimativa da distribuição expressão da ASI e ADF para um nível dado alimento. Múltiplas leituras de imagens de worm única permite-nos analisar não só a quantidade de informação codificada de forma independente por cada neurônio, mas também a informação combinatória do circuito inteiro neural (Figura 2B-2C). Combinar estas duas medidas de informação teórica nos permite caracterizar o sistema em termos de estratégia de codificação utilizada pelos neurônios para transmitir informações sobre comida. A quantidade de redundância no circuito pode ser obtida levando a soma da informação mútua para cada neurônio e subtraindo a informação mútua conjunta (capacidade de canal) obtida, considerando as leituras combinatórias do circuito. Um valor positivo de tal diferença denota um caráter redundante da estratégia de codificação, porque a informação cumulativa entre as partes é maior do que a real informação codificada pelo circuito inteiro. Inversamente, um valor negativo reflete uma estratégia sinérgica porque a verdadeira informação codificada é maior do que a soma de seus componentes (Figura 2B). Informações e redundância podem ser comparados entre diferentes genótipos para explorar possíveis funções de ordem superiores da regulação genética, por exemplo, Diana et al (2017) 13 o efeito da mutação daf-7 muda a estratégia de codificação de redundante para sinérgica (Figura 2C-2D).

Figure 1
Figura 1 : Resposta da expressão de gene e vida útil sob vasta gama Dr. (A) a média expectativa de vida do tipo selvagem N2 estirpe (linha preta) exibe uma resposta complexa à vasta gama DR. A magnitude da resposta é atenuada em um mutante nulo do gene daf-7 (linha vermelha). Barras de erro representam o erro padrão da média, dados em pool de Entchev et al (2015) 12. níveis de expressão (B), a média de um repórter transcriptional gene daf-7 no fundo tipo selvagem (linha preta) também exibir uma resposta não-monotônicas complexa a vasta gama DR. No fundo genético de daf-7(-) a expressão deste repórter transcriptional é altamente atenuada e mostra pouca resposta às mudanças no nível de comida. Barras de erro representam o erro padrão da média, dados de um único julgamento em Entchev et al (2015) 12. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Metodologia computacional. (A) ilustração da estimativa de densidade bidimensional de tph-1 expressão de ADF e daf-7 em ASI como obtido o pacote 'ks' R usando uma grade dimensão 30 x 30. (B) visualização da informação codificada pela expressão conjunta de tph-1 e 7-daf (inteira) e individualmente (soma das partes) para ADF, ASI e NSM neurônios. Redundantes e sinérgicos caracteres da codificação são representados pela diferença entre a altura das barras empilhadas sobre o direito e a informação codificada pelo circuito completo. (C) comparação entre codificada pelo tipo selvagem animais e o mutantes daf-7(-) informação sobre os alimentos. (D) a redução de informação mútua observada nos mutantes é acompanhada por um interruptor para codificação sinérgica. Os painéis B-D são adaptados de Diana et al . (2017) 13. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Concentração bacteriana (células/ml) Densidade óptica (600nm) Factor de diluição (do anterior)
1.12E + 10 56.000 0,00
2.00E + 09 10.000 5.60
6.32E + 08 3.160 3.16.
6.32E + 07 0,316 10,00
2.00E + 07 0,100 3.16.
0 (S basal) 0.000 AT

Tabela 1: níveis de alimento e fatores de diluição utilizados na vasta gama Dr. Bactériasconcentrações de l (células/mL) usadas no protocolo DR vasta gama, junto com suas respectivas medições de600 OD e o factor de diluição necessária para alcançar cada concentração da anterior.

Temperatura experimental de expectativa de vida
Dia 12,5 ° C 15° C 17,5 ° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27,5 ° C
-12 Bolão de todas as estirpes para placas NGM frescas e manter a 20° C
-11
-10 P0 geração de cepas daf-7(-) e manterão a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)
-9 Configurar a geração de P0 de estirpes de tipo selvagem e manter a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)
-8
-7
-6
-5 Configurar a geração F1 de cepas daf-7(-) e manter a 20° C (1 L4 por placa, 90 placas)
-4 Geração F1 de estirpes de tipo selvagem e manterão a 20° C (1 L4 por placa, 30 placas)
-3
-2
-1
0 Escolher as larvas L4 F2 para > RNAi ovo-5 placas e manter a 20° C (15 L4 por placa, 24 chapas)
1 Passo 1 - velhos dias adultos para placas NSC semearam com 2.0 e + 9 células/ml em nível alimentar e mantêm a 20 ° C
2 Passo 2 - velhos dias adultos para placas NSC semearam com condições experimentais de comida e a temperatura experimental
3 Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência
4
5 Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência
6
7 Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência
8
9 Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência
10
11 Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência Transferência
12
13
14 Transferência Transferência Transferência Transferência
15
16
17
18 Transferência Transferência
19
20
21
22 Transferência

Tabela 2: cronograma para lifespans conduzida em temperaturas diferentes. Esboço esquemático das etapas necessárias para configurar vasta gama DR vida útil experimentos em temperaturas diferentes usando cepas daf-7(-) e tipo selvagem como exemplos. O número de transferências para pratos frescos de cada nível de comida experimental diminui com o aumento da temperatura. Esta é a conta para o fato de que os animais a temperaturas mais elevadas estão envelhecendo mais rapidamente e então um mais propensas a danos físicos por transferência.

Dias Ima
Ging Pipeline -14 Cepas de repórter pedaço no fundo daf(-). Manter a 20 ° C. -13 Cepas de repórter pedaço no fundo do tipo selvagem. Manter a 20 ° C. -12 Configure o P0 geração de cepas de repórter de daf-7(-). Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas e manter a 20 ° C. -11 -10 Configure a geração de P0 de estirpes de tipo selvagem repórter. Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas e manter a 20 ° C. -9 -8 Configure a geração F1 de cepas de repórter de daf-7(-). Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. 12 placas de usar e manter a 20 ° C. -7 -6 Configure a geração F1 de estirpes de tipo selvagem repórter. Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Use 4 placas e manter a 20 ° C. -5 -4 -3 Alvejante daf-7(-) cepas de repórter na tarde (~ 5 pm) e depositar os ovos em 3 placas de 10cm NGM e manter a 20 ° C. -2 Lixívia selvagem tipo repórter cepas manhã (~ 10 m) e o depósito de ovos em 3 a 10 cm placas NGM e manter a 20 ° C. -1 0 Lave L4 para placas de RNAi de ovo-5 de 10 cm. Use 3 placas por estirpe e manter a 20 ° C. 1 Lave 1 dia adultos para placas NSC semeados com 2.0 e + 9 células / ml. usar 3 placas por estirpe e manter a 20 ° C. 2 Lavagem dia 2 adultos para placas NSC semearam com níveis de comida experimental. Use 3 placas por estirpe e shift para temperatura experimental. 3 Transfira para pratos frescos de NSC. Use 3 placas por estirpe e manter a temperatura experimental. 4 5 Transfira para pratos frescos de NSC. Use 3 placas por estirpe e manter a temperatura experimental. 6 Escolher animais pratos e prepare-se para a imagem latente.

Tabela 3: programação para gasoduto de imagem. Esboço esquemático das etapas necessárias para configurar o DR vasta gama de experimentos utilizando cepas de repórter transcriptional fluorescente em fundos daf-7(-) e tipo selvagem em temperaturas diferentes como exemplos de imagens.

Discussion

Aqui, apresentamos um novo método para restrição dietética que encapsula uma muito mais ampla gama de concentrações de comida do que os protocolos publicados anteriormente. Este método vincula dois fenômenos anteriormente separados vistos na literatura DR c. elegans , bacteriana privação e restrição dietética clássica, permitindo que ambos os efeitos dietéticos ser estudaram sob um protocolo. Usando o novo paradigma de DR vasta gama, apresentamos um quadro geral para examinar a expressão de gene única célula em resposta a uma sugestão ambiental específica e determinar como esta célula codifica informações. Nosso quadro é composto por dois protocolos experimentais que ilustram como realizar a expectativa de vida e imagem quantitativa, respectivamente, sob a vasta gama Dr. Data destes protocolos experimentais então podem ser examinada com as análises computacionais fornecidas em Este quadro para quantificar as informações codificadas por mudanças nos níveis de expressão do gene ou expectativa de vida em condições diferentes de alimentos.

Experiências de vida útil, utilizando vasta gama DR paradigma envolvem seis níveis distintos de comida (tabela 1). Isto exige uma abordagem mais trabalhosa do que examinando a longevidade sob menos níveis de alimentos, tais como a privação alimentar10,11 ou usando o fundo genético de comer-2 35. No entanto, examinar a expectativa de vida sob uma única condição pode limitar as interpretações do papel de um gene em DR. Por exemplo, mostramos recentemente que mutantes daf-7 tem uma atenuação de bidirecional da resposta à concentração de alimentos em relação ao tipo selvagem animais12 (figura 1A). Na ausência de comida, mutantes daf-7 exibem um encurtamento de sua vida útil em comparação com animais do tipo selvagem. Se nós só tinha considerado privação dietética, interpretaria a que o gene daf-7 como sendo necessário para a extensão de vida útil apenas, , quando na verdade o papel de daf-7 é mais complexa. Portanto, o resultado crítico desta parte do protocolo é estabelecer se um gene de interesse é envolvido em modulando a resposta global às mudanças de expectativa de vida em abundância de comida.

Uma das principais vantagens do presente protocolo em relação a outros métodos é que ele usa um novo método para eliminar a produção de descendência em animais submetidos à análise de expectativa de vida. A maioria dos estudos usa a droga FuDR para inibir a proliferação do germline em adultos, tornando-os estéreis. No entanto, estudos recentes têm mostrado FuDR tratamento pode ter efeitos de condição e gene-específico na expectativa de vida17,18,19,20,21, comparecendo questione sua aplicabilidade geral. Neste protocolo, a eliminação da produção de descendência é conseguida através de um 24h fertilizados de tratamento dos animais com RNAi como alvo o gene 5-ovo , que inibe a formação da casca da ovo de quitina de oócitos de c. elegans , resultando em sua morte de22,23. A vantagem deste método é que é muito tarde-agir e por isso não interfere com da linha germinal, que é um grande regulador da longevidade em c. elegans.

Uma ressalva potencial do protocolo DR vasta gama é sua dependência do uso de antibióticos para controlar a proliferação bacteriana para garantir um controlo apertado da concentração bacteriana. Proliferação bacteriana dentro do intestino do verme é conhecida por ser das principais causas de morte em c. elegans16. Assim, o uso de antibióticos bacteriostáticos, como a carbenicilina, em ágar NGM impede a proliferação bacteriana e aumenta a vida útil de vermes em comparação com controles não-antibiótico16. Certos tipos de antibióticos, como a rifampicina36 e membros da tetraciclina família37,38, foram mostrados para estender a vida útil em c. elegans , independentemente do seu efeito sobre bactérias proliferação. No entanto, não há nenhuma evidência na literatura que a carbenicilina ou estreptomicina pode aumentar longevidade, independentemente do seu efeito sobre a proliferação bacteriana.

Expectativa de vida pode ser vista como o resultado de um cálculo complexo onde a informação ambiental, encaminhada pela expressão gênica em redes neuronais, é transmitida à fisiologia. Nosso protocolo fornece uma metodologia para entender como específicos genes afetam o fluxo de informações ambientais. Para resolver esta questão, precisamos confiável para determinar a distribuição das respostas de expressão do gene no nível de célula única de processamento de imagem. Ser capaz de estimar não só as médias das respostas da expressão do gene para mudanças em abundância de comida, mas também a distribuição estatística completa de grandes populações representa um importante requisito para a aplicabilidade do nosso método. Esta descrição precisa de respostas de expressão de gene a abundância de alimentos permite a aplicação da teoria da informação quantificar a informação codificada pelos neurônios específicos, bem como a estratégia de codificação utilizada pelo circuito neural.

Aspectos de imagem e computacionais dos métodos indicados no presente protocolo são aplicáveis a um conjunto maior de contextos biológicos. No nosso trabalho, focamos em uma pequena rede neural envolvida na comida detecção, no entanto, as análises das características de processamento de informações não estão limitadas a um tipo específico de célula ou pistas ambientais específicas. No futuro, essas metodologias potencialmente podem ser estendidas a uma variedade maior de variáveis de entrada, afetando qualquer saída fisiológica. Essas abordagens contribuirá para uma maior compreensão de como as redes reguladoras do gene codifica, processo e transmitir informações.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos os laboratórios Bargmann e Horvitz para reagentes. Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Agradecemos também Lipovsek M. para comentários sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo Wellcome Trust (projeto 087146 Grant para Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 e 1/BB/M00757X de Q.C.), Conselho Europeu de investigação (242666 de NeuroAge de Q.C.), nos institutos nacionais de saúde (R01AG035317 e R01GM088333 para H.L.) e U.S. Fundação Nacional de ciência (0954578 de H.L., 0946809 GRFP para magalhaes).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

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Genética edição 126 restrição dietética imagem latente de alta produtividade teoria da informação neurociência microfluídica codificação Neural expressão gênica
Quantificação da informação codificada pelo Gene expressão níveis durante a vida útil modulação sob vasta gama dietéticas restrição em <em>c. elegans</em>
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Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

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