Summary
Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.
Abstract
Anne obezite, kısmen, autophagy bozukluk bağlanabilir güvenliği aşılan plasental işlevi tarafından büyük olasılıkla aracılı olumsuz perinatal sonuçlar riski ile ilişkilidir. Plasenta obez gebelik üzerinden autophagy düzenleyiciler ifadesi anormal değişiklikleri obezite ve gebelik ile ilgili inflamatuar işlemler tarafından düzenlenmiş olabilir. Burada açıklanan örnekleme villous doku ve dönem insan plasenta birincil hücre kültürü için gelen villous cytotrophoblasts yalıtım için bir protokoldür. Bu tümör nekrozis faktör alfa (TNFα), obezite ve içinde yüksek bir proinflamatuar sitokin ile yalın gebelik gelen birincil trophoblasts tedavisi ile obez intrauterin ortam inflamatuar ortamda simülasyonu için bir yöntem izliyor gebelik. Burada açıklanan protokol uygulanması, bu maruz kalma eksojen bulunursa TNFα düzenleyen Rubicon, autophagy, trophoblasts kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile yalın gebelik gelen olumsuz bir regülatör ifadesidir. Biyolojik faktörleri obez intrauterin ortamında çeşitli korumak trophoblasts kritik yollar modüle potansiyeline, bu ex vivo sistem vivo içinde gözlenen ifade desenleri belirlemek için özellikle yararlı iken insan plasenta anne obezite ile TNFα sinyal doğrudan bir sonucu vardır. Sonuçta, bu yaklaşım dışarı autophagy ve etki potansiyeline sahip trophoblasts diğer kritik hücresel yollar anne obezite ile ilişkili iltihap düzenleyici ve moleküler etkileri ayrıştırmak için fırsat tanıyor plasental fonksiyon.
Introduction
Obezite, aşırı yağ dokusu ve besin kullanılabilirlik kaynaklanan kronik düşük dereceli inflamasyonu ile karakterize enflamatuar bir durumdur. Obezite, proinflamatuar sitokinler metabolik doku yanı sıra sistemik dolaşıma yüksek. Kanıt sağlam bir gövdesi TNFα önemli ölçüde obezite ayarında kaygıları ile insülin direnci ve metabolik fonksiyon bozukluğu1yükselmiş olduğunu göstermiştir. TNFα aktivasyonu da kanser ve otoimmünite, yapım o bir çekici terapötik hedef2gibi koşulları hastalık patogenezinde katkıda bulunur.
Obezite iltihap gebelik, bir proinflamatuar devlet43,aynı zamanda tarafından bileşik olduğunu. Daha önce plasental TNFα içeriği gebelik kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile anne obezite ile artar gösterilmiştir. Ayrıca, TNFα tedavi kadın ama değil erkek Trofoblast hücrelerde mitokondrial solunum TNFα cinsel dimorfik şekilde5plasental metabolizmasında düzenlenmesinde ilgilenmektedir düşündüren engeller. Anne obezite distres, erkek fetusa en duyarlı3,6,7,8 olmak dahil gebelikte komplikasyon çeşitli artan insidansı ile ilişkilidir . Maternal-fetal arayüzü anahtar rolü nedeniyle, plasenta inflamatuar sinyal karşılık obez intrauterin ortamda fonksiyonel kapasite değişimler obez gebelik sonuçlarını arabuluculuk önemli bir rol oynayabilir.
Cytotrophoblasts ve syncytiotrophoblasts plasenta villous doku endokrin sinyal ve anne ve gelişmekte olan fetus9arasındaki besin ve oksijen alışverişi için önemlidir. Fonksiyonel kapasite aksamalar villous cytotrophoblasts (bundan sonra trophoblasts anılacaktır), fetal sağlık ve gelişme tehlikeye. Bu iletişim kuralı uzak chorionic ve Bazal plakayı trophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım için en iyi duruma getirilmiş bir prosedür ile birlikte anatomi tarafından villous insan terim plasenta dokudan örnekleme için bir yöntem açıklar. Bu iletişim kuralı kurulan yöntemleri Enzimatik sindirim trophoblasts10, izole etmek için farklı yoğunluk Santrifüjü tarafından takip hücre dışı matriks hücrelerinden serbest bırakmak için villous doku içeren türetilir 11,12. Yalın gebeliklerde plasenta gelen birincil trophoblasts kültür TNFα ile inflamatuar ortamın bir bileşeni benzetimini yapmak için desteklenen medya ile kabul edilir bir yaklaşım anne obezite ile ilişkili olan bu protokolü ayrıntıları. Son olarak, toplam hücresini lysates TNFα tedavi trophoblasts gen ifadesinde değişiklikleri algılamak için kurutma Western ardından gelen hasat için basit bir yordam açıklanır.
Bu model obesogenic rahim içinde çevre bütünüyle özetlemek değil iken, bir bireysel katkı TNFα aracılı inflamasyon trophoblasts yanıt olarak dışarı ayrıştırmak veren kontrollü bir sistem sağlar Anne obezite. Bu model keşfetmek veya moleküler hedefler doğrudan TNFα trophoblasts içinde sinyal tarafından düzenlenir onaylamak için hem fırsat tanıyor hem de bir gen ifade şekillerindeki değişiklikleri vivo içinde plasenta anne ile içinde gözlenen Eğer test etmek izin verir Obezite TNFα aracılı inflamasyon sonucu olabilir.
Burada açıklanan yaklaşım TNFα aracılı inflamasyon etkisi autophagy düzenlenmesinde insan trophoblasts test etmek için kullanılmıştır. Erkek fetusa sergi ile obez gebelik trophoblasts alt üst autophagic ciro veya autophagosome olgunlaşma13. Organellerin ve geç endosomes için yerelleştirilmiş, çünkü o bir negatif görev son zamanlarda bir "fren" autophagic ciro işlemi tarif edilmiştir (Çalıştır etki alanını, protein Beclin1 etkileşim ve sistein-zengin içeren), Rubicon adlı bir protein Regülatör autophagosome olgunlaşma14,15. Aslında, Rubicon bu değerli terapötik hedef yapıyor autophagy kısıtlayan bir protein nadir bir örnektir. Rubicon, patofizyolojik önemi mikroplara16,17 ve cardiomyocyte koruma18doğuştan gelen bağışıklık yanıtındaki rolleri dışında hakkında çok az bilgi mevcuttur. Burada açıklanan protokolü kullanarak, Rubicon TNFα konsantrasyonları 250 pg/mL kadar artan ile tedaviye yanıt kadın birincil trophoblasts upregulated's bulunur. Gebelik erkeklerde daha iyi Rubicon düzenlenmesi bir rol nasıl kadın fetusa fare anne obezite ile oynayabilir. Eksojen TNFα için insan trophoblasts açarak anne obezite ex vivo ile ilişkili iltihap recapitulating obez intrauterin ortam üzerinde kritik yollar düzenlemenin etkisi çalışma için bir platform sağlar trophoblasts ve dolayısıyla, plasental fonksiyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
placentae toplanan emek ve teslim birimi Üniversitesi Hastanesi ile aydınlatılmış onam kurumsal inceleme Oregon sağlık ve bilim Üniversitesi Portland, Oregon'da tarafından onaylanmış bir protokol altında hasta.
1. koleksiyonun plasental doku
- hazırlık
Not: doku karşılaştığı tüm ekipman steril olmalıdır.- 60 dk 121, ısıyla tarafından parçalanmış ekipman sterilize ° C.
- Kişisel koruyucu ekipman (PPE) Kullanım: laboratuvar mont/önlük/önlük, eldiven ve maske yüz kalkan ya da gözlük ile.
- Su banyosu ve 37 kümesine açmak ° C.
- İki 50 mL konik tüp, komple bir medya içeren her 25 mL sıcak (Iscove ' modifiye Dulbecco s ' s %10 FBS ve % 1 ile desteklenmiş orta penisilin/streptomisin, Tablo 3) 37 ° C su banyosunda.
- Bilinçli hasta rızası ile bir şey yok hemen teslim sezaryenle ardından elde.
- Plasenta ile hakkında bilgi sahibi olun. Göbek kordonu fetal yan (koryonik plaka) eklenir ve kan damarları göbek kordonu ekleme sitesinden yayılan görülebilir. Maternal yan veya Bazal plaka ters tarafındadır. Decidua ve cotyledons adı verilen gemi ağaçları içeren yapılarını içerir.
- Villous doku örnekleme
Not: Villous doku üzerinden en kısa zamanda teslim, tercihen 30 dakika veya daha kısa sürede takip plasenta örneklenmiş.- Koryonik plaka ile 2-3 tam-kalınlık bölümler (yaklaşık 2.5 cm x 2,5 cm boyutunda) tüketim yukarı, bakacak plasenta rastgele, kullanma forseps ve makas ( şekil 1A) çevre içinde 2-3 cm.
Not: anormal (yani beyaz kireçlenmeler) görünür plasenta parçaları kaçının. - Uzakta chorionic ve Bazal plakaları ve herhangi bir büyük kan damarları trim.
- Elde edilen villous doku ( şekil 1B, yaklaşık 80-120 g toplam) sıcak tam medyada yer ve Trofoblast yalıtım örnekleme 30 dk içinde başlar.
Not: Bazı aşağı akım deneyleri ve uygulamaları teslim, örnekleme ve Trofoblast yalıtım arasındaki gecikme süresinin uzunluğu etkilenir. Bu süreler kısa olarak mümkün ve izolasyonların arasında tutarlı olarak tutmak en iyisidir. - Adımları 1.2.1 - 1.2.2, açıklanan teknikleri kullanarak örnek 5 rastgele 1 cm x 1 cm çapında villous dokudan bölümlerini (merkezi dahil olmak üzere) plasenta.
- 4-5 daha küçük parçalara (yaklaşık 30 mg her), her 1 cm x 1 cm villous doku örneği 2 mL microcentrifuge tüplerde yerleştirin ve flash kesme sıvı N 2 ' dondur. -80 ° c kullanmak daha sonraki analizler için mağaza.
- Koryonik plaka ile 2-3 tam-kalınlık bölümler (yaklaşık 2.5 cm x 2,5 cm boyutunda) tüketim yukarı, bakacak plasenta rastgele, kullanma forseps ve makas ( şekil 1A) çevre içinde 2-3 cm.
2. Trophoblasts Villous dokusundan izolasyon
- hazırlık
Not: steril ekipman kullanımı ve laminar akış başlıklı hücreleri içeren yordamları gerçekleştirin.- Tezcan dört dondurulmuş yoğunluk gradyanlar (Tablo 1, tablo temel malzemeleri, reaktifler ve donanımları, takıma giren malzeme bkz:) 4 ° C'de plasenta gelmeden önce gece.
Not: Alternatif olarak, yoğunluk gradyanlar yalıtım gününde yapılabilir. - Dönüş santrifüj ve set 20 ° C.
Not: Tüm Santrifüjü maksimum hızlanma ve yavaşlama aksi belirtilmedikçe adımlardır. - Hazırla 1 Ca + 2 ve Mg + 2 (Tablo 3) ile desteklenmiş HEPES tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) x.
- Sıcak tripsin 37 ° c
- Seyreltik Dnaz yaklaşık 2720 kilounits/ml steril olarak takıma HBSS.
- Yeni doğan buzağı Serum (NCS) ile 37 ° c sıcak 50 mL
- Sıcak komple medya 37 ° c
- Sıcak dondurma medya (% 90 FBS, % 10 DMSO, Tablo 3) 37 ° c
Uyarı: DMSO toksik ve eldiven ile ele alınması gerekir.
308 mL karıştırma tarafından - hazırla sindirim arabellek (Tablo 2 ve 3) takıma HBSS, tripsin 50 mL (3751.7 BAEE adet/mL) ve Dnaz 0.5 mL (379.4 kilounits/mL) bir steril şişe.
Not: villous doku hücreleri izole etmek için gereken yaklaşık 7 h. zamanı
- Tezcan dört dondurulmuş yoğunluk gradyanlar (Tablo 1, tablo temel malzemeleri, reaktifler ve donanımları, takıma giren malzeme bkz:) 4 ° C'de plasenta gelmeden önce gece.
- Villous doku işleme
- villous doku 50 mL konik tüp içinde her parça dolu oda sıcaklığında fosfat ile durulama tamponlu tuz (PBS). Tekrarlayın ve aşırı kan kaldırılana kadar PBS gerektiği gibi yerine (PBS durulama ışık kırmızı ya da pembe doku iyice durulanır zaman olacaktır).
- Villous doku içinde steril Petri kabına yerleştirin ve nazikçe kazıma tarafından mümkün olduğunca çok sayıda kan damarları mikroskop slayt kullanarak damarları villous yumuşak dokudan kapalı şekilde kaldırın.
- İnce makas kullanarak elde edilen villous doku kıyma.
- Villous doku sindirim ve ham Trophoblasts yalıtım
- kıyılmış villous doku sindirim çözüm tripsin belirli faaliyete göre hesaplanan birimleri göre steril bir şişeyle Transfer ve Dnaz (165 mL, Tablo 2).
- Sonra 35 dk, kuluçka (rpm), dakikada 70 devrimler, sallayarak ile 37 ° C su banyosu içinde kendi tarafında sindirim şişe eğilme ve şişenin dibinde yerleşmek için doku sindirilmemiş parçaları izin. Dikkatlice yukarı süpernatant kapatılan doku kaçınarak bir serolojik pipet ile çizin.
- Dağıtmak süpernatant 50 mL konik borular arasında eşit olarak 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla.
Not: zaman kazanmak için bu ikinci başlamak için tavsiye edilir kalan için sindirim çözüm (110 mL, tablo 2) ekleyerek sindirim yerleşmiş doku ve kuluçka 2.3.2 adımda anlatıldığı gibi devam ettirme. - Yavaşça yavaşça serolojik pipet tüp alt üzerinden dağıtımı tarafından NCS 3-5 mL gergin süpernatant altında katman. Bir Menisküs (trophoblasts içeren) gergin süpernatant ve NCS arasında-meli var olmak görülebilir ( şekil 2A).
- Supernatants üzerinde NCS 1,250 x g 20 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi Elde edilen Pelet kırmızı kan hücreleri Trofoblast hücreleri ( şekil 2B) içeren beyaz bir katman tarafından takip en alt tabakasında yer alacak.
- Adımları 2.3.2 - 2.3.5 her biri (110 mL ve 83,5 m, sırasıyla, doku, Tablo 2 şişe sindirim çözüm ekleme) ikinci ve üçüncü kesimi için de yineleyin.
- Bütün supernatants centrifuged sonra her Pelet 5 mL sıcak komple medya resuspend ve süspansiyonlar birlikte havuz.
- Hücre süspansiyon iki 50 mL konik boru ve 1,250 x g, santrifüj 20 15 dakika arasında eşit olarak bölünmüş ° C.
- Yavaşça süpernatant kaldırmak ve her hücre pellet 6 mL sıcak compl resuspendete medya.
- Yoğunluğu Santrifüjü
- hücre süspansiyon yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon yoğunluk gradyanlar ile transfer damlalıklı üst katman tarafından eşit dört yoğunluk gradyanlar (3 mL her) arasında bölmek.
- Yoğunluk gradyanlar 1,250 x g için en az hızlanma ve yavaşlama ile 20 ° C'de 20 dk, santrifüj kapasitesi. Bu posalı hücre (Tablo 4) ayırt bantları üretmek gerekir.
- Trofoblast hücreleri (arasında 35-%50 DGM) içeren opak band(s) (Tablo 4) ulaşılana kadar yavaş ve dikkatli yoğunluk gradient medya (DGM) üst katmanları kaldırma.
- Trofoblast bantları 2 50 mL konik tüp aktarmak ve doldurmak tam sıcak ortamıyla.
- Yavaşça tüpler 3 - tersine çevirin 6 kez karıştırmak ve 1,250 x g 20 15 dakika, santrifüj kapasitesi ° C.
- Süpernatant kaldırmak ve her hücre Pelet 5 mL sıcak komple medya resuspend. Hücre süspansiyonlar birleştirmek ve bir hemasitometre ve Trypan mavi kullanarak hücrelerin saymak (veya tercih edilen hücre yöntemi sayma).
- Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak
- yukarı ve aşağı serolojik damlalıklı ile pipetting veya tüp birkaç kez yavaşça ters çevirme hücre süspansiyon Mix.
- Hücre süspansiyon ve Trypan mavi (yani 20 µL her) eşit parçaya ayrı tüp içinde birleştirmek ve karışımı yavaşça.
- 1-2 dakika oda sıcaklığında Incubate.
- Yavaşça hücre Trypan 15-20 µL dağıtmak mavi karışımı coverslip ve hemasitometre arasında ve hücreleri kılcal eylem tarafından ızgara üzerinde yaygın izin.
- (Ölü hücreleri derin mavi lekeli) hücrelerin her birinde dört 4 x 4 çeyrek dairelerin bir sayım sayacı ile saymak. Hücre birden çok kez sayılmaz emin olmak için sayma sistemi istihdam (yani alt ve sol engelsiz dokunma hücre sayılmaz).
Not: Her 4 x 4 çeyreği 50-150 hücreler arasında yer almalıdır. Çok az veya çok fazla sayıda hücre üzerinde veya hücre sayının küçümseme yol açabilir. - Toplam hücresini sayar 4 x 4 çeyrek dairelerin herbiri ortalama 10 tarafından çarpın 4 ve mL başına hücre sayısını hesaplamak için seyreltme faktörü (Trypan mavi hücre süspansiyon) çarpın.
- Çarpma mL başına hücre sayısı toplam hücre verim hesaplamak için hücre süspansiyon toplam hacimce.
Not: 80-120 g villous doku ile başlayan izolasyonların üzerinden yaklaşık 100 milyon hücre bekleniyor.
- Kaplama hücre
- 6-şey plaka (2 mL süspansiyon iyi başına) 3 milyon hücre/iyi (3.3 cm 2 başına 10 5 hücre x) plaka ve yavaşça ileri geri sallamak ve yan tarafa hücreleri olarak dağıtabilmenizi.
Not: Trophoblasts doku kültürü tedavi tabakları düzgün bağlı kalmak için gereklidir. Bir monolayer hücre syncytialization teşvik için gereklidir. - Hücreler eşit olarak dağıtmak, yerleşmek ve kuluçka makinesine koymadan önce kuyu dibine uymaları başlamak izin vermek yaklaşık 30 dk laminar akış başlıklı kaplama hücre bıraktığınızdan.
- Kültür hücreleri en fazla 72 saat (günlük ortam değişiklikleri) içeren % 5 CO 2 ve % 95 nem ile 37 ° C kuluçka için.
Not: trophoblasts 10-20 x 24 her y kültürünün bir mikroskop altında incelemek. Trophoblasts değil çoğalırlar ve passaged olamaz. Kültür 72 saat boyunca, bir syncytium ( şekil 3A ve B) oluşturmak için yuvarlak bireysel trophoblasts sigorta.
- 6-şey plaka (2 mL süspansiyon iyi başına) 3 milyon hücre/iyi (3.3 cm 2 başına 10 5 hücre x) plaka ve yavaşça ileri geri sallamak ve yan tarafa hücreleri olarak dağıtabilmenizi.
- Buz gibi hücreleri
- Santrifüjü 1,250 x g 20 10 dk de tarafından kullanılmayan hücreleri cips ° C.
- Kadar medya Pelet üzerinden mümkün olduğunca Aspire edin.
- Medya (Tablo 3) dondurma Pelet resuspend.
- Aliquots % 100 isopropanol ile dolu dondurucu bir kap içinde-80 ° C'de dondurmak. Donmuş aliquots uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı N 2 ' ye naklet.
Not: Hücreleri donma sonra kültürlü.
- Çözdürme hücreleri
- bir aliquot donmuş hücre kaldırmak ve çözülme bir 37 ° C su banyosunda dönen iken. Sadece o tam bir sıvı çözdürülen önce aliquot su banyosundan kaldırın.
- 15 ml konik tüp çözdürülen hücreleri hemen aktarın. İlk başta, yavaş başlayan 10 mL aralıklı karıştırma ile komple medya ekleyin.
- Ters tüp birkaç kez karıştırmak için.
- Santrifüj 200 x g 20 ° C'de 10 dk de
- Süpernatant Aspire edin ve Pelet 2-5 mL sıcak komple medya resuspend.
- Hücreleri ve daha önce açıklandığı gibi plaka sayısı.
3. TNFα, hücre Lysates koleksiyon ve Western Blot birincil Trophoblasts tedavisinde
- hazırlık
- sıcak komple medya 37 ° c
- TNFα 10 µg/mL stokunun tam medya ve store-20 ° c kadar kullanım için hazır olun.
- 1 µg/mL TNFα çalışma stokunun tam medyada hazır olduğunuzda hücreleri tedavi etmek yapmak. Seri seyreltik TNFα çalışma stok 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL ve komple medya 125 pg/mL.
Not: 10 4 pg/mL TNFα konsantrasyonu orta sitotoksik olduğunu. Test TNFα konsantrasyonları düzeltilmesi istenilen aşağı akım uygulamaları özelliklerini temel bağlı olacaktır.
- TNFα hücrelerle tedavi
- kültür 24 saat sonra hücreler kültür ortamından Aspire edin ve eski yerine koymak ile TNFα 2 mL takıma iyi 6-şey plakaları (en az iki kuyu başına tedavi ve araç başına kitle iletişim araçları Denetim).
- Sonra TNFα-pozlama (48 h kültür), s 24 yerine takıma TNFα kitle iletişim araçları ile komple medya.
- Hücre hasat ve toplam Protein
- 72 h kültür (24 TNFα kaldırılması s) sonra Aspire medya, yavaşça oda sıcaklığında PBS hücrelerle durulayın ve buz soğuk Radioimmunoprecipitation tahlil 80 µL Ekle Taze içeren arabellek (RIPA) eklendi fosfataz ve proteaz inhibitörleri (Tablo 3) doğrudan her şey.
- Hücre hücre sıyırıcı plaka kaldırma. Hücreleri tedavi grupları içinde wells havuzu bir 1.5 mL microcentrifuge tüp transfer.
- Hücreleri vortexing tarafından yüksek tüpler 15 en az üç aralıkları için koşullar s.
- 4 ° C'de 15 dakika için sallanan ile hücreleri kuluçkaya
Not: Alternatif olarak, sonra adım 3.3.3., hücreleri aralıklı ajitasyon ile 15 dakika buzda tüp, vortexing, veya yukarı pipetting ve flicking inkübewn. - Tekrarlama adım 3.3.3.
- 4 ° C'de hücresel enkaz cips için 5 min için 10.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi.
- Yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp ve-80 mağazasında süpernatant (içeren hücresel protein) transfer ° C.
Not: Protokol burada durdu ve daha sonra yeniden başladı. Hücresel protein örneklerinin birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek için birkaç aliquots tavsiye yapmaktır. - Bicinchoninic asit tahlil gibi tercih edilen bir yöntem tarafından toplam protein konsantrasyonu belirlemek (BCA, temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın).
- SDS-sayfa ve Western Blot Rubicon veya faiz Protein için
Not: üretici göre protokolleri kurutma Western izleyin ' tercih edilen laboratuvar sistemi kullanarak s yönergeleri.- Yük örnek arabelleği iyi bir % 12 Akrilamid (Tablo 3) toplam protein 20-40 µg arasında jel. Ayrı proteinler SDS-sayfa tarafından tampon (Tablo 3) çalıştıran.
- Islak-Devret jel gelen proteinler için üretici göre polivinilidin difluoride (PVDF) membran ' s yönergeleri aktarma arabelleği (Tablo 3).
- % 0,1 ile % 5 süt tozu Tris-Buffered serum fizyolojik içinde membran kuluçkaya sallanan ile oda sıcaklığında en az 1 h için ara 20 (TBST, Tablo 3).
- Bir Rubicon birincil antikor membran kuluçkaya (temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın), gecede 4 ° C'de sallanan ile TBST içinde % 1 süt tozu 1:500.
- Yavaşça membran 3 x 5 dk TBST ve 1 x 5 dk sallanan ile oda sıcaklığında TBS içinde yıkayın.
- 1:2000 - 1: 5000 ikincil antikor membran kuluçkaya (HRP bağlı veya tercih edilen görünür eşlenik, temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın) %5 süttozu TBST içinde en az 1 h ile oda sıcaklığında içinde Rock.
- Adım 3.4.5 özetlenen çamaşır yordamı yineleyin ve leke uygun görselleştirme (yani chemiluminescent) substrat bir görüntüleme sistemi ile birlikte görselleştirmek.
- Adım 3.4.5 özetlenen çamaşır yordamı yineleyin ve membran β-aktin veya üretici göre bir tercih edilen yükleme denetimi için yoklama ' s yönergeleri.
- Tercih edilen görüntü analiz yazılımı üzerinde ifade analiz Absorbans (grup yoğunluklarda) el ile miktar tarafından Rubicon çıkarma arka plan Absorbans ve normalleştirme karşılık gelen yükleme kontrol grubu yoğunluklarda. Protein düzeyleri istatistiksel olarak önemli değişiklikleri sınamak uygun istatistiksel analizleri gerçekleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dönem üzerinden yalın insan plasenta (önceden hamilelik vücut kitle indeksi (VKİ) < 25) anneler komplikasyonsuz gebelik kadın çoluk çocuk taşıyan ile toplanmış ve 15 dakika içinde teslimat sezaryenle (emek) örneklenmiş. Plasenta kireçlenmeler ve tipik geliştirme olmaması için muayene: kaldırıldı membranlar arasında göbek kordonu ile 300-600 g ağırlığında, Şekil 15-25 cm çapında ve göbek kordonu ortasına takılı arasında yuvarlak Plasenta. Villous doku yaklaşık 100 g için birincil Trofoblast yalıtım malzemesi başlangıç olarak villous doku verimli Bazal ve koryonik plakalar arasında plasenta (şekil 1), 2-3 örneklerdeki uzak disseke. Villous doku örnekleme 20 dakika içinde anlatıldığı gibi birincil trophoblasts yalıtmak için yordamı başlatıldı burada, verimli arasında 0,8 - 1 x 108 hücrelerin. Hücreleri 6-şey kültür plakaları 3 x 106 (3.3 cm2başına 105 hücre x) yoğunluğu, seribaşı. Sonra 24 h kültür hücreleri eki için mikroskop altında incelenmiş ve uygun Trofoblast Morfoloji (hücreler yuvarlak bireysel) onaylandı. Kültür medya en az iki kuyu başına konsantrasyon ve araç kontrolü (yalnızca tam medya) dahil edildi TNFα konsantrasyonları 125-104 pg/mL arasında bir dizi içeren komple bir medya ile değiştirildi.
Yirmidört saat TNFα-tedavi (kültür 48 h) aşağıdaki tüm TNFα kitle iletişim araçları ile komple medya değiştirildi. Hiçbir kayda değer hücre ölümü veya altında 103 pg/mL konsantrasyonlarda TNFα ile tedavi nedeniyle gözlendi. 104 pg/mL TNFα ile tedavi orta sitotoksik ve bu TNFα konsantrasyon sitotoksik etkileri medya laktat dehidrogenaz (karaciğer) deneyleri (veri gösterilmez) tarafından kanıtlanan değiştirildi sonra kalıcı değil. Kültür 72 h hücreleri için syncytialization mikroskop altında incelenmiş. Immunocytochemistry syncytialization ve fibroblast kirlenme için trophoblasts (şekil 3) nispeten saf yalıtım saptandı. Hücresel lysates 3-8 µg/µL BCA tahlil (veri gösterilmez) tarafından belirlenen hazırlık başına toplam protein arasında verimli burada, açıklanan protokolüne göre hasat edildi. Western blot hücre lysates kadın trophoblasts bir upregulation Rubicon ifade TNFα 250 pg/mL kadar konsantrasyonları ve sonraki downregülasyon Rubicon ifade TNFα konsantrasyonlarda karşısında büyük gösterdi TNFα ile tedavi dan analizde 250 pg/mL (şekil 4A ve B, 104 pg/mL üzerindeki sitotoksik etkileri dayalı analiz dışında). Aynı şekilde, Rubicon önemli ölçüde villous doku flaş donmuş biyopsi Western blot analizi ile kanıtladığı gibi yalın kontrollere göre kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile obez gebeliklerde plasenta üzerinden upregulated (şekil 4 c ve D, n = 6 Plasenta BMI başına sınıf, ANOVA, P < 0,05).
| Konsantrasyonu (%) | % 90 DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Katman kalınlığı (ml) |
| 4 x gradyan | 4 x gradyan | Toplam 34,5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4,67 | 3 |
| 50 | 3,34 | 2,67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13.5 ml işareti) |
| 40 | 5,33 | 6,67 | 3 |
| 35 | 4,67 | 7.33 | 3 (19,5 ml işareti) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2,67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
Tablo 1. Yoğunluk gradyanlar birincil Trophoblasts yoğunluğu Santrifüjü için yapmak için özellikleri.
Soldan sağa, sütun bir yoğunluk gradient ortamı belirtir (DGM, temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın) DGM HBSS içinde yüzde olarak ifade edilen konsantrasyon. Sütun iki sütun üç DGM çözüm uygun yüzdesi yapmak için gerekli HBSS hacmi belirtir DGM hacmi belirtir. Sütun dört en yoğun tabaka ile başlayan degrade oluşturmak için 50 mL konik tüp eklenecek birimin belirtir.
| Tripsin | HBSS | Dnaz | ||
| Sindirim | (Toplam faaliyet; BAEE adet) | hacmi (ml) | (Toplam faaliyet; Kunits) | Toplam hacim /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 ml) | 141.76 ml | 62594 (0,230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15,34 ml) | 94.51 ml | 41729 (0.154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11.65 ml) | 71.74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83,5 ml |
| Toplam | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0.5 ml) | 358.5 ml |
Tablo 2. Dnaz ve tripsin belirli faaliyete göre birincil Trofoblast yalıtım sindirim çözüm hazırlanması için özellikleri.
Soldan sağa, ilk sütun sindirim sayısını belirtir, ikinci sütun sindirim için gerekli tripsin etkinliği belirtir, üçüncü sütun uygun sindirim için eklenecek ilave HBSS hacmi belirtir Dördüncü sütun sindirim için gerekli Dnaz etkinlik ve sindirim çözüm olmak hacmi son sütun belirtirplasental dokuya uygun sindirim için eklendi.
| HBSS (Ca+ 2 ve Mg+ 2ile birlikte) | Örnek arabellek |
| %10 10 x HBSS | %90 4 X Laemmli boya |
| 1.26 mM CaCl2 (anhyd.) | %10 2-Mercaptoethanol |
| 0.80 mM MgSO4 (anhyd.) | |
| 20.77 mM HEPES | |
| pH 7.4 10N NaOH ile için Birim 1 L steril ddH2O ile yapmak Steril filtre bir steril şişe içine |
|
| Medya tamamlandı | Çalışan arabellek |
| % 11 v/v IMDM Kaldır | 25 mM Tris Bankası |
| % 10 v/v FBS Ekle | 190 mM glisin |
| %1 eklemek 10.000 U/mL penisilin/streptomisin (100 U/mL final) | %0.1 SDS |
| 8.3 için pH | |
| Ortam buz gibi | |
| % 90 v/v FBS | Aktarma arabelleği |
| % 10 v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190 mM glisin | |
| Sindirim arabellek | % 20 metanol |
| 50 mL tripsin (26,900 BAEE adet/mL) | 8.3 için pH |
| 0.5 mL Dnaz (272,000 K adet/mL) | |
| 358.5 ml ilave HBSS getirmek | TBS |
| 20 mM Tris | |
| RIPA arabellek | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH 7,6 için |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| %0.1 SDS | TBS ile % 0,1 ara 20 |
| %0.5 sodyum deoxycholate | |
| % 1 Triton X-100 | |
| proteaz/fosfataz inhibitörü 10 ml başına 1 tablet RIPA tampon |
Tablo 3. Yalıtım için gerekli çözüm ve kültür, birincil Western Blot tarafından takip Trophoblasts.
| % DGM | ml işareti | Hücre tipi |
| 10 | 31,5-34.5 | Enkaz |
| 20 | 28.5-31.5 | |
| 30 | 22,5-28.5 | |
| 35 | 19,5-22,5 | Trophoblasts |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13,5-16,5 | |
| 50 | 10,5-13,5 | Lenfositler |
| 55 | 7.5-10,5 | |
| 60 | 4.5-7.5 | Kırmızı kan hücreleri |
| 70 | 4.5 |
Tablo 4. Sedimantasyon yoğunluğu Santrifüjü tarafından Trophoblasts.
Soldan sağa, ilk sütun DGM (Tablo 1) yüzdesini belirtir, ikinci sütun mL işareti nerede DGM ilgili yüzde 50 mL konik tüp üzerinde bulunur ve üçüncü sütun, hangi hücre türü çökeller belirtir belirtir DGM ve mL işareti 50 mL konik tüp üzerinde karşılık gelen yüzdesi. Trophoblasts tortu arasında 50-%35 DGM, farklı opak bantları şekillendirme. Bu aralığın altına veya üstüne DGM toplama kirlenme hücresel enkaz ve lenfositler gibi diğer hücre türleri neden olur.
Şekil 1. Villous doku dan izole Korionik ve Bazal levha kaldırarak dönem insan plasenta.
A) yukarı bakacak şekilde koryonik plaka ile (fetal yan), bir tam kalınlıkta örnek plasenta varlığına. B) villous doku örneği chorionic ve Bazal levha kaldırarak elde edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Santrifüjü sindirim çözüm üzerinde yeni doğan buzağı Serum hücrelerinin bir çok katmanlı hücre Pelet sonuçlanır.
A) yeni doğan buzağı serum (NCS) Özet çözüm 50 mL konik tüp içinde hücre süspansiyon altında katmanlı. B) aralıklarla (a) bir çok katmanlı hücre Pelet sonuçlanır. En alttaki katman derin kırmızı renkte ve kırmızı kan hücreleri oluşur. Yukarıdaki katman trophoblasts içerir ve beyaz veya bej renkli. Trofoblast tüp üst sindirim çözüm (süpernatant) tarafından takip NCS katmanıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Syncytialization ve Fibroblast içerik birincil insan Trofoblast kültürlerde Immunocytological analizi.
A) temsilcisi suretinde Cytokeratin-7 (kırmızı) kültürünün 24 saat sonra cytotrophoblasts. B) temsilcisi görüntüde multinucleated kitleler erimiş hücre kültürünün 72 h gösterdikten sonra syncytiotrophoblasts Cytokeratin-7 (kırmızı). C) temsilcisi suretinde Vimentin (kırmızı) kültürünün 72 saat sonra syncytiotrophoblasts. Görüntüleri DAPI (mavi) nükleer counterstain floresan mikroskop elde. 10 X büyütme oranında görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Rubicon ifade Yalın kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile obez gebelik karşı gelen yanıt TNFα-kadın Trophoblasts tedavisinde ve endojen Rubicon ifade Villous doku olarak düzenlenmesi.
Dönem plasenta sağlıklı gebelik kadın bir fetus taşıyan ile yalın anneler üzerinden gelen birincil trophoblasts izole ve tedavi 125, 250, 500, 103ve 104 pg/mL TNFα (veya araç kontrol). A) kadın Trofoblast lysates için Rubicon temsilcisi Western blot tedavi ile TNFα. Β-aktin yükleme denetimi olarak kullanıldı. B) TNFα tedaviye yanıt olarak kadın trophoblasts ifadede Rubicon Batı lekesi sayılabilir ve β-aktin için normalleştirilmiş. TNFα konsantrasyon ± S.E. n başına ortalama Rubicon ifade değerlerdir 3 plasenta =. C) Western bütün doku lysates villous kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile obez gebelik karşı yalın dokudan biyopsiler donmuş Flash için Rubicon lekesi (F1-F12). Laktat dehidrogenaz A (LDHA) bir yükleme denetimi olarak kullanıldı. D) Western ifadede lekesi (C) Rubicon sayılabilir ve LDHA için normalleştirilmiş. BMI sınıflandırma ± S.E. n başına ortalama Rubicon ifade değerlerdir = BMI sınıf başına 6 plasenta (ANOVA, * P < 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plasenta, fetus, büyüme düzenleyen sorumlu obez environment6güvenliği aşılan işlevinde sergiler. Trophoblasts yüksek metabolik talep rağmen plasenta anne obezite ile işlevsiz mitokondrial solunum6,19sergi. Plasental metabolizma değişiklikleri komplikasyonlar ve advers fetal sonuçları obez gebelik3,6,7' gözlenen olaylarının artması için katkıda bulunabilir. Autophagy Ayrıca plasenta içinde anne obezite ile güvenilir değil. Erkek fetus ile obez gebeliklerde plasenta autophagosomes13birikimi kanıtladığı gibi işlevsel olmayan autophagic akı göster. En iyi autophagic akı korumak için hücresel homeostazı önemlidir ve arızalı autophagy plasenta anne obezite ile obez gebelik ile ilgili olumsuz sonuçlar arabuluculuk önemli bir rol oynayabilir.
Güvenliği aşılan plasental fonksiyon anne obezite sergilenen kesin nedenini de anlaşılmadı ve kökenleri inflamatuar sinyal içinde olabilir. Obezite ve gebelik TNFα1,4,20,21dolaşan yüksek düzeyde karakterize proinflamatuar durumlarıdır. TNFα bir aktivatör autophagy22,23ve plasenta obez gebelik üzerinden autophagic akı değişimler aracılık. TNFα yaygın inflamasyon etkisi hücreleri, özellikle kanser2bağlamında incelemek için kullanılır. Burada sunulan Protokolü kültüründe eksojen TNFα ile birincil trophoblasts davranarak plasenta fonksiyonel kapasite iltihap obezite ile ilgili etkileri eğitimi için bu yaklaşım uyum sağlar.
Bu iletişim kuralı dört ana bileşenden oluşur: dan plasenta, villous dokusundan birincil trophoblasts yalıtım villous dokusunun örnekleme birincil trophoblasts kültürünün takip TNFα tedavi ve ardından toplam hücresel lysates topluluğu tarafından Western blot analizi bir protein(s) ilgi ifade ölçmek için. Saf trophoblasts ayırmak için koryonik ve Bazal plakaları iyice plasenta (şekil 1B) örnekleme sırasında uzak villous doku disseke önemlidir. Villous doku (Yani 30 dakika içinde teslimat) zamanında işlenir zorunludur. Bu iletişim kuralı trophoblasts ekstra hücresel matris villous dokusunun serbest bırakmak için üç sindirim adım, kullanımı her kalıcı 35 dakika ayrıntıları. Lengthier sindirim zarar hücreleri hücre yüzey proteinleri trypsinization tarafından riske. Digests artırıldığında uygun trophoblasts son verimi kayda değer artırmaz. Ancak, zaman ve sindirim sayısı azalan azalma hücre verimleri neden olur (Simon, Bucher ve Maloyan, yayınlanmamış veri). Bu iletişim kuralı güvenilir bir şekilde 80-120 gram villous dokusunun yaklaşık 100 milyon hücre üretir.
Yoğunluk gradyanlar izolasyonların arasında gözlenen ayırt Trofoblast bant sayısı değişkenlik vardır. Diğer hücre türleri kirlenmesini önlemek için kesinlikle üzerinde yoğunluk gradient (Tablo 4) trophoblasts içeren band(s) toplamak önemlidir. Burada ayrıntılı iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş nispeten saf trophoblasts ile % 5 daha az verim daha önce kurulan yöntemleri diğer hücre kirlenme10,11,12türleri. Daha fazla arıtma pozitif veya negatif seçim24tarafından elde edilebilir. Ancak, bu yaklaşım uygun trophoblasts verimini azaltarak riski çalışır. Cytokeratin-7 Immunocytochemical analizde birincil trophoblasts 24 72 h kültür zaman karşı hücreleri syncytialization multinucleated hücre kitlelerin varlığı ile kanıtlandığı uygulandı doğruladı sonra burada sunulan yordamı kullanarak izole 72 h, hallmark olay bir Trofoblast (şekil 3A ve B) ömrü içinde. Ayrıca, immunocytochemical analizinde Vimentin birincil trophoblasts için 72 h kültürlü çok az bulaşıcı fibroblastlar (şekil 3 c) ortaya koydu. Rutin amaçlı trophoblasts saflığı kültüründe basit morfolojik değerlendirme tarafından izlenebilir. Kültür zaman 24 h yuvarlak bireysel cytotrophoblasts kültürü hakim. Cytotrophoblasts yuvarlak hücre kümeleri kaynaklanan kültür, 72 h sonra syncytialization tabi. Bu kültürde buldum en yaygın bulaşıcı hücre fibroblast veya sırasıyla daha uzun ve çokgen şeklinde, endotel hücre türüdür. Bu özellikleri kabaca parlak bir mikroskop kullanarak izlenebilir.
TNFα ile birincil trophoblasts tedavi TNFα etkisini ölçmek bir tane trophoblasts kritik yollar düzenlenmesinde sinyal veren kontrollü bir sistem sağlar. Doğal olarak, Trofoblast işlevi oransal için sorumlu olabilir obez anne ortamı içinde vivo TNFα başka faktörler vardır. Bunlar bunlarla hormonal sinyaller, hiperlipidemi ve diğer proinflamatuar faktörler25bir dizi için sınırlı değildir. Farklı tedaviler kombinasyonları daha fazla obez intrauterin ortam ex vivo fizyolojik olarak daha doğru bir şekilde özetlemek. Bu protokol için çok trophoblasts tedavisinde kullanılan eksojen TNFα konsantrasyonları bu genellikle vivo içindedolaşan fazla. Serum konsantrasyonları 20 ng/mL ulaşmak için bildirilen veya belirli inflamatuar koşulları26daha yüksek olmuştur. (Yani Batı kurutma) geçerli laboratuvar yöntemleri tarafından ölçülebilir bir yanıt almak için gen ekspresyonu ve yolları ilgi değişiklikler ortaya çıkarmak için TNFα konsantrasyonları yükseltmek gereklidir. Bu yanıtları vivo içinde daha az bir ölçüde var olabilir. Ancak, onlar yine de önemli ölçüde trophoblasts işlev etkisi. TNFα yüksek konsantrasyonda trophoblasts açığa gen ekspresyonu ve sitotoksik etkileri köklü yolu analizleri eserler üreten riski çalışır. Orta sitotoksisite 104 pg/mL takıma TNFα medya 24 h için karaciğer sitotoksisite deneyleri (veri gösterilmez) tarafından kanıtlanan maruz trophoblasts gözlendi. Ancak, konsantrasyonları veya 103 pg/mL TNFα altında herhangi bir kayda değer hücre ölümü üretmek değildi.
TNFα konsantrasyonları daha küçük aralıklar ve/veya burada açıklanan daha düşük olan test en iyi nicel tarafından izlenmesi gerekenPolimeraz zincir tepkimesi (qPCR) gen ifade analizi, bir teknik için de gen ifadesinde küçük değişiklikleri algılamak için uygun. QPCR özellikle gen ifade düzeyleri transkripsiyon düzeyinde sınar iken, Western Blot muhtemelen onların hücresel görevler gerçekleştirmek kullanılabilir protein ürünleri son düzeyde algılar. Analitik her iki teknikleri birlikte kullanarak ifade düzeylerindeki değişiklikler transkripsiyon bir sonucu olup olmadığını belirleme gelince gen ifade düzeyleri de düzenlenmesinde TNFα tedavi etkisini belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır, çoğu veya post-translational düzenleme. İnflamatuar stres Trofoblast davranış, morfoloji ve syncytialization etkisi olabilir. Morfolojik Değerlendirmeler (yani immunocytochemistry) yanı sıra moleküler analitik yaklaşımlar dahil TNFα maruz kalmanın etkileri daha kapsamlı bir analiz Trofoblast sağlık üzerinde sağlar. TNFα konsantrasyonları test edilmiş ve aşağı akım deneyleri deneysel taleplerine göre düzeltilmesi tavsiye edilir.
Burada açıklanan Protokolü uygulayarak, TNFα aracılı iltihap upregulate insan trophoblasts ifadede Rubicon yalın gebelik kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile gelen bulunmuştur. Batı Trofoblast Rubicon için kurutma lysates iki ayrı Grup yakınındaki ve 140 kDa (şekil 4A) beklenen Moleküler ağırlığı yukarıda ortaya koydu. Kanıt alt grubun belirsiz olduğunu göstermektedir (PD047 Anti-Rubicon pAb, MBL bilgi formu, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Trophoblasts kadın upregulate Rubicon ifadede konsantrasyonları 250 pg/mL kadar TNFα tedaviye yanıt yeteneğini gösterdi. Bu, Rubicon ifade yüksek konsantrasyonlarda düzeyleri azalmıştır geri temel doğru (tedavi edilmemiş denetimi) ve hatta aşağıda (şekil 4B, n = 3). TNFα ile yalın gebelik üzerinden trophoblasts tedavi iltihap obez intrauterin ortamında simüle göz önüne alındığında bu sonuç Rubicon önemli ölçüde villous doku flaş donmuş biyopsi upregulated bulma tamamlayıcı ki Yalın kontrollere göre kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile obez gebeliklerde plasenta (şekil 4 c ve D, ANOVA, n = BMI sınıflar, P 6 < 0,05).
Autophagic akı trophoblasts obez gebelik üzerinden yalın kontrollere göre kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile farklı görünmüyor olsa da, trophoblasts gelen erkek fetus ile obez gebelik oluşumu aktivasyonu ve autophagosomes birikimi sergi 13. Rubicon's autophagy, negatif bir Regülatör hareket autophagosome-lysosome füzyon27durdurmak için nereye. Kadın trophoblasts upregulate Rubicon ifadesi olarak bir telafi edici veya koruyucu mekanizma autophagy22onları yalın benzeri autophagic akı ayarını korumak için izin, etkinleştirebilirsiniz TNFα aracılı inflamasyon karşı olabilir Anne obezite. Bu yanıt olarak plasenta obez intrauterin ortam erkeklerde daha iyi nasıl kadın fetusa fare bir rol oynayabilir. TNFα ile birincil insan trophoblasts tedavi yoluyla anne obezite ex vivo ile ilişkili inflamatuvar ortam modelleme kritik yollar düzenlenmesinde obez intrauterin ortam etkilerini incelemek için bir platform sağlar trophoblasts. Obez anne ortamı recapitulating yönelik yeni ve Kombinatorik tedavileri ile bu iletişim kuralını değiştiren plasental fonksiyon anne obezite etkilerini incelemek için heyecan verici bir cadde sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışma için onların plasenta hibe kadınlar teşekkür ederiz. Biz de emek ve teslim bölümü OHSU ve Maternal ve Fetal araştırma ekibi plasenta topluluğu koordinasyon için teşekkür ederim. Biz destek için Eric Wang, doktora ve Kelly Kuo, MD için minnettar ve deneysel yöntemleri ve optimizasyonu ile yardımcı olur.
Bu eser NIH HD076259A (AM) tarafından finanse edildi ve AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A.
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P.
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B.
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
