Summary
Presenteres her er en protokoll for prøvetaking av menneskelig placental villous vev etterfulgt av isolering av cytotrophoblasts for primær cellekultur. Behandling av trophoblasts med TNFα viser betennelse i overvektige intrauterine miljøet og Letter oppdagelsen av molekylære mål regulert av betennelse i placentas med mors fedme.
Abstract
Mors overvekt er assosiert med økt risiko for uønskede perinatal resultater som er sannsynlig formidlet av kompromittert placental funksjon som kan tilskrives, delvis feilregulering av autophagy. Avvikende endringer i uttrykket av autophagy regulatorer i placentas fra overvektige svangerskap kan reguleres av inflammatoriske prosesser knyttet til både fedme og graviditet. Beskrevet her er en protokoll for prøvetaking av villous vev og isolering av villous cytotrophoblasts fra begrepet menneskelige morkaken for primær cellekultur. Dette etterfølges av en metode for å simulere inflammatorisk miljøet i overvektige intrauterine miljøet ved å behandle primære trophoblasts fra lean svangerskap med tumor nekrose faktor alpha (TNFα), en proinflammatory cytokin det er opphøyet i fedme og graviditet. Gjennom implementeringen av protokollen beskrevet her, er det funnet at eksponering for eksogene TNFα regulerer uttrykk for Rubicon, en negativ regulator av autophagy, i trophoblasts fra lean svangerskap med kvinnelige fostre. Mens en rekke biologiske faktorer i overvektige intrauterine miljøet opprettholde potensial til å modulere kritiske stier i trophoblasts, er ex vivo systemet spesielt nyttig for å avgjøre hvis uttrykket mønstre observert i vivo i menneskelig placentas med mors overvekt er et direkte resultat av TNFα signalering. Til slutt denne tilnærmingen gir oss mulighet til å analysere regulatoriske og molekylære implikasjoner av betennelse forbundet med mors overvekt på autophagy og andre kritiske cellulære veier i trophoblasts som har potensial til å påvirke placental funksjon.
Introduction
Fedme er en inflammatorisk tilstand preget av kronisk lav-grade betennelse, stammer fra overflødig fettvev og næringsstoffer tilgjengelighet. I fedme, er proinflammatory cytokiner opphøyet i metabolske vev og systemisk i sirkulasjon. En robust kropp av bevis har vist at TNFα er betydelig hevet i innstillingen av fedme med implikasjoner i insulinresistens og metabolske dysfunksjon1. Aktivering av TNFα bidrar også til sykdom patogenesen i forhold som kreft og autoimmunitet, noe som gjør det til et attraktivt terapeutisk mål2.
Betennelse i fedme er forsterket av graviditet, også en proinflammatory tilstand3,4. Det har tidligere vist at placental TNFα innhold øker med mors lokalisert fedme i svangerskap med kvinnelige fostre. Videre hemmer TNFα behandling mitokondrie åndedrett i kvinnelige men ikke mannlige trophoblast celler, noe som tyder på at TNFα er involvert i å regulere placental stoffskiftet i en dekket av hvit måte5. Mors overvekt er assosiert med økt forekomst av en rekke komplikasjoner i svangerskapet, inkludert dødfødsel, med mannlige fostre er mest utsatt3,6,7,8 . På grunn av sin nøkkelrolle på mødre fosterets grensesnittet, kan endringer i den funksjonelle kapasiteten til placenta hos overvektige intrauterine miljøet svar på inflammatorisk signalering spille en viktig rolle i formidle resultatene av overvektige svangerskap.
Cytotrophoblasts og syncytiotrophoblasts i villous vev av morkaken er avgjørende for endokrine signalering og næringsstoffer og oksygen utveksling mellom mor og utvikle fosteret9. Forstyrrelser i den funksjonelle kapasiteten av villous cytotrophoblasts (heretter referert til som trophoblasts) kan sette fosterets helse og utvikling. Denne protokollen beskriver en metode for prøvetaking av villous human frist morkaken av dissecting unna chorion og basal platene med en optimalisert prosedyre for isolering av trophoblasts for primær cellekultur. Denne protokollen er utledet fra etablerte metoder som involverer enzymatisk fordøyelsen av villous vev å løslate celler fra den ekstracellulære matrisen etterfulgt av differensial tetthet sentrifugering isolere trophoblasts10, 11,12. Denne protokollen detaljer tilnærming som primær trophoblasts fra placentas fra lean svangerskap er behandlet med kultur medier med TNFα å simulere en del av inflammatoriske miljøet forbundet med mors overvekt. Endelig, en enkel prosedyre for høsting total-celle lysates fra TNFα-behandlet trophoblasts etterfulgt av Western blotting for å registrere endringer i genuttrykk er beskrevet.
Mens denne modellen ikke er recapitulate obesogenic i utero miljøet i sin helhet, gir det et kontrollert system som gjør det mulig å sortere ut de enkelte bidrag av TNFα-mediert betennelse trophoblasts' svar mors overvekt. Denne modellen gir både muligheten til å oppdage eller bekrefte molekylære mål direkte regulert av TNFα signalering i trophoblasts som gjør det mulig å teste om endringer i gene expression mønstre observert i vivo i placentas med mors fedme kan være et resultat av TNFα-mediert betennelse.
Fremgangsmåten beskrevet her ble gjennomført for å teste effekten av TNFα-mediert betennelse på regulering av autophagy i menneskelig trophoblasts. Trophoblasts fra overvektige svangerskap med mannlige fostre utstillingen forstyrret autophagic omsetning eller autophagosome modning13. Et protein som kalles Rubicon (Kjør domene protein Beclin1 samspill og cystein-rik inneholder), som er lokalisert til lysosomer og sene endosomes, har blitt nylig beskrevet som en "håndbrekket" i autophagic omsetning prosessen fordi det fungerer som en negativ regulator autophagosome modning14,15. Rubicon er faktisk et sjeldent eksempel på en protein som begrenser autophagy, som gjør det en verdifull terapeutisk mål. Svært lite informasjon er tilgjengelig om patofysiologiske betydningen av Rubicon, bortsett fra dens roller i medfødte immunforsvaret til microbials16,17 og cardiomyocyte beskyttelse18. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, er det funnet at Rubicon er upregulated i kvinnelige primære trophoblasts i respons på behandling med økende konsentrasjoner av TNFα opp til 250 pg/mL. Regulering av Rubicon kan spille en rolle i hvordan kvinner fostre billettpris bedre enn menn i svangerskap med mors fedme. Recapitulating betennelse forbundet med mors overvekt ex vivo ved å utsette menneskelige trophoblasts til eksogene TNFα gir en plattform for å studere virkningen av overvektige intrauterine miljøet på regulering av kritiske stier i trophoblasts og dermed placental funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
placentae ble Hentet fra Arbeiderpartiet og levering enhet ved Universitetssykehuset under en protokoll godkjent av institusjonelle gjennomgang styret av Oregon Health and Science University i Portland, Oregon, med samtykke fra den pasienter.
1. samling av Placental vev
- forberedelse
Merk: alt utstyr som møter vev må sterilt.- Sterilisere dissecting utstyret ved autoklavering for 60 min på 121 ° C.
- Bruke personlig verneutstyr (PVU): lab strøk/kjoler/scrubs, hansker og maske med ansiktsskjerm eller beskyttelsesbriller.
- Slå på vannbad og satt til 37 ° C.
- Varme to 50 mL konisk rør, hver med 25 mL av komplett (Iscove ' s endret Dulbecco ' s Medium med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin, tabell 3) i et 37 ° C vannbad.
- Med informert pasienten samtykke, få en Morkake umiddelbart etter levering av keisersnitt.
- Bli kjent med morkaken. Navlestrengen settes på fosterets side (chorion plate) og blodkar kan sees stråler ut fra navlestreng innsetting site. Motsatt side er mors side eller basale plate. Det inkluderer decidua og strukturer som inneholder fartøyet trær, kalt cotyledons.
- Prøvetaking av Villous vev
Merk: Villous vev bør prøves fra morkaken så snart som mulig etter levering, fortrinnsvis i 30 minutter eller mindre.- Med chorion platen peker oppover, avgiftsdirektoratet 2-3 full-tykkelse deler (omtrent 2,5 cm x 2,5 cm i størrelse) 2-3 cm inn fra utkanten av morkaken på tilfeldig, bruke tang og saks ( figur 1A).
Merk: Unngå deler av morkaken som vises unormal (dvs. hvit calcifications). - Klippe bort chorion og basal platene og noen store blodkar.
- Plasserer den resulterende villous vev ( figur 1B, ca 80-120 g totalt) i varme komplett medier og begynne trophoblast isolasjon innen 30 min av sampling.
Merk: Noen nedstrøms analyser og programmer påvirkes av ventetid periode mellom levering, prøvetaking og trophoblast isolasjon. Det er best å holde disse periodene som kort som mulig og konsistent mellom isolasjoner. - Ved hjelp av metodene beskrevet i trinnene 1.2.1 - 1.2.2, prøve 5 tilfeldig 1 cm x 1 cm deler av villous vev fra over morkaken (inkludert center).
- Kutt hver 1 cm x 1 cm villous Vevsprøve i 4-5 mindre biter (ca 30 mg hver), plasser i 2 mL microcentrifuge rør, og flash fryse i flytende N 2. Butikken på-80 ° C for bruk i senere analyser.
- Med chorion platen peker oppover, avgiftsdirektoratet 2-3 full-tykkelse deler (omtrent 2,5 cm x 2,5 cm i størrelse) 2-3 cm inn fra utkanten av morkaken på tilfeldig, bruke tang og saks ( figur 1A).
2. Isolasjonen av Trophoblasts fra Villous vev
- forberedelse
Merk: Bruk sterilt utstyr og utføre prosedyrer som involverer celler i laminær strømning hette.- Tøvær fire frosne tetthet forløpninger (tabell 1, se tabellen over grunnleggende forsyninger, reagenser, og utstyr, tilleggsmateriale) på 4 ° C natten før morkaken ankommer.
Merk: Alternativt tetthet forløpninger gjøres ved isolasjon. - Slå på sentrifuge og satt til 20 ° C.
Merk: Alle sentrifugering trinnene er ved maksimal akselerasjon og deselerasjon hvis ikke annet. - Forberede 1 x HEPES-bufret salt løsning (HBSS) med Ca 2 og Mg 2 (tabell 3).
- Varme trypsin til 37 ° C.
- Fortynne DNase til ca 2720 kilounits/mL i sterilt supplert HBSS.
- Varm 50 mL av nyfødte kalv Serum (NCS) til 37 ° C.
- Varme komplett medier til 37 ° C.
- Varme frysing media (90% FBS, 10% DMSO tabell 3) til 37 ° C.
Forsiktig: DMSO er giftig og må håndteres med hansker. - Forberede fordøyelsen buffer (tabell 2 og 3) ved å blande 308 mL supplert HBSS, 50 mL av Trypsin (3751.7 BAEE enheter/mL), og 0,5 mL DNase (379.4 kilounits/mL) i en steril flaske.
Merk: Omtrentlig tiden det tar å isolere celler fra villous vev er 7 h.
- Tøvær fire frosne tetthet forløpninger (tabell 1, se tabellen over grunnleggende forsyninger, reagenser, og utstyr, tilleggsmateriale) på 4 ° C natten før morkaken ankommer.
- Behandling Villous vev
- skyll hver del av villous i et 50 mL konisk rør fylt med romtemperatur fosfat bufret saltvann (PBS). Gjenta og erstatte PBS nødvendig til overskytende blod fjernes (PBS skyll blir rødt eller rosa når vev er grundig skylt).
- Plasser villous vevet i et sterilt Petriskål og fjerne så mange blodårene som mulig ved å forsiktig skrape av bløtvev villous fra båtene ved hjelp av et mikroskop lysbilde.
- Fint hakke det resulterende villous vev ved hjelp av saks.
- Villous vev fordøyelsen og råolje isolasjon av Trophoblasts
- overføre hakket villous vev til en steril flaske med fordøyelsen løsning etter beregnet volumene basert på til aktiviteten av trypsin og DNase (165 mL, tabell 2).
- Etter 35 min inkubasjon i et 37 ° C vannbad med skjelvende på 70 omdreininger per minutt (rpm), tilt fordøyelsen flasken på sin side, og tillate ufordøyd biter av vev å bosette seg på bunnen av flasken. Nøye utarbeide nedbryting med en serologisk pipette, unngå utlignede vevet.
- Dispensere nedbryting gjennom en 100 µm celle sil likt mellom 50 mL konisk rør.
Merk: For å spare tid, er det tilrådelig å starte andre fordøyelsen ved legge fordøyelsen løsning (110 mL, tabell 2) til de gjenværende avgjort vev og gjenoppta inkubasjon som beskrevet i trinn 2.3.2. - Forsiktig layer 3-5 mL sokkel under anstrengt nedbryting av sakte dispenser fra en serologisk pipette nederst på røret. En menisk mellom anstrengt nedbryting (med trophoblasts) og sokkel skal vises ( figur 2A).
- Sentrifuge supernatants over sokkel 1250 x g i 15 min på 20 ° C. Den resulterende pellet inkluderer røde blodlegemer i nedre mest laget etterfulgt av et hvitt lag som inneholder de trophoblast cellene ( figur 2B).
- Gjenta 2.3.2 - 2.3.5 for hver av de andre og tredje digestions (tilføyer 110 mL og 83.5 m, henholdsvis fordøyelsen løsningen å flaske vev, tabell 2).
- Når alle supernatants har vært sentrifugeres, resuspend hver pellet i 5 mL av varm fullfører media, og deretter bassenget av suspensjon sammen.
- Dele celle suspensjon like mellom to 50 mL konisk rør og sentrifuger 1250 x g i 15 min 20 ° C.
- Forsiktig fjerne nedbryting og resuspend hver celle pellets i 6 mL av varm complete media.
- Tetthet sentrifugering
- dele celle suspensjon likt mellom fire tetthet forløpninger (3 mL hver) av sakte og forsiktig lagdeling celle suspensjon på tetthet forløpninger med en overføring pipetter.
- Sentrifuge tetthet forløpninger 1250 x g for 20 min ved 20 ° C med minimum akselerasjon og retardasjon. Dette bør gi skjelnes band av sedimented celler (Tabell 4).
- Sakte og forsiktig fjerne den øverste lag av tetthet gradert media (DGM) helt ugjennomsiktig bånd som inneholder trophoblast celler (mellom 35-50% DGM) (Tabell 4).
- Overføre trophoblast band i to 50 mL konisk rør og fyll med varm komplett medier.
- Forsiktig Inverter rør 3 - 6 ganger å blande og sentrifuge 1250 x g i 15 min 20 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend hver celle pellet i 5 mL av varm komplett medier. Kombinerer celle suspensjoner og telle levedyktig celler ved hjelp av en hemocytometer og Trypan blå (eller foretrukket celle telling metoden).
- Teller celler med en Hemocytometer
- blande celle suspensjon av pipettering opp og ned med en serologisk Pipetter eller forsiktig invertere røret flere ganger.
- Kombinere like deler av cellen fjæring og Trypan blå (dvs 20 µL hver) i et separat rør og bland forsiktig.
- Incubate i 1-2 min ved romtemperatur.
- Forsiktig dispensere 15-20 µL av celle-Trypan blå blanding av dekkglassvæske og hemocytometer og at cellene å spre over rutenettet av kapillær handlingen.
- Teller levedyktige cellers (død celler vil bli farget mørkeblå) i hver av de fire 4 x 4 kvadrantene med en telleapparat teller. Ansette et system av teller for å sikre celler ikke telles mer enn en gang (dvs. ikke teller celler som berører bunnen eller venstre grenser).
Merk: Hver 4 x 4-kvadrant bør inneholde mellom 50-150 celler. For få eller for mange celler kan føre til en over- eller undervurdering av celle nummer. - Gjennomsnitt totalt-cellen teller fra hver av de 4 x 4 quadrants, multiplisere med 10 4, og deretter multiplisere med fortynningsfaktoren (celle suspensjon til Trypan blå) for å beregne antall celler per mL.
- Multiplisere antall celler per mL av det totale volumet av cellen suspensjon å beregne den totale celle avkastningen.
Merk: Ca 100 millioner celler ventet fra isolasjoner starter med 80-120 g villous vev.
- Plating celler
- Plate 3 millioner celler/vel (3.3 x 10 5 celler per cm 2) i en 6-vel plate (2 mL av suspensjon per brønn) og forsiktig frem og tilbake og side til side for å jevnt distribuere cellene.
Merk: Trophoblasts krever vev kultur behandlet plater å følge riktig. En monolayer av celler er nødvendig for å fremme syncytialization. - La belagt cellene i laminær strømning panseret i ca 30 min slik at cellene å jevnt distribuere, avgjøre, og begynne å følge bunnen av brønnene før du plasserer i inkubator.
- Kultur celler for opptil 72 h (med daglige media endringer) i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 og 95% fuktighet.
Merk: Undersøke trophoblasts under et mikroskop på 10-20 x hver 24 h kultur. Trophoblasts spre seg ikke og kan ikke være passaged. I løpet av 72 h kultur, de runde personlige trophoblasts sikring for å danne en syncytium ( figur 3A og B).
- Plate 3 millioner celler/vel (3.3 x 10 5 celler per cm 2) i en 6-vel plate (2 mL av suspensjon per brønn) og forsiktig frem og tilbake og side til side for å jevnt distribuere cellene.
- Frysing celler
- pellets ubrukte celler med sentrifugering 1250 x g i 10 min 20 ° C.
- Sug opp så mye media som mulig fra pellet.
- Resuspend pellets i iskaldt media (tabell 3).
- Fryse dele ved-80 ° C i en fryser container fylt med 100% isopropanol. Transfer frosne dele væske N 2 dagen for langtidslagring.
Merk: Celler kan kultivert etter frysing.
- Tining celler
- fjerne en aliquot av frosne celler og tine i et 37 ° C vannbad mens virvler. Fjerne aliquot fra vannbad like før det har fullt tint til en væske.
- Øyeblikkelig overføre tinte cellene til en 15-ml konisk rør. Begynner bremse først legge 10 mL av komplett media med intermitterende blande.
- Inverter rør flere ganger for å blande.
- Sentrifuger 200 x g i 10 min på 20 ° C.
- Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 2-5 mL av varm komplett medier.
- Telle celler og plate som beskrevet tidligere.
3. Behandling av primære Trophoblasts med TNFα, samling av cellen Lysates og Western Blotting
- forberedelse
- varme komplett medier til 37 ° C.
- Gjør en 10 µg/mL lager av TNFα i komplett og butikk på 20 ° C til du er klar for bruk.
- Gjør en 1 µg/mL arbeider lager av TNFα i komplett medier når du er klar til å behandle cellene. Føljetong fortynne TNFα arbeider sluttvederlag til 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL og 125 pg/mL i komplett.
Merk: TNFα konsentrasjonen av 10 4 pg/mL er moderat cytotoksisk. Justering av TNFα konsentrasjonen testet avhenger av spesifikk av ønsket nedstrøms programmene.
- Behandling av celler med TNFα
- etter 24 h kultur, Sug opp kultur media fra cellene og Erstatt med 2 mL TNFα supplert medier per brønn på 6-vel plater (minst to brønner per behandling og kjøretøy kontroll).
- Etter 24 timer TNFα-eksponering (48 h kultur), erstatte TNFα supplert medier med komplett.
- Høste celler og Total
- etter 72 h kultur (24 h forbi fjerning av TNFα), Sug opp media, forsiktig rense celler med romtemperatur PBS og legge 80 µL av iskald Radioimmunoprecipitation analysen Buffer (RIPA) som inneholder ferske lagt protease og fosfatase hemmere (tabell 3) direkte i hver brønn.
- Fjerne celler fra platen med en celle skraper. Overføre cellene til en 1,5 mL microcentrifuge tube, pooling brønner i behandlingsgrupper.
- Lyse cellene av vortexing rør høye for minst tre intervaller på 15 s.
- Ruge cellene på 4 ° C med rock i 15 min.
Merk: Alternativt etter trinn 3.3.3., cellene kan være ruges på isen i 15 min med intermitterende agitasjon ved å sveipe tunnelbane, vortexing, eller pipettering opp og gjørewn. - Gjenta trinn 3.3.3.
- Sentrifuge rørene på 10.000 x g i 5 min på 4 ° C pellets mobilnettet rusk.
- Overføring nedbryting (som inneholder mobilnettet protein) til en ny 1,5 mL microcentrifuge rør og butikk på-80 ° C.
Merk: Protokollen kan stoppet her og fortsette senere. Det anbefales å gjøre flere dele mobilnettet protein prøver å unngå flere fryse-Tin sykluser. - Bestem totale protein konsentrasjon ved en foretrukket metode, for eksempel en bicinchoninic syre analysen (BCA, se tabellen over grunnleggende forsyninger, reagenser, og utstyr, tilleggsmateriale).
- SDS side og Western Blotting Rubicon eller Protein av interesse
Merk: Følg Western blotting protokoller ifølge produsenten ' s instruksjoner ved å bruke en foretrukket laboratorium.- Last mellom 20-40 µg totale protein eksempel buffer (tabell 3) per brønn på en 12% akrylamid gel. Separate proteiner SDS-side i bufferen (tabell 3) som kjører.
- Våt-transfer proteiner fra gel til en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran ifølge produsenten ' s instruksjonene i overføre buffer (tabell 3).
- Ruge membranen i 5% melkepulver i Tris-Buffered Saline med 0,1% mellom 20 (TBST, tabell 3) for minst 1 time i rom temperatur med rocking.
- Ruge membranen i et Rubicon primære antistoff (se tabell over grunnleggende forsyninger, reagenser, og utstyr, tilleggsmateriale) på 1:500 i 1% melkepulver i TBST overnatting på 4 ° C med rocking.
- Forsiktig vaske membranen 3 x 5 min TBST og 1 x 5 minutter i TBS ved romtemperatur med rocking.
- Ruge membranen i 1:2000 - 1:5000 sekundære antistoff (HRP-koblede eller foretrukne synlig konjugert, se tabellen over grunnleggende forsyninger, reagenser, og utstyr, tilleggsmateriale) i 5% melkepulver i TBST minst 1t ved romtemperatur med rocking.
- Gjenta vask i trinn 3.4.5 og visualisere blot med en passende visualisering (dvs. chemiluminescent) substrat på en tenkelig system.
- Gjenta vask i trinn 3.4.5 og sonde membranen β-utgangen eller en foretrukket lasting kontroll ifølge produsenten ' s instruksjoner.
- På foretrakk image analyseprogramvare, analysere uttrykket av Rubicon ved manuell kvantifisering av absorbansen (bandet intensiteter), subtraksjon av bakgrunnen absorbansen og normalisering til tilsvarende lasting kontroll bandet intensiteter. Utføre statistiske analyser som passer til å teste statistisk betydelige endringer i protein nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begrepet menneskelige placentas fra lean (pre-graviditet kroppsmasseindeks (BMI) < 25) mødre med ukomplisert svangerskap bærer kvinnelige avkom var samlet og samplet innen 15 minutter av levering av keisersnitt (ingen arbeid). Placentas ble undersøkt for fraværet av calcifications og typisk utvikling: veier mellom 300-600 g med navlestrengen og membraner fjernet, runde i formen, mellom 15-25 cm i diameter og navlestreng satt inn i midten av den morkaken. Villous vev ble dissekert fra basal og chorion plater i 2-3 prøver fra over morkaken (figur 1), gir ca 100 g villous vev som starter materiale for primære trophoblast isolasjon. 20 minutter av prøvetakingen villous vev prosedyren for å isolere primære trophoblasts ble startet som beskrevet her, gir mellom 0,8 - 1 x 108 levedyktige cellers. Cellene ble sådd i 6-brønnen plater på en tetthet 3 x 106 (3.3 x 105 celler per cm2). Etter 24 timer av kultur, cellene ble undersøkt under et mikroskop for å feste og riktig trophoblast morfologi ble bekreftet (individuell rundt celler). Kultur media ble erstattet med komplett medier som inneholder en rekke konsentrasjoner av TNFα mellom 125-104 pg/mL slik at minst to brønner ble inkludert per konsentrasjon og kjøretøy kontroll (komplett media bare).
Tjuefire timer etter TNFα-behandling (48 h kultur), erstattet alle TNFα medier med komplett. Ingen merkbar celledød ble observert på grunn av behandling med TNFα i konsentrasjoner på eller under 103 pg/mL. Behandling med 104 pg/mL TNFα var moderat cytotoksiske cytotoksiske effekten av denne TNFα konsentrasjonen beholdes ikke når media ble endret som gjenspeiles av laktat Dehydrogenase (LDH) analyser (data ikke vist). På 72 h kultur, ble celler undersøkt for syncytialization under et mikroskop. Immunocytochemistry for syncytialization og fibroblast forurensning avslørte ren isolering av trophoblasts (Figur 3). Mobil lysates ble høstet i henhold til protokollen beskrevet her, gir mellom 3-8 µg/µL totale protein per forberedelse som bestemmes av en BCA analysen (data ikke vist). Western blot analyse i celle lysates fra kvinnelige trophoblasts behandlet med TNFα viste en oppregulering Rubicon uttrykk som svar på konsentrasjoner av TNFα opp til 250 pg/mL og påfølgende downregulation Rubicon uttrykk i TNFα konsentrasjoner større enn 250 pg/mL (figur 4A og B, 104 pg/mL ekskludert fra analyse basert på cytotoksiske effekter). Likeledes Rubicon er betydelig upregulated i flash-frosne villous vev biopsier fra placentas fra overvektige svangerskap med kvinnelige fostre sammenlignet mager kontroller som gjenspeiles av Western blot analyse (figur 4C og D, n = 6 placentas per BMI klasse, ANOVA, P < 0,05).
| Konsentrasjon (%) | 90% DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Lagtykkelse (ml) |
| 4 x gradering | 4 x gradering | Totalt 34,5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2,67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13,5 ml-merke) |
| 40 | 5,33 | 6,67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (19,5 ml-merke) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2,67 | 9,33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
Tabell 1. Spesifikasjoner for å gjøre tetthet forløpninger for tetthet sentrifugering av primære Trophoblasts.
Fra venstre til høyre, kolonne angir tetthet gradert media (DGM, se tabellen over grunnleggende forsyninger, reagenser, og utstyr, tilleggsmateriale) konsentrasjon uttrykkes som prosentandeler av DGM i HBSS. Kolonne to angir mengden DGM mens kolonnen tre angir antall HBSS som kreves for å gjøre riktige andelen DGM løsning. Kolonne fire angir volumet legges til 50 mL konisk røret å bygge gradient, med den mest tette laget.
| Trypsin | HBSS | DNase | ||
| Fordøyelse | (totalt aktivitet. BAEE enheter) | volum (ml) | (totalt aktivitet. Kunits) | Totalt volum /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 ml) | 141.76 ml | 62594 (0.230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15.34 ml) | 94.51 ml | 41729 (0.154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11.65 ml) | 71.74 ml | 31676 (0.116 ml) | 83.5 ml |
| Totalt | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0,5 ml) | 358.5 ml |
Tabell 2. Spesifikasjoner for utarbeidelse av fordøyelsen løsning for primære Trophoblast isolasjon basert på bestemte aktiviteten til DNase og Trypsin.
Fra venstre til høyre, den første kolonnen angir antall digestions, den andre kolonnen angir trypsin aktiviteten må etter fordøyelsen, den tredje kolonnen angir det totale volumet av supplert HBSS legges på riktig fordøyelsen, den fjerde kolonne angir DNase aktiviteten må etter fordøyelsen, og den siste kolonnen angir mengden fordøyelsen-løsninglagt til placental vevet på riktig fordøyelsen.
| HBSS (supplert med Ca2 og Mg2) | Eksempel Buffer |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 X Laemmli dye |
| 1,26 mM CaCl2 (anhyd.) | 10% 2-Mercaptoethanol |
| 0.80 mM MgSO4 (anhyd.) | |
| 20.77 mM HEPES | |
| pH 7,4 med 10N NaOH Gjøre volumet til 1 L med sterilt ddH2O Sterilt filter i et sterilt flaske |
|
| Komplett | Kjører Buffer |
| Fjerne 11% v/v IMDM | 25 mM Tris Base |
| Legge til 10% v/v FBS | 190 mM glysin |
| Legge til 1% 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin (100 U/mL endelig) | 0,1% SDS |
| pH til 8.3 | |
| Frysing Media | |
| 90% v/v FBS | Overføre Buffer |
| 10% v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190 mM glysin | |
| Fordøyelsen Buffer | 20% metanol |
| 50 mL Trypsin (26,900 BAEE enheter/mL) | pH til 8.3 |
| 0,5 mL DNAse (272,000 K enheter/mL) | |
| Bringe til 358.5 ml i supplert HBSS | TBS |
| 20 mM Tris | |
| RIPA Buffer | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH til 7,6 |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0,1% SDS | TBS med 0,1% mellom 20 |
| 0,5% natrium deoxycholate | |
| 1% Triton X-100 | |
| 1 tavle av protease/fosfatase hemmer per 10 ml RIPA Buffer |
Tabell 3. Lobbyer isolering og kultur av primære Trophoblasts etterfulgt av Western Blotting.
| % DGM | ml merke | Celle type |
| 10 | 31,5-34,5 | Rusk |
| 20 | 28.5-31,5 | |
| 30 | 22,5-28.5 | |
| 35 | 19,5-22,5 | Trophoblasts |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13.5-16,5 | |
| 50 | 10.5-13,5 | Lymfocytter |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4.5 7.5 | Røde blodlegemer |
| 70 | Under 4.5 |
Tabell 4. Sedimentering av Trophoblasts av tetthet sentrifugering.
Fra venstre til høyre, den første kolonnen angir prosenten DGM (tabell 1), den andre kolonnen angir mL merket der tilsvarende andelen DGM er funnet på en 50 mL konisk rør, og den tredje kolonnen angir hvilken celle type sedimenter på den tilsvarende andelen DGM og mL merke på en 50 mL konisk rør. Trophoblasts sedimenter mellom 50-35% DGM, danner forskjellige ugjennomsiktig band. Samle DGM ovenfor eller nedenfor dette området vil medføre forurensing av mobilnettet rusk og andre celletyper som lymfocytter.
Figur 1. Villous vev er isolert fra begrepet menneskelige morkaken ved å fjerne chorion og Basal plater.
A) med chorion platen (fosterets siden) vendt oppover, et tykkhet utvalg er forbrukeravgift fra morkaken. B) en prøve av villous vev oppnås ved å fjerne chorion og basal platene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sentrifugering celler i oversikten over nyfødte kalv Serum gir flerlags celle pellets.
A) nyfødte kalv serum (NCS) er lagt under cellen suspensjon i oversikten løsning i et 50 mL konisk rør. B) sentrifugering av (A) gir flerlags celle pellets. Det nederste laget er rød farge og består av røde blodlegemer. Lag over inkluderer trophoblasts og hvit eller beige farge. Over trophoblast er laget sokkel etterfulgt av fordøyelsen løsning (supernatant) til toppen av røret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Immunocytological analyse av Syncytialization og Fibroblast innhold i primære menneskelige Trophoblast kulturer.
A) representativt bilde av Cytokeratin-7 (rød) i cytotrophoblasts etter 24 h kultur. B) representativt bilde av Cytokeratin-7 (rød) i syncytiotrophoblasts etter 72 h kultur viser multinucleated massene som har smeltet. C) representativt bilde av Vimentin (rød) i syncytiotrophoblasts etter 72 h kultur. Bildene ble anskaffet på fluorescerende mikroskop med DAPI (blå) kjernefysiske counterstain. Visualisert på 10 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Regulering av Rubicon uttrykk svar på TNFα-behandling i kvinnelige Trophoblasts og endogene Rubicon uttrykk i Villous vev fra Lean Versus overvektige svangerskap med kvinnelige fostre.
Primære trophoblasts fra begrepet placentas fra lean mødre med friske svangerskap bærer en kvinnelig fetus isolert og behandlet med 125 250, 500, 103, og 104 pg/mL TNFα (eller kjøretøy kontroll). A) representant Western blot for Rubicon i kvinnelige trophoblast lysates behandlet med TNFα. Β-utgangen ble brukt som en lasting. B) Rubicon uttrykk i respons til TNFα-behandling i kvinnelige trophoblasts var kvantifisert fra vestlige blots og normalisert til β-utgangen. Verdiene er mener Rubicon uttrykk per TNFα konsentrasjon ± S.E. i n = 3 placentas. C) Western blotter for Rubicon i hele vev lysates fra flash frossen biopsier villous vev fra lene mot overvektige svangerskap med kvinnelige fostre (F1-F12). Laktat dehydrogenase A (LDHA) ble brukt som en lasting. D) Rubicon uttrykk i Western blotter fra (C) var kvantifisert og normalisert til LDHA. Verdiene er mener Rubicon uttrykk per BMI klassifisering ± S.E. i n = 6 placentas per BMI klasse (ANOVA, * P < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Morkaken, ansvarlig for å regulere vekst av fosteret, utstillinger kompromittert funksjon i overvektige miljø6. Til tross for høye metabolsk krav trophoblasts utstilling placentas med mors overvekt dysfunksjonelle mitokondrie åndedrett6,19. Endringer i placental metabolisme kan bidra til økt forekomsten av komplikasjoner og uønskede fetal resultater i overvektige svangerskap3,6,7. Autophagy er også utsatt i placentas med mors fedme. Placentas fra overvektige svangerskap med mannlige fostre viser dysfunksjonelle autophagic forandring som gjenspeiles av autophagosomes13. Opprettholde optimal autophagic fluks er avgjørende for mobilnettet homeostase defekt autophagy i placentas med mors overvekt kan spille en viktig rolle i formidling av uønskede resultater forbundet med fedme svangerskap.
Nøyaktige årsaken (e) av kompromittert placental funksjonen utstilt i mors overvekt er ikke godt forstått og kan ha sin opprinnelse i inflammatorisk signalering. Både fedme og graviditet er proinflammatory stater som er preget av forhøyede nivåer av sirkulerende TNFα1,4,20,21. TNFα er en aktivator av autophagy22,23og mekle endringer i autophagic endring i placentas fra overvektige svangerskap. TNFα brukes vanligvis til å studere virkningene av betennelse på celler, spesielt i sammenheng med kreft2. Protokollen presenteres her tilpasser denne tilnærmingen for å studere virkningene av fedme-relaterte betennelse på den funksjonelle kapasiteten av morkaken ved å behandle primære trophoblasts med ytre TNFα i kultur.
Denne protokollen består av fire hovedkomponenter: prøvetaking av villous vev fra morkaken, isolering av primære trophoblasts fra villous vev, kultur av primære trophoblasts etterfulgt av TNFα behandling og samling av totale mobilnettet lysates etterfulgt av Western blot analyse måle uttrykk for en protein(s) av interesse. For å isolere ren trophoblasts, er det avgjørende at chorion og basal platene er grundig dissekert fra villous vev under prøvetaking av morkaken (figur 1B). Det er også viktig at villous vev behandles i tide (dvs. innen 30 minutter for levering). Denne protokollen detaljer bruk av tre fordøyelsen trinn, hver varig 35 minutter, for å løslate trophoblasts fra ekstra mobil matrisen av villous vev. Lengre digestions risk skade celler av trypsinization av cellen overflaten proteiner. Øke antall fordøyer øker merkbart ikke endelige avkastningen av levedyktig trophoblasts. Men redusere tid og antall digestions vil føre til redusert celle gir (Simon Bucher og Maloyan, upublisert data). Denne protokollen gir pålitelig ca 100 millioner celler fra 80-120 gram villous vev.
Det er variasjoner i antall skjelnes trophoblast band observert på tetthet graderingene mellom isolasjoner. For å unngå forurensning fra andre celletyper, er det viktig å samle strengt bånd som inneholder trophoblasts på tetthet gradient (Tabell 4). Protokollen detaljert her er optimalisert fra tidligere etablerte metoder som gir ren trophoblasts med mindre enn 5% forurensning fra andre cellen typer10,11,12. Ytterligere rensing kan oppnås med positive eller negative utvalg24. Men risikerer denne tilnærmingen å redusere avkastningen av levedyktig trophoblasts. Immunocytochemical analyse av Cytokeratin-7 i primære trophoblasts isolert bruke fremgangsmåten presenteres her etter 24 versus 72 h kultur tid bekreftet at cellene gjennomgikk syncytialization som gjenspeiles av tilstedeværelsen av multinucleated celle massene på 72 h, en hallmark hendelse i levetiden til en trophoblast (figur 3A og B). Videre avdekket immunocytochemical analyse av Vimentin i primære trophoblasts kultivert 72 h svært få forurensende fibroblaster (Figur 3 c). For rutinemessig formål, kan renheten av trophoblasts overvåkes i kultur ved enkel morfologiske vurdering. På 24 h av kultur dominerer runde personlige cytotrophoblasts kultur. Cytotrophoblasts gjennomgår syncytialization etter 72 h av kultur, noe som resulterer i klumper av smeltet celler. Den vanligste forurensende celle typen funnet i denne kulturen er fibroblast eller endothelial celle, som er avlang og mangekantede i form, henholdsvis. Disse funksjonene kan overvåkes omtrent bruke lyse mikroskop.
Behandle primære trophoblasts med TNFα gir et kontrollert system som gjør det mulig å måle effekten av TNFα signalisering på regulering av kritiske stier i trophoblasts. Naturligvis, det er andre faktorer enn TNFα i overvektige mors miljø i vivo som kan være ansvarlig for modulerende trophoblast funksjon. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til hormonelle signaler, hyperlipidemi og en rekke andre proinflammatory faktorer25. Kombinasjoner av ulike behandlinger vil ytterligere recapitulate overvektige intrauterine miljø ex vivo på mer fysiologisk nøyaktig måte. Konsentrasjonen av ytre TNFα brukes til å behandle trophoblasts i denne protokollen langt overstiger de vanligvis sirkulerer i vivo. Serum konsentrasjonen har vært rapportert å nå 20 ng/mL eller høyere i enkelte inflammatoriske tilstander26. For å oppnå målbare svar av gjeldende laboratorium metoder (i.e. vestlige blotting), er det nødvendig å forsterke TNFα konsentrasjoner for å vise endringer i genuttrykk og veier rundt. Disse svarene kan finnes i vivo i mindre grad. Imidlertid kan de likevel betydelig påvirke funksjonen til trophoblasts. Utsette trophoblasts for høye konsentrasjoner av TNFα risikerer å produsere gjenstander i genuttrykk og veien analyser som kan være forankret i cytotoksiske effekter. Moderat cytotoksisitet ble observert i trophoblasts utsatt for 104 pg/mL TNFα supplert medier for 24 h som dokumentert av LDH cytotoksisitet analyser (data ikke vist). Men produserer konsentrasjoner på eller under 103 pg/mL TNFα ikke noen merkbar celledød.
Testing TNFα konsentrasjoner på mindre intervaller og/eller som er lavere enn beskrevet her kan best følges opp av kvantitativepolymerasekjedereaksjons (qPCR) for gene expression analyse, en teknikk godt egnet for å oppdage små endringer i genuttrykk. Mens qPCR tester spesielt for gene expression nivåer på transcriptional nivå, oppdager vestlige blotting siste nivåene av protein produkter som er antagelig tilgjengelig til å utføre sine cellular aktivitet. Bruker begge analytiske teknikker sammen er en kraftig metode for å bestemme effekten av TNFα behandling på regulering av genet uttrykk nivåer, så vel som for å avgjøre om endringer i uttrykket nivåer er et resultat av transcriptional, post-transcriptional eller post-translasjonell regulering. Inflammatorisk stress kan påvirke trophoblast atferd, morfologi og syncytialization. Inkludert morfologiske vurderinger (dvs. immunocytochemistry) i tillegg til molekylær analytiske metoder vil gi en mer omfattende analyse av effekten av TNFα eksponering på trophoblast helse. Justering av TNFα konsentrasjoner testet og nedstrøms analyser ifølge eksperimentelle krav er tilrådelig.
Ved å implementere protokollen beskrevet her, er TNFα-mediert betennelse funnet upregulate Rubicon uttrykk i menneskelig trophoblasts fra lean svangerskap med kvinnelige fostre. Vestlige blotting for Rubicon i trophoblast lysates avslørt to forskjellige band nær og over den forventede Molekylvekten av 140 kDa (figur 4A). Det er bevis som tyder på at lavere bandet er uspesifisert (PD047 anti-Rubicon pAb, MBL datablad, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Trophoblasts av kvinner vist evnen til å upregulate uttrykk for Rubicon svar til TNFα behandling for opptil 250 pg/mL. I konsentrasjoner høyere enn dette, Rubicon uttrykket nivåer redusert tilbake mot planlagt (ubehandlet kontroll) og selv under (figur 4B, n = 3). Behandling av trophoblasts fra lean svangerskap med TNFα simulerer betennelse i overvektige intrauterine miljøet, er dette resultatet utfyllende til finne at Rubicon er betydelig upregulated i flash-frosne villous vev biopsier fra placentas fra overvektige svangerskap med kvinnelige fostre sammenlignet med magre kontroller (figur 4C og D, ANOVA, n = 6 per BMI klasse, P < 0,05).
Mens autophagic flux ikke vises forskjellig i trophoblasts fra overvektige svangerskap med kvinnelige fostre sammenlignet med magre kontroller, utstilling trophoblasts fra overvektige svangerskap med mannlige fostre aktivering av formasjonen og akkumulering av autophagosomes 13. Rubicon er en negativ regulator av autophagy, der det fungerer for å stanse autophagosome-lysosome fusion27. Kvinnelige trophoblasts kan upregulate uttrykk for Rubicon som en kompenserende eller beskyttende mekanisme mot TNFα-mediert betennelse, som kan aktivere autophagy22, slik at de kan opprettholde lean-lignende autophagic endring i innstillingen for mors overvekt. Dette svaret i morkaken kan spille en rolle i hvordan kvinner fostre billettpris bedre enn menn i overvektige intrauterine miljøet. Modellering inflammatorisk miljøet forbundet med mors overvekt ex vivo gjennom behandling av primære menneskelige trophoblasts med TNFα gir en plattform for å studere virkningene av overvektige intrauterine miljøet på regulering av kritiske stier i trophoblasts. Endre denne protokollen med nye og kombinasjon rettet recapitulating overvektige mors miljøet vil gi en spennende avenue for å studere virkningene av mors overvekt på placental funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker kvinner som donerte sine placentas for denne studere. Vi takker også arbeids- og levering avdeling ved OHSU og mors og Fetal Research Team for å koordinere innsamlingen av placentas. Vi er takknemlige for Eric Wang, Ph.D., og Kelly Kuo, MD for støtte og hjelp med eksperimentelle metoder og optimalisering.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH HD076259A (AM) og AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A.
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P.
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B.
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
