Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Burada, bir çerçeve geniş menzilli diyet kısıtlaması gen ekspresyonu ve ömrü ile ilgili mevcut. Biz iletişim kuralları bu paradigma altında gen ekspresyonu kantitatif görüntüleme ve geniş menzilli diyet kısıtlaması için açıklar. Daha fazla bilgi işleme özellikleri genetik devrelerin temel gıda algılamalı içinde söz konusu ortaya çıkarmak için hesaplama analizleri anahat.

Abstract

Duyu sistemleri hayvan tespit etmek, işlemek ve çevreleri için yanıt vermek için izin verir. Gıda bereket hayvan fizyolojisi ve davranışı üzerinde derin etkileri vardır çevresel bir ipucudur. Son zamanlarda, modülasyon uzun ömürlü gıda bereket tarafından Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar önceden tanınan daha karmaşık olduğunu gösterdi. Ömrü gıda düzeyindeki değişikliklere yanıt bilgi sinirsel bir devre içinde işlem kontrol ederek hareket belirli genler belirler. Bizim framework genetik analizi, yüksek üretilen iş nicel görüntüleme ve bilgi kuramı birleştirir. Burada, bu teknikler geniş menzilli diyet kısıtlaması için fizyolojik bir ilgisi vardır herhangi bir gen karakterize etmek için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Özellikle, bu iş akışını nasıl bir gen ilgi ömrü geniş menzilli diyet kısıtlama altında düzenleyen ortaya çıkarmak için tasarlanmıştır; o zaman nasıl değişeceğini ifade genin gıda düzeyiyle kurmak; ve son olarak, tarafsız bir miktar bilgi miktarını sağlamak için gen ekspresyonu ortamda gıda zenginliği hakkında tarafından aktarılmaktadır. Çeşitli genler, sinirsel bir devre bağlamında aynı anda incelendiğinde bu iş akışını devre tarafından istihdam kodlama stratejisi ortaya çıkarmak.

Introduction

Tüm organizmalar hissediyorum ve onların hayatta kalmasını sağlamak için ortamındaki değişiklikleri yanıt mümkün olması gerekir. Hayvanlarda, sinir sisteminin birincil dedektörü ve dönüştürücü ortamı hakkında bilgi ve fizyolojik yanıt olarak organizmanın hayatta kalma1etkileyebilecek herhangi bir değişiklik koordine eder. Gıda bereket bu sadece örneğin2yiyecek, gıda ile ilgili davranışları düzenleyen ama aynı zamanda bir hayvan uzun ömürlü etkiler de birden fazla bağlamda okudu bir çevre ipucudur. Ömrü gıda bolca değişikliklerden modülasyon diyet kısıtlaması (DR) bilinen bir olgudur ve geniş evrimsel koruma3vardır.

Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans temel biyolojik soru adresleme için güçlü modeli bir sistemdir. Bir bolluk teknikleri geliştirilmiştir gibi düzenleme teknikleri RNAi ve in vivo gen solucan genom manipülasyon için izin. Solucan ve optik onun şeffaflık küçük fiziksel boyutunu da kendilerini ödünç vivo içinde görüntüleme hem transkripsiyon ve çevirim floresan gazetecilere ve havacilik4gibi yüksek üretilen iş teknolojileri yardımcı programı. Birlikte, bu araçları nasıl sinir devreleri doğrudan hayvan davranışı incelemek için harnessed olabilir.

C. elegans bir bacterivore olduğunu ve çeşitli yöntemler bakteri konsantrasyonu5,6,7,8 manipüle ederek gıda bereket hassas kontrol için izin Yayınlandı . C. elegans araştırma topluluğu içinde DR iki farklı bağlamlarda eğitim gördü. Yanıt-e doğru diğer organizmaların gıda seviyelerinde azalan görülen değişiklikler aynalar gibi ilk 'klasik DR' olarak adlandırdığı. Daha fazla gıda6,7azalma ile bu noktaya uzun ömür azalır sonra en uygun ulaştı kadar bu bağlamda gıda bereket ad libitum seviyeleri azalan artan bir ömrü içinde sonuç, 9. Altında DR C. elegans içinde çalışılmıştır ikinci bağlamdır diyet yoksunluğu uzun ömürlü solucanların herhangi bir bakteriyel gıda kaynağı10,11tümüyle kaldırılmasını tarafından artırılır. Entchev ve ark. (2015)12, biz gösterdi bu iki farklı paradigmaların kaynaklanan DR karmaşıklığı incelenebilir aynı anda bir bağlamı altında 'geniş menzilli DR' dönem. Aşağıda verilen iletişim kuralını kullanarak, biz yeni bir sınıf gen tespit DR o uzmanlığından ömrü yanıt gıda bereket için modüle ve gıda12 (şekil 1) anlamda sinir devrelerinde katılmaktadırlar.

Bir hayvan yanıt ortamındaki değişikliklere duyu sistemi fizyolojisi için çevresel bilgi taşıma karmaşık yasal etkileşimleri bağlantı biyolojik süreçlerin bir dizi entegre. Böyle "bilgi akışı" mekanik ayrıntılarını kez bilinmeyen olmakla birlikte, genetik araçları bu karmaşık hesaplama farklı biyolojik bileşenler arasında nasıl düzenlenir içine bir fikir elde etmek için kullanılabilir. Son çalışmalarda, biz ve daf-7 tph-1 ömrü C. elegans12 gelen gıda algılamalı sinir devresi aracılığıyla gıda zenginliği hakkında çevresel bilgi iletimi katılmaktadırlar gösterdi , 13. bilgi kuramı14matematiksel çerçevesinde uygulayarak, daf-7 ve Gen ifade değişikliklerden temsil çevresel bilgi bit, açısından miktarını ölçmek başardık tph-1 farklı gıda düzeyleri arasında belirli nöronlar içinde. Bundan sonra bu sinir devre ve nasıl genetik olarak kontrol edilir tarafından istihdam kodlama strateji (Şekil 2) ortaya çıkarmak başardık.

Aşağıdaki iletişim kuralında, genler belirli nöronlarda ifade ilgi etkileri nelerdir ve nasıl onlar ömrü ortamına gıda bilgi akışı için katılın anlamak için gereken adımları özetlemektedir. Genel olarak, bizim framework iki deneysel protokol ve hesaplama iş akışı ayrılmıştır. Deneysel yönleri mutantlar var önemlidir geniş menzilli altında incelenebilir ilgi genlerin Dr Faithful transkripsiyon gazetecilere de genlerin farklı gıda düzeyde ifade düzeyini ölçmek gereklidir. Bizim yönteminde tartışılan sayısal analiz gerçekleştirmek veri kümesini ifade dağılımları anlamlı tahminleri sağlamak için yeterli boyutta olması gerekir. Biz analizleri için şablonu kaynak kodlarını sağlamasına karşın, kullanıcı dil bizim Hesaplamalı çerçeve yoğun kullanılan bilgi teorisi hakkında bilgi sahibi olmanız gerekir. Kaynak kodlarını R ve C++ yazılır. Bu nedenle, belirli bir düzeyde yeterlilik programlama da anlamlı bir şekilde uygulamak için gereklidir.

Protocol

1. bakteri kültürleri hazırlık ve kaplamalar için genel Worm kültür

  1. lysogeny suyu (LB) medya 250 mL cam şişe 100 mL hazırlamak ve ısıyla tarafından sterilize.
  2. Bir koloni ile şişe Escherichia coli zorlanma OP50 aşılamak ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya ve kültür gerekinceye kadar 4 ° C'de depolayın.
  3. Steril nematodunun büyüme 5 L orta (NGM) agar 15 ve aliquot 12 mL birimleri steril 6 cm plastik Petri yemekler hazırlamak.
  4. Gecede ve ihtiyaç kadar 4 ° C de saklama agar izin.
  5. Tohum NGM buzdolabında OP50 kültür 225 μL ile kullanmak için en az 3 gün önce tabaklar. Plakayı gerekinceye kadar 20 ° C'de depolayın.

2. Hazırlık bakteri kültürleri ve deneyler için Dilutions

  1. 500 mL 2 L Erlenmeyer flask LB medya iki sürü hazırlamak ve ısıyla tarafından sterilize.
  2. Her şişe bir koloni OP50 ile aşılamak ve 37 ° c civarında 14 h. için 200 devirde sallayarak büyümek
  3. 50 μg/mL nihai bir konsantrasyon için antibiyotik streptomisin kültürlerle ek. Sallayarak 37 ° C'de 30 dk sonra yer için şişe buz 15 dakika süreyle devam
  4. Transfer 450 mL her kültür ayrı steril santrifüj şişe (kültürler bölme önlemek için ideal bir konuma sahip 500 mL kapasite şişe) içine. Bakteri konsantrasyonu belirlemek için kullanılacak buz üzerinde kalan kültür saklamanız.
  5. Spin aşağı 4500 x g 25 dakika süreyle 4 ° C'de soğutmalı santrifüj kümesindeki şişe atma süpernatant ve şişe buz üzerinde depolamak
  6. Steril LB. kullanım 1 ml steril lb Spektrofotometre sıfır olarak 900 μL her şişeye üzerinden artık yemek kültürünün 100 μL sulandırmak ve her kültür 10 kat seyreltme OD 600 belirleyin. Örneğin, 10 kat seyreltme gecede kültür OD 600 0,28 Eğer o zaman kültür 2.8 gerçek bir OD 600 vardı.
  7. Kullanım çalışan hisse senedi çözüm bakteri 1.12 x 10 10 OP50 hücreler/bir OD 600 56 için eşittir mL. Bu nedenle, 2.8 yukarıdaki örnek OD 600 kullanarak, pelet 450 mL kültüründen bir 20 inci bu durumda 22.50 mL'dir orijinal hacminin içinde resuspend. Streptomisin 50 μg/ml (SB + strep) ile takıma steril S Bazal çözüm ile bakteri resuspend.
  8. Pelet steril SB + strep uygun hacmindeki resuspend.
  9. Seri dilutions SB çalışma stokunun deneylerden kullanılan tüm sonraki konsantrasyonları olun + strep seyreltme faktörler kullanarak, tablo 1'de listelenen.

3. Ayarı kadar ömrü deneyleri

Not: ömrü deneyleri 6 cm tedavi doku kültürü 12 mL streptomisin ve carbenicillin (NSC), hem de 50 μg/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma NGM agar dolu üzerinde gerçekleştirilir. Solucanlar önemli ölçüde daha az plaka duvarına yapışmasını ve kurutulan yatkındır gibi bakteriyel konsantrasyonları, ömrü deneyleri hiçbir ya da çok düşük için doku kültürü tabakları de uygundur. İki farklı antibiyotik kullanımı OP50 zorlanma bakteriyel konsantrasyon plaka üzerinde kontrolünde kritik olduğu ilaç direnci, geliştirme engeller. Ayrıca, antibiyotik bakteri ihracı tarafından biz solucan ömrü nedeniyle patojenik enfeksiyon 16 üzerindeki etkilerini en aza indirmek. Bu bizi sadece gıda ile ilgili bileşenleri bu deneylerde bakteriyel konsantrasyon düşünün sağlar. Birçok C. elegans yaşlanma çalışma NGM pilakalar ve kimyasal fluoro-2 ek ′-deoxyuridine (FUdR) Yetişkin steril işlemek için. Kullanımı birkaç karıştırıcı sorunu uzun ömürlü deneyleri 17 , 18 , 19 ile , neden olabilir ancak, FUdR kullanımı sorunlu olabilir 20 , 21. Entchev et al. (2015) 12-den kaçmak bu sorun hangi engeller yumurta-5 22 , 23, RNAi L4 larva maruz yumurta kabuğu oluşumunu engelleyerek oosit embriyo geçiş onların ölümle sonuçlanan C. elegans yumurta döllenmiş.

Üzerinde denenecektir
  1. kültür C. elegans suşları numaralı seribaşı NGM tabak 20 ° C. izin tüm hayvanlar Tekdüzen bir moda ve potansiyel olarak hesabına herhangi bir transgenerational etkileri için yetişkin olması için dışarı açlıktan plakaları gelişimsel koşullar.
  2. Transfer açlıktan L1 larva yeni numaralı seribaşı NGM tabakaları bana agar (5 x 5 mm) küçük bir parça keserek steril neşter kullanarak ve bir işlem adı verilen yeni bir tabakta aşağı yerleştirerek aç plaka ' parçalama ' C. elegans araştırma comm tarafından Birlik 15. L4 sahne ulaşana kadar solucanlar büyümek. Zorlanma başına beş L4 larva sonra bireysel numaralı seribaşı NGM plakaları için transfer ve 20 ° C'de muhafaza Bu hayvanlar P0 nesil temsil.
  3. Kullanım L4 döl F1 üretimi ayarlamak için P0 nesil. Tek tek F1 L4 larva vahşi türü N2 baskı üstünde-e doğru 30 numaralı seribaşı NGM tabak yerleştirin.
    Not: mutant suşları için gerekli tabak sayısı onların büyüme oranına bağlıdır. Örneğin, bir geçici dauer tutuklama 20 ° C'de daf-7(ok3125) hayvanlar geçmesi Böylece, bu zorlanma N2 vahşi türü bir tabak solucanlar daha az L4 larva üretir.
  4. Bu fark için telafi etmek için bir gün önce kadar daf-7(ok3125) plakaları kurmak N2 tabaklar ve daha büyük bir sayı iyi bir çalışma oranı 3: 1'dir.
  5. Transfer L4-sahne döl F1 ebeveynlerin 1 mM IPTG ve 50 µg/mL carbenicillin (RNAi plakaları) yumurta-5 gen hedefleme dsRNA ifade HT115 bakteri 225 µL ile seribaşı ve yönü muhafaza ile takıma NGM plakaları için senkronize 20 ° C 24 h için. Zorlanma, plaka, başına 15 hayvan yoğunluğu, muhafaza başına en az 360 solucanlar deney gereklidir.
  6. Yumurta-5 sonra RNAi tedavi, solucanlar 2 x 10 9 hücre/mL (Tablo 1) bir konsantrasyon ek bir 24 saat 20 ° C'de, streptomisin tedavi OP50 225 µL ile seribaşı NSC tabak transfer Bu ve tüm izleyen aktarımlar sırasında fiziksel zarar kurtçuklar görmesini önlemek için yavaşça hayvanlar üzerinden solucan çok ince hafifçe eğimli solucan al kullanarak altında Kepçe. Float solucan kapalı hayvanlar pick SB + strep 10 µL damlacık çeker tarafından yerleştirilen yeni plaka yüzeyinde.
  7. Ertesi gün yeniden dağıtma her gıda düzeyleri m temsil eden NSC plakaları için solucanlaristed hiçbir bakteri içeren NSC plakaları bir dizi yanı sıra tablo 1. Tüm NSC plakaları 225 µL bakterilerin ilgili konsantrasyon ile tohum ve tohum ile 225 µL SB + strep bakteri-özgür NSC plakalar. Plaka, gıda koşul zorlanma başına başına en az dört tabak sonuçlanan başına 15 hayvanların bir yoğunluk, solucan korumak. Tabakları istenen deneysel sýcaklýðýna vardiya.
  8. Transfer solucanlar taze NSC plakaları için numaralı seribaşı Tablo 2 ' de belirtilen zamanlamaya göre uygun gıda konsantrasyon ile.
  9. Puanı hayvanlar için bir tel ile hafifçe dürtmeye tarafından hareket seç. Yanıt vermek için başarısızlık olarak ölüm attı. Hayvanlar için ölüm her aktarma noktası ve sonra günlük son transfer sonra puan.

4. Ayarı kadar Imaging deneyler

Not: Bu bölümde anlatılan adımları yeterli solucanlar bir deneysel yiyecek durum belli bir sıcaklık olarak görüntüleme için zorlanma başına oluşturmak yeterlidir. Bu protokol üzerinde herhangi bir gün yansıma koşulları sığdırmak üzere ölçeklenebilir. Ancak, süre makul ve hayvanlar farklı suşları arasında görüntüleme günde 12 saat daha büyük bir yaş farkı var mı emin olmak için deneysel tasarım özen gösterilmelidir. Bu gen yerli düzenlenmesi daha yakından benzer gibi yansıma transkripsiyon gazetecilere tek kopya transgenics vardır önerilir. Aşağıda özetlenen ve Tablo 3 ' te özetlenmiştir protokolü de eşleşen büyük zaman uyumlu yaş nüfus deneysel diğer iş akışları için kullanılabilir suşlarının elde etmek için kullanışlı bir yöntem sağlar.

  1. Kültür solucanlar büyük bir yoğunluk için izin vermek için 10 cm tedavi doku kültürü plakaları üzerinde deneyler Imaging'de hayvanlar (∼ plaka başına 100 hayvanlar) ömrü deneyleri daha.
  2. Beş 225 µL aliquots buzdolabında OP50 kültür bir haç benzeri oluşumu ile 30 mL NGM Ağar Kaplamalar ve tohum ile 10 cm tabak doldurun.

5. İlk muhabir kültür suşları

üzerinde denenecektir
  1. kültür C. elegans suşları numaralı seribaşı NGM tabak 20 ° C. izin tüm hayvanlar Tekdüzen bir moda ve potansiyel olarak hesabına herhangi bir yetişkin olması için dışarı açlıktan plakaları gelişimsel koşulları etkileri transgenerational.
  2. Larvalar için NGM plakaları tohumlari ve L4 sahne ulaşana kadar büyümek aç L1 Dobiş. İki numaralı seribaşı NGM tabak 20 ° C'de zorlanma başına üç L4 larva transfer Bu hayvanlar P0 nesil temsil.
  3. P0 nesil L4 döl F1 üretimi ayarlamak için kullanın. F1 L4 larva vahşi türü muhabir baskı 4 numaralı seribaşı NGM plakaları üzerine yerleştirin. Mutant suşları için gerekli plakaların kendi büyüme oranına bağlıdır. Daf-7(ok3125) önceki örneği kullanarak, muhabir suşları bu arka planda üç kez sayı plakaları gerektirir ve iki gün önce büyüme oranı farklılıkları hesaba vahşi türü muhabir suşları, kurmak.

6. Yumurta toplama ve eşitleme muhabir suşları

Not: C. elegans yaşlanma araştırma topluluk ilgi bazı genler neden büyüme ve mutasyona uğramış zaman yumurta atarken kusurları için daha zor hale getirir farklı genotip hayvanların büyük zaman uyumlu nüfus oluşturur. Örneğin, daf-7(ok3125) mutasyon ağır yumurta atarken kusuru ile karşılaştırıldığında vahşi türü N2 zorlanma neden olur. Bu nedenle, yeterli almak için farklı suşları nicel görüntüleme deneyler için zaman uyumlu L4 larva numaralarını el ile toplama solucanlar daha daha sağlam bir metodoloji gerektirir. Bu nedenle, transkripsiyon muhabir suşları sodyum hipoklorit (NaClO) tabi tutuldu / sodyum hidroksit (NaOH) çözüm tedavi kırmaya gravid yetişkinlerin hayvanlar açın ve yumurtalarını yaygın olarak adlandırılan bir süreç kurtarmak ' beyazlatma ' C. elegans tarafından topluluk 15 araştırma.

  1. Hesap için büyüme farklılıkları suşları arasında oranları ve her baskı plakaları ne zaman hasat ve ağartılmış hesaplamak. Ne zaman vahşi türü ve daf-7(ok3125) muhabir suşları ağartılmış örnek için bkz: Tablo 3.
  2. Seri olarak SB 15 mL kullanarak uygun gününde belirli bir yük kapalı plakaları, kurtlardan yıkama ve steril 15 mL tüp içinde toplamak. Doğal olarak tortu hayvanlara izin ve 7 ml sıvı seviyesini ayarlamak.
  3. %5 NaClO Ekle 2 mL ve 1 mL tüp gravid yetişkin içeren 5 M NaOH. En fazla 3 dakika oda sıcaklığında karışımı yavaşça rock. NaOH sıvı içine içerdikleri herhangi bir döllenmiş yumurta bırakmadan parçalayın solucanlar neden olur iken NaClO bakteri ve solucanlar, öldürür. Pozlama süresi oldukça kısa olduğu sürece embriyo yumurta kabuğu kitin onları tedavi etkilerinden korur. 3-dak kuluçka, girdap ~ 30 için tüp sonra ayrılık solucan iskelet daha da kolaylaştırmak için s.
  4. Sonra 3-dak kuluçka spin 1000 x g yumurta cips için 1 dakika için karisimin aşağı. Dış görev çoğu yumurta rahatsız etmek ~0.5 mL her tüpün içinde bırakarak bir vakum şişesi bağlı bir steril cam pipet kullanarak süpernatant Aspire edin.
  5. Pelet SB 9.5 mL ile resuspend ve Santrifüjü adım ve resuspension adımları ek bir iki kez böylece toplam üç kez yumurta SB ile yıkanmış yineleyin.
  6. Son yıkadıktan sonra yumurta Santrifüjü cips ve tüm 0.5 mL süpernatant atın. SB ve sonra aliquot 100 µL üstünde-e doğru üç numaralı seribaşı 10 cm NGM plakaları kalan 0.5 ml yumurta resuspend. 100 µL her plaka üzerinde tüm beş bakteriyel çimenler üzerinde eşit olarak dağıtın. Vahşi türü suşları için yumurta yoğunlukları plaka başına 200 den büyük, yatırılması değil.
    1. 20 ° C'de 48 h ve L4 larva son derece homojen bir nüfusa edinmek için tutmak tabaklar. Gecikmeli büyüme fenotipleri ile suşları için mevcut çok sayıda yumurta Kasası ve kuluçka süresini artırmak için önerilir. Örneğin, daf-7(ok3125) tutmak-20 ° c ~ 64 yumurta yumurtadan ve L4 sahne ulaşmak izin vermek h için muhabir suşları içeren.

7. Yumurta-5 RNAi ile muhabir suşlarının tedavi

  1. seri olarak solucanlar kapalı SB 15 mL kullanarak üç tabak yıkama ve sıvı bir steril 15 ml tüp içinde toplamak. L4 larva doğal olarak tortu için izin ve tüm ~0.5 mL sıvı Aspire edin. Vahşi type muhabir suşları, bu adım herhangi bir larva L4 genç kaldırır. Mutant kökenden, bu adımı dauers daf-7(ok3125) durumunda gibi tutuklandı herhangi bir larva kaldırılması AIDS.
  2. SB 9 mL Kurtlarla resuspend. Yine, L4 larva sedimantasyon hızı izlemek ve L4 larva çoğunu pelleted bir kez tüm ~0.5 mL süpernatant Aspire edin. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. L4 larva çoğunluğu yerleşmiş bir kez her mL ~0.5 sıvı Aspire edin.
    3. Steril s Bazal
  3. ekleyin 10 µL % 0.1 ile desteklenmiş L4 larva içeren sıvı için Pluronic F-127 (SB + Plu). Bu yüzey aktif davranır ve larvalar plastik pipet ipuçları iç yüzeye yapışmasını önler.
    1. Yavaşça P200 düşük tutma pipet ucu ve sonra aliquot 150 µL numaralı seribaşı üç 10 cm RNAi plakalar üzerine yumurta-5 RNAi bakteri 5 x 225 µL ile kullanarak larva resuspend. Solucanlar tüm beş bakteriyel çimenler arasında eşit olarak dağıtılır sağlamak.
  4. Sıvı agar emilir sonra herhangi bir L4 larva çamaşır yordam tarafından seçerek el ile onları elendi değil tabak kaldırın. Plakayı 24 h için 20 ° C'de depolayın

8. Geniş menzilli DR inisiyasyon

Not: 24 h yumurta-5 sonra RNAi tedavi, başlangıçta Tabaklarda tevdi L4 larvalar 1 - gün eski yetişkin haline gelmiştir.

  1. Önceki el kaldırma adım kapalı bu aşamada, yalnızca 1 - gün eski yetişkin Tabaklarda bırakarak kaçan herhangi bir genç larvalar kapalı seçin.
  2. İçin her zor, 15 mL steril SB + strep ile üç tabak 1 gün eski yetişkinlerden 15 mL tüp içine yıkayın. Solucanlar için doğal olarak tortu izin ve tüm 0.5 mL süpernatant Aspire edin. SB + strep 9.5 mL Kurtlarla resuspend ve sedimantasyon ve yıkama adımları yineleyin.
  3. Son yıkadıktan sonra solucan tortu için izin ve tüm 0.5 mL süpernatant Aspire edin. 10 µL SB + Plu ekleyin ve hafifçe P200 pipet ucu ve sonra aliquot 100 µL bir konsantrasyon 2 x 10 9 hücre/mL, 5 x 225 µL bakteri ile seribaşı bir NSC plaka üzerine kullanarak larva resuspend. Tüm beş bakteriyel çimenler arasında eşit olarak
    1. Dağıt 100 µL. Mikroskop altında hayvan üzerinde plaka mevcut sayısını tahmin etmek: amaç plaka üzerinde 100-150 solucanlar arasında sahip olmaktır.
    2. Bir solucan yoğunluğu bu aralığı ve sonra aliquot üzerine iki ek tabak içinde sağlamak için gereken sıvı hacmi belirlemek. Solucanlar da bu sınırlar içine düşmek ve tabak 24 h için 20 ° C'de depolamak için ilk plaka üzerinde sayısını ayarlamak
  4. Ertesi gün 2 gün eski yetişkin toplama ve gıda (Tablo 1), istenen deneysel konsantrasyon ile seribaşı yeni NSC tabak 2 ve 3 numaralı adımlarda anlatılan yöntemleri yeniden dağıtma. Bir kere sıvı agar emilir, 24 h için istenen deneysel sıcaklık plakaları kaymak
  5. Ertesi gün 3 gün eski yetişkin toplama ve gıda, 8.3 ve 8,4 adımlarda açıklanan yöntemleri yeniden aynı deneysel konsantrasyonu ile seribaşı taze NSC plakaları için dağıtma. Bir kere sıvı agar emilir, 48 h. için deneysel sıcaklık plakaları dönmek
  6. 5 gün eski yetişkin toplama ve gıda, 8.3 ve 8,4 adımlarda açıklanan yöntemleri yeniden aynı deneysel konsantrasyonu ile seribaşı taze NSC plakaları için dağıtma. Bir kere sıvı agar emilir, 24 h için deneysel sıcaklık plakaları dönmek

9. Muhabir suşları, mikrosıvısal Imaging

  1. üzerinde gün 6 yetişkinlik, hayvanlar özel mikrosıvısal platformu 24 , 25 kullanarak görüntü. Fiziksel olarak üç tabak hayvanlardan kapalı almak ve bir 5 mL kriyojenik tüpe SB + strep 4.5 mL içeren askıya alma.
    1. Bir kez solucanlar tortu, tüm ~0.5 mL süpernatant Aspire edin ve 4 mL SB + strep hayvanlar resuspend. Bu yıkama ile görüntülemede aksi etkileşebilir aşırı bakteri kaldırır. Solucanlar içine özel mikrosıvısal aygıt yolu ile akışı 24 , 25 tahrik basınç tanıtılmaktadır. Cihaz içindeki bireysel solucanlar içine yönetmen ve özel yazılım kontrol altında üstünde-küçük parça vanalar basınç tahrik 26 tarafından geçişli bir görüntüleme kanal içinde sıkışıp.
  2. Sonra bir solucan tekniklerle görüntüleme kanalda kapana kısılmış, floresan bir z-yığını, bir 40 X Petrol objektif (1.3 NA) ve bir kamera ile standart epifluorescence mikroskop kullanarak 2 µm adımda 50 bölümleri ile toplamak. Her biri aynı anda bir emisyon splitter kullanarak ve analiz için depolanan transkripsiyon gazeteciler için kırmızı ve yeşil flüoresan görüntüleri toplamak. Özel yazılım kullanarak otomatik resim alma.
  3. Özel MATLAB komut dosyaları 27 (https://github.com/meizhan/SVMelegans kullanılabilir) kullanarak otomatik olarak görüntüyü işlemek. Z-yığınlar MATLAB yüklenir ve nöron-çiftleri ve görüntüleme düzlem içinde konumlarını belirlemek için çözümlenebilir. Maksimum projeksiyonlar sonra hesaplanır ve bir eşik algoritma bireysel floresan hücreleri bulmak için kullanılmaktadır. Hücre kimliği sonra göreli mesafeler ve solucan konumlara göre hesaplanan ' s baş.
    4. Muhabir Floresan, ölçmek için
  4. z yığından hücresel her yeri çevresinde üç boyutlu ses ayıklayın. Yoğunluğu tam olarak her durumda tüm hücre saklayan en parlak piksel, tutarlı bir dizi entegre.
    5. Gut auto-floresan her hayvanın deneysel durumu özgü ya da zorlanma özel değişiklikleri müdahalelerden ortadan kaldırmak için
  5. hesaplamak gut (ADF ve ASI) en yakın cep çiftleri için arka plan yoğunluğu modu tahmin bir birimdeki nöron çevresinde şiddeti dağıtım. Bu arka plan yoğunluk değeri üzerinden son çıktı almak için entegre Floresans çıkarma.

10. Veri derlemesi

Not: floresan yoğunluklarda bütün nöronların görüntü işleme yazılımı tarafından analiz dağıtım profilleri gen tahmin etmek için kullanılan filtre uygulanmış ifade veri dosyasına (FED) birleştirilir ifade (şablon R ve C++ komut dosyaları mevcuttur https://github.com/giovannidiana/templates).

    Tüm hücreler için doğru kimlik doğrulamak için el ile onay her işlenen görüntü
  1. . Hatalı hücre kimliği görüntülerle bir dışlama dosyasında kayıtlı gerekir. Diana ve ark. (2017) 13 dışlama dosyasından oluşur ile ikili bir tablonun ' 0 ' için düzeltmek ve ' 1 ' hatalı hücre kimliği için. Tablodaki satırların sayısı solucanlar (i.e ASI, ADF ve NSM) her hücre görüntüsü için bir sütunla yansıma sayısını eşittir.
  2. FED dosyası oluşturma:
    1. Çalıştır bash komut dosyası " gen_data + zaman " dışlama dosya kullanarak elde görüntüsü her solucanından ifade değerleri birleştiren hücre özgü dosyaları oluşturmak için filtre. Görüntü işleme yazılımı tarafından oluşturulan her klasör için bash betiği ek açıklama dosyasını okur < folderprefix > _EXP.txt deneysel koşullar ve dışlama dosya ayıklamak için < folderprefix > _X.csv sadece doğru seçmek için nöronlar tespit. İfade değerleri dosyaları okumak < folderprefix > _data_ < nöron > .csv.
    2. İçine tüm dosyaları bir arada " FED_split.dat " ve deneme toplu iş koduyla sıralamak, solucan etiketi ve hücre kimlik.
    3. Çalıştırmak " sıralama " (C++ programı, kullanımı:. / FED_split.dat FED_merged.dat sıralama) her hücre için sıfır olmayan floresan ile girişleri seçin ve onları FED_merged.dat tek satır içine birleştirmek için.

11. Tahmini kodlanmış bilginin

Not: Aşağıdaki yordam nasıl gen ifadeler kümesi tarafından kodlanmış belirli çevre koşulları hakkında bilgi ölçmek için açıklar. İçinde Diana vd. (2017) 13, gıda zenginliği ortamında hakkında kodlanan bilgiler incelendiğinde, ancak, yöntemi kendisi çevresel durumları herhangi bir ayrı sayısı için uygulanabilir. Bilgi entropies ve fazlalık gibi bilgileri teorik değişkenlerini ölçmek için vazgeçilmez olarak kabul küme çevresel uyaranlara altında sinirsel tepkilerin ortak olasılık dağılımıdır. Böyle tahmin gerçekleştirmek için yeterli bir örnekleme yanıtının solucanlar nüfus arasında var önemlidir. Gauss dağıtımları nispeten küçük örnekler tahmin edilebilir; Ancak, güvenilir yoğunluk tahmini için uygun örnek boyutu ölçmek için bir fikir ifade dağıtım beklenen şeklinin olması önemlidir. Farklı denemeler karşısında kaçınılmaz değişkenlik nedeniyle aynı deneyi farklı tekrarlar elde edilen dağıtım merkezi değerleri değil sistematik olarak kaydırılacağı denetlemek için temel ya da herhangi bir istatistiksel özellikleri olduğunu ifade dağıtım değil önemli ölçüde değişmiş denemeler arasında. Deneme deneme değişkenlik her deneme içinde değişkenlik ile uyumlu olmaması durumunda, bu deneme deneme deneme deneme etkiler bu çevre/biyolojik faktörler ortalama içinde solucanlar sayısını karşı sayısı dengelemek önemlidir değişkenlik. Bu faktörlerin undersampling bilgi teorik analiz ağır önyargı.

  1. Olarak R komut dosyası " code3D.R " üç boyutlu yoğunlukları dosyasını temel alan oluşturmak için şablon sağlar " FED_merged.dat ", belirli FED başlık biçimine göre bu şablonu üzerinde değişiklik yapma. Listenin " HeaderNames " FED dosyasındaki her alanın adını temsil eder " RONames " veriler listesidir. Komut dosyası R paketi kullanır ' ks ' GS hypercubic kılavuzla içinde birden fazla varyasyon dağılımları tahmin etmek için 28 , 29 depo minimum ve maksimum arasındaki aralığı ayırmaktan her boyut her okuma için veri değerleri. Ne zaman iç değişken " grup " yoğunluk tahmini için kullanılan tüm veri 0 olarak ayarlanır. Ne zaman " grup " etiket veri kümesi 5 ayrık kümeler halinde bölünmüş 5 1 arasında ve ifade yoğunlukları %80 beş setleri hariç kaynaklanan veri tahmin edilir. Bu özellik daha sonra belirsizlikler tahmin etmek için kullanılır.
    Not: Kullanım-in code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < gıda > < GS > < outfolder > < etiket > < Grup > < frac > GT genotip gösterir nerede, gıda çevre koşulu, outfolder önceden varolan nerede dağılımları saklanır, etiket dosya adı öneki ve frac kullanılan dataset kısmını klasör.
    2. Çevre her koşul oluşturmak için farklı bir kılavuz ile çok değişkenli dağılımları
  2. GS (örneğin 20,30,40 depo) boyutlandırır. Ne zaman ince kararları önemli ölçüde bilgi tahmini değiştirmeyin Hesaplamalı yükü azaltmak için GS küçük değerler tercih edilir. Gen ifadesinin dağıtım klasörüne yazılır < outfolder > code3D.R olarak tek sütun metin dosyaları dosya adı yapısı ile çalışırken belirtilen < etiket > _ < GT > _ < gıda > _GS < GS > _group < grubu >. dat.
    Not: önceki adımlar koşullu olasılık dağılımları tahmin sağlamak Equation 1 burada g tüm okuma vektörünü gösterir ve f çevre koşulu. Ancak, gen ekspresyonu ile çevre 30 , 31 arasında karşılıklı bilgileri hesaplamak için.
    Equation 2
    giriş dağıtım ihtiyacımız Equation 3 Ayrıca belirler (giriş-) gen ifadesinin ortalama < img alt "Denklem 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" = / >. Giriş dağıtım doğrudan kullanılabilir olmadığında, kodlama özellikleri tanımlamak için bir anlamlı tüm olası giriş dağılımları arasında karşılıklı bilgi maksimize ederek elde edilebilir kanal kapasitesi miktardır.
  3. Gen ekspresyonu dağıtım kullanmak sistem kanal kapasitesi ve dağıtım bilgileri en üst düzeye çıkarır çevre giriş tahmin etmek için Arimoto-Blahut 32 algoritması uygulanır. Algoritma uygulaması örneği C++ programında bulunabilir " Ccap3D.cpp " üç boyutlu gen ekspresyonu için kod Diana vd (2017) 13 analiz. Örnek: dağılımları genotip GT123 üzerinden elde edilir kılavuz boyutu ile verilerin (grup 3) %80 30 eşit ve klasöründe depolanır ". /pdf/ " bir önek etiket kullanarak = " PDF ". GT123 arka planda kodlanmış bilgileri hesaplamak için komut. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Not: sistem tarafından kodlanan bilgiler tahmini belirsizlik, yoğunluk tahmini seçimi de dahil olmak üzere birden çok kaynak tarafından etkilenir algoritma ve örnek boyutu önyargı. Adımları 11.1-11,2 sistematik önyargı her algoritması tarafından tanıtılan boyutunu değerlendirmek için farklı yoğunluk tahmini yöntemleri kullanarak tekrar.
    4. Belirsizlik nedeniyle örnek boyutu, tahmin etmek için
  4. adımları 11.1-11,2 bilgi 1-5 arasında gruplarla yeniden hesaplayın. Bu beş bağımsız örnekleme veri % 80 arasında değişkenlik bilgi tahmini üzerinde örnek boyutu etkisini yansıtacaktır.
  5. Adımları kullanarak bilgileri hesaplamak 11.1-11,2 (5. adım) olduğu gibi verilerin kesir için örnek boyutu önyargı düzeltmek için artan üzerinde (Jack-knife) yöntemi 33.

12. Artıklık, gürültü ve sinyal korelasyon hesaplama

  1. kullanımı en uygun giriş dağıtımları tahmininden karşılıklı bilgileri hesaplamak için maksimum bir bilgi elde Equation 5 giriş ve gen ifade yanıt her neuron N arasında. C++ kaynak dosya " GetMI1D.c " ortak olasılık dağılımları marjinal karşılıklı bilgi edinmek için bir örnek program.
  2. Yukarıda elde her neuron için karşılıklı bilgi toplamını alarak artıklık hesaplamak ve sonra kanal kapasitesi çıkarma.
  3. Hesaplama " shuffle " bilgi terim Equation 6 13 , 34. Bir şablon C++ kaynak dosyası bulunabilir " GetShuffle.c ".
  4. Kullanım " shuffle " sinyal ve gürültü korelasyon hesaplamak için dönem. Signa içinBiz l korelasyon Equation 7 ve biz gürültü korelasyon Equation 8.
  5. Belirsizlikler artıklık üzerinde gürültü elde etmek ve sinyal toplam bilgilerden (önceki bölümde adım 11,3) birden fazla örnekleme % 80 gelince korelasyon verileri ve standart sapmayı alma.

Representative Results

Ömrü vahşi türü N2 zorlanma yanında ilgi genlerin mutantlar üzerinde deneyler yaparak, bir bu genlerin geniş menzilli DR gıda cevaben bir role sahip olup olmadığını kurabilirsiniz. Vahşi türü yanıt şekil 1içindeAtasvir bir yakın olabilir. Bu genlerin solucan doğru hangi noktası daha fazla araştırma, gıda bolca değişikliklere tepki yeteneğini etkileyen herhangi bir modülasyon tarafından gıda koşullar, üniform olmayan etkisiyle yansıyan mutantlar, bu tepki gösteren Bu genlerin ifade yanıtlarını geniş menzilli DR garanti. Ancak, uzun ömürlü yanıt mutantların vahşi türünden önemli ölçüde farklı ise, genlerin geniş menzilli DR, etkilerini en az ortalama ömrü düzeyinde transducing herhangi bir rolü var. Eğer bütün ömrü yanıtının Tekdüzen bir kayma mutasyonlar neden genlerin uzun ömür gıda bağımsız etkisi vardır. Bu genler ilgi gıda bilgileri Bu genler tarafından taşınan bu durumda ömrü için yayın yapıyor duyarlı, ifadedir olasılığını ekarte değil.

Protokol sonraki aşaması nasıl faiz genler için geniş menzilli DR altında ifade düzeylerini değiştirmek belirlemektir. Şekil 1' deB, biz bu ifade seviyeleri gıda düzeyde ASI duyusal sinir hücreleri bulunan değişiklikleri bir tepki gösteren daf-7, transkripsiyon bir gazeteci ile göstermek. Bir daf-7(-) mutant bir transkripsiyon muhabir ifade yanıt değiştirilmez. Faiz genler ömrü düzeyinde gerçekten gıda duyarlı iseniz bir onların ifade da yemekle değişecektir bekleyebilirsiniz. Buna bağlı olarak, transkripsiyon muhabir mutant arka planda geniş menzilli DR yanıt olarak bir değişmiş ifade profili olmalıdır. Ancak, transkripsiyon muhabir vahşi türü arka plan ilgi gen ifadesinde gıda duyarlı değişiklikleri göstermek değil mümkündür. Bu durumda, bu bu iletişim kuralının kapsamı dışında kalan bir çoğu düzenleyici etki gösterebilir.

Diana ve ark. (2017)13, ifade ASI daf-7 tph-1 ADF ve NSM yeni_sunucu_adı aldığımız. Şekil 2içindeA, ASI ve ADF ifade dağıtım verilen gıda düzeyi için tahmini göstermektedir. Tek solucan görüntülerden birden çok güzel olması sadece bağımsız olarak her neuron aynı zamanda bütün sinirsel devre (Şekil 2B-2 C) Kombinatorik bilgi kodlanmış bilgi miktarını analiz etmemizi sağlar. Bu iki bilgi teorik önlemleri birleştirerek gıda hakkında bilgi iletmek için nöronlar tarafından istihdam kodlama strateji açısından sistem karakterize için bize izin verir. Artıklık devre miktarı her neuron için karşılıklı bilgi toplamını alarak ve devre Kombinatorik çıktıları dikkate alarak elde edilen ortak karşılıklı bilgi (kanal kapasitesi) çıkarılarak elde edilebilir. Parçalar arasında toplu bilgileri tüm devre tarafından kodlanmış gerçek bilgi daha büyük olduğu için gereksiz bir karakter kodlama strateji böyle fark pozitif bir değer gösterir. Bunun tersi olarak kodlanmış gerçek bilgi bileşenlerini (Şekil 2B) toplamından daha büyük olduğu için negatif bir değer sinerjik bir strateji yansıtır. Bilgi ve artıklık gen düzenlemesi, Diana vd. , örneğin mümkün yüksek sipariş rolleri keşfetmek için farklı genotip arasında karşılaştırılabilir (2017) 13 daf-7 mutasyon etkisini gereksiz kodlama stratejiden sinerjik (Şekil 2C-2D) için geçiş yapar.

Figure 1
Resim 1 : Geniş menzilli Dr altında ömrü ve gen ifadesinin yanıt Vahşi türü N2 zorlanma (siyah çizgi) (A) ortalama ömrü görüntüler geniş menzilli DR karmaşık bir yanıt. Bu yanıtı büyüklüğü daf-7 gen (kırmızı çizgi) boş bir mutant içinde zayıflatılmış. Hata çubukları standart hata ortalamaya, Entchev ve ark. havuza alınan verileri temsil eder. (2015) 12. (B) ortalama ifade düzeyleri vahşi türü arka planda (siyah çizgi) daf-7 gen transkripsiyon bir gazeteci de geniş menzilli DR karmaşık monoton olmayan yanıt görüntüler. Daf-7(-) genetik arka planda Bu transkripsiyon muhabir ifade son derece zayıflatılmış ve küçük değişiklikler karşısında gıda kademede gösterir. Hata çubukları standart hata ortalamaya, Entchev vd. , tek bir deneme verileri temsil eder. (2015) 12. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Hesaplama yöntemi. (A)iki boyutlu yoğunluk tahmini tph-1 ifade kullanarak bir kılavuz Boyut 30 x 30 'ks' R paketinden elde gibi ASI ADF ve daf-7 ifadede Illustration. (B) görselleştirme tph-1 ve daf-7 (bütün) ortak ifade tarafından kodlanan bilgiler ve ayrı ayrı (parçaların toplamından) ADF, ASI ve NSM nöronlar için. Gereksiz ve sinerjik karakter kodlama sağdaki yığılmış çubuklarının yüksekliğini ve tam devre tarafından kodlanan bilgiler arasındaki fark gösterilir. (C) karşılaştırma vahşi türü hayvanlar ve daf-7(-) mutantlar tarafından kodlanan gıda bilgiler arasında. (D) karşılıklı bilgi mutantlar gözlenen azalma sinerjik kodlama doğru bir geçiş eşlik ediyor. Panelleri B-D Diana ve ark. adapte (2017) 13. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bakteri konsantrasyonu (hücre/ml) Optik yoğunluk (600nm) Seyreltme faktörü ('dan önceki)
1.12E + 10 56.000 0,00
2.00E + 09 10.000 5,60
6.32E + 08 3.160 3,16
6.32E + 07 0.316 10,00
2.00E + 07 0,100 3,16
0 (S Bazal) 0.000 NA

Tablo 1: gıda düzeyleri ve geniş menzilli Dr içinde kullanılan seyreltme faktörleri Bakteril konsantrasyonları (hücre/mL) geniş menzilli DR protokolü, onların anılan sıraya göre OD600 ölçümleri ve her konsantrasyon önceki bir elde etmek için gerekli seyreltme faktörü ile birlikte kullanılır.

Deneysel ömrü sıcaklığını
Gün 12.5° C 15° C 17,5 ° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27.5° C
-12 Tüm suşların taze NGM plakaları için yığın ve 20 ° C'de korumak
-11
-10 Daf-7(-) suşları P0 nesil kadar atayıp saklamanız 20 ° C'de (plaka başına 1 L4, 5 levha)
-9 Vahşi türü suşları P0 nesil kadar atayıp saklamanız 20 ° C'de (plaka başına 1 L4, 5 levha)
-8
-7
-6
-5 Daf-7(-) suşları F1 nesil kadar atayıp saklamanız 20 ° C'de (plaka başına 1 L4, 90 levha)
-4 Vahşi türü suşları F1 nesil kadar atayıp saklamanız 20 ° C'de (plaka başına 1 L4, 30 levha)
-3
-2
-1
0 F2 L4 larva için almak > yumurta-5 RNAi tabaklar ve 20 ° c (15 L4 plaka, 24 plaka başına) korumak
1 1 - gün eski yetişkin NSC plakaları tohumlari 2.0E + 9 hücre/ml gıda düzeyi ile taşımak ve 20 ° C'de korumak
2 Deneysel yiyecek koşulları ile seribaşı NSC plakaları ve deneysel sıcaklık 2 - gün eski yetişkin taşımak
3 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
4
5 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
6
7 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
8
9 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
10
11 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
12
13
14 Transfer Transfer Transfer Transfer
15
16
17
18 Transfer Transfer
19
20
21
22 Transfer

Tablo 2: katlanacak zamanlamasını yürütülen farklı sıcaklıklarda. Daf-7(-) ve vahşi türü suşları örnek olarak kullanarak farklı sıcaklıklarda deneyler kadar geniş aralıklı DR ömrü için gereken adımları şematik taslağı. Her deneysel yiyecek düzey taze plakaları için transferlerinin sayısı giderek artan bir sıcaklık azalır. Hayvanlar daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı yaşlanma aslında ve çok daha fazlası için hesap bu transfer başına fiziksel zarar eğilimli.

Gün Ima
Ging boru hattı -14 Yığın gazeteci suşları daf(-) arka planda. 20 ° C'de korumak -13 Yığın gazeteci suşları vahşi türü arka planda. 20 ° C'de korumak -12 Daf-7(-) muhabir suşları P0 nesil kadar ayarla. 3 L4 larva 10 cm NGM plaka başına kullanın. 2 tabak kullanın ve 20 ° C'de korumak -11 -10 Vahşi türü muhabir suşları P0 nesil kadar ayarla. 3 L4 larva 10 cm NGM plaka başına kullanın. 2 tabak kullanın ve 20 ° C'de korumak -9 -8 Daf-7(-) muhabir suşları F1 nesil kadar ayarla. 3 L4 larva 10 cm NGM plaka başına kullanın. 12 plakaları kullanır ve 20 ° C'de sahip -7 -6 Vahşi türü muhabir suşları F1 nesil kadar ayarla. 3 L4 larva 10 cm NGM plaka başına kullanın. 4 plakaları kullanır ve 20 ° C'de sahip -5 -4 -3 Öğleden sonra DAF-7(-) muhabir suşları bleach (~ 5 pm) ve yumurta 3 10 cm NGM Tabaklarda mevduat ve 20 ° C'de korumak -2 Çamaşır suyu vahşi türü muhabir suşları sabah (~ 10 değilim) ve mevduat NGM plakaları 3 10 cm üzerinde yumurta ve 20 ° C'de korumak -1 0 L4 10 cm yumurta-5 RNAi tabakaları bana yıkayın. 20 ° C'de korumak ve zorlanma başına 3 tabak kullanın 1 Tohumlari 2.0E + 9 hücreleri ile NSC plakaları için 1 günlük yetişkin yıkama / ml. zorlanma başına 3 tabak kullanın ve 20 ° C'de korumak 2 Yıkama 2 gün yetişkin NSC plakaları için deneysel gıda düzeyleri ile seçilir. Zorlanma ve ÜST KRKT başına 3 tabak deneysel sıcaklık için kullanın. 3 Taze NSC tabakaları bana aktarın. Deneysel sıcaklığında korumak ve zorlanma başına 3 tabak kullanın. 4 5 Taze NSC tabakaları bana aktarın. Deneysel sıcaklığında korumak ve zorlanma başına 3 tabak kullanın. 6 Hayvanlar plakaları kapalı almak ve görüntüleme için hazır olun.

Tablo 3: zamanlama için boru hattı düşsel. Şematik anahat floresan transkripsiyon muhabir suşları daf-7(-) ve vahşi türü arka planlar farklı sıcaklıklarda örnek olarak kullanarak deneyler görüntüleme geniş menzilli DR kurmak için gerekli adımlar.

Discussion

Burada, gıda konsantrasyonları çok daha geniş bir dizi daha önceden yayınlanmış protokollerini kapsüller diyet kısıtlaması için yeni bir yöntem mevcut. Bu yöntem iki önceden ayrı fenomen C. elegans DR literatürde görülen bağlantılar, bakteriyel yoksunluğu ve klasik diyet kısıtlaması, olmak her iki diyet etkileri sağlayan bir iletişim kuralı okudu. Yeni geniş menzilli DR paradigması kullanarak, biz tek hücre gen ekspresyonu yanıt belirli bir çevre işaret olarak incelenmesi ve nasıl bu hücre bilgi kodlar belirlenmesi için genel bir çerçeve mevcut. Bizim framework katlanacak ve nicel görüntüleme, sırasıyla gerçekleştirmek nasıl çalışılacağını deneysel iki protokol oluşur, geniş menzilli altında bu deneysel protokoller Dr verilerden sonra sağlanan hesaplama analizleri ile incelenebilir Bu çerçevede farklı gıda koşullar arasında gen ifade düzeyleri veya katlanacak değişiklikleri tarafından kodlanan bilgiler ölçmek için.

Geniş menzilli DR paradigması kullanarak ömrü deneyler altı farklı gıda düzeyleri (Tablo 1) içerir. Bu diyet yoksunluğu10,11 gibi daha az gıda düzeyleri altında uzun ömürlü inceleyerek veya yemek-2 genetik arka plan35kullanarak daha fazla emek yoğun bir yaklaşım gerektirir. Ancak, tek bir koşul altında ömrü, inceleyerek bir gen'ın rolü DR yorumlarını sınırlayabilirsiniz. Örneğin, biz son zamanlarda daf-7 mutantlar bir çift yönlü zayıflama vahşi türü hayvanlar12 ' ye (şekil 1A) göre gıda konsantrasyon için yanıt var gösterdi. Gıda yokluğunda, daf-7 mutantlar vahşi türü hayvanlar için karşılaştırıldığında onların ömrü bir kısalma görüntüler. Sadece diyet yoksunluğu olarak kabul ettiği, bu yorumlanır aslında daf-7 rolü daha karmaşık olduğunda sadece ömrü uzatma, için gerekli varlık olarak daf-7 gen. Bu nedenle, bu protokolün bir parçası, kritik sonucunu olup olmadığını bir gen ilgi kurmak için gıda bolluk içinde ömrü genel yanıt değişikliklere oransal ilgilenmektedir.

Diğer yöntemlerine göre bu iletişim kuralı bir büyük avantajı bu ömrü analiz geçiren hayvanların döl üretimde ortadan kaldırmak için yeni bir yöntem kullanıyor olması. Çoğu çalışmalar hızla çoğalmak-in onları steril işleme erişkinlerde germline etkisizleştirmek için uyuşturucu FuDR kullanın. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda FuDR tedavi çağıran ömrü17,18,19,20,21, koşul ve gen özel etkileri olabilir göstermiştir onun genel uygulanabilirliği soru. Bu protokol için bir 24 h'den döl üretim ortadan kaldırılması sağlanır muamele-in hayvan RNAi kitin yumurta kabuğu oluşumunu inhibe yumurta-5 gen hedefleme ile sonuçlanan C. elegans yumurta döllenmiş kendi Ölüm22,23. Bu yöntemin avantajı çok geç oyunculuk ve çok uzun ömürlü C. elegansiçinde büyük bir düzenleyicisidir germline engel olmasıdır.

Geniş menzilli DR Protokolü'nün bir potansiyel uyarı bakteriyel nükleer silahların yayılmasına karşı bakteriyel konsantrasyon sıkı bir denetim sağlamak için kontrol etmek için antibiyotik kullanımı üzerindeki güven var. Bakteri çoğalması solucan bağırsak içinde C. elegans16ölüm önemli bir nedeni olduğu bilinmektedir. Böylece, carbenicillin, NGM agar gibi bakteriyostatik antibiyotik kullanımı bakteri yayılmasını engeller ve antibiyotik olmayan denetimleri16için karşılaştırıldığında solucan ömrünü artırır. Antibiyotikler, Rifampisin36 ve38tetrasiklin aile37,, üyeleri gibi belirli türde bağımsız olarak bakteriyel üzerindeki etkileri C. elegans içinde ömrünü uzatmak için gösterilen nükleer silahların yayılmasına karşı. Ancak, ya carbenicillin ya da streptomisin uzun ömürlü bağımsız olarak bakteriyel yayılması üzerindeki etkileri artırabilir hiçbir kanıt literatürde.

Ömrü çevresel bilgi, gen-ifade nöronal ağlarda tarafından yönlendirilen fizyolojisine nerede iletilir karmaşık bir hesaplama çıktı olarak görüntülenebilir. Bizim iletişim kuralı nasıl belirli genler anlamak için bir metodoloji sağlar bu çevresel bilgi akışını etkiler. Bu soru adresi için güvenilir görüntü gen ifade yanıt tek hücre düzeyinde dağılımını belirlemek için işleme gerekir. Sadece gen ekspresyonu için ortalama yanıt gıda bolluk içinde değiştirir ama aynı zamanda bizim yöntem uygulanabilirliği için önemli bir gereksinimi büyük popülasyonlarda üzerinden tam istatistiksel dağıtım temsil eder tahmin edememek. Gen ifade yanıt gıda bereket için bu doğru bir açıklama bilgi kuramı uygulanması belirli nöronlar tarafından kodlanan bilgiler gibi sinirsel devre tarafından istihdam kodlama strateji ölçmek için sağlar.

Bu protokol için özetlenen yöntemleri görüntüleme ve Hesaplamalı yönlerini biyolojik bağlamlarda daha büyük bir grup için geçerlidir. Çalışmamızda, biz gıda ile ilgili küçük bir sinirsel ağ üzerinde algılama, ancak, bilgi işlem özellikleri analiz belirli hücre tipi veya belirli çevre ipuçları için sınırlı değildir duruldu. Gelecekte, bu metodolojileri potansiyel olarak daha büyük girdi değişkenlerini, fizyolojik herhangi bir çıktı etkileyen çeşitli için genişletilebilir. Bu yaklaşımların nasıl gen düzenleyici ağları kodlamak, işlem daha büyük bir anlayış için katkıda bulunmak ve bilgi iletimi.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz Bargmann ve Horvitz labs reaktifler için teşekkür ederim. Bazı suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir. Biz ayrıca M. Lipovsek el yazması üzerine yorumlar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Wellcome Trust (proje Grant 087146 Q.C. için), BBSRC (BB/H020500/1 ve 1/M00757X/BB Q.C. için), Avrupa Araştırma Konseyi (NeuroAge 242666 Q.C. için) bize ulusal sağlık Enstitüleri (R01AG035317 ve R01GM088333 H.L. için) ve ABD tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı (0954578 şöyle, M.Z. için 0946809 GRFP için).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

Genetik sayı: 126 diyet kısıtlaması yüksek üretilen iş görüntüleme bilgi teorisi nörolojik havacilik sinirsel kodlama gen ekspresyonu
<em>C. elegans</em> gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter