סריקת שקופיות אוטומטיים, פילוח ברקמות שכותרתו Fluorescently באמצעות מערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן

Summary

כאן נתאר פילוח אוטומטיות של רקמות fluorescently עם תוויות עבור פרוטוקול על שקופיות באמצעות מערכת ניתוח תוכן גבוהה widefield (WHCAS). פרוטוקול זה יש יישומים נרחב בכל תחום אשר מערבת את כימות של סמני פלורסנט ברקמות ביולוגיות, לרבות מדעי הביולוגיה, הנדסה רפואית, מדעי הבריאות.

Abstract

שקופית סריקה אוטומטית, פילוח של רקמות fluorescently שכותרתו היא הדרך היעילה ביותר כדי לנתח כל השקופיות או מקטעים גדולים רקמות. למרבה הצער, חוקרים רבים מבלים כמויות גדולות של זמן ומשאבים בפיתוח של אופטימיזציה של זרימות עבודה הרלוונטיים רק ניסויים משלהם. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול יכול לשמש על ידי אלה עם גישה למערכת ניתוח תוכן גבוהה widefield (WHCAS) לשיקוף כל רקמות רכוב שקופיות, עם אפשרויות עבור התאמה אישית בתוך מודולים שנבנו מראש למצוא את התוכנה המשוייכת. לא במקור מיועד לסריקת שקופיות, הפעולות המפורטות במאמר זה מאפשרים לרכוש שקופית סריקת תמונות ב- WHCAS אשר ניתן לייבא לתוך התוכנה המשויכים. בדוגמה זו, הוכח את פילוח אוטומטיות של שקופיות גידול במוח, אך פילוח אוטומטית של כל fluorescently התווית על-ידי גרעיני או cytoplasmic סמן אפשרית. יתר על כן, ישנם מגוון רחב של מודולים אחרים תוכנה כמותית כולל מבחני חלבון לוקליזציה/רוברטסונית, תאית שגשוג/הכדאיות/אפופטוזיס של אנגיוגנזה שיכולות לפעול. טכניקה זו לחסוך חוקרים זמן ומאמץ וליצור פרוטוקול אוטומטית לניתוח שקופיות.

Introduction

כימות ומדויקים של fluorescently התווית על-ידי רקמות בשקופיות היא טכניקה מאוד מבוקש בתחומים מדעיים רבים. אולם, חוקרים באופן ידני לעיתים קרובות לסמוך דגימות או לבזבז כמויות ניכרות של זמן פיתוח אזוטרי אוטומטית טכניקות כדי להשיג זאת. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול כדי להפוך את שקופיות אוטומטיים סריקה כימות של תאים באמצעות WHCAS ותוכנה הקשורים שלה, עם תאים חיסוניים מולדת בסעיפים הגידול קפוא המוח האנושי כדוגמה. התוכנה המשוייכת מציע מגוון רחב של מודולים מוכללים להתאמה אישית של תוצר neurite סופר התמיינות של תאים סוגים^{1,2,3,4,5, 6}. מטרת שיטה זו היא לספק לחוקרים פרוטוקול התחלה-סיום, בקלות לשחזור כדי לרכוש תמונות של quantitate fluorescently התווית על-ידי ישויות ברקמות כלשהו התלויות על השקופית.

פרוטוקול זה, WHCAS משמש בעיקר עבור הדמיה צלחות לניתוח עוקבות על התוכנה המשויכים למרות מתאם שקופיות ויסודות להחליק סריקה⁷ היו זמינים. זה היה אוסרני שקופיות תמונה כי הכיול המרחבי זהיר של האזור רכישה, מבחר יומנים המתאים, היצירה של loadouts המותאמים המקשרת המוצר נציגים נדרשו. בגוף רחב יותר של ספרות, במקום רכישת שקופית ייעודי-הדמיה של ניתוח מתקן⁸, דוח טכנולוגי הקודם עם גישה לתוכנה זו עקפו רכישת תמונות שקופיות לגמרי WHCAS⁹. ביצוע ניתוח רכישה או תמונה תמונה בפלטפורמות שונות מחייבת עבודה נוספת כדי להבטיח שכל אחד הוא תואם עם האחר.

היכולת להשתמש WHCAS את התוכנה שלה עבור לכידת תמונה ימנע סיבוכים מיותרים של חיפוש או לפתח זר זרימת עבודה לכלים אלו. במאמר זה, הצעדים הנחוצים כדי ליצור סריקה סקירה הגדלה נמוכה ותמונות בהגדלה המתאימים על ידי טיפול השקופית כמו צלחת, וגם הניתוחים הבאים בעזרת המודול פילוח גל מרובה תאים הבקיע מאפשרים שינוי של WHCAS. פרוטוקול ברצון שמיש זה מספק יתרון על טכניקות חלופיות מכיוון שאין צורך לפתח אלגוריתמים או צעד מרובת הספירה פרוטוקולים^10,11 , ברגע הדימויים נרכשים על WHCAS. פרוטוקול זה מפחית את הסיכון של הזמן הדרוש כדי למטב את הטכניקה כימות, היא מדויקת יותר¹² יעיל יותר ספירה ידנית ומגדיל את השימוש WHCAS. פרוטוקול זה נרחב ובקלות ניתן מאז זה מאפשרת הדמיה וניתוח של כל הרקמות fluorescently התווית על-ידי בשקופיות.

Protocol

דגימות הגידול התקבלו לפי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המקומית סקירה מוסדיים לוח ואתיקה, שנערך בהתאם לתקנות הלאומית. את WHCAS ותוכנה הקשורים שלה להשתמש במאמר זה מפורטים בטבלה של חומרים.

1. ייבוא היומנים

1. פתח את התוכנה המשוייכת.
2. הורדה חבילת יומן המצוין בטבלה של חומרים.
3. לייבא את הסוויטה יומן לספריה מתאימים על ידי לחיצה על התפריט הראשי פונה היומן, בחירת הסוויטה יומן הייבוא, ולחיצה על ' ייבוא.

2. יצירת הגדרות עבור תצוגה מקדימה לסרוק רכישה

1. בתיבת הדו-שיח הגדרת רכישת צלחת , כנס ל הכרטיסיה אובייקטיבית, מצלמה בחר 4 X כמו ההגדלה, 1 כמו המצלמה binning, ו- 2 כמו הרווח.
2. קלט את ההגדרות באיור 1A תחת הלשונית צלחת-Slidescanning.
   הערה: הגדרות אלה נוצרו כדי לאפשר למשתמש להציג ולנווט עד 3 שקופיות. כל שקופית חולקה 3 בארות סמוכים ניווט קל, 'חיים' ויזואליזציה של רקמות פרוסות או תאים.
3. בכרטיסיה אתרים לביקור , למלא הבארות בצורה אחידה עם האתרים.
4. לחץ על עריכת צלחת התחתון הגדרות... , הזן את הערכים המוצגים איור 1B.
5. תחת הלשונית רכישה לולאה , הזן את אורך הגל הרצוי (כל כתם גרעיני בדוגמה זו) עבור הסריקה המקדימה. הניגודיות הטובה ביותר ומיקוד מבוססת תמונה, להשתמש האות פלורסנט המבריקים (למשל, לעתים קרובות כתם גרעינית).
   הערה: צביעת רקמות עם כתם בהיר כמו כתם גרעיני מומלץ מאז זו מספקת קונטרסט גבוה בהשוואה לרקע. לא רק יהיה עזר זה מיקום הדגימה, אך כאשר הדמיה fluorophore אחד או יותר ברכישת בהגדלה הבאים, הצבע הבהיר ישמש כדי לבסס את ההיסט הדמיה של צבעים אחרים על.
6. לאפשר תיקון הצללה במצב רכישת צלחת לתפור תמונות ביחד.
7. שמירת הגדרות אלה הגדרה א

3. יצירת את ההגדרות עבור רכישת שקופית בהגדלה

1. בתיבת הדו-שיח הגדרת רכישת צלחת , כנס להכרטיסיה אובייקטיבית, מצלמה בחר 40 X כמו ההגדלה, 1 כמו המצלמה binning (עבור הרזולוציה הגבוהה ביותר דיגיטלי), ו- 2 כמו הרווח (כדי להגדיל את האות והבהירות של תמונות).
   הערה: הגדרה אובייקטיבית הגדלה נמוכה יותר יכול לשמש, אך המחברים נמצאו 40 X להיות מההגדרה המיטבית עבור הניתוח של מיקרוגלייה אנושי ו מקרופאגים ברקמת הגידול במוח באמצעות המודול גל מרובה תאים הניקוד .
2. להבטיח את כל ההגדרות עבור הכרטיסיות צלחת-Slidescanning לערוך את הצלחת התחתונה הגדרות. הם זהה עבור הגדרת א (ראה שלב 2).
3. אם התמונות שהתקבלו הן לא פריך, לשנות את עומק טוב, גובה צלחתוהגדרות צלחת התחתון כדי להתאים את המוקד. אם עדיין יש בעיה עם המוקד, לבחור לייזר עם שחזור תמונה תחת המקטע אפשרויות פוקוס אוטומטי .
4. תחת הלשונית רכישה לולאה , הזן את מספר אורכי הגל הנוכחי במדגם. בדוק את אפשרויות להפעיל מבוססת לייזר תוך התמקדות ולאפשר את מבוססת תמונה התמקדות (עבור שחזור רכישה או לייזר) .
5. תחת הלשונית פוקוס אוטומטי , בחר להתמקד צלחת והתחתון היטב.
6. כתבי עת בכרטיסיה, בחר באפשרויות כמצוין איור 2, להבטיח שמניעת אסינכרוני בחומרה מהלכים נבחר גם.
7. שמירת הגדרות אלה הגדרה ב'

4. הנחת את השקופית במערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן

1. הקש F4 כדי לקבל את התפריט הראשי. בחר שקופית סריקה. לחץ על דלת פתוחה – שקופיות הוצא והכנס השקופיות ואת המתאם שקופית (זה יכול להכיל עד 3 שקופיות) לתוך WHCAS (איור 3A ו- 3B). אוריינט השקופית עם coverslip פונה כלפי מטה, התווית בצד החריץ מתאם שקופיות (איור 3 א).
   הערה: השקופיות השתמשו בניסוי זה היו רגיל 25 x 75 x שקופיות של 1 מ"מ.
2. לחץ על סגור דלת – עומס שקופיות.

5. רכישת סריקה מקדימה

1. תחת הכותרת ההקרנה , בחר רכישת צלחת ושליטה. ואת ההתקנה של רכישת צלחת. ולטעון הגדרה א
2. תחת הלשונית בארות לביקור , להעביר טוב המכיל את הדגימה, באמצעות לחצן העכבר הימני על העכבר. תחת הלשונית של אתרי הביקור , להעביר אתרים שונים עם לכידת התמונה Live עד התאים ממוקמים. באופן ידני להתמקד המדגם או להשתמש את פוקוס אוטומטי. כדי ללכוד את התמונה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט הצמד .
   הערה: המדגם קל לאתר עם אתרים נוספים, ועל -ידי התאמת האתרים לבאר (ראה שלב 2.3).
3. בתפריט הראשי, בחר תצוגה מקדימה של שקופיות.
4. בתיבת הדו-שיח באופן אוטומטי שצץ, בחר באפשרות המשקף כמה שקופיות הולכים לסרוק. סריקת שקופית אחת בכל פעם. הקש על אישור. בחר 4 X ההגדלה. הקש על אישור. בחר Coverslip למטה (0.17 מ מ) כיוון שקופית (שימוש תיקון צווארון אם עובי שונה coverslip משמש). הקש על אישור. לחץ על המשך.
   הערה: אם המשתמש מבקש לרכוש סריקות תצוגה מקדימה של שקופיות 2 או יותר, כל סריקה מקדימה יש להיפתח בנפרד לפני רכישת התמונה בהגדלה התואמת.
5. תחת עומס לסרוק שקופיות הגדרת, ודא שבתיבות הגדרות רכישה ו ולידציות נבדקים. לחץ על ביטול. כאשר שבה ומופיעה תיבת הגדרות סריקה שקופית , בחר המשך.
6. עם הופעת תיבת הדו-שיח לסרוק שקופיות , התאם את הגדרות כפי שהוצע ב איור 4Aסי-4. בחר קרוב לסיום.
   הערה: להגדיל את המצלמה binning ו להקטין את זמן החשיפה של המצלמה תגרום סריקה מהירה יותר, גם אם דיגיטלית ברזולוציה נמוכה יותר, טווח דינמי, בהתאמה, ומכאן הפחתת איכות התמונה. הצללה תיקון יבטיח של עוצמה אחידה על פני השדה מבט יחיד. הפעלת חומרה, פוקוס אוטומטי תמונה תבטיח הסריקה נמצא בפוקוס, אבל יהיה להאט את הסריקה. מתוך רצון לחסוך זמן, מומלץ לעשות הצללה תיקון, חומרה, פוקוס אוטומטי תמונה מחוץ בעת רכישת הגדלה נמוכה הסריקה, אבל יש אפשרויות אלה מופעל עבור שלב 6 במהלך ההדמיה בהגדלה. הרזולוציה של הגדלה נמוכה הסריקה לא תשפיע את רזולוציית הסריקה בהגדלה.
7. בחר ספריה עבור השקופית סריקת נתונים. לחץ על אישור. הזן שם עבור הקובץ. לחץ על אישור.
8. תיבת הדו-שיח לאזור לצייר יופיעו באופן אוטומטי. השתמש בכלי אזור מלבני (איור 5A) כדי לבחור אזור הסריקה המקדימה כולו כפי שמוצג באיור 5B. לחץ על המשך.
9. יופיע בתיבת הדו-שיח ההתקנה הושלמה . בחר להמשיך.
   הערה: סריקת שקופית מקדימה כעת תחל.
10. כאשר התצוגה המקדימה הושלם, תופיע תיבת הדו-שיח סריקה מלאה . בחר להמשיך. לא תסגור את החלון סריקה מקדימה (בדוגמה זו, חלון דאפי סרוק ; ראה איור 6).
    הערה: תוכנית ההתקנה ותהליך רכישה הגדלה נמוכה הסריקה ייקח כ 20 דקות. הפעם רכישת התמונה בהגדלה הבאים יהיה תלוי מספר האתרים שבחרת כמו גם פעמים חשיפה לכל ערוץ.

6. בהגדלה סריקה

1. לטעון הגדרת B.
2. לקבוע אילו בארות לדימות. תחת הלשונית בארות לביקור , להעביר טוב המכיל את הדגימה, באמצעות לחצן העכבר הימני על העכבר.
   הערה: הטכניקה מומחש פה הדמיה טוב 1.
3. תחת הלשונית של אתרי הביקור , להעביר אתרים שונים עם תכונת Live עד ממוקם של תאים או רקמות. באופן ידני להתמקד המדגם או להשתמש את פוקוס אוטומטי. כדי ללכוד את התמונה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט הצמד .
   הערה: כדי לסייע באיתור המדגם בהגדלה גדולה, השתמש בתיבת הדו-שיח רכישת לוח הבקרה כדי להתאים את גודל הצעד איפשהו בין 5 מיקרומטר 100 למצוא לדוגמה אם לא פוקוס אוטומטי.
4. תחת הכרטיסיה W1 דאפי , לחץ על אוטומטי לחשוף. ודא התמונה הצלחת הצמד רכישה - דאפי פריך.
5. תחת התפריט הראשי, לחץ על יומן כדי לחשוף את נפתחים. בחר לנהל יומן...
6. לחץ פעמיים על העת ההתקנה רכישה אזור השקופית כדי להפעיל אותו. מופיעה תיבת הדו-שיח רכישה אזור השקופית ההתקנה , בחירת המשך.
7. כאשר הורה, לבחור כראוי את דאפי לסרוק כדי לבחור קלה של תמונת השקופית ההגדלה נמוך. הקש על אישור. באופן דומה, להדגיש הצלחת הרכישה הצמד - דאפי כשנשאל לקראת רכישת צלחת ההגשה. לחץ על אישור.
8. כאשר מופיעה תיבת צור או עומס אזורים , השתמש בכלי האזור המלבני לבחירת region(s) (א) ריבית על דאפי הסריקה (איור 6). לחץ על המשך.
   הערה: השטח המרבי שניתן לבחור בגיל 40 X הוא 45 עמודות על 35 שורות. אם אזורים מרובים עניין נבחרו, האזורים ישונה לתיבה עם האזור הגדול ביותר. באפשרותך למקם את התיבות לאחר שינוי הגודל.
9. בחר בלא תחת תיבת הדו-שיח Load אזורים .
   הערה: בחירת כן נטען בעבר נשמרים אזורים עבור אצוות של שקופיות באותו האזור של עניין מיקומים.
10. באמצעות הכלי מאתר , סמן את האזור הגדול ביותר של הריבית ולחץ המשך תחת תיבת הדו-שיח בחר אזור . כאשר מופיעה תיבת אישור אזורים , בחר המשך. להחליט אם האזור צריך להינצל כאשר מופיעה תיבת הדו-שיח שמירה אזורים .
11. בתיבת הדו-שיח הבאה, ריווח האתר, מאפשרת למשתמש לבחור פרוש, כשהתוצאה היא תמונה ללא חפיפה, או 10% חופפים. בחרו אפשרות ' ולחץ על ' אישור'. המחברים בחר פרוש.
12. שלוש תיבות דו-שיח תופיע כעת. תיבת ההתקנה הושלמה יכולים להיות משוחררים על ידי לחיצה על המשך להשאיר את רכישת אתר ההתקנה עבור 40 X תיבת (איור 7 א) פתוחה לעת עתה מאז זה גורם ברור כמה עמודות, שורות צריך להיות מוזנים לתוך תיבת הגדרת רכישת צלחת (איור 7 ב). . פקח את תיבת WellPositions (איור 7C) המופיע בפינה השמאלית התחתונה למשך ההדמיה
13. בתיבה ההתקנה רכישת צלחת , תחת בארות כדי לבקר, אותו מספר של בארות אזורים מעניינים שבחרת בעבר חייב להיות מסומן (איור 7D).
    שים לב: המחברים פיתחו פרוטוקול זה לכל היותר תשע מחוזות עניין לכל שקופית. אם יש עוד, פשוט להגדיל את מספר עמודות או שורות בכרטיסיה צלחת - SlideScanning כדי לשקף את מספר אזורים מעניינים. בארות אלה אינם מייצגים את המיקום של האזורים עניין בדרך כלשהי במרחב, אך מספר מתאים להיות מסומן (שמאל לחץ).
14. בתיבה הגדרת רכישת צלחת , ללכת אל הכרטיסיה של אתרי הביקור הזן המוצע והעמודות והשורות (איור 7 ב). זכור ללחוץ על אריח אתרים.
15. כדי להעלים את מציאת האתרים המכילים את הדגימה, הקש לרכוש צלחת תחת הכרטיסיה סיכום כדי למקם את הבמה-האזור שנבחרו מראש של ריבית. ברגע סוקרת המצלמה מעל אתר המכיל תאים, לחץ על ביטול בפינה הימנית התחתונה כדי להפסיק את ייבוא תמונות. להבטיח הבמה כבר ממוקם על המדגם.
16. למטב את הגדרות אורך הגל כדי להבטיח כי ממוקד, תמונת טווח דינמי גבוה מתקבל. מרוצה, לחץ על הכרטיסיה סיכום , לרכוש צלחת.

7. ניתוח תמונות

1. בחר את המודול המותאם אישית הרצוי.
   שים לב: המחברים בחרה המודול גל מרובה תאים הבקיע להפגין על פילוח אוטומטיות של השקופיות גידול במוח.
2. להפעיל את הניתוח על כל האתרים. אם הפרמטרים ניתוח זהה עבור שקופיות רבים, הניתוח יכולים להיכלל בתיבת הגדרת רכישת צלחת תחת הלשונית פוסט רכישה .
3. לאחר סיום הניתוח, הכללת אתרים של איכות תמונה גרועה כדי לא הטיה את התוצאות. מאז המטרה של ניתוח זה הוא לכמת מיקרוגלייה ו מקרופאגים ב- parenchyma הגידול, בחר את אזור עניין בתוך הקצוות של המדגם הגידול. יתר על כן, אל תכלול את האתרים לא ממוקדות ו/או מכילים רקמה קיפולים או בועות ודמעות ברקמה. להדגמה, לראות את התוצאות נציג. לחלופין, השתמש לייזר פוקוס הציון שנוצרו עבור כל אתר בהתאם משרעת של השתקפות לייזר סף להלן אילו אתרים הם יכללו (הסף ניתן להתאמה אישית ותלוי בפרמטרים כגון זמן חשיפה ו סוג של מדיה המשמשת).
   הערה: התמונות בהגדלה מאפשרים במפורש לא לכלול מבנים, כגון כלי דם גדולים ובאזורים של נמק, במידת הצורך. . זה גם ניתן לכלול רק תחומי עניין, כגון אלה שנמצאים במקרי... בדרך זו, ירידה לפרטים ודיוק של הניתוחים יכול להיות מוגברת.

Representative Results

ניתן להציג את התמונות בתוך התוכנה WHCAS. איור 8 מראה הממוזערות בהגדלה של כל האתרים שבתוך האזור המוגדר של ריבית. סקור כל אתר כדי לזהות אלה לא להיות כלולים הניתוח (דוגמאות מוצגות בהגדלה נמוך וגבוה ב איור 8 ו- 9 איור, בהתאמה). לדוגמה, אתר 149 לא בפוקוס (איור 9 א) 219 באתר יש בועות (איור 9B), 54 אתר מכיל קיפול (איור 9C), וצריכה. . זה אופייני כדי לא לכלול 10-15% של כל האתרים עם תמונה בדוגמה מסופקים, שוחררנו 15.3% מהאתרים (25/300 היו בועות, 17/300 היו בפוקוס, 3/300 קופלו, 1/300 היה על הקצה). איור 10A היא תמונה ייצוגית שבחרת לניתוח (התמונה הממוזערת שלה הגדלה נמוכה המתאים מוצג באיור8). כאן, כשסוגרים המקביל שנוצר על ידי המודול גל מרובה תאים הבקיע להדגים את התוצאות של פילוח האוטומטי מתבצע על האתר 59, אישית למפרטים של המחברים (גרעינים רוחב מינימלי = 2.5 מיקרומטר, רוחב מרבי = 7.5 מיקרומטר, ועוצמה מעל רקע מקומי = 35 graylevels; רוחב מינימלי של תאים CD11b-חיובית = 4 מיקרומטר, רוחב מרבי = 18 מיקרומטר, מינימום צבעונית אזור = 15 מיקרומטר²ו בעוצמה מעל רקע מקומי = 310 graylevels; ואת רוחב מינימלי של תאים CD45-חיובית = 4 מיקרומטר, רוחב מרבי = 18 מיקרומטר, מינימום צבעונית אזור = 15 מיקרומטר²ו בעוצמה מעל רקע מקומי = 50 graylevels). בעקבות את פילוח, הנתונים הכמותיים של היחס של תאים מכתים חיובי עבור כל סמן (6.2 ± 5.1%, 3.8 ± % 2.1 של CD11b⁺ , CD45⁺ תאים, בהתאמה), שני הסמנים (± 3.5 2.1% CD11b⁺CD45⁺ התאים), אין סמני (± 86.6 9.0% CD11b^–CD45 תאים^– ; איור 10 ב'), אומר צבעונית אזור (40.0 ± 9.2 מיקרומטר ו- 36.7 ± 7.6 מיקרומטר של CD11b⁺ , CD45⁺ תאים, בהתאמה; איור 10C), ואני מתכוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית (408.9 ± 40.3 פלורסצנטיות יחסית יחידות ויחידות 373.9 ± 38.1 פלורסצנטיות היחסי של CD11b⁺ , CD45⁺ תאים, בהתאמה; איור 10D) ניתן להשיג.

איור 1: הגדרות עבור שקופיות רכישת בהגדלה נמוכה. א. תמונה זו מציגה את הגדרות צלחת. B. כאן, מוצגות ההגדרות בתחתית הצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הגדרות עבור שקופיות רכישת בהגדלה גדולה. איור זה מציג את מבחר היומנים המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: הדגמה של איך לטעון את השקופיות באמצעות מתאם שקופיות. א. השקופית ממוקמת coverslip למטה עם התווית בצד החריץ מתאם שקופיות. B. מתאם שקופיות נטען לתוך מערכת ניתוח תוכן גבוהה widefield. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: תצוגה מקדימה של השקופית הגדרות. א. איור זה מציג את הפרמטרים עבור הרכישה. B. כאן, הערכים עבור ההגדרות באורך גל של Hoescht/דאפי מוצגים. ג. תמונה זו מציגה את הגדרות היומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: ציור אזור השקופית. א. הכלי אזור מלבני (לא ניתן להשתמש בכלי ציור אחרים) משמש כדי לבחור את אזור הסריקה המקדימה וליצור אזורים מעניינים בסריקה דאפי. B. קווי המתאר של טיל באיור זה מראה כיצד יש לבחור את כל שטח השקופית (כולל התווית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: יצירת אזורים מעניינים על הסריקה המקדימה. הצג תצוגה מקדימה או סרוק דאפי, תייצג את אזור השקופית כולה. בדוגמה זו, ישנם שלושה חלקים רקמת המוח סדרתי (מוצק לבן מלבני קווי המתאר). האזור שמעל מקטעים אלה מייצג את התוויות מעגלית בשקופית. במקטע אחר הסדרי לא יגביל את הבחירה הבאים של אזורים מעניינים. האזור עניין בדוגמה זו מסוים מוצג עם קו מקווקו מיתאר מלבני לבן. Scalebar = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7: תמונת windows חיוניים בהגדלה רכישת. א. חלון הגדרת אתר הרכישה יראה כמה שורות ועמודות נמצאים במרחק region(s) של עניין. B. להבטיח את המספר הנכון של עמודות, שורות המצוין איור 7 א נכנסו לתוך תיבת הגדרת רכישת צלחת ואת האתרים מרוצפים. ג. יש צורך להשאיר את החלון WellPositions פתוח למשך הזמן של רכישת התמונה למרות שזה ריק. ד. מספר מתאים של אזורים עניין חייב להיות מודגשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8: תמונת הנציגה של האזור עניין. לכל אתר ניתן להציג תמונה ממוזערת ללא הפרדות צבע של האזור בעל עניין. נציג האתרים לא נכללו (מסומן עם התיבות האדומות) ודוגמה של אתר כלולים (מסומן עם תיבת הירוק) מוצג בהגדלה גדולה יותר. מומלץ לעיין בכל אתר כדי להבטיח שהיא באיכות מספיקה לניתוח. Scalebar = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 9: דוגמאות של אתרים לא להיות כלולים ניתוח. א. הסעיפים גידול המוח האנושי נוטף CD11b (ירוק), CD45 (אדום), סמנים של מיקרוגלייה מקרופאגים. התמונה לא בפוקוס, לא נכלל מניתוח. B. בועות נמצאים בתמונה זו, אשר לא נכלל מניתוח הסופי. ג. אתר זה לא נכללו בניתוח בגלל הקיפול ברקמה. פסי בקנה מידה הם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 10: להחליפן בתמונות וניתוח. א. כל תמונה מוצגת לצד כשסוגרים המייצג את התוצאות של פילוח אוטומטית. בכיסוי, גרעינים מוצגים בלבן, תאים באופן חיובי מוכתם מוצגים בירוק עבור CD11b ואדום עבור CD45. לאחר למעט האתרים של איכות לקוי מניתוח, ומשלב את התוצאות של כל שאר האתרים, B. יחסי הגודל הממוצע של המספר הכולל של תאים בכל אתר צבעונית חיובי עבור כל סמן, במשותף עם תוויות עבור שני הסמנים, C. הממוצע מוכתם באזור, ו- D. תא ממוצע עוצמת מיוצגים בצורה גרפית. RFU = יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי. הנתונים מבוטא הממוצע ± סטיית התקן. פסי בקנה מידה הם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

עדיין בעיה נפוצה הפגיעה את היעילות של מחקר במדעי הביולוגיה היא הפיתוח של פרוטוקולים עבור כימות לא משוחדת, ומדויקים של fluorescently התווית על-ידי רקמות ומבנים שלהם בתוך. כמות משמעותית של זמן ומאמץ מופנות לכיוון מציאת דרכים לנתח רקמות שקופיות, ברגע שיש כבר עם תמונה. קיימות שיטות רבות לספק אלגוריתמים עבור משתמשים ליצור מחדש בתוך תוכניות^12,13,14. שיטות אלה מקובלים, אבל המשמעות של דו ח זה הוא שהם מאפשרים למשתמש בקלות ובמהירות לקבוע ייבוא תמונות הוליסטית ופרוטוקול ניתוח אם למשתמש יש גישה WHCAS. מבחני להבדיל בין סוגי תאים, לכמת מספר מבנים, תהליכים ניתוח מחזור התא, רוברטסונית גרעינית, לדוגמה, זמינות כבר התוכנה המשוייכת.

ההגדרה כוללת כמה צעדים קריטיים. ראשית, הפרמטרים המרחבי של השקופית מוגדרים כאילו היתה צלחת. שנית, סריקת סקירה הגדלה נמוכה נוצרת שממנו אזורים מעניינים שנבחרו לדימות בהגדלה. לבסוף, לא יכללו האתרים המשפיעים על דיוק ואמינות של ניתוחים שלאחר מכן. המגבלה הגדולה ביותר של טכניקה זו היא כי את תחולתן תלוי אם למשתמש יש גישה WHCAS. עם זאת, עם צורך גדל והולך למערכות ניתוח תוכן גבוהה, מוסדות רבים מספקים אלה לחוקרים שלהם להישאר תחרותי¹⁵. פתרון בעיות צורך בדרך כלל כאשר רקמות מקטעים אין עובי אותה. אם אזורים מרובים עניין נבחרו, כמה יהיה בפוקוס בעוד שאחרים יהיו לא. באופן אידיאלי, במהלך חלוקתה, ידאג המשתמש כדי ליצור דוגמאות הומוגנית. עם זאת, אם הדגימות אינם עקביים, המיקוד על הגל הכתם גרעינית (או fluorophore המבריקים של המשתמש), אשר משמש כדי להתמקד, יכול להיות והשתלב לכל אזור out-of-להתמקד עניין, אפילו עבור כל שדה ראייה. כפי אורכי הגל השני הם פשוט מוזחות הגל הכתם גרעינית, רק הגל הזה צריך כוונון מחדש.

בדו ח זה, אנו מפרטים כיצד לסרוק ולנתח שקופיות באמצעות WHCAS התוכנה המשוייכת. המודול גל מרובה תאים הבקיע מאפשר למשתמש לספור באופן אוטומטי את כל סמני גרעינית או cytoplasmic המסומנות fluorescently. לאחר התאמת ההגדרות מיקוד והגדרת המאפיינים הסלולר כגון רוחב ואזור כדי להתאים אישית את המודול הרקמה עם תמונה, אין עוד צורך התערבות של המשתמש להשיג את השקופיות שבעורך נתונים כמותיים. עד שלוש שקופיות יכול לדימות בכל פעם, ניתן להגדיר אזורים מרובים של עניין. זו מאפשרת פרוטוקול WHCAS המשתמשים צריכים לנתח שקופיות לנצל להתאמה אישית, רב תכליתי, אוטומטית לזרימות דורש קצת אופטימיזציה ללא יכול להיות מיושם בכל פרויקט בעתיד המערבות ניתוח היסטולוגית של רקמות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageXpress MicroXLS	Molecular Devices	NA	Apparatus for image acquisition
MetaXpress 5.1	Molecular Devices	NA	Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).
Slide adapter	Molecular Devices	NA	Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp	Molecular Devices	NA	The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative
Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL	Molecular Devices	NA	Select this journal in Step 6.6.