Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Published: September 27, 2017 doi: 10.3791/56484
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University
* These authors contributed equally

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Abstract

Maternale obesitas wordt geassocieerd met een verhoogd risico op nadelige perinatale uitkomsten die zijn waarschijnlijk gemedieerd door gecompromitteerde placenta functie die kan worden toegeschreven aan, in deel, de disregulatie van autophagy. Aberrant wijzigingen in de expressie van de regelgevers autophagy in de placentas van zwaarlijvige zwangerschappen kunnen bij inflammatoire processen gekoppeld aan zowel overgewicht en zwangerschap worden geregeld. Hier beschreven is een protocol voor de bemonstering van villous weefsel en isolatie van de villous cytotrophoblasts van de term menselijke placenta voor primaire celculturen. Dit wordt gevolgd door een methode voor het simuleren van de inflammatoire milieu in de zwaarlijvige uteriene omgeving door het behandelen van primaire trophoblasts van mager zwangerschappen met tumor necrose factor Alfa (TNFα), een proinflammatoire-cytokine dat is verheven in zwaarlijvigheid en in zwangerschap. Via de implementatie van het protocol beschreven hier, komt het voor dat de blootstelling aan exogene TNFα regelt de uitdrukking van Rubicon, een negatieve regulator van autophagy, in trophoblasts van mager zwangerschappen met vrouwelijke foetussen. Terwijl een aantal biologische factoren in de zwaarlijvige uteriene omgeving behouden het potentieel om te moduleren kritische trajecten in trophoblasts, is dit systeem ex vivo vooral handig voor het bepalen van als expressie waargenomen in vivo patronen in menselijke placentas met moeders obesitas zijn een direct gevolg van TNFα signalering. Uiteindelijk, deze aanpak biedt de mogelijkheid om te ontleden de regelgevings- en moleculaire implicaties van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over autophagy en andere kritische cellulaire routes in trophoblasts die de potentie hebben om invloed functie van de placenta.

Introduction

Obesitas is een inflammatoire staat gekenmerkt door chronische low-grade ontsteking, die voortkomen uit overtollige vetweefsel en de beschikbaarheid van nutriënten. In overgewicht, zijn proinflammatoire cytokines verheven in metabole weefsels en systemisch in omloop. Een robuust lichaam van bewijsmateriaal blijkt dat TNFα is aanzienlijk verhoogd in de omgeving van obesitas met gevolgen in insulineresistentie en metabole dysfunctie1. Activering van TNFα draagt ook bij aan de pathogenese van de ziekte in aandoeningen zoals kanker en autoimmuniteit, waardoor het een aantrekkelijke therapeutisch doel2.

Ontsteking in obesitas wordt verergerd door zwangerschap, ook een proinflammatoire staat3,4. Eerder is aangetoond dat de placenta TNFα inhoud met moeders vetmobilisering in zwangerschappen met vrouwelijke foetussen toeneemt. Bovendien remt TNFα behandeling mitochondriale ademhaling in vrouwelijke maar niet mannelijke trofoblast cellen, suggereren dat TNFα is betrokken bij de regulering van de placenta metabolisme in een seksueel dimorphic wijze5. Maternale obesitas wordt geassocieerd met de verhoogde incidentie van allerlei complicaties tijdens de zwangerschap, met inbegrip van doodgeboorte, met mannelijke foetussen worden de meest gevoelig3,6,7,8 . Als gevolg van haar belangrijke rol op de moeders-foetale interface, kunnen veranderingen in de functionele capaciteit van de placenta in de zwaarlijvige uteriene omgeving in reactie op inflammatoire signalering een belangrijke rol in het bemiddelen van de resultaten van zwaarlijvige zwangerschappen.

Cytotrophoblasts en syncytiotrophoblasts in het villous weefsel van de placenta zijn kritisch voor endocriene signalering en voedingsstoffen en zuurstof uitwisseling tussen de moeder en de ontwikkeling van de foetus9. Verstoringen in de functionele capaciteit van villous cytotrophoblasts (hierna te noemen trophoblasts) in gevaar kunnen brengen foetale gezondheid en ontwikkeling. Dit protocol beschrijft een methode voor de bemonstering van villous weefsel van de placenta menselijke termijn door het ontleden weg de chorionic en basale platen samen met een geoptimaliseerde procedure voor de isolatie van de trophoblasts voor primaire celculturen. Dit protocol is afgeleid van gevestigde methoden waarbij enzymatische vertering van villous weefsel vrij te geven van de cellen van de extracellulaire matrix gevolgd door differentiële dichtheid centrifugeren te isoleren trophoblasts10, 11,12. De gegevens van dit protocol een aanpak waarin primaire trophoblasts van placentas van mager zwangerschappen worden behandeld met voedingsbodems aangevuld met TNFα te simuleren een onderdeel van de inflammatoire milieu gekoppeld aan moeders obesitas. Eindelijk, een eenvoudige procedure voor de oogst van de cel Totaal lysates van TNFα-behandeld trophoblasts gevolgd door Western blotting om de opsporing van wijzigingen in genexpressie is beschreven.

Dit model doet het obesogenic in utero milieu in zijn geheel niet recapituleren, geeft maar een gecontroleerde systeem dat een toelaat parseren uit de individuele bijdrage van TNFα-gemedieerde ontsteking naar aanleiding van de trophoblasts maternale obesitas. Dit model biedt zowel de mogelijkheid om te ontdekken of bevestigen van moleculaire targets direct geregeld TNFα signalering in trophoblasts evenals maakt het mogelijk om te testen of veranderingen in gen-expressiepatronen in vivo in placentas met moeders waargenomen overgewicht kan een gevolg zijn van TNFα-gemedieerde ontsteking.

De hier beschreven aanpak werd opgestart om te testen van het effect van TNFα-gemedieerde ontsteking op de regulering van autophagy in menselijke trophoblasts. Trophoblasts van zwaarlijvige zwangerschappen met mannelijke foetussen tentoonstelling verstoord autophagic omzet of autophagosome rijping13. Vallen proteïnen aan genaamd Rubicon (RUN domein eiwit Beclin1-interactie en cysteïne-rijke bevatten), die is gelokaliseerd in de lysosomen en laat Endosomen, is onlangs beschreven als een "rem" in het proces autophagic omzet omdat het functioneert als een negatief regulator van14,15van de rijping van de autophagosome. In feite, is Rubicon een zeldzaam voorbeeld van een eiwit dat weerhoudt autophagy, waardoor het een waardevolle therapeutisch doel. Zeer weinig informatie is beschikbaar over de pathofysiologische betekenis van Rubicon, met uitzondering van haar rollen in de ingeboren immune reactie op microbials16,17 en cardiomyocyte bescherming18. Met het protocol beschreven hier, het komt voor dat Rubicon upregulated in vrouwelijke primaire trophoblasts in reactie op behandeling is met toenemende concentraties van TNFα tot 250 pg/mL. De regulering van de Rubicon kan een rol spelen in hoe vrouwelijke foetussen fare beter dan mannetjes in zwangerschappen met moeders obesitas. Recapitulerend ontsteking geassocieerd met moeders obesitas ex vivo door blootstelling van menselijke trophoblasts aan exogene TNFα biedt een platform voor het bestuderen van de effecten van de zwaarlijvige uteriene milieu over de regulering van de kritische trajecten in trophoblasts en bij uitbreiding, placenta functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

placentae werden verzameld uit de arbeid en de levering eenheid op universitair ziekenhuis onder een protocol dat is goedgekeurd door de institutionele Review Board van Oregon Health and Science University in Portland, Oregon, met geïnformeerde toestemming van de patiënten.

1. collectie van placenta weefsel

  1. voorbereiding
    Opmerking: alle apparatuur die weefsel ontmoetingen moet steriel.
    1. Het ontleden uitrusting steriliseren in autoclaaf gedurende 60 minuten op 121 ° C.
    2. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM): lab jassen/jassen/scrubs, handschoenen en masker met een gelaatsscherm of bril.
    3. Inschakelen waterbad en ingesteld op 37 ° C.
    4. Warm twee 50 mL conische buizen, elk met 25 mL van volledige media (Iscove ' s gewijzigd Dulbecco ' s Medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine, tabel 3) in een waterbad 37 ° C.
    5. Met geïnformeerde patiënt toestemming, het verkrijgen van een placenta onmiddellijk na levering door keizersnede.
    6. Vertrouwd te raken met de placenta. De navelstreng wordt ingevoegd in de foetale kant (chorionic plaat) en bloedvaten kan worden gezien straalt uit van de navelstreng invoeging site. De overkant is de moeders kant, of basale plaat. Het omvat de decidua en structuren die vaartuig bomen, genaamd zaadlobben bevatten.
  2. Bemonstering van Villous weefsel
    Opmerking: Villous weefsel uit de placenta zo spoedig mogelijk na levering, bij voorkeur in 30 minuten of minder moet worden bemonsterd.
    1. Met de chorionic plaat naar boven, accijnzen 2-3 full-dikte secties (ongeveer 2,5 x 2,5 cm grootte) 2-3 cm vanaf de rand van de placenta op willekeurige, met Tang en schaar ( figuur 1A).
      Opmerking: Voorkomen dat delen van de placenta die verschijnen abnormaal (dat wil zeggen wit kalkafzettingen).
    2. Trim weg de chorionic en basale platen en de grote bloedvaten.
    3. Plaatst de resulterende villous weefsel ( figuur 1B, ongeveer 80-120 g totale) in warme volledige media en begint van trofoblast isolatie binnen 30 min van bemonstering.
      Opmerking: Sommige downstream testen en toepassingen worden beïnvloed door de lengte van de latentieperiode tussen levering, bemonstering en trofoblast isolatie. Het is het beste te houden deze termijnen zo kort als mogelijk en consistente tussen isolatie.
    4. Met behulp van de technieken beschreven in stappen 1.2.1 - 1.2.2, sample 5 willekeurige 1 x 1 cm secties van villous weefsel van over de placenta (inclusief het centrum).
    5. Knippen elk monster 1 x 1 cm villous weefsel in kleinere stukjes 4-5 (ongeveer 30 mg elke), plaats in 2 mL microcentrifuge buizen en flash bevriezen in vloeistof N 2. Winkel bij-80 ° C voor gebruik in latere analyses.

2. Isolatie van Trophoblasts van Villous weefsel

  1. voorbereiding
    Opmerking: gebruiken van steriel injectiemateriaal en uitvoeren van procedures waarbij cellen in een laminaire flow-kap.
    1. Dooi vier bevroren dichtheid verlopen (tabel 1, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) bij 4 ° C de nacht voordat de placenta aankomt.
      Nota: Alternatief, dichtheid verlopen kunnen worden gemaakt op de dag van het isolement.
    2. Beurt op centrifuge en ingesteld op 20 ° C.
      Opmerking: Alle stappen van het centrifugeren worden op maximale acceleratie en vertraging, tenzij anders gespecificeerd.
    3. Voorbereiden 1 x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS) aangevuld met Ca + 2 en Mg + 2 (tabel 3).
    4. Warme trypsine tot 37 ° C.
    5. DNase verdund tot ongeveer 2720 kilounits/mL in steriel aangevuld HBSS.
    6. Warme 50 mL Serum van pasgeboren kalf (NCS) tot 37 ° C.
    7. Warm volledige media tot 37 ° C.
    8. Warm bevriezing media (90% FBS, 10% DMSO, tabel 3) tot 37 ° C.
      Let op: DMSO is giftig en moeten worden behandeld met handschoenen.
    9. Voorbereiden spijsvertering buffer (tabel 2 en 3) door het mengen van 308 mL aangevuld HBSS, 50 mL trypsine (3751.7 BAEE eenheden/mL), en 0,5 mL DNase (379.4 kilounits/mL) in een steriele fles.
      Opmerking: Het geschatte benodigde tijd voor het isoleren van cellen uit villous weefsel is 7 h.
  2. Het Villous weefsel verwerking
    1. Rinse elk stuk van villous weefsel in een conische tube van 50 mL gevuld met kamertemperatuur fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal en de PBS vervangen als dit nodig is, totdat het overtollige bloed is verwijderd (PBS spoelen zullen worden licht rood of roze wanneer het weefsel is grondig afgespoeld).
    2. Het villous weefsel in een steriele petrischaal plaatsen en verwijderen als veel bloedvaten mogelijk door voorzichtig afschrapen korting op de villous weke delen van de vaartuigen die met behulp van een microscoopglaasje.
    3. Fijn gehakt het resulterende villous weefsel met behulp van schaar.
  3. Villous weefsel spijsvertering en ruwe isolatie van Trophoblasts
    1. het gehakt villous weefsel overbrengen in een steriele fles met spijsvertering oplossing volgens de berekende volumes op basis van de specifieke activiteit van trypsine en DNase (165 mL, tabel 2).
    2. Na 35 min van incubatie in een waterbad 37 ° C met 70 omwentelingen per minuut (rpm), schudden kantelen van de spijsvertering fles op zijn kant en laat de onverteerd stukjes weefsel te vestigen op de bodem van de fles. Zorgvuldig opstellen van de bovendrijvende substantie met een serologische Pipet, het vermijden van het vaste weefsel.
    3. Het supernatant afzien door een zeef cel 100 µm gelijkelijk tussen de conische buisjes 50 mL.
      Opmerking: Om tijd te besparen, is het raadzaam om te beginnen met de tweede vertering door spijsvertering oplossing (110 mL, tabel 2) toe te voegen aan de overige geregeld weefsel en hervatten van incubatie, zoals beschreven in stap 2.3.2.
    4. Laag 3-5 mL NCS onder het gespannen supernatant zachtjes door het langzaam verstrekking van een serologische pipet aan de onderkant van de buis. Een meniscus tussen de gespannen supernatant (met trophoblasts) en de NCS moet zichtbaar ( figuur 2A).
    5. Centrifugeren het supernatant over NCS bij 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C. De resulterende pellet nemen rode bloedcellen in de laag van de lagere meest gevolgd door een wit laagje met de cellen van de trofoblast ( figuur 2B).
    6. Herhaal stap 2.3.2 - 2.3.5 voor elk van de spijsvertering van het tweede en derde (toevoegen van 110 mL en 83,5 m, respectievelijk van spijsvertering oplossing aan de fles van weefsel, tabel 2).
    7. Zodra alle supernatant hebben zijn gecentrifugeerd, resuspendeer elke pellet in 5 mL warme volledige media, en vervolgens samen bundelen de schorsingen.
    8. Splitsen de celsuspensie even tussen twee kegelvormige buizen van 50 mL en centrifuge op 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C.
    9. Voorzichtig Verwijder het supernatant en resuspendeer elk van de cel pellets in 6 mL warme complETE media.
  4. Dichtheid centrifugeren
    1. verdelen de celsuspensie gelijkelijk tussen vier dichtheid verlopen (van elk 3 mL) door het langzaam en zorgvuldig stapelen de celsuspensie op de bovenkant van het verlopen van de dichtheid met een overdracht Pipetteer.
    2. Centrifugeren de dichtheid verlopen bij 1250 x g gedurende 20 minuten bij 20 ° C met minimale versnelling en vertraging. Dit moet produceren te onderscheiden bands van gesedimenteerd cellen (tabel 4).
    3. Langzaam en zorgvuldig verwijdert de bovenste lagen van dichtheid kleurovergang media (DGM) totdat het ondoorzichtige band(en) aan met cellen van de trofoblast (tussen 35-50% DGM) is bereikt (tabel 4).
    4. Overbrengen van de trofoblast bands in twee 50 mL conische buizen en vul met warme volledige media.
    5. Voorzichtig het omkeren van de buizen 3 - 6 keer te mengen en centrifugeer bij 1250 x g gedurende 15 minuten bij 20 ° C.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van elke cel in 5 mL warme volledige media. Combineer de cel schorsingen en levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en de Trypan blauwe tellen (of voorkeur cel tellen methode).
  5. Cellen tellen met een Hemocytometer
    1. de celsuspensie Meng door op en neer met een serologische Pipetteer pipetteren of door zachtjes het omkeren van de buis meermaals.
    2. Combineren gelijke delen celsuspensie en Trypan blauw (dat wil zeggen 20 µL elke) in een aparte buis en meng voorzichtig.
    3. Voor 1-2 minuten bij kamertemperatuur Incubate.
    4. Voorzichtig afzien van 15-20 µL van de cel-Trypan blauwe mengsel tussen het dekglaasje aan en de hemocytometer en de cellen om te verspreiden over het raster door capillaire werking toestaan.
    5. Levensvatbare cellen (dode cellen zal worden gekleurd donkerblauw) in elk van de vier 4 x 4 kwadranten met een teller tally tellen. Een systeem om ervoor te zorgen dat cellen worden niet meegeteld meer dan eens te tellen (d.w.z. tellen niet cellen die de onderzijde of de linker grenzen raken).
      Opmerking: Elke 4 x 4-kwadrant moet tussen de 50-150 cellen bevatten. Te weinig of te veel cellen kunnen leiden tot een over of onderschatting van celaantal.
    6. Gemiddelde de cel totaal telt uit elk van de 4 x 4 kwadranten, te vermenigvuldigen met 10 4, en dan te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (celsuspensie naar Trypan blue) voor het berekenen van aantal cellen per mL.
    7. Het aantal cellen per milliliter te vermenigvuldigen met het totale volume van de celsuspensie voor het berekenen van het rendement van de cel totaal.
      Opmerking: Ongeveer 100 miljoen cellen worden verwacht van isolatie beginnen met 80-120 g van villous weefsel.
  6. Plating cellen
    1. plaat 3 miljoen cellen per putje (3.3 x 10 5 cellen per cm 2) in een 6-well plaat (2 mL van een schorsing per putje) en zachtjes heen en weer rock en kant naar kant gelijkmatig verdelen de cellen.
      Opmerking: Trophoblasts vereisen Weefselkweek behandeld platen te houden goed. Een monolayer van cellen is vereist ter bevordering van syncytialization.
    2. Laat de vergulde cellen in de kap van de laminaire flow gedurende ongeveer 30 minuten om cellen te gelijkmatig te verspreiden, te regelen, en beginnen zich te houden aan de onderkant van de putten alvorens in de incubator.
    3. Cultuur cellen voor maximaal 72 uur (met dagelijkse wijzigingen van de media) in een incubator 37 ° C met 5% CO 2 en 95% vochtigheid.
      Opmerking: Controleer de trophoblasts onder een microscoop bij 10-20 x elke 24 h van cultuur. Trophoblasts niet vermenigvuldigen en niet kan worden gepasseerd. In de loop van 72 h van de cultuur, de ronde individuele trophoblasts zekering om te vormen van een syncytium ( figuur 3A en B).
  7. Bevriezing cellen
    1. Pellet ongebruikte cellen door centrifugeren bij 1250 x g gedurende 10 minuten bij 20 ° C.
    2. Gecombineerd zoveel media mogelijk van de pellet.
    3. Resuspendeer de pellet in de bevriezing van de media (tabel 3).
    4. Bevriezen de aliquots bij-80 ° C in een bevriezing container gevuld met 100% isopropanol. Overbrengen in de bevroren aliquots vloeistof N 2 de volgende dag voor lange termijn opslag.
      Opmerking: Cellen gekweekt kunnen worden na invriezen.
  8. Ontdooien cellen
    1. verwijderen van een aliquoot deel van bevroren cellen en ontdooien in een waterbad 37 ° C terwijl zwenken. Verwijderen van het afgepipetteerde deel uit het waterbad, net voordat het heeft volledig ontdooid tot een vloeistof.
    2. Onmiddellijk overbrengen in de ontdooide cellen een conische buis 15 ml. Begin vertragen aanvankelijk, voeg 10 mL van de volledige media met het mengen van intermitterende.
    3. Omkeren buis meerdere malen te mengen.
    4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 20 ° C.
    5. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in warme volledige media 2-5 mL.
    6. Rekenen de cellen en de plaat zoals hiervoor is beschreven.

3. Behandeling van primaire Trophoblasts met TNFα collectie van cel Lysates en westelijke bevlekken

  1. voorbereiding
    1. Warm volledige media tot 37 ° C.
    2. Maken van een voorraad van 10 µg/mL van TNFα in volledige media en opslag bij-20 ° C tot parasols.
    3. Maak een 1 µg/mL werken voorraad van TNFα in volledige media als u klaar bent voor de behandeling van de cellen. Seriële Verdun de TNFα werken voorraad 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL en 125 pg/mL in volledige media.
      Opmerking: De TNFα concentratie van 10 4 pg/mL is matig cytotoxische. Aanpassing van de concentraties van de TNFα getest zal afhangen van de specifieke kenmerken van de gewenste downstream toepassingen.
  2. Behandeling van cellen met TNFα
    1. gecombineerd na 24 h van de cultuur, de media van de cultuur van de cellen en vervangen met 2 mL TNFα aangevuld medias per putje op 6-Wells-platen (ten minste twee putten per behandeling en voertuig Control).
    2. Na 24 h blootstellingsduur TNFα-48 h van cultuur, vervangen de medias TNFα aangevuld met volledige media.
  3. Oogst cellen en totale proteïne
    1. na 72 uur van cultuur (24 h verleden verwijdering van TNFα) gecombineerd media voorzichtig spoelen cellen met kamertemperatuur PBS en voeg 80 µL van ijskoud Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (RIPA) met vers protease en phosphatase inhibitors (tabel 3) direct aan elk putje toegevoegd.
    2. Verwijder de cellen van de plaat met een cel schraper. De cellen overbrengen in een 1,5 mL microcentrifuge buis, bundeling van putten binnen behandelgroepen.
    3. Lyse de cellen door vortexing de buizen op hoge voor ten minste drie intervallen van 15 s.
    4. Incubeer de cellen bij 4 ° C met rockende voor 15 min.
      Opmerking: u kunt ook na stap 3.3.3., de cellen kunnen worden geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten met intermitterende agitatie door flicking de buis, vortexing, of pipetteren omhoog en doenWN.
    5. Herhaal stap 3.3.3.
    6. Centrifugeren van de buizen bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot cellulaire puin pellet.
    7. Overdracht het supernatant (met cellulaire eiwit) om een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis en sla op -80 ° C.
      Opmerking: Het protocol kan worden gestopt hier en op een later tijdstip hervat. Het is raadzaam om verschillende hoeveelheden van cellulaire EiwitSteekproeven om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli.
    8. Totaal eiwitconcentratie te bepalen door een voorkeur, zoals een bicinchoninic zuur assay (BCA, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal).
  4. SDS-pagina en het westelijke bevlekken voor Rubicon of eiwit van belang
    Opmerking: Volg Westelijke Bevlekkende Protocollen volgens fabrikant ' s-instructies met behulp van een systeem van aangewezen laboratorium.
    1. Belasting tussen 20-40 µg totaal eiwit in monster buffer (tabel 3) per putje op een 12% acrylamide gel. Afzonderlijke proteïnen door SDS-PAGE in rijklare buffer (tabel 3).
    2. Natte-overdracht de eiwitten uit de gel aan een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan volgens fabrikant ' s instructies in overdracht buffer (tabel 3).
    3. Incubeer het membraan in 5% melkpoeder in zoute Tris-Buffered met 0,1% Tween-20 (TBST, tabel 3) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met rockende.
    4. Incubeer het membraan in een Rubicon primair antilichaam (zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) op 1:500 in 1% melkpoeder in TBST's nachts bij 4 ° C met rockende.
    5. Voorzichtig wassen het membraan 3 x 5 min in TBST en 1 x 5 min in TBS bij kamertemperatuur met rockende.
    6. Incubeer het membraan in 1:2000 - 1:5000 secundair antilichaam (HRP-gekoppeld of voorkeur zichtbaar conjugaat, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) in 5% melkpoeder in TBST gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur met Rocking.
    7. Herhaal de wassen procedure in stap 3.4.5 en visualiseren van de vlek met een passende visualisatie (d.w.z. chemiluminescentie) substraat op een imaging systeem.
    8. Herhaal de wassen procedure in stap 3.4.5 en sonde het membraan voor β-actine of een besturingselement voorkeur laden volgens de fabrikant ' s instructies.
    9. Op de software van de analyse van de preferent spiegelbeeld, analyseren de expressie van Rubicon door handmatige kwantificering van absorptie (band intensiteiten), controle aftrekken van de extinctie van de achtergrond en de normalisatie bij het laden van de bijbehorende band intensiteiten. Het uitvoeren van statistische analyses om te testen voor statistisch significante veranderingen in eiwitniveaus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Termijn van menselijke placentas van lean (pre-zwangerschap index van de lichaamsmassa (BMI) < 25) moeders met ongecompliceerde zwangerschappen uitvoering van vrouwelijke nakomelingen werden verzameld en bemonsterd binnen 15 minuten na levering door keizersnede (geen arbeid). De placentas werden onderzocht voor het ontbreken van kalkafzettingen en typische ontwikkeling: weegt tussen 300-600 g met de navelstreng en membranen verwijderd, ronde in vorm, tussen 15-25 cm in diameter en navelstreng ingevoegd in het midden van de placenta. Villous weefsel werd ontleed uit de buurt van de basale en chorionic platen in 2-3 samples uit via de placenta (Figuur 1), opbrengst van ongeveer 100 g villous weefsel als grondstof voor primaire trofoblast isolatie. Binnen 20 minuten van bemonstering villous weefsel, startte de procedure om te isoleren van de primaire trophoblasts zoals beschreven hier, opbrengst tussen 0,8 - 1 x 108 levensvatbare cellen. De cellen waren bezaaid in 6-well cultuur platen bij een dichtheid van 3 x 106 (3.3 x 105 cellen per cm2). Na 24u van cultuur, de cellen werden onderzocht onder een Microscoop voor bevestiging en goede trofoblast morfologie (individuele ronde cellen) werd bevestigd. De voedingsbodems werd vervangen door volledige media waarin een reeks concentraties van TNFα tussen 125-104 pg/mL, zodat ten minste twee waterputten opgenomen per concentratie en controle van het voertuig (alleen volledige media werden).

Vierentwintig uren na de TNFα-behandeling (48u voor cultuur), werden alle TNFα medias vervangen door volledige media. Geen aanzienlijke celdood werd waargenomen als gevolg van behandeling met TNFα bij concentraties op of onder 103 pg/mL. Behandeling met 104 pg/mL TNFα was matig cytotoxische en de cytotoxische effecten van deze concentratie TNFα niet blijven bestaan nadat de media werd veranderd, zoals blijkt uit de lactaat Dehydrogenase (LDH) testen (gegevens niet worden weergegeven). Bij 72 h van cultuur, werden cellen voor syncytialization onder een microscoop onderzocht. Immunocytochemie voor syncytialization en fibroblast besmetting bleek relatief zuiver Isolatievan trophoblasts (Figuur 3). Cellulaire lysates zijn geoogst volgens het protocol hier beschreven, opbrengst tussen 3-8 µg/µL totaal eiwit per preparaat zoals bepaald door een BCA assay (gegevens niet worden weergegeven). Western blot analyse in cel lysates van vrouwelijke trophoblasts behandeld met TNFα toonde een opregulatie van Rubicon expressie in reactie op de concentraties van TNFα tot 250 pg/mL en latere Downregulatie van Rubicon expressie bij TNFα concentraties groter dan 250 pg/mL (figuur 4A en B, 104 pg/mL uitgesloten van de analyse op basis van cytotoxische effecten). Evenzo, Rubicon is aanzienlijk upregulated in flash-bevroren villous weefsel Biopten van placentas van zwaarlijvige zwangerschappen met vrouwelijke foetussen in vergelijking met mager besturingselementen, zoals blijkt uit de westelijke vlekkenanalyse (figuur 4C en D, n = 6 placentas per BMI klasse, ANOVA, P < 0,05).

Concentratie (%) 90% DGM (ml) 1 x HBSS (ml) Laagdikte (ml)
4 x verloop 4 x verloop Totale 34.5 ml
70 14 4 4.5
60 8 4 3
55 7.33 4.67 3
50 3.34 2,67 3
45 6 6 3 (13,5 ml mark)
40 5.33 6.67 3
35 4.67 7.33 3 (19.5 ml mark)
30 8 16 6
20 2,67 9.33 3
10 1.33 10.67 3

Tabel 1. Specificaties voor het maken van dichtheid verlopen voor dichtheid centrifugeren van primaire Trophoblasts.
Van links naar rechts, geeft kolom dichtheid kleurovergang media (DGM, zie tabel van de essentiële benodigdheden, reagentia, en apparatuur en aanvullend materiaal) concentratie uitgedrukt in percentages van de DGM in HBSS. Kolom twee Hiermee geeft u het volume van de DGM terwijl kolom drie de hoeveelheid HBSS vereist geeft voor het maken van het passende percentage van DGM oplossing. Kolom vier Hiermee geeft u het volume moet worden toegevoegd aan de conische buis van 50 mL te bouwen van het verloop, beginnend met de meest dichte laag.

Trypsine HBSS DNase
Spijsvertering (totale activiteit; BAEE eenheden) volume (ml) (totale activiteit; Kunits) Totaal Volume
/digestion
1 619037 (23.01 ml) 141.76 ml 62594 (0.230 ml) 165 ml
2 412691 (15.34 ml) 94.51 ml 41729 (0.154 ml) 110 ml
3 313270 (11.65 ml) 71.74 ml 31676 (0.116 ml) 83,5 ml
Totaal 1345000 (50 ml) 308 ml 136000 (0,5 ml) 358.5 ml

Tabel 2. Specificaties voor de bereiding van spijsvertering oplossing voor primaire Trophoblast isolatie op basis van de specifieke activiteit van DNase en trypsine.
Van links naar rechts, de eerste kolom geeft aan hoeveel van de spijsvertering, de tweede kolom geeft de activiteit van de trypsine nodig per spijsvertering, de derde kolom de totale hoeveelheid aangevuld HBSS worden toegevoegd voor de juiste spijsvertering, de vierde kolom geeft de DNase activiteit vereist per spijsvertering, en de laatste kolom geeft het volume van de spijsvertering oplossingtoegevoegd aan de placenta weefsel voor de juiste spijsvertering.

HBSS (aangevuld met Ca+ 2 en Mg+ 2) Monster Buffer
10% 10 x HBSS 90% 4 X Laemmli kleurstof
1.26 mM CaCl2 (anhyd.) 10% 2-Mercaptoethanol
0.80 mM MgSO4 (anhyd.)
20.77 mM HEPES
pH aan 7.4 met 10N NaOH
Volume tot 1 L met steriele ddH2O maken
Steriel filter in een steriele fles
Volledige Media Lopende Buffer
Verwijderen van 11% v/v IMDM 25 mM Tris Base
10% v/v FBS toevoegen 190 mM Glycine
Voeg 1% 10.000 U/mL penicilline/streptomycine (100 U/mL final) 0,1% SDS
pH ten slotte op 8.3
Bevriezing van de Media
90% v/v FBS Overdracht Buffer
10% v/v DMSO 25 mM Tris
190 mM Glycine
Spijsvertering Buffer 20% methanol
50 mL trypsine (26,900 BAEE eenheden/mL) pH ten slotte op 8.3
0,5 mL DNAse (272,000 K eenheden/mL)
Zodat 358.5 ml in aangevuld HBSS TBS
20 mM Tris
De Buffer RIPA 150 mM NaCl
25 mM Tris-HCl pH 7,6
5 mM EDTA
150 mM NaCl TBST
0,1% SDS TBS met 0,1% Tween 20
0,5% natrium deoxycholate
1% Triton X-100
1 tablet van protease/fosfatase-remmer per 10 ml RIPA Buffer

Tabel 3. Oplossingen vereist voor isolatie en cultuur van primaire Trophoblasts gevolgd door het westelijke bevlekken.

% DGM ml mark Celtype
10 31,5-34,5 Puin
20 28,5-31,5
30 22,5-28.5
35 19,5-22.5 Trophoblasts
40 16,5-19,5
45 13,5-16,5
50 10.5-13.5 Lymfocyten
55 7.5-10.5
60 4.5-7.5 Rode bloedcellen
70 Onder 4.5

Tabel 4. Sedimentatie van Trophoblasts door dichtheid centrifugeren.
Van links naar rechts, de eerste kolom geeft het percentage van de DGM (tabel 1), de tweede kolom het mL merk waar het overeenkomstige percentage van DGM is te vinden op een conische tube van 50 mL, en de derde kolom wordt aangegeven welke cel type sedimenten op de overeenkomstige percentage van DGM en mL merk op een conische buis van 50 mL. Trophoblasts sediment tussen 50-35% DGM, vorming van verschillende ondoorzichtige banden. DGM verzamelen boven of onder dit bereik zal resulteren in besmetting van cellulaire puin en andere celtypes zoals lymfocyten.

Figure 1
Figuur 1. Villous weefsel is geïsoleerd van de Term menselijke Placenta door het verwijderen van het verdikte en basale platen.
A) met de chorionic plaat (foetale kant) naar boven, een monster van de volledige dikte van de placenta is weggesneden. B) een steekproef van villous weefsel wordt verkregen door het verwijderen van de chorionic en basale platen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Centrifugeren van cellen in spijsvertering oplossing over pasgeboren kalfsserum resulteert in een meerdere lagen cel-Pellet.
A) pasgeboren kalfsserum (NCS) laag onder de celsuspensie in de analyse-oplossing in een conische tube van 50 mL. B) centrifugeren van (A) resulteert in een cel van meerdere lagen pellet. De onderste laag is diep in rode kleur en bestaat uit rode bloedcellen. De bovenstaande laag bevat trophoblasts en is wit of beige in kleur. Laag is boven de trofoblast NCS gevolgd door spijsvertering oplossing (bezinken) tot de bovenkant van de buis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Immunocytological analyse van Syncytialization en Fibroblast inhoud in primaire menselijke Trophoblast culturen.
A) representatief beeld van Cytokeratin-7 (rood) in cytotrophoblasts na 24 h van cultuur. B) representatief beeld van Cytokeratin-7 (rood) in syncytiotrophoblasts na 72 h van cultuur toont multinucleaire massa's van cellen die zijn gesmolten. C) representatief beeld van Vimentin (rood) in syncytiotrophoblasts na 72 uur van cultuur. Beelden werden verworven op een fluorescente microscoop met nucleaire counterstain van de DAPI (blauw). Gevisualiseerd op 10 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Regeling van de Rubicon expressie in reactie op TNFα-behandeling in vrouwelijke Trophoblasts en endogene Rubicon expressie in Villous weefsel van Lean Versus zwaarlijvige zwangerschappen met vrouwelijke foetussen.
Primaire trophoblasts uit placentas van de term van mager moeders met gezonde zwangerschappen uitvoering van een vrouwelijke foetus werden geïsoleerd en behandeld met 125, 250, 500, 103, en 104 pg/mL TNFα (of voertuig controle). A) vertegenwoordiger westelijke vlek voor Rubicon in vrouwelijke trofoblast lysates met TNFα behandeld. Β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden. B) Rubicon expressie in reactie op TNFα-behandeling in vrouwelijke trophoblasts was van Western blots gekwantificeerd en genormaliseerd naar β-actine. Waarden zijn gemiddelde Rubicon expressie per TNFα concentratie ± S.E. in n = 3 placentas. C) westelijke vlekken voor Rubicon in hele weefsel lysates van flash bevroren Biopten van villous weefsel van mager versus zwaarlijvige zwangerschappen met vrouwelijke foetussen (F1-F12). Lactaat dehydrogenase A (LDHA) werd gebruikt als een besturingselement laden. D) Rubicon expressie in westelijke van (C vlekken) werd gekwantificeerd en genormaliseerd naar LDHA. Waarden zijn gemiddelde Rubicon expressie per BMI classificatie ± S.E. in n = 6 placentas per klasse van de BMI (ANOVA, * P < 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De placenta, verantwoordelijk voor de regulering van de groei van de foetus, vertoont gecompromitteerde functie in de zwaarlijvige milieu-6. Ondanks de hoge metabole eisen van trophoblasts vertonen placentas met moeders obesitas disfunctionele mitochondriale ademhaling6,19. Veranderingen in de placenta metabolisme kunnen bijdragen aan de toename van complicaties en negatieve foetale effecten waargenomen in zwaarlijvige zwangerschappen3,6,7. Autophagy is ook in placentas met moeders obesitas gecompromitteerd. Placentas van zwaarlijvige zwangerschappen met mannelijke foetussen Toon disfunctionele autophagic flux zoals blijkt uit de accumulatie van autophagosomes13. Behoud van optimale autophagic flux is kritisch voor cellulaire homeostase en defecte autophagy in de placentas met moeders obesitas kan spelen een belangrijke rol in het bemiddelen van de nadelige resultaten zwaarlijvige zwangerschappen is gekoppeld.

De precieze oorzaak van de gecompromitteerde placenta functie tentoongesteld in maternale obesitas zijn niet goed begrepen en wellicht hun oorsprong in de inflammatoire signalering. Zowel overgewicht en zwangerschap zijn proinflammatoire-staten die worden gekenmerkt door verhoogde niveaus van circulerende TNFα1,,4,,20,21. TNFα is een activator autophagy22,23en wijzigingen in autophagic beweging in de placentas van zwaarlijvige zwangerschappen kunnen bemiddelen. TNFα is gebruikt bij het bestuderen van de effecten van ontsteking op cellen, met name in de context van kanker2. Het hier gepresenteerde protocol past deze aanpak voor het bestuderen van de gevolgen van obesitas ontsteking op de functionele capaciteit van de placenta door de behandeling van primaire trophoblasts met exogene TNFα in cultuur.

Dit protocol bestaat uit vier hoofdcomponenten: bemonstering van villous weefsel van de placenta, isolatie van primaire trophoblasts van de villous weefsel, cultuur van de primaire trophoblasts gevolgd door TNFα behandeling, en het verzamelen van totale cellulaire lysates gevolgd door Western blot analyse voor het meten van de expressie van een expressie gebrachte eiwitten van belang. Isoleren van pure trophoblasts, is het cruciaal dat de chorionic en basale platen uit de buurt van het villous weefsel grondig worden ontleed tijdens de bemonstering van de placenta (figuur 1B). Het is ook noodzakelijk dat villous weefsel is verwerkt in een tijdig (d.w.z. binnen 30 minuten van levering). Het gebruik van drie stappen van de spijsvertering, elke duurzame 35 minuten, gegevens dit protocol vrij te geven trophoblasts uit de extra-cellulaire matrix van het villous weefsel. De spijsvertering van de langere riskeren schadelijk cellen door trypsinebehandeling van cel oppervlakte-eiwitten. Verhoging van het aantal samenvattingen vergroot aanzienlijk niet de uiteindelijke opbrengst van levensvatbare trophoblasts. Echter, verminderend het tijd en aantal spijsvertering zal leiden tot verminderde cel opbrengsten (Simon, Bucher en Maloyan, ongepubliceerde gegevens). Dit protocol produceert betrouwbaar ongeveer 100 miljoen cellen van 80-120 gram villous weefsel.

Er is variatie in het aantal te onderscheiden trofoblast banden waargenomen op de hellingen van de dichtheid tussen isolatie. Om besmetting te voorkomen van andere celtypes, is het belangrijk om strikt het verzamelen van de band(en) aan met trophoblasts op het verloop van de dichtheid (tabel 4). Het protocol hier gedetailleerde is geoptimaliseerd van tevoren vastgelegde methoden die relatief zuiver trophoblasts met minder dan 5% rendement besmetting van andere cel typen10,11,12. Verdere zuivering kan worden bereikt door positieve of negatieve selectie24. Echter, deze aanpak loopt het risico van vermindering van de opbrengst van de haalbare trophoblasts. Immunocytochemische analyse van Cytokeratin-7 in primaire trophoblasts geïsoleerd met behulp van de procedure die hier gepresenteerd na 24 versus 72 h van cultuur tijd bevestigd dat de cellen syncytialization onderging, zoals blijkt uit de aanwezigheid van multinucleaire cel massa 's bij 72 h, een keurmerk evenement in de levensduur van een trofoblast (figuur 3A en B). Bovendien bleek immunocytochemische analyse van Vimentin in primaire trophoblasts gekweekt voor 72 h zeer weinig contaminerende fibroblasten (Figuur 3 c). Voor de doeleinden van de routinematige, kan de zuiverheid van trophoblasts worden gecontroleerd in cultuur door eenvoudige morfologische beoordeling. Op 24u van cultuur tijd domineren ronde individuele cytotrophoblasts de cultuur. Cytotrophoblasts ondergaan syncytialization na 72 uur van cultuur, wat resulteert in bosjes van gesmolten cellen. Het meest voorkomende celtype contaminerende gevonden in deze cultuur is de fibroblast of endothelial cel, die zijn langwerpig en veelhoekige in vorm, respectievelijk. Deze functies kunnen ruwweg worden gecontroleerd met behulp van een lichte Microscoop.

Behandeling van primaire trophoblasts met TNFα biedt een gecontroleerde systeem waarmee men voor het meten van het effect van TNFα signalering over de regulering van de kritische trajecten in trophoblasts. Er zijn natuurlijk andere factoren dan TNFα in de zwaarlijvige moeder milieu in vivo die mogelijk verantwoordelijk is voor het moduleren van de trofoblast functie. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot hormonale signalen, hyperlipidemie, en een heleboel andere proinflammatoire factoren25. Combinaties van verschillende behandelingen zal verder de zwaarlijvige uteriene milieu ex vivo recapituleren in een meer fysiologisch accurate manier. De concentraties van exogene TNFα gebruikt voor de behandeling van trophoblasts in dit protocol veel groter zijn dan die meestal circuleert in vivo. Serum concentraties zijn gerapporteerde tot 20 ng/mL of hoger in bepaalde inflammatoire voorwaarden-26. Voor het verkrijgen van een meetbare reactie door huidige laboratoriumtechnieken (d.w.z. westelijke bevlekken), is het noodzakelijk om te vergroten TNFα concentraties te onthullen wijzigingen in genexpressie en trajecten van belang. Deze reacties kunnen bestaan in vivo in mindere mate. Echter kon ze toch aanzienlijk van invloed op de functie van trophoblasts. Blootstelling van trophoblasts aan hoge concentraties van TNFα loopt het risico artefacten in genexpressie en traject analyses die kunnen worden geworteld in cytotoxische effecten te produceren. Matige cytotoxiciteit werd waargenomen in trophoblasts blootgesteld aan 104 pg/mL TNFα aangevuld media voor 24u blijkens LDH cytotoxiciteit assays (gegevens niet worden weergegeven). Concentratie op of beneden 103 pg/mL TNFα deed echter niet produceren een aanzienlijke celdood.

Testen van TNFα concentraties op kleinere intervallen en/of zijn lager dan hier beschreven kan worden best gevolgd door kwantitatievepolymerase-kettingreactie (qPCR) gen expressie p.a., een techniek is geschikt voor het opsporen van kleine wijzigingen in genexpressie. Terwijl qPCR specifiek voor gen expressie niveaus op het transcriptional niveau test, detecteert westelijke bevlekken de definitieve niveaus van eiwitproducten die vermoedelijk beschikbaar zijn voor hun cellulaire taken uitvoeren. Het gebruik van beide analysetechnieken in combinatie is een krachtige aanpak voor het bepalen van het effect van TNFα behandeling over de regulering van gen expressie niveaus alsmede wat betreft bepalen als veranderingen in de expressie een gevolg van transcriptionele zijn, post-transcriptional, of posttranslationele verordening. Inflammatoire stress invloed kan trofoblast gedrag, morfologie en syncytialization. Met inbegrip van morfologische evaluaties (d.w.z. immunocytochemie) naast moleculaire analytische benaderingen krijgt een meer uitgebreide analyse van de gevolgen van TNFα blootstelling op de gezondheid van de trofoblast. Aanpassing van de TNFα concentraties geteste en "downstream" tests volgens experimentele eisen is aan te raden.

Door de uitvoering van het protocol die hier worden beschreven, zijn de TNFα-gemedieerde ontsteking komt tot upregulate Rubicon expressie in menselijke trophoblasts van mager zwangerschappen met vrouwelijke foetussen. Westelijke bevlekken voor Rubicon in trofoblast lysates bleek twee verschillende bands in de buurt van en boven de verwachte molecuulgewicht van 140 kDa (figuur 4A). Er is bewijs om te suggereren dat de onderste band aspecifieke (PD047 anti-Rubicon pAb, MBL informatieblad, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). De trophoblasts van vrouwen de capaciteit aangetoond om te upregulate de expressie van Rubicon in reactie op TNFα behandeling van concentraties tot 250 pg/mL. Bij concentraties hoger dan deze, Rubicon expressie niveaus daalde terug naar basislijn (onbehandeld controlegewas) en zelfs hieronder (figuur 4B, n = 3). Gezien het feit dat behandeling van trophoblasts van mager zwangerschappen met TNFα ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving simuleert, is dit resultaat een aanvulling op de bevinding dat Rubicon is aanzienlijk upregulated in flash-bevroren villous weefsel biopten uit placentas van zwaarlijvige zwangerschappen met vrouwelijke foetussen in vergelijking met mager besturingselementen (figuur 4C en D, ANOVA, n = 6 per BMI klasse, P < 0,05).

Terwijl autophagic flux niet lijkt te verschillen in trophoblasts van zwaarlijvige zwangerschappen met vrouwelijke foetussen in vergelijking met mager besturingselementen, vertonen trophoblasts van zwaarlijvige zwangerschappen met mannelijke foetussen activering van vorming en accumulatie van autophagosomes 13. Rubicon is een negatieve regulator van autophagy, waar het fungeert autophagosome-lysosoom fusion27halt toe te roepen. Vrouwelijke trophoblasts kunnen upregulate de uitdrukking van Rubicon als een compenserende of beschermende mechanisme tegen TNFα-gemedieerde ontsteking, die autophagy22 activeren kan, toestaand hen om lean-achtige autophagic flux in het kader van maternale obesitas. Deze reactie in de placenta kan een rol spelen in hoe vrouwelijke foetussen fare beter dan mannetjes in de zwaarlijvige uteriene omgeving. Modelleren van de inflammatoire milieu moeders obesitas ex vivo door behandeling van primaire menselijke trophoblasts met TNFα gekoppeld biedt een platform voor het bestuderen van de effecten van de zwaarlijvige uteriene milieu over de regulering van de kritische trajecten in trophoblasts. Tot wijziging van dit protocol met nieuwe en combinatorische behandelingen gericht Recapitulerend het zwaarlijvige moeder milieu zorgt voor een spannende Laan om te bestuderen van de effecten van maternale obesitas op de functie van de placenta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken vrouwen die gedoneerd hun placentas voor dit onderzoek. Wij danken ook de arbeid en de afdeling van de levering bij OHSU en de moeders en foetale onderzoeksteam voor de coördinatie van de verzameling van placentas. Wij zijn dankbaar Eric Wang, Ph.D., en Kelly Kuo, MD voor ondersteuning en helpen met experimentele methoden en optimalisatie.

Dit werk werd gefinancierd door de NIH HD076259A (AM) en AHA GRNT29960007 (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X HBSS Gibco 14185-052
CaCl2 (anhyd.) Sigma-Aldrich C1016-100G
MgSO4 (anhyd.) Sigma-Aldrich M7506-500G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
Trypsin Gibco 15090-046
DNAse Worthington Biochemical Corp. LS002139
Protease/Phosphatase inhibitors Thermofisher Scientific 88668
Tris HCl Invitrogen 15506-017
EDTA Invitrogen 15576-028
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
SDS Fisher Scientific BP166-600
Sodium deoxycholate. Fisher Scientific AAJ6228822
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) Gibco 12440-046
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Neonatal Calf Serum (NCS) Gibco 26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
10% Formalin Fisher Scientific 23-427-098
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
TNFα Sigma-Aldrich SRP3177-50UG
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 70013-032
K2EDTA vacutainer blood collection tubes BD 366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM) GE Healthcare 17-0891-01
6 well plates Corning 353046
Cell strainers Fisher Scientific 22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural Fisher Scientific 22363352
Trypan Blue Corning 25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad 1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad 1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber Bio-Rad 1654112
4X Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-100ML
Glycine Bio-Rad 1610718
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ML
Instant Nonfat Dry Milk Carnation
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb Cell Signalling Technology 8465S
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich A2228-100UL
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7074S
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

Tags

Geneeskunde kwestie 127 menselijke placenta maternale obesitas ontsteking Tumornecrosefactor alfa (TNFα) villous weefsel trophoblasts primaire celculturen westelijke vlek autophagy Rubicon seksueel dimorfisme
Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A … More

Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta. J. Vis. Exp. (127), e56484, doi:10.3791/56484 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter