Summary
여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.
Abstract
슬라이드 검색 자동화 되 고 붙일 라는 조직의 세분화는 전체 슬라이드 또는 큰 조직 단면도 분석 하는 가장 효율적인 방법. 불행히도, 많은 연구원은 다량 시간 및 자원을 개발 하 고 그들의 자신의 실험 관련만 되는 워크플로 최적화의 지출. 이 문서에서 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)에 대 한 액세스와 함께 그 어떤 슬라이드 마운트 조직, 관련된 소프트웨어에 미리 모듈 내에서 사용자 지정에 대 한 옵션으로 이미지를 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 원래 슬라이드 스캔을 위한,이 문서에 자세히 설명 하는 단계 슬라이드 관련된 소프트웨어로 가져올 수 있는 WHCAS에서 이미지 스캔을 취득 가능 합니다. 이 예제에서는 뇌 종양 슬라이드의 자동된 분할 설명 된다, 그러나 마커의 모든 붙일 표시 된 핵 또는 세포질 자동된 분할 가능 하다. 또한, 단백질 지역화/전, 세포질 확산/생존/apoptosis, 및 실행할 수 있는 신생에 대 한 분석을 포함 한 다른 양적 소프트웨어 모듈의 다양 한이 있다. 이 기술은 연구원은 시간 및 노력을 저장 하 고 슬라이드 분석을 위한 자동화 프로토콜을 만듭니다.
Introduction
슬라이드에 붙일 레이블 조직의 정확 하 고 정밀한 정량 많은 과학 분야에서 매우 인기 있는 기술입니다. 그러나, 연구원은 자주 수동으로 계산 표본 또는이 비 자동화 된 기법을 개발 하는 시간의 상당한 금액을 지출. 여기, 우리는 자동된 슬라이드 스캔 및 예를 들어 냉동된 인간 두뇌 종양 섹션에 타고 난 면역 세포는 WHCAS 및 그 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 정량에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 셀 유형1,2,3,,45, 의 세 neurite 결과에서 기본 제공 사용자 정의 모듈의 넓은 범위를 제공 하는 관련된 소프트웨어 6.이 방법의 목표의 이미지와 슬라이드 마운트 어떤 조직에 놓여있는지 표시 된 엔터티를 quantitate 시작 완료, 쉽게 재현할 수 프로토콜 연구를 제공 하는.
이 프로토콜에는 WHCAS 주로 슬라이드 어댑터와 기본 슬라이드 스캔7 에 사용할 수 있었던 비록 후속 분석 관련된 소프트웨어에 대 한 번호판을 이미징 사용 됩니다. 그것은 수집 지역, 해당 저널의 선택, 맞춤형된 로드의 창조와 제품 담당자와 연락의 주의 공간 교정 필요 했다 때문에 이미지 슬라이드를 금지 했다. 문학, 전용된 슬라이드 이미징 및 분석 기구8, 구입 하는 대신 넓은 본문에이 소프트웨어에 액세스할 수 있는 이전 기술 보고서 WHCAS 전부9슬라이드 이미지 수집을 피할. 이미지 수집 또는 이미지 분석을 수행 하는 다른 플랫폼에서 각각 다른와 호환은 보장 하기 위해 추가 작업을 필요로 합니다.
이미지 캡처는 WHCAS 및 그것의 소프트웨어를 사용 하는 기능에 대 한 검색 또는 이러한 도구를 워크플로 외국인 개발의 불필요 한 합병증을 피할 것 이다. 이 문서에서는, 접시,으로 슬라이드 하 여 낮은 확대 개요 검사 및 해당 고배율 이미지를 만드는 데 필요한 단계 및 다중 파장 셀 득점 세그먼트 모듈을 사용 하 여 후속 분석을 허용 합니다 WHCAS의 재사용. 이 쉽게 사용할 수 프로토콜 알고리즘 또는 다단계 세 프로토콜10,11 을 개발 하는 일단 이미지는 WHCAS에 인수는 필요가 없기 때문에 다른 기술에 비해 우위를 제공 합니다. 이 프로토콜 정량 기법을 최적화 하는 데 필요한 시간을 줄입니다, 더 정확 하 게12 와 수동 계산 보다 효율적인는 WHCAS의 사용을 극대화. 이 프로토콜 사용할 수 있습니다 광범위 하 고 쉽게 영상 및 슬라이드에 어떤 붙일 라는 조직의 분석 수 있습니다 이후.
Protocol
종양 표본은 프로토콜 로컬 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 및 국가 규정에 따라 실시에 의하여 얻은 했다. WHCAS 및이 문서에서 사용 되는 관련된 소프트웨어 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
1. 가져오기는 저널
- 관련된 소프트웨어를 엽니다.
- 재료의 테이블에에서 표시 된 저널 스위트를 다운로드 합니다.
- 저널을 향하고 주 메뉴를 클릭 하 여 적절 한 디렉터리에 저널 스위트를 가져오기 가져오기 저널 스위트...,을 선택 하 고 가져오기를 클릭 하.
2. 만들기 설정 미리 보기에 대 한 검색 인수
- 플레이트 수집 설정 대화 상자에서 이동 목표 및 카메라 탭 선택 4 배 확대, 카메라 binning으로 1과 2는 이득으로.
- 접시-Slidescanning탭 그림 1A 에 설정을 입력 합니다.
참고: 이러한 설정은 사용자 보고 최대 3 슬라이드를 탐색할 수 있도록 개발 되었습니다. 각 슬라이드 쉬운 탐색을 위한 3 인접 한 우물으로 분리 되어 고 '라이브' 조직 조각 또는 셀의 시각화. - 방문 사이트 탭에서 사이트와 우물을 균일 하 게 작성.
- 플레이트 하단 설정 편집... 을 클릭 하 고 그림 1B에서 표시 되는 값을 입력.
- 인수 루프 탭에서 미리 보기 스캔에 대 한 원하는 파장 (이 예제에서 어떤 핵 얼룩)를 입력 합니다. 최고의 콘트라스트 및 초점 이미지 기반, 밝은 형광 신호 (예를 들어, 자주 핵 얼룩)를 사용 합니다.
참고: 조직 핵 얼룩 같은 밝은 얼룩으로 얼룩이 지기 것이 좋습니다 이후 백그라운드에 비해 높은 콘트라스트를 제공 하는이. 뿐만 아니라 샘플 위치에이 지원 되지만 다음 높은 배율 인수에 하나 이상의 fluorophore 이미징 때 밝은 색상은 다른 색상의 이미징 오프셋을 기준 하는 데 사용 됩니다. - 함께 이미지를 플레이트 수집 모드에서 음영 보정 을 사용 합니다.
- A. 설정 이러한 설정을 저장합니다
3. 고배율에서 슬라이드 인수에 대 한 설정 만들기
- 플레이트 수집 설정 대화 상자에서 이동 목표 및 카메라 탭 선택 40 X (해상도 대 한 최고의 디지털), 카메라 binning으로 1과 2 (신호 및 이미지의 밝기를 증가)를 이득으로 확대 합니다.
참고: 낮은 객관적인 배율 설정을 사용할 수 있습니다, 하지만 작가 찾을 인간의 microglia 및 다중 파장 셀 득점 모듈을 사용 하 여 뇌 종양 조직에서 세포의 분석에 대 한 최적의 설정 수 X 40. - 접시-Slidescanning 및 편집 판 하단 설정 탭 설정 A와 동일은 모든 설정을 확인 (단계 2 참조).
- 얻은 이미지 선명 하 고 있다면, 잘 깊이, 판 높이및 플레이트 하단 설정 조정 초점을 변경할. 초점 문제가 여전히 경우 자동 초점 옵션 섹션 아래 레이저 이미지 복구 를 선택 합니다.
- 인수 루프 탭 아래 샘플에 존재 하는 파장의 수를 입력 합니다. 초점 레이저 기반 사용 하 고 (인수 또는 레이저 복구)에 대 한 초점 이미지 기반 사용 옵션을 확인 합니다.
- 자동 초점 탭 아래 판과 잘 하단에 초점을 선택 합니다.
- 그림 2, 또한 선택 방지 비동기 하드웨어 이동 보장에 표시 된 대로 저널 탭에서 옵션을 선택 합니다.
- 이 설정을 설정 B. 저장
4. Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템에서 슬라이드 배치
- 주 메뉴를 얻을 수 f 4 를 누릅니다. 검색 슬라이드를 선택 합니다. 오픈도어-추출 슬라이드를 클릭 하 고 슬라이드와 슬라이드 어댑터 (에 최대 3 개의 슬라이드를 저장할 수 있는) WHCAS (그림 3A 와 3B)에 삽입. 슬라이드 아래로 향하게 하는 coverslip와 슬라이드 어댑터 (그림 3A)에 노치 측면 라벨 동양.
참고:이 실험에서 사용 하는 슬라이드 1 mm 슬라이드 x 75 x 표준 25 했다. - 닫기 문-부하 슬라이드를클릭 하십시오.
5. 미리 보기 스캔을 획득
- 상영 제목 아래 플레이트 수집 및 제어... 및 플레이트 수집 설치... 선택 하 고 설정 a. 로드
- 방문에 웰 스 탭 필요는 잘 포함 하는 샘플을 마우스 오른쪽 클릭 버튼을 사용 하 여 이동 합니다. 셀 위치까지 방문 하는 사이트 탭 아래 라이브 이미지 캡처 다른 사이트로 이동 합니다. 수동으로 샘플에 집중 하거나 자동 초점을 사용 합니다. 캡처 이미지를 스냅 을 사용 합니다.
참고: 샘플 잘 사이트를 피팅 하 여 더 많은 사이트와 찾을 수 쉽습니다 (단계 2.3 참조). - 메인 메뉴에서 미리 보기 슬라이드를 선택 합니다.
- 자동으로 팝업 되는 대화 상자에서 스캔 하려고 얼마나 많은 슬라이드를 반영 하는 옵션을 선택 합니다. 한 번에 한 슬라이드를 스캔 합니다. 확인키를 누릅니다. 4 X 배율을 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. (0.17 m m) 아래로 Coverslip 슬라이드 방향 (사용 정정 고리 다른 coverslip 두께 사용 하는 경우) 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. 계속을 클릭 합니다.
참고: 사용자가 2 이상의 슬라이드 미리 보기 스캔을 취득 하고자 하는 경우 각 미리 보기 스캔 해당 고배율 이미지의 인수 전에 개별적으로 열 수 있다. - 부하 검사 슬라이드 설정, 수집 설정 및 교정 상자 체크 확인. 취소를 누릅니다. 검색 슬라이드 설정 상자가 다시 나타납니다, 계속을 선택 합니다.
- 슬라이드 스캔 대화 상자가 나타나면 그림 4A-4 C에 제안 하는 대로 설정을 조정 합니다. 가까운 완료를 선택 합니다.
참고: 카메라 binning 및 감소 하는 카메라의 노출 시간을 증가 발생 합니다 빠른 스캔, 이기는 하지만 낮은 디지털 해상도 동적 범위에서 각각, 그러므로 감소 이미지 품질. 음영 보정 보기의 단일 필드에 걸쳐 균일 한 강도 보장 합니다. 하드웨어 및 이미지 자동 설정 검색 초점에서 이지만 스캔 속도 보장 됩니다. 시간을 절약, 관심 낮은 확대 검사를 취득 하는 동안 수정 및 하드웨어 및 이미지 자동 초점에서 음영을 하지만이 옵션을 켜 6 단계에 대 한 높은 확대 이미징 동안 것이 좋습니다. 낮은 확대 스캔의 해상도 높은 확대 스캔의 해상도 영향을 미치지 않습니다. - 데이터를 검색 하는 슬라이드에 대 한 디렉터리를 선택 합니다. 확인을 클릭 합니다. 파일에 대 한 이름을 입력 합니다. 확인을 클릭 합니다.
- 그리기 영역 대화 상자가 자동으로 표시 됩니다. 사각형 영역 도구 (그림 5A)를 사용 하 여 그림 5B와 같이 전체 미리 보기 스캔 영역을 선택. 계속을 클릭 합니다.
- 설치 완료 대화 상자가 표시 됩니다. 계속을 선택 합니다.
참고: 미리 보기 슬라이드 스캔 지금 시작 됩니다. - 미리 보기가 완료 되 면 스캔 완료 대화 상자가 나타납니다. 계속을 선택 합니다. 미리 보기 검색 창을 닫지 마십시오 (이 예에서 DAPI 스캔 창; 그림 6참조).
참고: 설치 및 낮은 확대 스캔 수집 과정 약 20 분 소요 됩니다. 이후 높은 확대 이미지 수집 시간이 각 채널에 대 한 노출 시간 뿐만 아니라 선택 하는 사이트의 수에 따라 달라 집니다.
6. 높은 확대 검사
- B. 설정 로드
- 어느 우물이 이미지 수를 확인 합니다. 방문에 웰 스 탭 필요는 잘 포함 하는 샘플을 마우스 오른쪽 클릭 버튼을 사용 하 여 이동 합니다.
참고: 기술 1 잘 이미징 의해 여기 증명 됩니다. - 세포 나 조직 때까지 방문 사이트 탭 아래 라이브 기능으로 다른 사이트로 이동 합니다. 수동으로 샘플에 집중 하거나 자동 초점을 사용 합니다. 캡처 이미지를 스냅 을 사용 합니다.
참고: 높은 확대에 샘플을 찾기에 투입, 자동 초점 없는 경우 샘플을 찾을 수 100 µ m에 어디에서 든 지 5 단계 크기를 조정 하려면 플레이트 수집 및 제어 대화 상자를 사용 합니다. - W1 DAPI 탭에서 자동 노출클릭 합니다. 플레이트 수집 스냅-DAPI 이미지는 선명 하 고 확인 합니다.
- 주 메뉴에서 풀-다운을 저널 에 클릭 합니다. 저널... 실행을 선택 합니다.
- 그것을 발사 지역 수집 설정 슬라이드 저널에 두 번 누릅니다. 설치 슬라이드 영역 인수 대화 상자가 나타나면 계속을 선택 합니다.
- 때, 제대로 된 DAPI 스캔 낮은 배율 슬라이드 이미지를 선택 선택 합니다. 확인키를 누릅니다. 마찬가지로, 강조 플레이트 수집 스냅-DAPI 플레이트 수집 스냅인에 대 한 질문. 확인을 클릭 합니다.
- 만들기 또는 부하 영역 상자가 나타나면 DAPI 스캔 (그림 6)의 (a) 지구를 선택 하는 사각형 영역 도구를 사용 합니다. 계속을 누릅니다.
참고: 40 X에서 선택할 수 있는 최대 영역 35 행 45 열입니다. 관심의 여러 영역을 선택 하는 경우 큰 영역 상자 영역 크기가 조정 됩니다. 상자는 크기 위치 될 수 있습니다. - 로드 영역 대화 상자에서 아니요 를 선택 합니다.
참고: 선택 예 부하 이전 슬라이드의 일괄 처리에 대 한 지역으로 저장 관심 위치의 동일한 지역. - 로케이터 도구를 사용 하 여 관심의 가장 큰 영역을 강조 표시 하 고 선택 영역 대화 상자에서 계속 을 누릅니다. 확인 지역 상자가 나타나면 계속을 선택 합니다. 지역 영역 저장 대화 상자가 나타나면 저장 해야 하는지 여부를 결정 합니다.
- 사이트 간격, 다음 대화 상자를 사용 하면 Tiled, 오버랩, 또는 10% 중복이미지를 선택할 수 있습니다. 옵션을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다. 저자 Tiled선택 했다.
- 세 개의 대화 상자는 이제 표시 됩니다. 계속을 눌러 설치 완료 상자를 해산 수 있습니다. 뜨고 40 X에 대 한 수집 사이트 설정 상자 (그림 7A) 지금 그것은 명확 얼마나 많은 열 및 행 (그림 7B) 플레이트 수집 설정 상자에 입력 하는 데 필요한 이후. 뜨고 표시 되는 WellPositions 상자 (그림 ℃) 왼쪽 아래 모서리에는 화상의 동안.
- 플레이트 수집 설정 상자의 방문 하 웰 스, 이전에 선택한 관심의 영역으로 우물의 동일한 수 있어야 합니다 (그림 7D)을 강조 했다.
참고: 저자 슬라이드 당 관심의 9 개 지역 중 최대이 프로토콜을 개발. 더 많은 경우, 단순히 열 또는 관심 영역 수를 반영 하기 위해 플레이트-SlideScanning 탭 행의 수를 늘립니다. 이러한 웰 스 공간 어떤 식으로든에서 관심 영역의 위치를 대표 하지 않는다 하지만 적절 한 번호 강조 (왼쪽) 해야 합니다. - 플레이트 수집 설정 상자에서 방문 하는 사이트 탭 이동 제안된 열과 행 (그림 7B)을 입력 합니다. 타일 사이트클릭 하 여 기억 하십시오.
- 샘플을 포함 하는 사이트를 찾는의 추측을 제거 하려면 미리 선택 된 관심 영역에서 무대를 요약 탭 아래 취득 접시 를 누릅니다. 일단 카메라는 셀을 포함 하는 사이트를 통해 팬, 누르십시오 취소 이미지 수집을 중지 하려면 오른쪽 하단 모서리에서. 무대는 이제 확인 샘플에 위치 하 고 있습니다.
- 초점과 높은 동적 범위 이미지 획득은 파장 설정을 최적화 합니다. 만족, 요약 탭 및 취득 접시에서 클릭 합니다.
7. 이미지 분석
- 원하는 사용자 지정 모듈을 선택 합니다.
참고: 저자는 뇌 종양 슬라이드의 자동된 분할을 보여 주기 위해 다중 파장 셀 득점 모듈을 선택 했다. - 모든 사이트에서 분석을 실행 합니다. 분석 매개 변수가 많은 슬라이드 같은 경우, 분석 게시물 수집 탭 플레이트 수집 설정 상자에 포함할 수 있습니다.
- 분석 완료 되 면 결과 편견을 하지 가난한 이미지 품질의 사이트를 제외 합니다. 이 분석의 목표 microglia 및 세포 종양 실질에 계량 하기 때문에, 종양 샘플의 가장자리에서 관심 영역을 선택 합니다. 또한, 초점 및/또는 조직 주름 또는 거품과 조직에서 눈물을 포함 하는 사이트를 제외 합니다. 데모를 위해 대표 결과참조 하십시오. 또는, 어떤 사이트는 제외 임계값 아래 레이저 반사의 진폭에 따라 각 사이트에 대해 생성 된 레이저 초점 점수 를 사용 하 여 (임계값은 사용자 정의 및 노출 시간 등에 따라와 사용 되는 매체 형식)입니다.
참고: 높은 확대 이미지 가능 하 게 특별히 필요한 경우 구조, 큰 혈관의 괴 사, 지역 등을 제외 하. 그것은 또한 hypercellular는 하는 관심 영역만 포함 하도록 가능입니다. 이러한 방법으로, 특이성 및 분석의 정확성 증가 수 있습니다.
Representative Results
WHCAS 소프트웨어 내에서 이미지를 볼 수 있습니다. 그림 8 의 정의 된 영역 내에서 모든 사이트의 높은 확대 축소판을 보여줍니다. (예제 표시 됩니다 그림 8 및 그림 9에서 낮은 확대율에서 각각) 분석에서 제외 해야 하는 것 들을 식별 하기 위해 각 사이트를 검토 합니다. 예를 들어 사이트 149 초점 (그림 9A), 사이트 219는 거품 (그림 9B) 이며 사이트 54 배 (그림 9C)를 포함 하 고 제외 해야 합니다. 이미지가 포함 된 모든 사이트의 10-15%를 제외 일반적입니다. 제공 된 예제에서 사이트의 15.3% 제외 (25/300 거품, 17/300 초점 있었다, 3/300은 접혀 있었고 1/300 가장자리에). 그림 10A는 대표 이미지 분석 (해당 낮은 확대 축소판 그림 8에 표시 됩니다)에 대 한 선택. 여기, 다중 파장 셀 득점 모듈에 의해 생성 된 해당 오버레이 사이트 59, 작성자의 사양에 맞게 사용자 지정에서 수행 하는 자동화 된 세분화의 결과 보여 줍니다 (핵 최소 폭 2.5 µ m, 최대 너비 = = 7.5 µ m, 그리고 로컬 배경 위의 강도 = 35 graylevels; CD11b-긍정적인 세포의 최소 폭 4 µ m, 최대 너비 = = 18 µ m, 최소 스테인드 영역 15 µ m2와 지역 배경 위의 강도 = = 310 graylevels; CD45-긍정적인 세포의 최소 폭 4 µ m, 최대 너비 = = 18 µ m, 최소 스테인드 영역 15 µ m2와 지역 배경 위의 강도 = 50 graylevels =). 따라 세분화, 각 표식에 대 한 긍정적인 얼룩이 지는 세포의 비율의 양적 데이터 (6.2 ± 5.1% 및 3.8 ± 2.1 %CD11b+ 및 CD45+ 세포, 각각), 두 마커 (3.5 ± 2.1 %CD11b+CD45+ 셀), 아무 표식 (86.6 ± 9.0 %CD11b-CD45- 세포; 그림 10B) 스테인드 지역 평균 (40.0 ± 9.2 µ m 및 CD11b의 36.7 ± 7.6 µ m+ 및 CD45+ 세포, 각각; 그림 10C) 형광 강도 의미 하 고 (408.9 ± 40.3 상대 형광 수량과 373.9 ± 38.1 상대 형광 CD11b의+ 및 CD45+ 세포, 각각; 그림 10) 얻을 수 있습니다.
그림 1: 낮은 확대율에서 슬라이드 인수에 대 한 설정. A.이 이미지는 접시 설정이 표시 됩니다. B. 여기, 플레이트 하단 설정이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 높은 배율 슬라이드 인수에 대 한 설정. 이 그림에는 적절 한 저널의 선택 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 슬라이드 어댑터를 사용 하 여 슬라이드를 로드 하는 방법의 데모. A. 슬라이드 아래로 슬라이드 어댑터 노치 측면 레이블 coverslip을 배치 됩니다. B. 슬라이드 어댑터 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템에 로드 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 미리 보기 슬라이드 설정. A.이 그림 인수에 대 한 매개 변수를 표시 합니다. B. 여기, Hoescht/DAPI 파장 설정에 대 한 값이 표시 됩니다. C.이 이미지 저널 설정을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 슬라이드 영역 그리기. A. 사각형 영역 도구 (다른 그리기 도구를 사용할 수 없습니다.) 미리 보기 스캔 영역을 선택한 DAPI 스캔에 관심 영역을 생성 하는 데 사용. B.이 그림에서 청록 개요 (를 포함 하 여 라벨) 슬라이드의 전체 영역을 선택 해야 합니다 방법을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 미리 보기 스캔에 관심 영역 만들기. 미리 보기 또는 DAPI 스캔 전체 슬라이드 영역을 나타냅니다. 이 예제에서 3 개의 직렬 뇌 조직 섹션 (단단한 흰색 사각형 윤곽선)이 있다. 이러한 섹션 위의 영역 슬라이드에 원형 레이블을 나타냅니다. 다른 섹션 준비는 이후 다양 한 관심 영역을 제한 하지 것입니다. 이 특정 예제에서 관심 영역 점선된 흰색 사각형 윤곽선으로 표시 됩니다. scalebar = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 높은 확대에 대 한 필수적인 윈도우 이미지 수집. A. 수집 사이트 설치 창이 표시 됩니다 얼마나 많은 열과 행의 지구 내. B. 열 정확한 수를 확인 그림 7A 에 표시 된 행 플레이트 수집 설정 상자에 입력 하 고 사이트 타일. C. 뜨고 WellPositions 윈도우 이미지 수집 동안 공백에 불구 필요가 있다. D. 적절 한 수의 관심 영역을 강조 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 관심 영역의 대표 이미지. 각 사이트는 관심의 영역의 복합 축소판에 표시할 수 있습니다. (빨간 상자 표시)는 제외 된 대표 사이트와 (녹색 상자 표시)는 포함 된 사이트의 예를 들어 더 높은 확대에 표시 됩니다. 그것은 분석에 대 한 충분 한 품질의 보장 하기 위해 각 사이트를 검토 하는 것이 좋습니다. scalebar = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 분석에서 제외 해야 하는 사이트의 예. A. 인간 두뇌 종양 섹션 있다 되었습니다 스테인드 CD45 (빨간색), CD11b (녹색)와 microglia 및 대 식 세포의 표식. 이 이미지 초점 고 분석에서 제외 되었습니다. B. 거품은 최종 분석에서 제외 된이 이미지에 존재. C. 이 사이트는 조직에서 배 때문에 분석에서 제외 했다. 스케일 바는 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 대표 이미지 및 분석. A. 각 이미지 오버레이 자동된 분할의 결과 나타내는 옆에 표시 됩니다. 오버레이에서 핵 화이트에 표시 됩니다 하 고 긍정적으로 얼룩진된 셀 CD45에 대 한 CD11b 및 빨간 녹색에 표시 됩니다. 후에 분석에서 부적절 한 품질의 사이트를 제외 하 고 모든 나머지 사이트, B의 결과 결합. 각 표식에 대 한 긍정적인 얼룩이 지 고 공동 두 마커, C에 대 한 분류는 각 사이트에 있는 셀의 총 수의 평균 비율. 평균 스테인드 영역 및 D. 평균 셀 강도 그래픽으로 표현 됩니다. RFU = 상대 형광 단위. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현 됩니다. 스케일 바는 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
생물 과학 연구의 효율성을 방해한 일반적인 문제 아직도 붙일 표시 된 조직의 정확, 공평 하 고 정확한 정량화 및 그들의 구조에 대 한 프로토콜의 개발 이다. 상당한 양의 시간과 노력을 그들은 몇 군데 있다 일단 조직 슬라이드를 분석 하는 방법을 찾는 쪽으로 이동 합니다. 많은 기존의 방법 프로그램12,13,14에서 다시 사용자에 대 한 알고리즘을 제공 합니다. 이러한 메서드는 수락 가능 하다, 하지만이 보고서의 의미는 그것 쉽고 빠르게 설정 하는 전체적인 이미지 수집 및 분석 프로토콜 사용자가는 WHCAS에 액세스 하는 경우 사용자 수 있습니다. 종류를 구분 하 고 여러 구조와 프로세스, 세포 주기 분석, 및 핵 전 좌, 계량 분석 예를 들어 이미 관련된 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다.
설치 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. 첫째, 접시에 마치 슬라이드의 공간 매개 변수 정의 됩니다. 둘째, 낮은 배율 개요 검사는 관심 영역 높은 확대 이미징 선택으로 만들어집니다. 마지막으로, 정확도 및 후속 분석의 정밀도 영향을 주는 사이트는 제외 됩니다. 이 기술의 가장 큰 한계는 그것의 적용에 따라는 사용자가는 WHCAS에 액세스할 경우 이다. 그러나, 하이 콘텐츠 분석 시스템을 위한 증가 필요와 많은 기관 제공 하는 이러한 경쟁15에 남아 그들의 연구원에 게. 문제 해결은 가장 일반적으로 때 필요 조직 단면도 동일한 두께 필요가 없습니다. 다른 사람 하지 것입니다 동안 관심의 여러 영역을 선택 하는 경우 일부 초점에 있을 것입니다. 이상적으로, 단면, 하는 동안 사용자 다룰 것입니다 균질 견본을 만드는. 그러나, 샘플 일치 하지 않는 경우 집중 하는 데 사용 되는 핵 얼룩 파장 (또는 사용자의 밝은 fluorophore)에 초점을 맞추고 수 수 재조정 관심 각 밖의 초점 영역에 대 한 및 보기의 각 필드에 대 한도. 로 다른 파장은 단순히 핵 얼룩 파장에서 오프셋만이 파장 재조정을 해야 합니다.
이 보고서에서 우리는 검사 하 고 WHCAS 및 관련된 소프트웨어를 사용 하 여 슬라이드를 분석 하는 방법을 선발. 다중 파장 셀 득점 모듈을 사용 하면 어떤 핵 또는 세포질 마커를 붙일 레이블이 자동으로 계산 수 있습니다. 초점 설정을 조정 하 고 너비와 몇 군데 조직에 모듈을 사용자 지정 하는 지역 등 세포 특성 정의 후 더 이상 이미지 슬라이드와 양적 데이터를 사용자의 개입에 대 한 필요는. 최대 3 개의 슬라이드를 한 번에 몇 군데 수 있다 하 고 관심의 여러 영역을 정의할 수 있습니다. WHCAS 사용자가 슬라이드를 분석 하는 데 필요한 활용 사용자 정의 다목적,이 프로토콜 사용 하면 자동 워크플로 좀 더 최적화를 요구 하 고 미래에 조직의 조직학 분석을 포함 하는 모든 프로젝트에 적용할 수 있습니다.
Disclosures
저자가이 원고에 설명 된 제품에 아무런 재정적 이익을 있고 아무것도 공개.
Acknowledgments
이 프로젝트는 건강 연구의 캐나다 학회 및 앨버타 혁신-건강 솔루션/앨버타 암 재단에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 저자는 그들의 장비, 건물 기초는 슬라이드 스캔은 WHCAS에서 가능 하 게 되었다, 그리고 제품의 창조 자에 폴라 Gedraitis의 일의 사용에 대 한 신경 생물학 핵심 시설에 재생 단위를 인정. 이 문서에서는, 분자 장치 언급.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL |
Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Gedraitis, P. Slide Region Acquisition Journal Suite. , Available from: http://metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide (2013).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
