Summary
Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.
Abstract
Obesidade materna está associada com um risco aumentado de resultados perinatais adversos que são provavelmente mediadas por comprometido função placentária que pode ser atribuída, em parte, a desregulação de autofagia. Aberrantes alterações na expressão dos reguladores de autofagia nas placentas de gestações obesas podem ser regulamentadas por processos inflamatórios associados com obesidade e gravidez. Descrito aqui é um protocolo para a recolha de amostras de tecido das vilosidades e isolamento de cytotrophoblasts das vilosidades da placenta humana termo para cultura de células primárias. Isto é seguido por um método para simular o milieu inflamatório no ambiente intra-uterino obeso, tratando trophoblasts primários de gravidezes magras com fator de necrose tumoral alfa (TNFa), uma citocina proinflammatory que é elevada na obesidade e no gravidez. Através da implementação do protocolo descrito aqui, encontra-se que a exposição a exógena TNFa regula a expressão do Rubicão, um regulador negativo de autofagia, em trophoblasts de magras gravidezes com fetos do sexo femininos. Embora uma variedade de fatores biológicos no ambiente intra-uterino obeso manter o potencial de modular caminhos críticos no trophoblasts, este sistema ex vivo é especialmente útil para determinar se os padrões de expressão observada na vivo na placenta humana com obesidade materna são um resultado direto de TNFa sinalização. Em última análise, essa abordagem oferece a oportunidade de analisar as implicações regulamentares e moleculares da inflamação associada com obesidade materna na autofagia e outras vias celulares críticas no trophoblasts que têm o potencial de impacto função da placenta.
Introduction
A obesidade é um estado inflamatório, caracterizado por inflamação crônica de baixo grau, decorrentes de excesso de tecido adiposo e disponibilidade de nutrientes. Na obesidade, cytokines proinflammatory são elevados em tecidos metabólicos, bem como sistemicamente em circulação. Um conjunto robusto de provas demonstrou que TNFa é significativamente elevada no cenário da obesidade com implicações na resistência à insulina e disfunção metabólica1. Ativação de TNFa também contribui para a patogênese da doença em condições tais como câncer e auto-imunidade, tornando-se uma atraente alvo terapêutico2.
Inflamação na obesidade é agravada pela gravidez, também, um estado proinflammatory3,4. Anteriormente mostrou que aumenta o conteúdo de TNFa placentário com adiposidade materna em gestações com fetos do sexo femininos. Além disso, tratamento de TNFa inibe a respiração mitocondrial nas células do trofoblasto feminino mas não masculino, sugerindo que o TNFa está envolvida na regulação do metabolismo da placenta em uma maneira sexualmente dimórficos5. Obesidade materna está associada com o aumento da incidência de uma variedade de complicações durante a gravidez, incluindo natimorto, com fetos masculinos, sendo a mais suscetível de3,6,7,8 . Devido ao seu papel chave na interface materno-fetal, alterações na capacidade funcional da placenta no ambiente intra-uterino obeso em resposta a sinalização inflamatória podem desempenhar um papel importante na mediação os resultados das gestações obesos.
Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts no tecido das vilosidades da placenta são críticos para a troca de nutrientes e oxigênio entre a mãe e o desenvolvimento do feto9e sinalização do sistema endócrino. Interrupções na capacidade funcional de cytotrophoblasts das vilosidades (doravante referida como trophoblasts) podem colocar em risco a saúde fetal e desenvolvimento. Este protocolo descreve um método para amostragem de tecido das vilosidades da placenta humana termo embora dissecando as placas coriônica e basais, juntamente com um processo otimizado para o isolamento de trophoblasts para cultura de células primárias. Este protocolo é derivado de metodologias estabelecidas envolvendo digestão enzimática do tecido das vilosidades para liberar as células da matriz extracelular, seguido por centrifugação diferencial de densidade para isolar trophoblasts10, 11,12. Este detalhes de protocolo uma abordagem em que trophoblasts primários de placentas de gestações magras são tratados com meio de cultura suplementado com TNFa para simular um componente do meio de inflamatória associada com obesidade materna. Finalmente, um procedimento simples para a colheita do lisado celular total de TNFa-tratados trophoblasts, seguidos por Western borram para detectar alterações na expressão gênica é descrito.
Enquanto esse modelo não recapitular o obesogénico no utero ambiente em sua totalidade, ele fornece um sistema controlado que permite analisar a contribuição individual de inflamação mediada por TNFa em resposta a trophoblasts a obesidade materna. Este modelo proporciona a ambos a oportunidade de descobrir ou confirmar alvos moleculares diretamente regulamentados pela sinalização de TNFa em trophoblasts, bem como permite testar se observadas alterações em padrões de expressão de gene na vivo na placenta com maternal a obesidade pode ser resultado de inflamação mediada por TNFa.
A abordagem descrita aqui foi implementada para testar o efeito da inflamação mediada por TNFa sobre o Regulamento de autofagia em trophoblasts humanas. Trophoblasts de obesos gravidezes com fetos do sexo masculino apresentam interrompido autophagic volume de negócios, ou de maturação autophagosome13. Uma proteína chamada Rubicon (RUN domínio da proteína Beclin1-interagindo e rica em cisteína contendo), que está localizada a lisossomos e tarde endossomos, tem sido recentemente descrito como um "freio" no processo de autophagic de volume de negócios porque funciona como um negativo regulador de maturação de autophagosome14,15. Na verdade, Rubicon é um raro exemplo de uma proteína que impede a autofagia, o que o torna um alvo terapêutico valioso. Muito pouca informação está disponível sobre o significado fisiopatológico de Rubicon, exceto por seus papéis na resposta imune inata para microbials16,17 e casos proteção18. Usando o protocolo descrito aqui, se verificar que o Rubicon é upregulated em femininos trophoblasts primárias em resposta ao tratamento com concentrações crescentes de TNFa até 250 pg/mL. O Regulamento de Rubicon pode desempenhar um papel na tarifa de fetos como feminino melhor do que os machos em gestações com obesidade materna. Recapitulando a inflamação associada com obesidade materna ex vivo expondo trophoblasts humanos para TNFa exógena fornece uma plataforma para estudar o impacto do ambiente intra-uterino obeso na regulamentação dos caminhos críticos no Trophoblasts e, por extensão, a função placentária.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
placentas foram coletadas a partir do trabalho e entrega unidade hospital universitário sob um protocolo aprovado pela institucional Review Board da Oregon Health and Science University, em Portland, Oregon, com consentimento informado da pacientes.
1. coleção de tecido placentário
- preparação
Nota: todos os equipamentos que encontra o tecido devem ser estéril.- Esterilizar o equipamento dissecação por autoclavagem durante 60 minutos a 121 ° C.
- Use equipamentos de proteção individual (EPI): laboratório casacos/vestidos/avental, luvas e máscara com um protetor facial ou óculos de proteção.
- Vez em banho de água e ajuste a 37 ° C.
- Aquecer dois tubos cónicos 50ml, cada contendo 25 mL de mídia completa (Iscove ' s modificado Dulbecco ' s suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina, tabela 3) em banho maria a 37 ° C.
- Com consentimento paciente informado, obter uma placenta, imediatamente após o parto por cesariana.
- Tornar-se familiarizado com a placenta. O cordão umbilical está inserido no lado fetal (placa coriônica) e os vasos sanguíneos podem ser vistos irradiando para fora do local de inserção do cordão umbilical. Do lado oposto é o lado materno, ou placa basal. Inclui a decidua e estruturas que contêm árvores de navio, chamadas cotilédones.
- Amostragem de tecido das vilosidades
Nota: tecido das vilosidades deve ser amostrado da placenta logo que possível após o parto, de preferência em 30 min ou menos.- Com a placa coriônica virada para cima, impostos especiais de consumo 2-3 seções de espessura total (aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de tamanho) 2-3 cm da periferia da placenta em aleatórias, usando pinças e tesoura ( figura 1A).
Nota: Evite partes da placenta que aparecem anormais (ou seja, brancas calcificações). - Aparar as placas basais e gonadotrofina e qualquer grandes vasos sanguíneos.
- Coloque o tecido das vilosidades resultante ( figura 1B, cerca de 80-120 g total) em mídia completa quente e começar o isolamento do trofoblasto dentro de 30 min de amostragem.
Nota: Alguns ensaios a jusante e aplicativos são afetados pela duração do período de latência entre entrega, amostragem e isolamento de trofoblasto. É melhor manter esses períodos como curto possível e consistente entre isolamentos. - Usando as técnicas descritas em etapas 1.2.1 - 1.2.2, amostra 5 seções aleatória 1 x 1 cm do tecido das vilosidades do outro lado da placenta (incluindo o centro).
- Corte cada amostra de tecido das vilosidades de 1 x 1 cm em pequenos pedaços de 4-5 (aproximadamente 30 mg cada), coloque em tubos de microcentrifuga de 2 mL e flash congela em líquido N 2. Loja a-80 ° C para uso em análises posteriores.
- Com a placa coriônica virada para cima, impostos especiais de consumo 2-3 seções de espessura total (aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de tamanho) 2-3 cm da periferia da placenta em aleatórias, usando pinças e tesoura ( figura 1A).
2. Isolamento de Trophoblasts do tecido das vilosidades
- preparação
Nota: usar equipamento estéril e executar procedimentos que envolvam células numa vizinhança de fluxo laminar.- Thaw quatro gradientes de densidade congelado (tabela 1, veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) a 4 ° C a noite antes que chegue a placenta.
Nota: Alternativamente, gradientes de densidade podem ser feitas no dia do isolamento. - Vez na centrífuga e conjunto a 20 ° C.
Nota: Todas as etapas de centrifugação estão em máxima aceleração e desaceleração, a menos que especificado em contrário. - Preparar 1 x tampão HEPES solução salina (HBSS) suplementada com Ca + 2 e Mg + 2 (tabela 3).
- Tripsina aquecida a 37 ° C.
- DNase diluir aproximadamente 2720 kilounits/ml em estéril suplementado HBSS.
- Quente 50 mL de soro de bezerro recém-nascido (NCS) a 37 ° C.
- Quente de mídia completa a 37 ° C.
- Quente mídia congela (90% FBS, 10% de DMSO, tabela 3) a 37 ° C.
Atenção: DMSO é tóxico e deve ser manuseado com luvas.
Buffer de - preparar digestão (tabela 2 e 3), misturando 308 mL de completadas HBSS, 50 mL de tripsina (3751.7 BAEE unidades/mL) e 0,5 mL de DNase (379.4 kilounits/mL) em um frasco estéril.
Nota: O tempo aproximado necessário para isolar as células do tecido das vilosidades é 7 h.
- Thaw quatro gradientes de densidade congelado (tabela 1, veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) a 4 ° C a noite antes que chegue a placenta.
- Processamento do tecido das vilosidades
- enxaguar cada pedaço de tecido das vilosidades em um tubo cônico de 50ml repleto de temperatura fosfato tampão salino (PBS). Repetir e substituir a PBS conforme necessário até que o sangue em excesso é removido (lavagem PBS será luz vermelha ou cor de rosa quando o tecido é completamente enxaguado).
- Coloque o tecido das vilosidades em uma placa de Petri estéril e remover a partir de muitos vasos sanguíneos possível raspando suavemente o tecido mole das vilosidades dos vasos usando uma lâmina de microscópio.
- Picar finamente o tecido das vilosidades resultante usando tesouras.
- Digestão de tecido das vilosidades e isolamento bruto de Trophoblasts
- transferir o tecido das vilosidades picado para um frasco estéril com solução de digestão de acordo com os volumes calculados com base na atividade específica de tripsina e DNase (165 mL, tabela 2).
- Após 35 min de incubação em um banho de água de 37 ° C com agitação de 70 rotações por minuto (rpm), incline a garrafa de digestão de lado e permitir que os pedaços não digeridos de tecido repousar no fundo da garrafa. Cuidadosamente, elaborar o sobrenadante com uma pipeta sorológica, evitando o tecido combinado.
- Dispensar o sobrenadante através de um filtro de célula de 100 µm igualmente entre tubos de Erlenmeyer de 50 mL.
Nota: Para poupar tempo, é aconselhável começar a segunda digestão adicionando solução de digestão (110 mL, tabela 2) para os restantes estabeleceram-se tecido e retomando a incubação, conforme descrito na etapa 2.3.2. - Suavemente camada 3-5 mL de NCS debaixo do sobrenadante tenso por dispensar lentamente com uma pipeta sorológica na parte inferior do tubo. Um menisco entre o NCS e tensa sobrenadante (contendo trophoblasts) deve ser visível ( Figura 2A).
- Centrifugar os sobrenadantes sobre NCS a 1.250 x g, durante 15 min a 20 ° C. O sedimento resultante incluirá glóbulos vermelhos na camada mais inferior, seguida por uma camada branca que contém as células do trofoblasto ( Figura 2B).
- Repita etapas 2.3.2 - 2.3.5 para cada um dos segundo e terceiros digestões (adição de 110 mL e 83,5 m, respectivamente, da solução de digestão para a garrafa de tecido, tabela 2).
- Uma vez que todos os sobrenadantes tem sido centrifugadas, cada Ressuspender em 5 mL de mídia completa quente e então juntar as suspensões.
- Dividir a suspensão de eritrócitos igualmente entre dois tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar 1.250 x g por 15 min a 20 ° C.
- , Suavemente, remover o sobrenadante e ressuspender cada uma as pelotas de célula em 6 mL de quente complETE mídia.
- Centrifugação densidade
- dividir a suspensão de eritrócitos igualmente entre quatro gradientes de densidade (3 mL cada) por camadas de lentamente e com cuidado a suspensão de células na parte superior os gradientes de densidade, com uma pipeta de transferência.
- Centrifugar os gradientes de densidade a 1.250 x g por 20 min a 20 ° C, com mínima aceleração e desaceleração. Isto deve produzir bandas distinguíveis das células sedimentadas (tabela 4).
- Lentamente e cuidadosamente remover as camadas superiores da mídia de gradiente de densidade (DGM) até atingir a opaca faixas contendo células do trofoblasto (entre 35-50% DGM) (tabela 4).
- Transferir as bandas do trofoblasto em dois tubos de 50ml cónico e encha com mídia completa quente.
- Inverter suavemente os tubos 3 - 6 vezes para misturar e centrifugar a 1.250 x g, durante 15 min a 20 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender cada célula em 5 mL de mídia completa quente. Combinar as suspensões celulares e contagem de células viáveis usando um hemocytometer e azul de Trypan (ou método de contagem de células preferencial).
- Contagem de células com um Hemocytometer
- misturar a suspensão de células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta sorológica ou suavemente o tubo várias vezes por inversão.
- Combine partes iguais de suspensão de células e Trypan azul (ou seja, 20 µ l cada) em um tubo separado e misture suavemente.
- Incubar durante 1-2 min à temperatura ambiente.
- Suavemente dispensar 15-20 µ l da célula-Trypan azul mistura entre a lamínula e o hemocytometer e permitir que as células difundir em toda a rede por acção capilar.
- Contagem de células viáveis (células mortas vão ser manchadas azul profundo) em cada um dos quadrantes quatro 4 x 4 com um contador de contagem. Empregar um sistema de contagem garantir que as células não são contadas mais de uma vez (ou seja, não contam as células que tocam o fundo ou limites à esquerda).
Nota: Cada 4x4 quadrante deve conter entre 50-150 células. Muito poucas ou muitas células podem levar a um over ou subestimação do número de celular. - Média a célula total conta de cada um dos 4x4 quadrantes, multiplique por 10-4 e em seguida multiplicar pelo fator de diluição (suspensão de células para Trypan azul) para calcular o número de células por mL.
- Multiplicar o número de células por mL pelo volume total da suspensão de células para calcular o rendimento total celular.
Nota: Espera-se cerca de 100 milhões de células de isolamentos começando com 80-120 g de tecido das vilosidades.
- Células chapeamento
- 3 milhões de células/poço (3,3 x 10 5 células por cm 2) da placa em uma placa de 6 (2 mL de suspensão por alvéolo) e gentilmente balançar para frente e para trás e lado a lado para distribuir uniformemente as células.
Nota: Trophoblasts exigem placas de cultura de tecidos tratada a aderir corretamente. Uma monocamada de células é necessário para promover a syncytialization. - Deixar as células chapeadas do capuz de fluxo laminar para cerca de 30 min permitir que as células distribuir uniformemente, resolver e começam a aderir ao fundo dos poços, antes de colocar na incubadora.
- Células de cultura por até 72 h (com alterações diárias de mídia) em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% humidade.
Nota: Examine os trophoblasts sob um microscópio em 10 / 20 x cada 24h de cultura. Trophoblasts não proliferam e não podem ser passadas. Ao longo de 72 h da cultura, os redondos trophoblasts individuais fundem-se para formar um sincício ( Figura 3A e B).
- 3 milhões de células/poço (3,3 x 10 5 células por cm 2) da placa em uma placa de 6 (2 mL de suspensão por alvéolo) e gentilmente balançar para frente e para trás e lado a lado para distribuir uniformemente as células.
- Congelando células
- Pellet de células não utilizadas por centrifugação a 1.250 x g durante 10 minutos a 20 ° C.
- Aspire tanta mídia quanto possível da pelota.
- Resuspenda o pellet em congelamento mídia (tabela 3).
- Congelar as alíquotas a-80 ° C em um recipiente de congelação com 100% de isopropanol. Transferir as alíquotas congeladas para líquido N 2 o dia seguinte para armazenamento a longo prazo.
Nota: As células podem ser cultivadas após congelamento.
- Células thawing
- remover uma alíquota de células congeladas e descongelar em banho maria a 37 ° C durante a agitação. Remover a alíquota do banho antes de ele tem totalmente descongelados para líquido.
- Transferir imediatamente as células descongeladas para um tubo cônico de 15 ml. Começando a abrandar em primeiro lugar, adicionar 10 mL de mídia completa com mistura intermitente.
- Inverter o tubo várias vezes para misturar.
- Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos a 20 ° C.
- Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2-5 mL de mídia completa quente.
- Contar as células e placa conforme descrito anteriormente.
3. Tratamento de Trophoblasts primária com TNFa, coleção de lisados celulares e mancha ocidental
- preparação
- aquecer mídia completa a 37 ° C.
- Fazer um estoque de 10 µ g/mL de TNFa em mídia completa e loja a-20 ° C até que esteja pronto para uso.
- Fazer um 1 µ g/mL estoque de trabalho de TNFa em mídia completa quando estiver pronto para tratar as células. Série diluir o estoque de trabalho TNFa 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, pg/mL 250 e 125 pg/mL em mídia completa.
Nota: A concentração de TNFa de 10 4 pg/mL é moderadamente citotóxica. Ajuste das concentrações TNFa testado vai depender as especificidades das aplicações a jusante desejadas.
- Tratar pilhas com TNFa
- após 24h de cultura, Aspire o meio de cultura de células e substituir com 2 mL de TNFa suplementado mídias por alvéolo em placas 6-bem (pelo menos dois poços por tratamento e veículo controle).
- Após 24 h de exposição TNFa (48 h de cultura), substituir as mídias de TNFa suplementada com mídia completa.
- Colheita de células e proteínas totais
- após 72 h de cultura (24 h após a remoção do TNFa), mídia, Aspire, lave suavemente células com temperatura PBS e adicione 80 µ l de frio gelo Radioimmunoprecipitation ensaio Reserva (RIPA) contendo recentemente adicionados inibidores de protease e fosfatase (tabela 3) diretamente a cada poço.
- Remover as células da placa com um raspador de célula. Transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, pool de poços nos grupos de tratamento.
- Lisar as células vortexing os tubos em alta pelo menos três intervalos de 15 s.
- Incube as celulas a 4 ° C, com balanço de 15 min.
Observação: como alternativa, depois passo 3.3.3., as células podem ser incubadas em gelo por 15 min com agitação intermitente por agredir o tubo, num Vortex, ou pipetagem acima eWN. - Repita o passo 3.3.3.
- Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, a pelota restos celulares.
- Transferência do sobrenadante (contendo proteína celular) para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuga e conservar a -80 ° C.
Nota: O protocolo pode ser parado aqui e retomado em um momento posterior. É aconselhável fazer várias alíquotas de amostras de proteína celular para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento. - Determinar a concentração de proteínas totais por um método preferencial, como um ensaio de ácido bicinchoninic (BCA, veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar).
- SDS-PAGE e Western Bloting para Rubicon ou proteína de interesse
Nota: siga a mancha protocolos de acordo com o fabricante do ocidental ' instruções s usando um sistema de laboratório preferido. Gel de- carga entre 20-40 µ g da proteína total em tampão de amostra (tabela 3) por bem em um 12% do acrilamido. Separar proteínas por SDS-PAGE em marcha tampão (tabela 3).
- Wet-transferência as proteínas do gel para uma membrana de polivinilideno difluoreto (PVDF) de acordo com o fabricante ' instruções de s no buffer de transferência (tabela 3).
- Incubar a membrana 5% leite em pó em carbono salina com 0.1% Tween 20 (TBST, tabela 3) pelo menos 1 h à temperatura ambiente com balanço.
- Incubar a membrana em um anticorpo primário Rubicon (veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) a 1: 500 1% leite em pó em TBST durante a noite a 4 ° C, com balanço.
- Delicadamente, lave a membrana 3 x 5 min em TBST e 1 x 5 min na TBS em temperatura ambiente com balanço.
- Incubar a membrana em 1: 2000 - 1:5000 anticorpo secundário (HRP-lig ou preferencial conjugado visível, consulte a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) 5% leite em pó em TBST pelo menos 1 h à temperatura ambiente com balançando.
- Repetir o procedimento de lavagem descrito no passo 3.4.5 e visualizar o blot com um substrato de visualização adequada (ou seja, quimioluminescente) em um sistema de imagem.
- Repetir o procedimento de lavagem descrito no passo 3.4.5 e sonda a membrana para β-actina ou um controle de carregamento preferencial de acordo com o fabricante ' instruções de s.
- Em software de análise de imagem preferida, analisar a expressão do Rubicão por quantificação manual de absorvância (intensidades de banda), subtração de absorvância do fundo e a normalização à carga correspondente controlar intensidades de banda. Realizar análises estatísticas, conforme apropriado para testar alterações estatisticamente significativas nos níveis de proteína.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prazo placenta humana de magra (índice de massa corporal de pré-gravidez (IMC) < 25) mães com gestações sem complicações carregando prole feminina foram coletadas e amostradas dentro de 15 minutos da entrega por cesariana (sem trabalho). As placentas foram examinadas para a ausência de calcificações e desenvolvimento típico: pesando entre 300-600 g com o cordão umbilical e membranas removidas, rodada em forma, entre 15-25 cm de diâmetro e o cordão umbilical inserido no meio da placenta. Tecido das vilosidades foi dissecado longe as placas basais e gonadotrofina coriônica em 2-3 amostras de através da placenta (Figura 1), produzindo cerca de 100 g de tecido das vilosidades como material para o isolamento primário trofoblasto de partida. Dentro de 20 minutos de amostragem das vilosidades tecido, o procedimento para isolar o trophoblasts primários foi iniciado conforme descrito aqui, rendendo entre 0,8 - 1 x 108 células viáveis. As células foram semeadas em placas de cultura 6-poços em uma densidade de 3 x 106 (3,3 x 105 células por cm2). Após 24h de cultura, as células foram examinadas sob um microscópio para fixação e morfologia adequada trofoblasto foi confirmada (individual por células). Os meios de cultura foi substituído com mídia completa, contendo uma série de concentrações de TNFa entre 125-104 pg/mL, para que pelo menos dois poços foram incluídos por concentração e controle do veículo (apenas mídia completa).
Vinte e quatro horas após o tratamento de TNFa (48 h de cultura), todas as mídias de TNFa foram substituídas com mídia completa. Nenhuma morte de apreciável celular foi observada devido ao tratamento com TNFa em concentrações ou inferior a 10 pg/mL de3 . Tratamento com 104 pg/mL TNFa foi moderadamente citotóxico e os efeitos citotóxicos desta concentração de TNFa não persistir após a mídia foi alterada, como evidenciado pelos ensaios de lactato desidrogenase (LDH) (dados não mostrados). 72 h de cultura, as células foram analisadas para syncytialization sob um microscópio. Imunocitoquímica para syncytialization e contaminação de fibroblasto revelou relativamente puro isolamento de trophoblasts (Figura 3). Lisados celulares foram colhidos de acordo com o protocolo descrito aqui, rendendo entre 3-8 µ g / µ l da proteína total por preparação conforme determinado por um ensaio BCA (dados não mostrados). Western blot análise em lisados celulares de trophoblasts femininos, tratados com TNFa mostrou um upregulation de expressão Rubicon em resposta a concentrações de TNFa até 250 pg/mL e subsequente downregulation de expressão Rubicon em concentrações de TNFa maior superiores a 250 pg/mL (Figura 4A e B, 104 pg/mL, excluídos da análise com base em efeitos citotóxicos). Da mesma forma, Rubicon é significativamente upregulated em biópsias de tecido das vilosidades congelado de placenta de obesos gravidezes com fetos femininos em comparação com controles magras, como evidenciado pela análise ocidental do borrão (Figura 4 e D, n = 6 classe de placenta por IMC, ANOVA, P < 0,05).
| Concentração (%) | 90% DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Espessura de camada (ml) |
| gradiente de x 4 | gradiente de x 4 | Total de 34,5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7,33 | 4,67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2,67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (marca de 13,5 ml) |
| 40 | 5,33 | 6,67 | 3 |
| 35 | 4,67 | 7,33 | 3 (marca de 19,5 ml) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2,67 | 9,33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
Tabela 1. Especificações para fazer gradientes de densidade para centrifugação densidade de Trophoblasts primárias.
Da esquerda para a direita, primeira coluna especifica a mídia de gradiente de densidade (DGM, veja a tabela dos suprimentos essenciais, reagentes e equipamentos, material suplementar) concentração expressada em percentagens de DGM em HBSS. Coluna dois especifica o volume de DGM enquanto três a coluna especifica o volume de HBSS necessários para fazer a percentagem adequada da solução DGM. 4. a coluna especifica o volume a ser adicionado ao tubo cónico de 50 mL para construir o gradiente, começando com a camada mais densa.
| Tripsina | HBSS | DNase | ||
| Digestão | (total de actividade; Unidades BAEE) | volume (ml) | (total de actividade; Kunits) | Volume total /digestion |
| 1 | 619037 (23,01 ml) | 141,76 ml | 62594 (0,230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15,34 ml) | 94,51 ml | 41729 (0,154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11,65 ml) | 71,74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83,5 ml |
| Total | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0,5 ml) | 358,5 ml |
Tabela 2. Especificações para a preparação da solução de digestão para isolamento primário trofoblasto baseada a actividade específica de DNase e tripsina.
Da esquerda para a direita, a primeira coluna especifica o número das digestões, segunda coluna especifica a atividade de tripsina exigida por digestão, a terceira coluna especifica o volume total de HBSS complementado a ser adicionado para a digestão apropriada, o quarta coluna especifica a atividade de DNase exigida por digestão, e a última coluna especifica o volume de solução de digestão para seradicionado ao tecido placentário para a digestão apropriada.
| HBSS (suplementado com Ca+ 2 e Mg+ 2) | Tampão de amostra |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 X Laemmli corante |
| 1,26 mM CaCl2 (an). | 10% 2-Mercaptoetanol |
| 0,80 mM de MgSO4 (an). | |
| 20,77 mM HEPES | |
| pH de 7,4 com NaOH 10N Tornar o volume até 1 L com ddH2O estéril Filtro estéril em um frasco estéril |
|
| Mídia completa | Buffer de execução |
| Remover 11% v/v IMDM | 25 mM Tris Base |
| Adicionar 10% v/v FBS | 190mm glicina |
| Adicionar 1% 10.000 U/mL penicilina/estreptomicina (final de 100 U/mL) | 0,1% SDS |
| pH de 8.3 | |
| Congelamento de mídia | |
| 90% v/v FBS | Buffer de transferência |
| 10% v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190mm glicina | |
| Tampão de digestão | 20% metanol |
| 50 mL de tripsina (26.900 BAEE unidades/mL) | pH de 8.3 |
| 0,5 mL de DNAse (272.000 K unidades/mL) | |
| Traga 358,5 ml em HBSS complementado | TBS |
| 20 mM Tris | |
| Amortecedor de RIPA | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH 7,6 |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0,1% SDS | TBS com 0.1% Tween 20 |
| 0,5% de sódio Deoxycholate do | |
| 1% Triton X-100 | |
| 1 comprimido de inibidor de protease/fosfatase por 10 ml de tampão de RIPA |
Tabela 3. Soluções necessárias para isolamento e cultura de Trophoblasts primário seguido de mancha ocidental.
| % DGM | marca ml | Tipo de célula |
| 10 | 31.5-34,5 | Restos |
| 20 | 28.5-31,5 | |
| 30 | 22.5-28,5 | |
| 35 | 19,5-22,5 | Trophoblasts |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13.5-16.5 | |
| 50 | 10.5-13.5 | Linfócitos |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4.5-7.5 | Glóbulos vermelhos |
| 70 | Abaixo de 4,5 |
Tabela 4. Sedimentação de Trophoblasts por centrifugação de densidade.
Da esquerda para a direita, a primeira coluna especifica a porcentagem de DGM (tabela 1), a segunda coluna especifica a marca mL, onde o percentual correspondente de DGM encontra-se em um tubo cónico de 50 mL, e a terceira coluna especifica que sedimentos de tipo de célula no percentual correspondente de marca DGM e mL em um tubo cónico de 50 mL. Sedimentos de Trophoblasts entre 35-50% DGM, formando distintas bandas opacas. Coletar o DGM, acima ou abaixo desse intervalo resultará em contaminação de restos celulares e outros tipos de células como linfócitos.
Figura 1. Tecido das vilosidades é isolado do termo Placenta humana, removendo as coriônica e placas basais.
A) com a placa Coriônica (lado fetal) virada para cima, uma amostra de toda a sua espessura é excisada da placenta. B) uma amostra de tecido das vilosidades é obtida removendo as placas basais e gonadotrofina coriônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Centrifugação de células em solução de digestão por soro de bezerro recém-nascido resulta em uma pelota de célula em várias camadas.
A) (NCS), soro de vitelo recém-nascido é mergulhado por baixo a suspensão de eritrócitos em solução de digerir em um tubo cónico de 50 mL. B) centrifugação do (A) resulta em uma pelota de várias camadas de células. A camada mais inferior é profundo na cor vermelha e consiste de células vermelhas do sangue. A camada acima inclui trophoblasts e é branco ou bege na cor. Acima o trofoblasto camada é NCS seguido por solução de digestão (sobrenadante) até o topo do tubo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de imunocitológico de Syncytialization e conteúdo de fibroblasto em culturas de trofoblasto humano primário.
A) imagem representativa de citoqueratina-7 (vermelho) em cytotrophoblasts após 24h de cultura. B) imagem representativa de citoqueratina-7 (vermelho) em syncytiotrophoblasts após 72 h da cultura mostra multinucleadas massas de células que se fundiram. C) imagem representativa da vimentina (vermelho) em syncytiotrophoblasts após 72 h da cultura. Imagens foram adquiridas em um microscópio fluorescente com corante de contraste nuclear DAPI (azul). Visualizado na ampliação de 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Regulação da expressão de Rubicon em resposta a TNFa-tratamento em Trophoblasts femininos e expressão endógena Rubicon no tecido das vilosidades do Lean contra obesos gravidezes com fetos do sexo femininos.
Trophoblasts primárias da placenta de termo de mães magras com gravidezes saudáveis carregando um feto feminino foram isolados e tratados com 125, 250, 500, 103e4 10 pg/mL TNFa (ou controle do veículo). A) borrão de representante ocidental para Rubicon no trofoblasto feminino lysates tratados com TNFa. Β-actina foi usado como um controle de carregamento. B) expressão Rubicon em resposta ao tratamento de TNFa em trophoblasts femininos foi quantificada de borrões ocidentais e normalizado de β-actina. Os valores são média Rubicon expressão por TNFa concentração ± S.E. em n = 3 placentas. C) borrões ocidentais para Rubicon em todo tecido lysates do flash congelados de biópsias de tecido das vilosidades do magra contra obesos gravidezes com fetos do sexo femininos (F1-F12). A lactato desidrogenase (LDHA) foi usado como um controle de carregamento. D) Rubicon expressão em Western borrões de (C) foi quantificado e normalizada para LDHA. Os valores são média Rubicon expressão por IMC classificação ± S.E. em n = 6 placenta por classe de IMC (ANOVA, * P < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A placenta, responsável pela regulação do crescimento do feto, exibe a função comprometida no ambiente obesos6. Apesar da alta demanda metabólica de trophoblasts, placenta com obesidade materna apresentam respiração mitocondrial disfuncional6,19. Alterações no metabolismo da placenta podem contribuir para o aumento da incidência de complicações e resultados de fetais adversos observados em gravidezes obesos3,6,7. Autofagia está também comprometida em placentas com obesidade materna. Placenta de obesos gravidezes com fetos masculinos mostra flux autophagic disfuncional, como evidenciado pelo acúmulo de autophagosomes13. Manter o fluxo de autophagic ideal é essencial para a homeostase celular e autofagia com defeito na placenta com obesidade materna pode desempenhar um papel importante na mediação os resultados adversos associados com gravidezes obesos.
As causas precisas da função placentária comprometida exibida na obesidade materna não são bem compreendidas e podem ter suas origens na sinalização inflamatória. Tanto a obesidade e a gravidez são Estados de proinflammatory que caracterizam-se por elevados níveis circulantes de TNFa1,4,20,21. TNFa é um ativador de autofagia22,23e pode mediar as alterações no fluxo autophagic nas placentas de gestações obesas. TNFa é comumente usada para estudar os efeitos da inflamação em células, especialmente no contexto do câncer2. O protocolo aqui apresentado adapta-se a essa abordagem para estudar os efeitos da inflamação obesidade na capacidade funcional da placenta por tratamento primários trophoblasts com TNFa exógena em cultura.
Este protocolo é composto por quatro componentes principais: amostragem do tecido das vilosidades da placenta, isolamento de trophoblasts primários do tecido das vilosidades, cultura de trophoblasts primários seguido por tratamento de TNFa e coleção de lisado celular total, seguido por Western blot análise para medir a expressão de uma somáticas de interesse. Para isolar trophoblasts puros, é fundamental que as placas de gonadotrofina e basais são dissecadas completamente longe do tecido das vilosidades durante a amostragem da placenta (figura 1B). Também é imperativo que o tecido das vilosidades é processado em tempo hábil (ou seja, dentro de 30 minutos de entrega). Este protocolo detalha o uso das três etapas da digestão, cada duração de 35 minutos, para liberar a trophoblasts da matriz extracelular do tecido das vilosidades. Mais longas digestões arriscar danificar células por tripsinização das proteínas de superfície celular. Aumentando o número de resumos não aumenta sensivelmente o rendimento final de trophoblasts viáveis. No entanto, diminuindo o tempo e o número de digestões resultará em diminuição da célula rendimentos (Simon, Bucher e Maloyan, dados não publicados). Este protocolo confiável produz cerca de 100 milhões de células de 80-120 gramas de tecido das vilosidades.
Há variabilidade no número de bandas de trofoblasto distinguíveis observada sobre os gradientes de densidade entre os isolamentos. Para evitar a contaminação de outros tipos de células, é importante coletar estritamente as faixas contendo trophoblasts do gradiente de densidade (tabela 4). O protocolo detalhado aqui é otimizado de métodos previamente estabelecidos que o rendimento relativamente puros trophoblasts com menos de 5% a contaminação de outras células tipos de11,de10,12. Depuração adicional pode ser conseguida de seleção positiva ou negativa24. No entanto, esta abordagem corre o risco de reduzir o rendimento de trophoblasts viáveis. Análise de Immunocytochemical de citoqueratina-7 em trophoblasts primários isolado usando o procedimento aqui apresentado após 24 contra 72 h de tempo de cultura confirmou que as células foram submetidos syncytialization, como evidenciado pela presença de massas de células multinucleadas a 72 h, um evento de marca na vida útil do trofoblasto (Figura 3A e B). Além disso, a análise immunocytochemical de vimentina no primários trophoblasts cultivadas por 72 h revelou muito poucos fibroblastos contaminantes (Figura 3). Para fins de rotina, a pureza de trophoblasts pode ser monitorada em cultura por simples avaliação morfológica. Em 24 horas de tempo de cultura, cytotrophoblasts individuais redondas dominam a cultura. Cytotrophoblasts submeter-se a syncytialization após 72 h da cultura, resultando em aglomerações de células fundidas. O tipo mais comum de célula contaminante encontrado nesta cultura é dos fibroblastos ou células endoteliais, que são alongadas e poligonal em forma, respectivamente. Esses recursos podem ser monitorados aproximadamente usando um microscópio brilhante.
Tratamento primários trophoblasts com TNFa fornece um sistema controlado que permite medir o efeito de TNFa sinalização na regulamentação dos caminhos críticos no trophoblasts. Naturalmente, existem outros factores que não TNFa no ambiente materno obesos na vivo que pode ser responsável pela função de trofoblasto de modulação. Estes incluem mas não estão limitados a sinais hormonais, hiperlipidemia e uma série de outros fatores de proinflammatory25. Combinações de diferentes tratamentos mais irão recapitular o ambiente intra-uterino obesos ex vivo em forma fisiologicamente mais precisa. As concentrações de TNFa exógena, usado para tratar trophoblasts neste protocolo longe exceder aqueles que normalmente circulam na vivo. Concentrações séricas foram relatados para alcançar 20 ng/mL ou superior em determinadas condições inflamatórias26. Para obter uma resposta mensurável por métodos de laboratório atual (mancha ou seja, a ocidental), é necessário amplificar as concentrações de TNFa para revelar alterações na expressão gênica e percursos de interesse. Estas respostas podem existir na vivo em menor grau. No entanto, eles podem, no entanto impacto a função de trophoblasts. Expondo trophoblasts a concentrações elevadas de TNFa corre o risco de produzir artefatos em expressão gênica e análises de caminho que podem ser enraizadas em efeitos citotóxicos. Citotoxicidade moderada foi observada em trophoblasts expostos a 104 pg/mL TNFa suplementado orifíco 24h, como evidenciado pelos ensaios de citotoxicidade LDH (dados não mostrados). No entanto, as concentrações em ou abaixo de 103 pg/mL TNFa não produziu qualquer morte celular apreciável.
Testes de concentrações de TNFa em intervalos menores e/ou que são mais baixos do que o descrito aqui podem ser melhor seguido por quantitativareação em cadeia da polimerase (qPCR) para análise de expressão do gene, uma técnica adequada para a detecção de pequenas alterações na expressão gênica. Enquanto qPCR testes especificamente para os níveis de expressão do gene no nível transcricional, mancha ocidental detecta os níveis finais de produtos proteicos que estão presumivelmente disponíveis para realizar sua tarefa (s) celular. Usar ambas as técnicas analíticas em conjunto é uma poderosa abordagem para determinar o impacto do tratamento de TNFa na regulamentação dos níveis de expressão gene, bem como para determinar se as alterações nos níveis de expressão são um resultado do transcriptional, regulação pós-transcricional, ou borne-translational. Estresse inflamatório pode impactar syncytialization, morfologia e comportamento de trofoblasto. Incluindo avaliações morfológicas (ou seja, imunocitoquímica) Além de abordagens analíticas moleculares irá fornecer uma análise mais abrangente dos efeitos da exposição de TNFa em saúde trofoblasto. Ajuste dos TNFa concentrações testados e jusante ensaios de acordo com demandas experimentais é aconselhável.
Implementando o protocolo descrito aqui, inflamação mediada por TNFa é encontrada para upregulate expressão Rubicon em trophoblasts humanas de magras gravidezes com fetos do sexo femininos. Mancha de Rubicon no trofoblasto ocidental lysates revelou duas bandas distintas perto e acima do peso molecular esperado de 140 kDa (Figura 4A). Há evidências de que a banda inferior é não-específica (pAb anti-Rubicon PD047, folha de dados MBL, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). As trophoblasts das fêmeas demonstraram a capacidade para upregulate a expressão de Rubicon em resposta ao tratamento de TNFa de concentrações até 250 pg/mL. Em concentrações superiores a esta, expressão de Rubicon níveis diminuídos para trás na direcção da linha de base (controle não tratado) e até mesmo abaixo (Figura 4B, n = 3). Dado que o tratamento de trophoblasts de gravidezes magras com TNFa simula inflamação no ambiente intra-uterino obeso, esse resultado é complementar para a conclusão de que o Rubicão é significativamente upregulated em biópsias de tecido das vilosidades congelado de placenta de obesos gravidezes com fetos femininos em comparação aos controles magras (Figura 4 e D, ANOVA, n = 6 por classe de IMC, P < 0,05).
Enquanto autophagic fluxo parece não diferem em trophoblasts de obesos gravidezes com fetos femininos em comparação aos controles magras, trophoblasts de obesos gravidezes com fetos machos exibem ativação de formação e acumulação de autophagosomes 13. Rubicon é um regulador negativo de autofagia, onde atua a travar autophagosome-lisossoma fusão27. Trophoblasts femininos podem upregulate a expressão de Rubicon como um mecanismo compensatório ou de protecção contra inflamação mediada por TNFa, que pode ativar autofagia22, permitindo-lhes manter magra como fluxo autophagic no cenário do obesidade materna. Esta resposta na placenta pode desempenhar um papel na tarifa de fetos como feminino, melhor do que os machos no ambiente intra-uterino obeso. Modelagem do meio inflamatório associado com obesidade materna ex vivo através de tratamento primários trophoblasts humanos com TNFa fornece uma plataforma para estudar os efeitos do ambiente intra-uterino obeso na regulamentação dos caminhos críticos no Trophoblasts. Que altera este protocolo com tratamentos novos e combinatórios vistos recapitulando o ambiente materno obeso fornecerá uma avenida emocionante para estudar os efeitos da obesidade materna na função placentária.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer as mulheres que doaram suas placentas para este estudo. Agradecemos também o departamento de entrega na OHSU e materno e Fetal equipe de pesquisa e trabalho para coordenar a coleção de placenta. Nós estamos gratos ao Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD para apoio e ajuda com métodos experimentais e otimização.
Este trabalho foi financiado pelo NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A.
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P.
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B.
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
