Summary
המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.
Abstract
השמנת יתר אימהית קשורה לסיכון מוגבר של תוצאות שליליות הלידה זה סביר בתיווך פרוץ פונקציה היפרדות ניתן לייחס, בין השאר, dysregulation של autophagy. חריגה שינויים בביטוי של הרגולטורים autophagy ב מאחד לשני של הריונות מהשמנת יתר עשוי להיות מפוקח על ידי תהליכים דלקתיים המשויכים השמנת יתר והריון. המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמת villous חלקית ובידוד של cytotrophoblasts villous חלקית של השליה האנושית המונח לתרבות התא הראשי. זה מלווה שיטה כדי לדמות את חצרו דלקתיות ב התוך-רחמית מהשמנת יתר על ידי טיפול trophoblasts העיקרי של הריונות רזה עם הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα), ציטוקינים proinflammatory כי הוא גבוה ב השמנת יתר הריון. תוך יישום הפרוטוקול המתואר כאן, הוא נמצא כי החשיפה ל אקסוגניים TNFα מווסת את הביטוי של רוביקון, מווסת שלילי של autophagy, ב- trophoblasts של הריונות רזה עם העוברים הנשי. בעוד מגוון רחב של גורמים ביולוגיים התוך-רחמית שמנים לשמור על פוטנציאל לווסת נתיבים קריטיים ב- trophoblasts, מערכת זו שמחוץ היא שימושית במיוחד עבור קביעת אם הביטוי תבניות שנצפה ויוו אנושי מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית הם תוצאה ישירה של TNFα איתות. בסופו של דבר, גישה זו מעניקה הזדמנות לנתח את ההשלכות רגולטוריות ומולקולרית של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על autophagy מסלולים אחרים קריטי הסלולר ב trophoblasts שיש להם פוטנציאל לפגיעה פונקציית היפרדות.
Introduction
השמנת יתר היא מדינה דלקתית המאופיינת בדרגה נמוכה דלקת כרונית, הנובעות רקמת שומן עודף וזמינות חומר מזין. ההשמנה, ציטוקינים proinflammatory גבוהות ברקמות מטבולית וכן מערכתית במחזור. גוף חזקים של הראיות הוכיחו כי TNFα הוא משמעותי גבוה בסביבה של השמנת יתר עם השלכות תנגודת לאינסולין ואת תפקוד מטבולי1. הפעלה של TNFα תורם גם מחלת פתוגנזה בתנאים כגון סרטן, מחלת חיסון עצמי, הפיכתה ליעד אטרקטיבי טיפולית של2.
דלקת ההשמנה מורכב ההריון, גם proinflammatory המדינה3,4. בעבר הוכח כי תוכן TNFα היפרדות מגביר עם השמנה אימהי של הריונות עם העוברים הנשי. יתר על כן, הטיפול TNFα מעכב נשימה מיטוכונדריאלי בתאים trophoblast נקבה אך לא זכר, רומז כי TNFα מעורב בוויסות חילוף החומרים היפרדות בצורה מינית dimorphic5. השמנת יתר אימהית קשורה עם שכיחות מוגברת של מגוון רחב של סיבוכים במהלך ההריון, כולל לידות, בעוברים זכרים להיות רגישים ביותר3,6,7,8 . בשל תפקידה מפתח-הממשק אמהי-עוברית, שינויים ביכולת תפקודית של השליה ב התוך-רחמית שמנים בתגובה איתות דלקתיות עשוי לשחק תפקיד חשוב תיווכה התוצאות של הריונות מהשמנת יתר.
Cytotrophoblasts syncytiotrophoblasts בתוך הרקמה villous חלקית של השליה הם קריטיים עבור איתות האנדוקרינית ו- exchange חומרי מזון וחמצן בין האם לעובר המתפתח9. שיבושים ביכולת תפקודית של cytotrophoblasts villous חלקית (ןלהל trophoblasts) עלול לסכן את בריאות העובר והתפתחות. פרוטוקול זה מתאר שיטת דגימה של רקמת villous חלקית של השליה האנושית המונח על ידי לנתח משם את הצלחות שליה, הבסיס יחד עם שגרת ממוטב עבור בידודו של trophoblasts לתרבות התא הראשי. פרוטוקול זה נגזר מתודולוגיות הוקמה מעורבים עיכול אנזימטי של רקמות villous חלקית כדי לשחרר תאים מטריצה חוץ-תאית ואחריו צפיפות דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי לבודד trophoblasts10, 11,12. פרוטוקול זה פרטים גישה שבה trophoblasts העיקרי של מאחד לשני של הריונות רזה מטופלים עם תרבות המדיה בתוספת TNFα כדי לדמות מרכיב אחד של הסביבה שבה התרחשה דלקתיות הקשורות בהשמנת יתר אימהית. לבסוף, מתואר הליך פשוט לשימוש בתא סכום lysates מן trophoblasts שטופלו TNFα ואחריו המערבי סופג כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים.
בעוד מודל זה לא מסכם את הדברים obesogenic בתוך הרחם הסביבה בשלמותו, הוא מספק מערכת מבוקרת המאפשר אחד כדי לנתח את תרומתו של הפרט של דלקת בתיווך TNFα בתגובה של trophoblasts השמנת יתר אימהית. מודל זה מעניק את ההזדמנות לגלות או לאשר את מטרות מולקולריות ישירות מוסדר על ידי TNFα איתות ב trophoblasts, כמו גם מאפשר לבדוק אם שינויים בדפוסי ביטוי גנים נצפתה ויוו ב מאחד לשני עם אימהית השמנת יתר עשוי להיות תוצאה של דלקת בתיווך TNFα.
הגישה המתוארת כאן בוצע כדי לבחון את ההשפעה של דלקת בתיווך TNFα על ויסות autophagy ב trophoblasts האנושית. Trophoblasts של הריונות שמנים עם נספח בעוברים זכרים משובשות מחזור autophagic, או autophagosome ההבשלה13. חלבון הנקרא רוביקון (בניהול תחום חלבון אינטראקציה-Beclin1 וציסטאין-עשיר המכיל), אשר הוא מקומי אל lysosomes ואל endosomes המאוחרות, לאחרונה מתוארת כ "בלימה" בתהליך מחזור autophagic כי הוא פועל כמו שלילי הרגולטור של autophagosome-התבגרות-14,-15. למעשה, רוביקון הוא דוגמה נדירה של חלבון זה מרסן autophagy, מה שהופך אותה מטרה טיפולית יקרי ערך. מעט מאוד מידע זמין למשמעות pathophysiological רוביקון, למעט תפקידים שלה בתגובה חיסונית מולדת microbials16,17 ו cardiomyocyte הגנה18. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן הוא נמצא כי רוביקון היא upregulated ב trophoblasts הראשי הנשי בתגובה לטיפול עם הגדלת ריכוזי TNFα עד 250 pg/mL. ברגולציה של רוביקון עשוי לשחק תפקיד איך נשים שהעוברים הנסיעה יותר גברים הריונות עם השמנת יתר אימהית. Recapitulating דלקת הקשורים עם השמנת יתר אימהית ex-vivo על ידי חשיפת האדם trophoblasts ל אקסוגניים TNFα מספק פלטפורמה לחקור את ההשפעה של התוך-רחמית מהשמנת יתר על התקנון של נתיבים קריטיים ב trophoblasts על ידי הרחבת, הפונקציה היפרדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
placentae נאספו מן העבודה היחידה המסירה בבית החולים האוניברסיטאי תחת פרוטוקול אושרה על ידי המוסדיים סקירה של אורגון הבריאות אוניברסיטת המדע בפורטלנד, אורגון, עם הסכמה מדעת של חולים.
1. אוסף של רקמות היפרדות
- הכנת
הערה: כל הציוד נתקל רקמות חייבת להיות סטרילי.- לחטא את הציוד ויבתר מאת autoclaving עבור 60 דקות בשעה 121 מעלות צלזיוס
- להשתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי): מעבדה מעילים/שמלות/scrubs, כפפות, מסיכה עם מגן הפנים או משקפי.
- הפעל את המים הרותחים, מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
- חם 50 מ ל שני חרוט, צינורות-כל 25 מיליליטר מדיה מלאה המכילה (Iscove ' s שונה Dulbecco ' s בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, טבלה 3) בתוך אמבט מים 37 ° C.
- בהסכמת החולה מושכלת, להשיג את השליה מיד אחרי הלידה בניתוח קיסרי.
- להכיר השליה. חבל הטבור מוכנס בצד העוברי (צלחת שליה), כלי הדם ניתן לראות מקרין החוצה מן האתר ההכנסה הטבור. הנגדי הוא הצד האימהי, או צלחת הבסיס. היא כוללת את רותמי והמבנים המכילים כלי עצים, שנקרא פסיגי הזרע.
- דגימה של רקמת villous חלקית
הערה: רקמת villous חלקית צריך ניתן לטעום מן השליה בהקדם האפשרי לאחר הלידה, רצוי תוך 30 דקות או פחות.- עם לוחית שליה כלפי מעלה, בלו מקטעים מלא-עובי 2-3 (כ 2.5 ס מ x 2.5 ס מ בגודל) 2-3 ס מ מן הפריפריה של השליה-אקראי, באמצעות מלקחיים ומספריים ( איור 1 א').
הערה: להימנע חלקים של השליה המופיעים נורמלי (קרי לבן calcifications). - לקיטום הלוחות שליה ו הבזליים וכלי הדם גדולה לכל.
- מקום הרקמה villous חלקית וכתוצאה מכך ( איור 1B, סה כ- 80-120 g) בתקשורת מלאה חמה ולהתחיל trophoblast בידוד בתוך 30 דקות של דגימה.
הערה: כמה מבחני במורד הזרם, יישומים מושפעים אורך תקופת השהיה בין משלוח הדגימה, בידוד trophoblast. מומלץ לשמור על אלה תקופות כמו קצר ככל האפשר ועקבית בין ומשום. - תוך שימוש בטכניקות המתוארות בצעדים 1.2.1 - 1.2.2, מדגם אקראי 1 ס"מ על 1 ס"מ 5, מקטעי רקמת villous חלקית מעבר השליה (כולל המרכז).
- לחתוך כל דגימה רקמה villous חלקית 1 ס"מ על 1 ס"מ לחתיכות קטנות יותר 4-5 (כ 30 מ ג כל אחד), הכנס 2 מ ל microcentrifuge צינורות, פלאש להקפיא נוזלי N 2. חנות ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש בהמשך מנתח.
- עם לוחית שליה כלפי מעלה, בלו מקטעים מלא-עובי 2-3 (כ 2.5 ס מ x 2.5 ס מ בגודל) 2-3 ס מ מן הפריפריה של השליה-אקראי, באמצעות מלקחיים ומספריים ( איור 1 א').
2. בידוד של Trophoblasts מרקמות villous חלקית
- הכנת
הערה: לבצע הליכים מעורבים בתאי תא למינארי ולהשתמש הציוד סטרילי.- הפשרה צפיפות קפוא ארבעה מעברי צבע (טבלה 1, ראה טבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים) ב 4 ° C בלילה לפני השליה מגיע.
הערה: לחלופין, צפיפות מעברי צבע יכול להתבצע ביום של הבידוד. - התור צנטריפוגה, מוגדר כ- 20 מעלות צלזיוס
הערה: כל השלבים צנטריפוגה נמצאים מרבית האצה והאטה אלא אם צוין אחרת. - הכן 1 x באגירה HEPES תמיסת מלח (HBSS) בתוספת Ca +2 ו- Mg +2 (טבלה 3).
- טריפסין חמים ל- 37 מעלות צלזיוס.
- לדלל DNase כ 2720 kilounits/מ בסטרילית בתוספת HBSS.
- חם 50 מ של העגל היילוד לנסיוב (רכיבי NC) 37 מעלות צלזיוס.
- חם מדיה מלאה 37 מעלות צלזיוס.
- חם מדיה קפוא (90% FBS, דימתיל סולפוקסיד 10%, טבלה 3) כדי 37 מעלות צלזיוס.
התראה: דימתיל סולפוקסיד רעיל ולא חייבים להיות מטופלים עם כפפות.
מאגר - הכן עיכול (טבלה 2 ו- 3) על ידי ערבוב 308 מ ל בתוספת HBSS, 50 מ של טריפסין (3751.7 BAEE יחידות/mL), ו- 0.5 מ ל DNase (379.4 kilounits/mL) בבקבוק סטרילי.
הערה: הזמן המשוער הנדרש כדי לבודד תאים מרקמות villous חלקית הוא ה 7
- הפשרה צפיפות קפוא ארבעה מעברי צבע (טבלה 1, ראה טבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים) ב 4 ° C בלילה לפני השליה מגיע.
- עיבוד הרקמה villous חלקית
- שטיפה כל פיסת רקמה villous חלקית צינור חרוטי 50 מ ל מלא עם פוספט בטמפרטורת החדר buffered תמיסת מלח (PBS). לחזור על ולהחליף את PBS לפי הצורך עד להסרת עודפי הדם (PBS שטיפה יהיה אור אדום או ורוד כאשר הרקמה ביסודיות שוטפים).
- למקם את הרקמה villous חלקית בצלחת פטרי סטריליות, להסיר כלי דם רבים ככל האפשר על ידי גירוד בעדינות הנחה את הרקמות villous חלקית מכלי הדם באמצעות מיקרוסקופ שקופית.
- דק מינצ הרקמה villous חלקית הנוצרת באמצעות מספריים.
- לעיכול רקמות villous חלקית, בידוד גולמי של Trophoblasts
- להעביר את הרקמה villous חלקית טחון לבקבוק סטרילי עם מערכת העיכול פתרון על-פי אמצעי האחסון מחושב על בסיס הפעילות הספציפי של טריפסין ו DNase (165 mL, בטבלה 2).
- לאחר 35 דקות של דגירה באמבט מים 37 ° C ברעידות-70 סיבובים לדקה (סל ד), להטות את הבקבוק עיכול על צידה ולאפשר את פיסות רקמה להתיישב בתחתית הבקבוק מעוכל. להכין היטב את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית, הימנעות הרקמה שיוחסו.
- לוותר על תגובת שיקוע דרך מסננת תא 100 מיקרומטר באופן שווה בין צינורות חרוט 50 מ ל.
הערה: כדי לחסוך זמן, מומלץ להתחיל השני לעיכול על ידי הוספת פתרון מערכת העיכול (מל ' 110, בטבלה 2) הנותרים התיישבו רקמות, חידוש הדגירה כפי שמתואר בשלב 2.3.2. - בעדינות שכבה 3-5 מ של רכיבי NC מתחת תגובת שיקוע מאומצות מאת לאט מחלק מן פיפטה סרולוגית בתחתית הצינורית. מניסקוס בין רכיבי NC מאומצות תגובת שיקוע (trophoblasts מכיל) צריך להיות גלוי ( איור 2 א).
- Centrifuge את supernatants מעל רכיבי NC ב g x 1,250 למשך 15 דקות ב 20 º C. בגדר שייווצר יכלול כדוריות דם אדומות בשכבה התחתונה ביותר ואחריו שכבה לבנה הכוללת תאי trophoblast ( איור 2B).
- חזור על שלבים 2.3.2 - 2.3.5 עבור כל אחד השני והשלישי digestions (הוספת 110 מ ל ו- 83.5 מ', בהתאמה, של מערכת העיכול פתרון של הבקבוק של רקמות, בטבלה 2).
- ברגע יש כבר centrifuged כל supernatants, resuspend כל גלולה ב 5 מ של מדיה מלאה חמה ולאחר מכן בריכה יחד את המתלים.
- לפצל התליה תא באופן שווה בין שני צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 1,250 x g למשך 15 דקות ב- 20 ° C.
- בעדינות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend אחד של כדורי תא ב 6 מ של חם להשאז תוציא את המדיה-
- צפיפות צנטריפוגה
- לחלק התליה תא באופן שווה בין ארבע צפיפות מעברי צבע (3 מ ל כל אחד) על ידי לאט ובזהירות שכבות התליה תא בראש צפיפות מעברי הצבע עם pipet העברה.
- Centrifuge מעברי הצבע צפיפות-1,250 g x עבור 20 דקות ב- 20 ° C עם מינימום האצה והאטה. זה צריך לייצר להקות ניתן להבחנה של תאים sedimented (טבלה 4).
- לאט ובזהירות להסיר את השכבות העליון של צפיפות הדרגתיות מדיה (DGM) עד שירטס אטום המכיל תאים trophoblast (בין 35-50% DGM) (טבלה 4).
- להעביר הלהקות trophoblast 50 מ ל שני צינורות חרוט ולמלא מדיה מלאה חמה.
- בעדינות היפוך צינורות 3 - 6 פעמים כדי לערבב צנטריפוגה ב g x 1,250 למשך 15 דקות ב- 20 ° C.
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה תא ב 5 מ של מדיה מלאה חמה. לשלב את המתלים תא ולספור התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan blue (או מועדף תא ספירת בשיטה).
- ספירת תאים עם Hemocytometer
- לערבב התליה תא pipetting למעלה ולמטה עם pipet סרולוגית או על ידי היפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים.
- לשלב חלקים שווים של הבולם תא, Trypan blue (כלומר 20 µL כל) בצינור נפרד ומערבבים בעדינות.
- Incubate 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
- בעדינות לוותר על 15-20 µL של התא-Trypan כחול תערובת של coverslip ועד hemocytometer את ולאפשר לתאים מפוזר ברחבי הרשת על-ידי נימיות.
- נחשב התאים קיימא (תאים מתים להיות מוכתם כחול עמוק) בכל אחד הרביעים 4 4 x 4 עם מונה צמיגים בוערים. מעסיקים מערכת ספירת כדי להבטיח התאים אינם נספרים יותר מפעם אחת (כלומר לא לספור תאים לגעת למטה או שמאלה גבולות).
הערה: כל רביע 4 x 4 צריך להכיל בין 50-150 תאים. מעט מדי או יותר מדי תאים יכול להוביל נגמר או underestimation של מספר הטלפון הנייד של. - ממוצע בתא סכום שנחשב מכל אחד הרביעים 4 x 4, להכפיל ב 10 4, ואז תכפיל על ידי הגורם דילול (השעיה תא כדי Trypan blue) לחישוב מספר תאים לכל mL-
- להכפיל את מספר התאים לכל mL הנפח הכולל של השעיה תא כדי לחשב את התשואה הכוללת תא.
הערה: כ-100 מיליון תאים צפויים מ ומשום החל מ 80-120 גרם של רקמת villous חלקית.
- תאי ציפוי
- צלחת 3 מיליון תאים/טוב (3.3 x 10 5 תאים לכל ס מ 2) לתוך צלחת 6-טוב (2 מ"ל של השעיה לכל טוב), בעדינות רוק אחורה וקדימה, צד לצד לפיזור אחיד של התאים.
הערה: Trophoblasts לדרוש תרביות רקמה מטופלים צלחות לדבוק כראוי. טפט של תאים נדרשת כדי לקדם את syncytialization. - להשאיר מצופים בתאים למינארי כ 30 דקות לאפשר לתאים באופן שווה להפיץ, להתפשר, ולהתחיל לדבוק בתחתית הבארות לפני הצבת בחממה.
- התרבות תאים עבור עד 72 שעות (עם המדיה משתנה מדי יום) בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 ו- 95% לחות.
הערה: לבחון את trophoblasts תחת מיקרוסקופ ב 10-20 x בכל 24 שעות של תרבות. Trophoblasts לא להתרבות, לא יכול להיות passaged. במהלך 72 h של התרבות, trophoblasts בודדים עגול הפתיל כדי ליצור את syncytium ( איור 3 א ו- B).
- צלחת 3 מיליון תאים/טוב (3.3 x 10 5 תאים לכל ס מ 2) לתוך צלחת 6-טוב (2 מ"ל של השעיה לכל טוב), בעדינות רוק אחורה וקדימה, צד לצד לפיזור אחיד של התאים.
- הקפאת תאים
- גלולה תאים שאינם בשימוש על ידי צנטריפוגה-1,250 g x 10 דקות ב- 20 ° C.
- תשאף כמה שיותר מדיה ככל האפשר מתוך בגדר.
- Resuspend בגדר קפואים מדיה (טבלה 3).
- להקפיא את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס בתוך מיכל הקפאה מלאים 100% אלכוהול איזופרופיל. להעביר את aliquots קפוא נוזלי N 2 למחרת לאחסון לטווח ארוך-
הערה: תאים יכולים להיות תרבותי לאחר הקפאה.
- מפשיר תאים
- והפשרה באמבט מים 37 ° C תוך מתערבל של הסרה של aliquot של תאים קפוא. להסיר aliquot את האמבט במים לפני זה יש מלא הקרת לנוזל.
- להעביר מיד את התאים המופשרים צינור חרוטי 15-ml. מתחיל להאט בתחילה, להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה עם ערבוב לסירוגין.
- להפוך את התחתית מספר פעמים כדי לערבב.
- צנטריפוגה-200 גרם x 10 דקות ב 20 º C.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 2-5 מ של מדיה מלאה חמה.
- לספור את התאים ואת צלחת כאמור תיאר.
3. הטיפול העיקרי Trophoblasts עם TNFα, אוסף של תאים Lysates המערבי סופג
- הכנת
- לחמם מדיה מלאה 37 מעלות צלזיוס.
- עושים מלאי µg/מ"ל של TNFα מדיה מלאה, חנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש.
- להפוך 1 µg/mL מלאי עבודה של TNFα בתקשורת מלאה כאשר מוכנה לטפל התאים. סידורי לדלל את מלאי עבודה TNFα 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL של 125 pg/mL בתקשורת מלאה.
הערה: ריכוז TNFα 10 4 pg/mL היא ציטוטוקסיות במתינות. ההתאמה של ריכוז TNFα נבדק תלויות בפרטים של היישומים הרצויים במורד הזרם.
- לטיפול תאים עם TNFα
- לאחר 24 שעות של תרבות, תשאף התקשורת התרבות את התאים ואת החלף ב 2 מיליליטר TNFα שיושלם מדיות לכל טוב על. ובכן 6 צלחות (לפחות שתי בארות לכל טיפול, רכב פקד).
- לאחר 24 h TNFα-חשיפה (48 שעות של תרבות), להחליף את מדיות TNFα בתוספת מדיה מלאה.
- קציר תאים וחלבונים הכולל
- לאחר 72 h של תרבות (24 h בעבר הסרת TNFα), תשאף מדיה, לשטוף בעדינות תאים עם טמפרטורת החדר PBS ולהוסיף 80 µL של קרים כקרח Radioimmunoprecipitation Assay מאגר (ריפה) המכיל טרי להוסיף מעכבי פרוטאז, פוספטאז (טבלה 3) ישירות מכל קידוח.
- להסיר התאים הצלחת עם המגרד התא. להעביר את התאים צינור microcentrifuge 1.5 mL, איגוד בארות בתוך קבוצות הטיפול.
- Lyse בתאים על-ידי vortexing הצינורות גבוה לפחות שלושה במרווחים של 15 ס'
- דגירה התאים ב 4 ° C עם נדנדה במשך 15 דקות
הערה: לחלופין, לאחר שלב 3.3.3., התאים יכולים להיות מודגרות על קרח למשך 15 דקות עם עצבנות לסירוגין על ידי מצליף את הצינור, vortexing, או pipetting למעלה ולעשותמהסכנה. - חזור על שלב 3.3.3.
- Centrifuge הצינורות ב g x 10,000 למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה פסולת הסלולר.
- העברת תגובת שיקוע (המכילה חלבון תאית) צינור microcentrifuge 1.5 mL החדש, חנות ב-80 מעלות צלזיוס
הערה: הפרוטוקול יכול להיות עצר כאן, חודשה במועד מאוחר יותר. מומלץ להכין מספר aliquots של דגימות חלבון הסלולר כדי למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. - לקבוע ריכוז החלבון הכולל בשיטה המועדפת, כגון וזמינותו חומצה bicinchoninic (BCA, עיין בטבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים).
- מרחביות-דף, ווסטרן סופג רוביקון או חלבון של עניין
הערה: בצע המערבי סופג פרוטוקולים על פי יצרן ' s הוראות שימוש במערכת המעבדה המועדפת.- עומס בין 20-40 µg של חלבון הכולל במאגר מדגם (טבלה 3) לכל טוב על אקרילאמיד 12% ג'ל. להפריד חלבונים על ידי עמודים מרחביות בניהול מאגר (טבלה 3).
- רטוב-העברת החלבונים של הג'ל על קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על פי יצרן ' s הוראות במאגר העברה (טבלה 3).
- דגירה קרום אבקת חלב 5% ב- Tris-Buffered Saline עם 0.1%-20 Tween (TBST, טבלה 3) לפחות שעה בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
- דגירה הקרום ב נוגדן ראשוני רוביקון (ראה טבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים)-שבערך באבקת חלב 1% ב- TBST בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה.
- בעדינות לשטוף את הקרום 3 x 5 דקות ב- TBST ו- 1 x 5 min ב- TBS בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
- דגירה הקרום ב 1:2000 - נוגדן משני 1:5000 (מועדף או מקושרים-HRP גלוי המספר המשלים, עיין בטבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים) אבקת חלב 5% ב- TBST לפחות שעה בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
- חזור על הפעולות כביסה המתוארים שלב ' ר 3.4.5 והמחש את האבן החשופה עם סובסטרט (קרי chemiluminescent) ויזואליזציה המתאים במערכת ההדמיה.
- חזור על הפעולות כביסה המתוארים שלב ' ר 3.4.5 ואני בדיקה הקרום עבור β-אקטין או פקד הטעינה מועדף על פי יצרן ' הוראות s.
- על תוכנת ניתוח התמונות המועדף, לנתח את הביטוי של רוביקון מאת כימות ידנית של ספיגת (עוצמות הלהקה), חיסור של רקע ספיגת ונורמליזציה הטעינה המתאימים לשלוט בעוצמות הלהקה. לבצע ניתוחים סטטיסטיים בהתאם לבדיקת שינויים משמעותיים מבחינה סטטיסטית רמות החלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מונח אנושי מאחד לשני מ רזה (מדד מסת הגוף שלפני ההריון (BMI) < 25) אמהות עם הריונות מסובכת נושאת צאצאים נקבות היו נאספים, שנדגמו תוך 15 דקות מרגע הלידה בניתוח קיסרי (ללא עבודה). מאחד לשני נבחנו בהעדר calcifications ופיתוח טיפוסי: שקילה בין 300-600 גרם עם חבל הטבור ממברנות הוסר, עגול בצורת, בין 15-25 ס מ קוטר, מוכנס לתוך האמצע חבל הטבור השליה. רקמות villous חלקית היה גזור מן הבזליים, שליה הלוחות ב- 2-3 דגימות על פני השליה (איור 1), מניב כ 100 גרם של רקמת villous חלקית כמתחילה חומר בידוד trophoblast הראשי. בתוך 20 דקות של דגימת רקמה villous חלקית, ההליך כדי לבודד trophoblasts העיקרי הופעל כפי שמתואר כאן, מניב בין 0.8 - עונה 1 פרק 108 התאים קיימא. התאים היו נזרע ב 6-ובכן תרבות צלחות על צפיפות של 3 x 106 (3.3 x 105 תאים לכל ס מ2). לאחר 24 שעות של תרבות, התאים נבדקו תחת מיקרוסקופ עבור הקובץ המצורף, מורפולוגיה תקין trophoblast אושרה (בודדים סביב התאים). התקשורת תרבות הוחלף המדיה מלאה המכילה סדרה של ריכוזי TNFα בין 125-104 pg/mL כך לפחות שתי בארות נכללו לפי ריכוז ושליטה ברכב (מדיה מלאה בלבד).
עשרים וארבע שעות לאחר TNFα-הטיפול (48 שעות של תרבות), כל מדיות TNFα הוחלפו במדיה מלאה. אין מוות תאי ניכר נצפתה עקב טיפול עם TNFα בריכוזים או תחתיו 103 pg/mL. טיפול עם4 10 pg/mL TNFα היה בינוני ציטוטוקסיות, השפעת הריכוז הזה TNFα ציטוטוקסיות אינן נמשכות לאחר התקשורת השתנה כפי שמעידים לקטט דהידרוגנאז (LDH) מבחני (נתונים לא מוצג). ב- 72 h של התרבות התאים נבדקו לצורך syncytialization תחת מיקרוסקופ. Immunocytochemistry עבור syncytialization וזיהום פיברובלסט חשף בידוד טהור יחסית של trophoblasts (איור 3). Lysates הסלולר נבצרו לפי הפרוטוקול המתואר כאן, מניב בין 3-8 µg/µL של חלבון הכולל לכל הכנה כפי שנקבע על ידי וזמינותו BCA (נתונים לא מוצג). המערבי כתם ניתוח תא lysates מ- trophoblasts נשים שטופלו TNFα הראה קולטנים של upregulation של רוביקון ביטוי בתגובה ריכוזי TNFα עד 250 pg/mL downregulation הבאים לביטוי רוביקון בריכוזים TNFα גדול מ- 250 pg/mL (איור 4A ו- B, 104 pg/mL נכללו ניתוח המבוסס על אפקטים ציטוטוקסיות). באופן דומה, רוביקון היא משמעותית upregulated של ביופסיות רקמות villous חלקית קפואה מ מאחד לשני של הריונות שמנים עם העוברים נקבה לעומת שולט רזה כפי שמעידים תספיג ניתוח (איור 4C ו- D, n = 6 מאחד לשני לפי BMI כיתה, אנובה, P < 0.05).
| ריכוז (%) | 90% DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | עובי השכבה (ml) |
| הדרגה x 4 | הדרגה x 4 | סה כ 34.5 מ | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (סימן 13.5 מ) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (סימן 19.5 מ) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
טבלה 1. מפרטי להכנת צפיפות מעברי צבע עבור צנטריפוגה צפיפות של ראשית Trophoblasts.
משמאל לימין, הטור הראשון מציין המדיה הדרגתיות צפיפות (DGM, עיין בטבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים) ריכוז המבוטא באחוזים של DGM ב- HBSS. הטור השני מציין את עוצמת הקול של DGM בזמן עמודה 3 מציין את עוצמת הקול של HBSS הנדרשים להכנת אחוז DGM הפתרון המתאים. עמודה 4 מציין את אמצעי האחסון יתווספו 50 מ ל צינור חרוט כדי לבנות מעבר הצבע, החל מהשכבה הצפופים ביותר.
| טריפסין | HBSS | DNase | ||
| עיכול | (סה כ פעילות; BAEE יחידות) | נפח (ml) | (סה כ פעילות; Kunits) | הנפח הכולל /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 מ"ל) | מ ל 141.76 | 62594 (0.230 מ) | 165 מ |
| 2 | 412691 (15.34 מ) | 94.51 ml | 41729 (0.154 מ) | 110 מ |
| 3 | 313270 (11.65 מ"ל) | מ ל 71.74 | 31676 (0.116 מ) | 83.5 מ |
| סה | 1345000 (50 מ"ל) | 308 מ | 136000 (0.5 מ) | מ ל 358.5 |
בטבלה 2. מפרטי עבור הכנת מערכת העיכול פתרון לבידוד Trophoblast הראשית מבוסס על פעילות ספציפית DNase וטריפסין.
משמאל לימין, העמודה הראשונה מציין את מספר digestions, העמודה השנייה מציין את הפעילות טריפסין הנדרש לכל מערכת העיכול, העמודה השלישית מציינת את הנפח הכולל של HBSS שהושלם שיש להוסיף למערכת העיכול המתאים, העמודה הרביעית מציינת את הפעילות DNase הנדרש לכל מערכת העיכול, הטור הסופי מציין את אמצעי האחסון של מערכת העיכול פתרון להיותלהוסיף הרקמה היפרדות לעיכול המתאים.
| HBSS (בתוספת Ca+2 ו- Mg+2) | מאגר דוגמאות |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 צבע X Laemmli |
| מ מ 1.26 CaCl2 (anhyd). | 10% מרקפטואתנול |
| מ"מ 0.80 MgSO4 (anhyd). | |
| 20.77 מ מ HEPES | |
| ה-pH ל 7.4 עם 10N NaOH להפוך את אמצעי האחסון עד 1 L עם ddH2O עקר מסנן סטרילי לתוך בקבוק סטרילי |
|
| התקשורת מלאה | מאגר הפעלה |
| הסר 11% v/v IMDM | בסיס טריס 25 מ מ |
| להוסיף 10% v/v FBS | 190 מ מ גליצין |
| להוסיף 1% 10,000 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (100 סופי U/mL) | 0.1% מרחביות |
| ה-pH ל 8.3 | |
| הקפאת מדיה | |
| 90% v/v FBS | מאגר ההעברה |
| 10% v/v דימתיל סולפוקסיד | 25 מ מ טריס |
| 190 מ מ גליצין | |
| מאגר עיכול | 20% מתנול |
| 50 מ ל טריפסין (26,900 BAEE יחידות/mL) | ה-pH ל 8.3 |
| 0.5 mL DNAse (272,000 K יחידות/mL) | |
| להביא מ 358.5 ל HBSS שהושלם | TBS |
| 20 מ מ טריס | |
| מאגר ריפה | 150 מ מ NaCl |
| 25 מ מ טריס-HCl | ה-pH ל 7.6 |
| 5 מ מ EDTA | |
| 150 מ מ NaCl | TBST |
| 0.1% מרחביות | TBS עם Tween 0.1% 20 |
| 0.5% נתרן deoxycholate | |
| 1% טריטון X-100 | |
| מאגר ריפה 1 טבליה של מעכב פרוטאז/פוספטאז לכל 10 מ |
בטבלה 3. הפתרונות הנדרשים עבור בידוד, תרבות של ראשי Trophoblasts ואחריו המערבי סופג.
| % DGM | מארק ml | סוג התא |
| 10 | 31.5-34.5 | פסולת |
| 20 | 28.5-31.5 | |
| 30 | 22.5-28.5 | |
| 35 | 19.5-22.5 | Trophoblasts |
| 40 | 16.5-19.5 | |
| 45 | 13.5-16.5 | |
| 50 | 10.5-13.5 | לימפוציטים |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4.5-7.5 | כדוריות דם אדומות |
| 70 | להלן 4.5 |
בטבלה 4. שיקוע של Trophoblasts על ידי צנטריפוגה צפיפות.
משמאל לימין, העמודה הראשונה מציין את אחוז DGM (טבלה 1), העמודה השנייה מציין הסימן mL שבו אחוז DGM המתאים נמצא על צינור חרוטי 50 מ ל, העמודה השלישית מציינת איזה משקעים סוג התא- התואמת באחוזים סימן DGM ו- mL על צינור חרוטי 50 מ. משקעים trophoblasts בין 50-35% DGM, ויוצרים להקות אטום ברורים. איסוף DGM מעל או מתחת לטווח זה יובילו לזיהום של פסולת הסלולר ואת סוגי תאים אחרים כגון לימפוציטים.
איור 1. רקמות villous חלקית הוא מבודד מן השליה האנושית המונח על-ידי הסרת כוריוני וצלחות הבזליים.
A) עם שליה לוחית (צד עוברית) כלפי מעלה, מדגם עובי מלא טוחנות מן השליה. B) דגימת רקמה villous חלקית מתקבל על-ידי הסרת הלוחות שליה ו הבזליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. צנטריפוגה של תאים בפתרון עיכול על סרום העגל היילוד תוצאות גלולה תא מרובה שכבות.
A) סרום העגל היילוד (רכיבי NC) מורכבת משכבות מתחת התליה תא בפתרון תקציר צינור חרוטי 50 מ ל. B) צנטריפוגה של (א) התוצאה היא גלולה תא מרובה שכבות. הרובד התחתון ביותר הוא בצבע אדום עמוק ומורכב של כדוריות דם אדומות. השכבה הנ ל כולל trophoblasts והוא לבן או בז בצבע. מעל trophoblast היא השכבה רכיבי NC ואחריו פתרון מערכת העיכול (supernatant) לחלק העליון של הצינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. ניתוח Immunocytological של Syncytialization ותוכן פיברובלסט בתרבויות ראשי Trophoblast האנושית.
A) התמונה נציג של Cytokeratin-7 (אדום) ב- cytotrophoblasts לאחר 24 שעות של תרבות. B) התמונה נציג של Cytokeratin-7 (אדום) ב- syncytiotrophoblasts לאחר 72 h של תרבות מראה multinucleated המוני תאים מתאחד. C) התמונה נציג של Vimentin (אדום) ב- syncytiotrophoblasts לאחר 72 h של תרבות. תמונות נרכשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם counterstain גרעיני דאפי (כחול). דמיינו בהגדלה X 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. רגולציה של רוביקון ביטוי בתגובה TNFα-טיפול ב Trophoblasts הנשי וביטוי רוביקון אנדוגני ברקמת villous חלקית של לין נגד הריונות שמנים עם העוברים הנשי.
Trophoblasts הראשי של המונח מאחד לשני של אמהות רזה עם הריונות בריאים נושאת העובר נקבה היו מבודדים ו שטופלו 125, 250, 500, 103, ו4 10 pg/mL TNFα (או בקרת הרכב). A) חשופה המערבי נציג עבור רוביקון ב trophoblast הנשי lysates שטופלו TNFα. Β-אקטין שימש פקד הטעינה. B) רוביקון בתגובה TNFα-טיפול ב- trophoblasts הנשי היה לכמת מן המערב שהכלים וביטוי מנורמל ל β-אקטין. ערכים הם ביטוי רוביקון מתכוון לכל TNFα ריכוז ± S.E. ב- n = 3 מאחד לשני. C) המערבי אבנים בודדות עבור רוביקון של כל הרקמות lysates של פלאש קפוא ביופסיות של רקמה villous חלקית מתוך רזה לעומת הריונות שמנים עם העוברים הנשי (F1-F12). לקטט דהידרוגנאז A (LDHA) שימש פקד הטעינה. D) רוביקון ביטוי מערביות לחומה מ (ג) היה לכמת, מנורמל ל LDHA. ערכים הם ביטוי רוביקון רשע לפי BMI סיווג ± S.E. ב n = 6 מאחד לשני בכיתה ה-BMI (ANOVA, * P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השליה, אחראית להסדרת הצמיחה של העובר, תערוכות פונקציה פרוץ ב סביבה שמנים6. למרות דרישות המטבולית גבוהה של trophoblasts, מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית התערוכה מתפקדת נשימה מיטוכונדריאלי6,19. שינויים בחילוף החומרים היפרדות עשוי לתרום שכיחות מוגברת של סיבוכים ותוצאות עוברית לוואי נצפו הריונות שמנים3,6,7. Autophagy בסכנה גם ב מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית. מאחד לשני של הריונות שמנים בעוברים זכרים הראה שטף autophagic לא מתפקדת כפי שמעידים ההצטברות של autophagosomes13. שמירה על שטף autophagic האופטימלי הוא קריטי עבור הסלולר הומאוסטזיס ואת autophagy פגומים ב מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית עשוי לשחק תפקיד חשוב בתיווכן של תוצאות שליליות הקשורות הריונות מהשמנת יתר.
דוחה מדויק של הפונקציה היפרדות פרוץ הציג ההשמנה האימהית אינם מובנים היטב, ייתכן מקורם איתות דלקתיות. השמנת יתר והן ההריון הם מדינות proinflammatory המאופיינת על ידי רמות גבוהות של מחזורי TNFα1,4,20,21. TNFα activator autophagy22,23, ייתכן לתווך שינויי שטף autophagic ב מאחד לשני של הריונות מהשמנת יתר. TNFα משמש בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעות של דלקת בתאי, במיוחד בהקשר של סרטן2. פרוטוקול המובאת כאן מסתגל גישה זו ללמוד את ההשפעות של דלקת הקשורות להשמנת יתר על הקיבולת הפונקציונלית של השליה על ידי טיפול trophoblasts ראשי עם TNFα אקסוגני בתרבות.
פרוטוקול זה כולל ארבעה מרכיבים עיקריים: דגימה של רקמת villous חלקית של השליה, בידוד של trophoblasts הראשית מרקמות villous חלקית, תרבות של trophoblasts הראשי ואחריו TNFα וטיפול, אוסף הכולל lysates הסלולר ואחריו המערבי כתם ניתוח כדי למדוד את הביטוי של protein(s) עניין. כדי לבודד trophoblasts טהור, זה קריטי כי הלוחות שליה ו הבזליים הם ביסודיות גזור מן הרקמה villous חלקית במהלך הדוגמאות של השליה (איור 1B). . זה גם הכרחי כי רקמת villous חלקית מעובד מבעוד (דהיינו בתוך 30 דקות של משלוח). פרוטוקול זה פרטי השימוש של שלושה צעדים עיכול, כל 35 דקות לאורך זמן, כדי לשחרר trophoblasts מתוך מטריצת סלולרית נוספת של הרקמה villous חלקית. Digestions ממושך תסתכן תאים מזיק trypsinization של חלבונים פני שטח התא. הגדלת מספר מעכל לא ניכרת להגדיל את התשואה הסופית של קיימא trophoblasts. אולם, להקטין את הזמן ואת המספר של digestions תגרום תא ירד התשואות (סיימון Bucher, Maloyan, שלא פורסמו נתונים). פרוטוקול זה מייצר באופן אמין כ-100 מיליון תאים מ 80-120 גרם של רקמת villous חלקית.
יש השתנות במספר להקות trophoblast ניתן להבחנה מובחנים צפיפות מעברי הצבע בין ומשום. כדי למנוע זיהום של סוגי תאים אחרים, חשוב לאסוף בקפדנות את שירטס המכיל trophoblasts במעבר הצבע צפיפות (טבלה 4). פרוטוקול מפורט כאן ממוטבת מפעולות שנקבעו קודם המניבים trophoblasts טהור יחסית עם פחות מ- 5% זיהום של תא שני סוגי10,11,12. טיהור נוספת יכולה להיות מושגת על ידי בחירה חיובי או שלילי24. עם זאת, גישה זו מסתכנת לצמצם את התשואה של קיימא trophoblasts. ניתוח Immunocytochemical של Cytokeratin-7 trophoblasts הראשית מבודדים באמצעות ההליך המובאת כאן אחרי 24 לעומת 72 h של תרבות זמן אישר כי התאים שעברו syncytialization כפי שמעידים הנוכחות של המוני תאים multinucleated ב- 72 h, אירוע איכותי ב תוחלת החיים של trophoblast (איור 3 א ו- B). יתר על כן, ניתוח immunocytochemical של Vimentin trophoblasts ראשי ותרבותית של 72 h חשף מעט מאוד משחיתה fibroblasts (איור 3C). למטרות שגרתית, ניתן לנטר את טוהר trophoblasts בתרבות על ידי הערכה מורפולוגית פשוטה. ב 24 שעות של זמן תרבות, סביב cytotrophoblasts בודדים שולטים התרבות. Cytotrophoblasts עוברים syncytialization לאחר 72 h של תרבות, וכתוצאה מכך גושים של תאים מאוחה. הסוג הנפוץ ביותר תא מזהמים נמצאו בתרבות זו הוא פיברובלסט או תא אנדותל, שהן מוארך, מצולע בכושר, בהתאמה. תכונות אלה ניתן יהיה בערך פיקוח באמצעות מיקרוסקופ בהיר.
טיפול ראשוני trophoblasts עם TNFα מספק מערכת מבוקרת המאפשר אחד כדי למדוד את ההשפעה של TNFα איתות על התקנון של נתיבים קריטיים ב- trophoblasts. באופן טבעי, ישנם גורמים אחרים מלבד TNFα הסביבה האימהית שמנים ויוו שעשויים להיות אחראי להתכוונן פונקציה trophoblast. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים אותות הורמונלי, היפרליפידמיה, וכן שורה של גורמים אחרים proinflammatory25. שילובים של טיפולים שונים נוספים מסכם את הדברים של שמנים רחמית לשעבר vivo בצורה מדויקת יותר מבחינה פיזיולוגית. ריכוזי TNFα אקסוגני המשמשת לטיפול trophoblasts ב פרוטוקול זה רחוק עולים על אלו בדרך כלל במחזור vivo. סרום ריכוזי כבר דווח על מנת להגיע 20 ng/mL ומעלה מסוים התנאים דלקתית26. כדי לקבל תגובה מדידה על ידי שיטות מעבדה הנוכחי (סופג דהיינו המערבי), יש צורך להגביר את ריכוזי TNFα לחשוף לשינויים ביטוי גנים מסלולים מעניינים. תגובות אלה ייתכן שקיימים ויוו פחותה. עם זאת, הם יכולים בכל זאת להשפיע באופן משמעותי את תפקוד trophoblasts. חשיפת trophoblasts כדי ריכוזים גבוהים של TNFα מסתכנת לייצר חפצים על ביטוי גנים וניתוחים מסלול זה עשוי להיות מושרש ציטוטוקסיות אפקטים. Cytotoxicity מתון נצפתה ב trophoblasts נחשפים 104 pg/mL TNFα בתוספת מדיה במשך 24 שעות ביממה, כפי שמעידים LDH cytotoxicity מבחני (נתונים לא מוצג). עם זאת, ריכוז או תחתיו3 10 pg/mL TNFα לא לייצר כל מוות של תאים ניכר.
בדיקה TNFα ריכוזים במרווחים קטנים ו/או דברים שהם יותר נמוך ממה שמתואר כאן שעשוי להיות הטוב ביותר מלווה כמותייםתגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) לניתוח ביטוי גנים, טכניקה גם מתאים לזיהוי שינויים קטנים בביטוי הגנים. בעוד qPCR בדיקות במיוחד עבור רמות ביטוי גנים ברמת תעתיק, סופג המערבי מזהה את רמות הסופי של מוצרי פרוטאין ככל הנראה הזמינים לביצוע או לפעילויות הסלולר שלהם. באמצעות שתי שיטות אנליטיות בשיתוף היא גישה רב-עוצמה לקביעת השפעת טיפול TNFα על התקנון של ג'ין רמות הביטוי כמו גם באשר לקבוע אם השינויים ברמות ביטוי הם תוצאה של תעתיק, תקנה post-transcriptional, או post-translational. מתח דלקתיות עשוי להשפיע trophoblast התנהגות, מורפולוגיה, syncytialization. כולל הערכות מורפולוגי (קרי immunocytochemistry) בנוסף גישות אנליטיות מולקולרית תספק ניתוח מקיף יותר של ההשפעות של חשיפה TNFα על בריאות trophoblast. התאמת TNFα בריכוזים שנבדקו, במורד הזרם מבחני בהתאם לדרישות ניסיוני, מומלץ.
על-ידי יישום הפרוטוקול המתואר כאן, בתיווך TNFα דלקת הוא נמצא כדי upregulate רוביקון ביטוי trophoblasts האנושי של הריונות רזה עם העוברים הנשי. המערבי סופג עבור רוביקון ב- trophoblast lysates חשף שתי להקות שונות ליד ומעל את המשקל המולקולרי הצפוי של 140 kDa (איור 4A). יש עדות לכך כי הלהקה התחתונה היא לא ספציפית (pAb רוביקון אנטי PD047, גליון נתונים MBL, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Trophoblasts של נשים הפגינו את היכולת upregulate הביטוי של רוביקון בתגובה TNFα טיפול של ריכוזים עד 250 pg/mL. בריכוזים גבוהים יותר ביטוי זה, רוביקון רמות ירד בחזרה לכיוון בסיסית (פקד ללא טיפול) ואפילו מתחת (איור 4B, n = 3). בהתחשב בכך לטיפול trophoblasts של הריונות רזה עם TNFα המדמה דלקת התוך-רחמית מהשמנת יתר, התוצאה זו משלים מציאת רוביקון היא משמעותית upregulated של ביופסיות רקמות villous חלקית קפואה מ מאחד לשני של הריונות שמנים עם העוברים נקבה לעומת שולט רזה (איור 4C ו- D, אנובה, n = 6 בכיתה ה-BMI, P < 0.05).
בעוד autophagic השטף מופיע נבדלים trophoblasts של הריונות שמנים עם העוברים נקבה לעומת שולט רזה, trophoblasts של הריונות שמנים בעוברים זכרים מוצג ההפעלה של היווצרות והצטברות של autophagosomes 13. רוביקון הוא מווסת שלילי של autophagy, שבו היא פועלת להפסקת ליזוזום autophagosome פיוז'ן27. Trophoblasts נקבה עשויה upregulate הביטוי של רוביקון כמנגנון פיצוי או מגן נגד דלקת בתיווך TNFα, אשר ניתן להפעיל autophagy22, המאפשר להם לשמר רזה כמו שטף autophagic בסביבה של השמנת יתר אימהית. תגובה זו את השליה עשוי לשחק תפקיד איך נשים שהעוברים הנסיעה יותר גברים שמנים התוך-רחמית. מידול את חצרו דלקתיות המשויכים השמנת יתר אימהית שמחוץ דרך לטיפול העיקרי trophoblasts האנושי עם TNFα מספק פלטפורמה לחקור את ההשפעות של התוך-רחמית מהשמנת יתר על התקנון של נתיבים קריטיים ב trophoblasts. המתקנת פרוטוקול זה עם טיפולים חדשים, קומבינטורית מכוון recapitulating הסביבה האימהית שמנים תספק שדרה מרגש לחקור את ההשפעות של השמנת יתר אימהית על תפקוד היפרדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה נשים שתרמה שלהם מאחד לשני במחקר זה. אנו מודים גם את העבודה ואת משלוח במחלקת OHSU ואת Maternal צוות המחקר העוברי לתיאום איסוף מאחד לשני. אנו אסירי תודה אריק וונג, Ph.d., ו קלי קואו, MD לתמיכה, לעזור עם שיטות נסיוניות ואופטימיזציה.
עבודה זו מומן על ידי NIH HD076259A (AM) ו AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A.
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P.
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B.
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
