Summary
هنا يصف لنا بروتوكول لتجزئة الآلي للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي على الشرائح باستخدام نظام تحليل محتوى عالية ويديفيلد (وكاس). هذا البروتوكول له تطبيقات واسعة النطاق في أي حقل الذي ينطوي كوانتيتيشن علامات مضيئة في الأنسجة البيولوجية، بما في ذلك العلوم البيولوجية والهندسة الطبية، والعلوم الصحية.
Abstract
الشريحة المسح الآلي وتجزئة للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي هو الطريقة الأكثر فعالية لتحليل الشرائح كاملة أو أجزاء كبيرة من الأنسجة. لسوء الحظ، العديد من الباحثين أنفاق مبالغ كبيرة من الوقت والموارد في تطوير وتحسين سير العمل ذات الصلة بالتجارب الخاصة بهم فقط. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول التي يمكن أن يستخدمها أولئك مع إمكانية الوصول إلى نظام تحليل محتوى عالية ويديفيلد (وكاس) للصورة أي أنسجة مثبتة على الشريحة، مع خيارات للتخصيص ضمن وحدات بنيت قبل العثور على البرمجيات المرتبطة بها. المقصود ليس أصلاً لمسح الشرائح، بالخطوات المفصلة في هذه المادة تجعل من الممكن الحصول على الشريحة مسح الصور في وكاس التي يمكن استيرادها إلى البرنامج المقترن. في هذا المثال، يتجلى الآلي تقسيم الشرائح ورم الدماغ، لكن من الممكن تجزئة الآلي لأي علامة النووية أو هيولى المسمى فلوريسسينتلي. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة متنوعة من وحدات كمية البرامج الأخرى بما في ذلك فحوصات للبروتين التعريب/إزفاء، انتشار الهاتف الخلوي/السلامة/المبرمج والأوعية التي يمكن تشغيلها. هذا الأسلوب سيتم حفظ الباحثين من الوقت والجهد وإنشاء بروتوكولا الآلي لتحليل الشريحة.
Introduction
كوانتيتيشن صحيحة ودقيقة للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي على الشرائح تقنية عالية رواجا في كثير من الميادين العلمية. غير أن الباحثين غالباً ما يدوياً عد عينات أو تنفق قدرا كبيرا من الوقت تطوير تقنيات الآلي مقصور على فئة معينة لتحقيق هذا الهدف. هنا، نحن نقدم بروتوكولا للشريحة الآلي المسح الضوئي وكوانتيتيشن من الخلايا باستخدام وكاس والبرمجيات المرتبطة بها، مع الخلايا المناعية الفطرية في أقسام ورم الدماغ البشري المجمدة كمثال. البرمجيات المرتبطة بها تشكيلة واسعة من المدمج في وحدات قابلة للتخصيص من ثمرة نيوريتي عد إلى التفريق بين الخلية أنواع1،2،3،،من45، 6-والهدف من هذا الأسلوب تزويد الباحثين ببروتوكول بدء-إلى-انتهاء، واستنساخه بسهولة للحصول على صور وكوانتيتاتي الكيانات المسماة فلوريسسينتلي في أي أنسجة مثبتة على الشريحة.
في هذا البروتوكول، وكاس يستخدم أساسا لتصوير لوحات للتحليل اللاحق على البرمجيات المرتبطة بها على الرغم من أن محول شريحة والاساسيات الشريحة المسح7 متاحة. كان مانعة لشرائح الصورة نظراً لأن هناك حاجة إلى معايرة المكاني الدقيق في مجال اقتناء واختيار المجلات المناسبة وإنشاء loadouts مصممة واتصال مع ممثلي المنتج. في الجسم أوسع من الأدب، بدلاً من شراء تصوير شريحة مخصصة و جهاز تحليل8، التحايل تقرير تكنولوجية سابقة مع إمكانية الوصول إلى هذا البرنامج الحصول على الصور من الشرائح في الإجمال وكاس9. إجراء تحليل اقتناء أو صورة صورة على منصات مختلفة تتطلب العمل الإضافي لضمان كل متوافق مع الآخر.
القدرة على استخدام وكاس والبرامج الخاصة به لالتقاط الصور من شأنه تجنب التعقيدات غير الضرورية للبحث عن أو النامية غريبة سير عمل بهذه الأدوات. في هذه المقالة، الخطوات المطلوبة لإنشاء تفحص نظرة عامة على تضخم منخفض والصور عالية التكبير المقابلة بعلاج الشريحة كلوحة، والتحاليل اللاحقة استخدام الوحدة النمطية لتجزئة "سجل خلية" متعددة الطول الموجي تسمح repurposing وكاس. يوفر هذا البروتوكول جاهزة للاستعمال ميزة على تقنيات بديلة لأنه ليس هناك حاجة لتطوير خوارزميات أو بروتوكولات متعددة خطوة العد10،11 مرة تكتسب الصور على وكاس. هذا البروتوكول تقليل الوقت المطلوب لتحسين أسلوب كوانتيتيشن، وهو أكثر دقة12 وكفاءة من العد اليدوي وتعظيم استخدام وكاس. هذا البروتوكول على نطاق واسع وسهولة استخدامها نظراً لأنه تمكن من تصوير وتحليل أي أنسجة المسمى فلوريسسينتلي على الشرائح.
Protocol
وتم الحصول على عينات من ورم وفقا للبروتوكول التي أقرتها اللجنة المجلس والأخلاقيات المراجعة المؤسسية المحلية ووفقا للوائح الوطنية. ترد في الجدول للموادوكاس والبرمجيات المرتبطة المستخدمة في هذه المقالة.
1-استيراد دفاتر اليومية
- قم بفتح البرنامج المقترن.
- تحميل جناح المجلة المشار إليها في الجدول للمواد.
- استيراد جناح دفتر اليومية إلى دليل مناسب بواسطة النقر فوق القائمة الرئيسية عنوان دفتر اليومية، تحديد استيراد دفتر يومية جناح..., ثم النقر فوق استيراد.
2-إنشاء إعدادات لمعاينة المسح الضوئي اقتناء
- في مربع الحوار إعداد اقتناء لوحة ، انتقل إلى علامة التبويب الكاميرا والهدف حدد 4 X التكبير، 1 ك binning الكاميرا، و 2 كالكسب.
- إدخال الإعدادات الموجودة في الشكل 1A تحت علامة التبويب لوحة – سليديسكانينج.
ملاحظة: تم إنشاء هذه الإعدادات للسماح للمستخدمين بعرض والتنقل الشرائح تصل إلى 3. كل شريحة ظلت مقسمة إلى 3 الآبار المجاورة لسهولة التنقل و 'يعيش' التصور لشرائح الأنسجة أو الخلايا. - في علامة التبويب مواقع للزيارة ، سد الآبار موحد مع المواقع.
- انقر فوق تحرير لوحة أسفل إعدادات.. وأدخل القيم المعروضة في الشكل 1B.
- ضمن علامة التبويب حلقة اقتناء ، أدخل الطول الموجي المطلوب (أي وصمة عار النووية في هذا المثال) لمعاينة المسح الضوئي. لتباين أفضل والمستندة إلى الصور مع التركيز، استخدم إشارة ألمع نيون (مثلاً، كثيرا ما وصمة عار نووية).
ملاحظة: تلطيخ الأنسجة مع وصمة مشرق مثل وصمة عار نووية يوصي بحيث يوفر هذا على النقيض عالية مقارنة بالخلفية. ليس فقط سوف هذه المعونة في الموقع عينة، ولكن عند التصوير فلوروفوري واحد أو أكثر في اكتساب عالية التكبير التالية، سيتم استخدام اللون ألمع أن تستند إليه الإزاحة التصوير الألوان الأخرى في. - تمكين تصحيح التظليل في وضع "اقتناء لوحة" لغرزة الصور معا.
- حفظ هذه الإعدادات كإعداد أ
3-إنشاء إعدادات للحصول على الشريحة في تضخم عالية
- في مربع الحوار إعداد اقتناء لوحة ، انتقل إلى علامة التبويب الكاميرا والهدف حدد 40 X التكبير، 1 ك binning الكاميرا (لأعلى دقة رقمية)، و 2 المكسب (لزيادة الإشارات وسطوع الصور).
ملاحظة: يمكن استخدام إعداد تكبير موضوعي أقل، ولكن وجد الباحثون 40 X أن يكون الإعداد الأمثل لتحليل microglia البشرية والضامة في الدماغ ورم الأنسجة باستخدام الوحدة النمطية سجل خلية متعددة الطول الموجي . - ضمان كافة إعدادات علامات التبويب لوحة – سليديسكانينج و تحرير لوحة أسفل إعدادات.. هي نفس الإعداد A (راجع الخطوة 2).
- إذا كانت الصور التي تم الحصول عليها غير هش، تغيير جيدا عمقو ارتفاع اللوحة، و اللوحة أسفل إعدادات ضبط التركيز. إذا كان لا يزال هناك مشكلة مع التركيز، اختر الليزر مع "استرداد الصورة" ضمن المقطع خيارات ضبط تلقائي للصورة .
- ضمن علامة التبويب اقتناء حلقة ، أدخل عدد الأطوال الموجية موجودة في العينة. تحقق من خيارات تمكين الليزر التركيز و تمكين المستندة إلى الصور مع التركيز (لاسترداد حيازة أو الليزر) .
- ضمن علامة التبويب ضبط تلقائي ، حدد التركيز على اللوحة وأسفل جيدا.
- في علامة التبويب دفاتر يومية ، حدد الخيارات كما هو مبين في الشكل 2، ضمان منع الأجهزة غير متزامن يتحرك محدداً أيضا.
- حفظ هذه الإعدادات "باء الإعداد"
4-وضع الشريحة في نظام تحليل ويديفيلد عالية-المحتوى
- اضغط F4 للحصول على القائمة الرئيسية. حدد الشريحة المسح الضوئي. انقر فوق فتح الباب – "إخراج الشريحة" وإدراج slide(s) ومحول الشريحة (يمكن أن تصل إلى ثلاث شرائح) وكاس (الشكل 3 ألف و 3 باء). توجيه الشريحة مع ساترة إلى الأسفل والتسمية على جانب الشق في محول الشريحة (الشكل 3A).
ملاحظة: الشرائح المستخدمة في هذه التجربة كانت 25 القياسية × 75 × 1 مم الشرائح. - انقر فوق إغلاق الباب – تحميل الشريحة.
5-الحصول على معاينة المسح الضوئي
- تحت عنوان الفرز ، حدد اقتناء لوحة والتحكم... و اقتناء لوحة الإعداد.. وتحميل الإعداد أ
- ضمن علامة التبويب الآبار للزيارة ، نقل إلى تتضمن أيضا العينة، باستخدام الزر الأيمن في الماوس. ضمن علامة التبويب مواقع للزيارة ، الانتقال إلى مواقع مختلفة بالتقاط الصور الحية حتى تقع الخلايا. التركيز على العينة أو استخدام ضبط تلقائييدوياً. استخدام المفاجئة لالتقاط الصورة.
ملاحظة: العينة الأسهل لتحديد المزيد من المواقع، وتركيب المواقع إلى البئر (راجع الخطوة 2، 3). - في القائمة الرئيسية، حدد معاينة الشرائح.
- في مربع الحوار تلقائياً للملوثات العضوية الثابتة، حدد الخيار الذي يعكس عدد الشرائح ستطبعها المراد مسحها ضوئياً. فحص شريحة واحدة في وقت واحد. اضغط على الزر "موافق". حدد 4 X التكبير. اضغط على الزر "موافق". حدد ساترة إلى أسفل (0.17 ملم) كاتجاه الشريحة (استخدام قلادة تصحيح إذا تم استخدام سمك ساترة مختلفة). اضغط على الزر "موافق". انقر فوق متابعة.
ملاحظة: إذا كان المستخدم يرغب في الحصول على المعاينة بالأشعة للشرائح 2 أو أكثر، قد مسح معاينة كل فتحه على حدة قبل الحصول على صورة عالية التكبير المقابلة. - تحت تحميل إعداد الشرائح المسح الضوئي، تأكد من اختيار المربعين إعدادات اقتناء و التحديدات . اضغط إلغاء الأمر. عندما يظهر مربع إعدادات المسح الضوئي الشريحة ، حدد متابعة.
- عندما يظهر مربع الحوار مسح الشرائح ، اضبط الإعدادات كما هو مقترح في الشكل 4A-4 ج. حدد إغلاق عند الانتهاء.
ملاحظة: زيادة الكاميرا binning وتقليل زمن التعرض الكاميرا سيؤدي في المسح الضوئي أسرع، أن كان ذلك في دقة رقمية أقل والنطاق الديناميكي، على التوالي، وبالتالي تقليل جودة الصورة. وسيكفل التظليل تصحيح كثافة موحدة عبر مجال رؤية واحدة. تشغيل الأجهزة وضبط تلقائي للصورة الصورة ستضمن التفحص في التركيز ولكن سوف تبطئ المسح الضوئي. توفيرا للوقت، من المستحسن أن يكون التظليل التصحيح والأجهزة وضبط تلقائي للصورة صورة قبالة مع اكتساب التفحص تضخم منخفضة، ولكن لهذه الخيارات قيد التشغيل للخطوة 6 أثناء التصوير عالية التكبير. دقة المسح الضوئي التكبير المنخفض لن يؤثر على دقة المسح الضوئي عالية التكبير. - تحديد دليل للشريحة مسح البيانات. انقر فوق "موافق". قم بإدخال اسم للملف. انقر فوق "موافق".
- سوف يظهر مربع الحوار رسم المنطقة تلقائياً. استخدم أداة "منطقة مستطيلة الشكل" (الشكل 5A) لتحديد منطقة المسح الضوئي معاينة كاملة كما هو موضح في الشكل 5 (ب). انقر فوق متابعة.
- سوف يظهر مربع الحوار إكمال برنامج الإعداد . حدد الاستمرار.
ملاحظة: سوف تبدأ الفحص معاينة الشريحة الآن. - عند الانتهاء من المعاينة، سوف يظهر مربع الحوار اكتمال المسح الضوئي . حدد الاستمرار. لا تقم بإغلاق إطار معاينة المسح الضوئي (في هذا المثال نافذة تفحص DAPI ؛ انظر الشكل 6).
ملاحظة: الإعداد وتضخم منخفض تفحص عملية اقتناء سوف يستغرق حوالي 20 دقيقة. الوقت اكتساب صورة التكبير عالية اللاحقة سيتوقف على عدد المواقع المختارة وكذلك أوقات التعرض لكل قناة.
6-عالية التكبير المسح الضوئي
- تحميل إعداد باء
- تحديد الآبار التي يتم تصويرها. ضمن علامة التبويب الآبار للزيارة ، نقل إلى تتضمن أيضا العينة، باستخدام الزر الأيمن في الماوس.
ملاحظة: هذا الأسلوب يتجلى هنا التصوير جيدا 1. - ضمن علامة التبويب مواقع للزيارة ، الانتقال إلى مواقع مختلفة باستخدام ميزة حية حتى تقع الخلايا أو الأنسجة. التركيز على العينة أو استخدام ضبط تلقائييدوياً. استخدام المفاجئة لالتقاط الصورة.
ملاحظة: للمساعدة في تحديد مكان العينة في تكبير عالية، استخدم مربع الحوار الحصول على لوحة والتحكم لضبط حجم خطوة في أي مكان من 5 إلى 100 ميكرومتر العثور العينة إذا كان لا يمكن ضبط تلقائي للصورة. - ضمن علامة التبويب W1 DAPI ، انقر فوق الكشف التلقائي. تأكد من الصورة لوحة اقتناء المفاجئة-DAPI هش.
- تحت القائمة الرئيسية، انقر فوق دفتر يومية لتكشف عن السحب لأسفل. حدد تشغيل دفتر اليومية...
- انقر نقراً مزدوجاً فوق الشريحة المنطقة اقتناء الإعداد اليومية لإطلاقه. عندما يظهر مربع الحوار إعداد الشرائح اقتناء المنطقة ، حدد متابعة.
- عندما أصدر تعليمات، حدد بشكل صحيح مسح DAPI لتحديد صورة الشريحة المنخفضة-التكبير. اضغط على الزر "موافق". وبالمثل، تبرز "المفاجئة اقتناء لوحة"-DAPI عندما سئل عن انطباق اقتناء لوحة. انقر فوق موافق.
- عندما يظهر مربع إنشاء أو مناطق التحميل ، استخدم أداة "منطقة مستطيلة الشكل" لتحديد (أ) region(s) الفائدة على مسح DAPI (الشكل 6). اضغط على مواصلة.
ملاحظة: الحد الأقصى للمساحة التي يمكن تحديدها في 40 X هو 45 الأعمدة حسب الصفوف 35. إذا لم يتم تحديد مناطق متعددة من الفائدة، سيتم تغيير حجم المناطق إلى المربع مع منطقة أكبر. يمكن أن تكون إعادة المربعات بعد تغيير الحجم. - حدد " لا" ضمن مربع الحوار تحميل المناطق .
ملاحظة: تحديد نعم الأحمال التي تم حفظها سابقا مناطق لدفعات شرائح بنفس المنطقة من مواقع الفائدة. - باستخدام أداة محدد موقع المعلومات ، تسليط الضوء على منطقة أكبر من الفائدة واضغط على استمرار تحت مربع الحوار حدد المنطقة . عندما يظهر مربع مناطق تأكيد ، اختر استمرار. أن تقرر ما إذا كانت المنطقة تحتاج إلى حفظ عندما يظهر مربع الحوار حفظ المناطق .
- مربع الحوار التالي، موقع المباعدة بين الولادات، ويسمح للمستخدم باختيار تجانب، الذي ينتج صورة مع لا تداخل، أو تتداخل مع 10%. اختر أحد الخيارات وانقر فوق موافق. اختار الكتاب تجانب.
- سوف تظهر مربعات الحوار الثلاثة الآن. يمكن فصل مربع إكمال برنامج الإعداد عن طريق الضغط على متابعة. اترك مربع اقتناء موقع الإعداد ل 40 س (الشكل 7 أ) مفتوح الآن نظراً لأنه يجعل من الواضح كم عدد الأعمدة والصفوف بحاجة إلى إدخالها في مربع الإعداد اقتناء لوحة (الشكل 7). إبقاء مربع ويلبوسيشنز (الشكل 7) الذي يظهر في الركن الأيمن السفلي مفتوحة طوال مدة التصوير.
- يجب أن يكون نفس عدد آبار المناطق ذات الاهتمام المحدد مسبقاً في مربع الإعداد اقتناء لوحة ، ضمن الآبار للزيارة، وأبرزت (الشكل 7).
ملاحظة: الكتاب وضع هذا البروتوكول لمدة أقصاها تسع مناطق لمصلحة كل شريحة. إذا كان هناك أكثر من ذلك، ببساطة زيادة عدد الأعمدة أو الصفوف في علامة التبويب لوحة-سليديسكانينج للتفكير في عدد المناطق ذات الاهتمام. هذه الآبار لا تمثل مكانياً موقع مناطق الاهتمام بأي شكل من الأشكال، ولكن يجب أن يكون عدد المناسبة المميزة (الأيسر). - في مربع الإعداد اقتناء لوحة ، أدخل انتقل إلى علامة التبويب مواقع للزيارة المقترحة الأعمدة والصفوف (الشكل 7). تذكر أن اضغط على مواقع بلاط.
- للقضاء على التخمين للعثور على المواقع التي تحتوي على النموذج، اضغط الحصول على لوحة تحت علامة التبويب ملخص لوضع المسرح في منطقة محددة مسبقاً للفائدة. بمجرد المقالي الكاميرا أكثر من موقع يحتوي على خلايا، اضغط إلغاء الأمر في الركن الأيمن السفلي التوقف عن الحصول على الصورة. التأكد من المرحلة الآن يقع على العينة.
- تحسين إعدادات الطول الموجي لضمان أن يتم الحصول عليها من مركزة وصورة عالية نطاق ديناميكي. وعندما يطمئن، انقر فوق في علامة التبويب ملخص و الحصول على لوحة.
7-صورة التحليل
- حدد الوحدة النمطية المخصصة المطلوبة.
ملاحظة: الكتاب اختيار الوحدة النمطية سجل خلية متعددة الطول الموجي تبرهن تجزئة الآلي للشرائح ورم الدماغ. - تشغيل التحليل في كافة المواقع. إذا كانت المعلمات التحليل هي نفسها بالنسبة للعديد من الشرائح، يمكن تضمين التحليل في مربع لوحة اقتناء الإعداد ضمن علامة التبويب الحصول على وظيفة .
- بمجرد الانتهاء من التحليل، استبعاد أي مواقع لجودة الصورة رديئة حتى لا تتعرض للتحيز في النتائج. نظراً لأن الهدف من هذا التحليل تحديد microglia والضامة في حمة الورم، حدد المنطقة الاهتمام داخل حواف الورم العينة. وعلاوة على ذلك، استبعاد المواقع التي هي خارج التركيز و/أو تحتوي على طيات الأنسجة أو فقاعات والدموع في الأنسجة. لمظاهرة, راجع نتائج الممثل. بدلاً من ذلك، استخدام نقاط تركيز الليزر التي تم إنشاؤها لكل موقع حسب السعة لانعكاس الليزر كعتبة أدناه المواقع التي يتم استبعاد (الحد الأدنى للتخصيص ويعتمد على معلمات مثل وقت التعرض نوع الوسائط المستخدمة).
ملاحظة: الصور التكبير عالية تجعل من الممكن على وجه التحديد استبعاد الهياكل، مثل الأوعية الدموية الكبيرة والمناطق من نخر، إذا لزم الأمر. من الممكن أيضا لتضمين فقط من مجالات الاهتمام، مثل تلك التي يتم هايبرسيلولار. ويمكن زيادة هذه الطريقة، خصوصية ودقة التحليلات.
Representative Results
ويمكن مشاهدة الصور داخل البرنامج وكاس. يبين الشكل 8 التكبير عالية الصور المصغرة لكافة المواقع داخل منطقة محددة من الفائدة. استعراض كل موقع لتحديد تلك التي ينبغي استبعادها من التحليل (أمثلة تظهر في تضخم منخفضة وعالية في الرقم 8 و الرقم 9، على التوالي). على سبيل المثال، الموقع 149 من التركيز (الشكل 9 ألف)، 219 موقع فقاعات (9B الشكل)، و 54 موقع يحتوي على إضعاف (الشكل 9)، وينبغي أن تستبعد. ومن المعتاد لاستبعاد 10-15 في المائة من جميع مواقع تصويرها. في المثال، تم استبعاد 15.3 في المائة المواقع (25/300 قد فقاعات 17/300 من التركيز، وكانت مطوية 3/300، و 1/300 وكان على الحافة). هو الرقم 10 ألف صورة ممثل الذي اختير للتحليل (مصغر تضخم منخفض المقابلة لها هو مبين في الشكل 8). هنا، توضح تراكبات المقابلة التي تم إنشاؤها بواسطة وحدة متعددة "الطول الموجي خلية سجل" نتائج تجزئة الآلي يقوم على الموقع 59، مخصصة للمواصفات صاحبي (نويات الحد الأدنى للعرض = 2.5 ميكرون، الحد الأقصى للعرض = 7.5 ميكرومتر، وكثافة أعلاه الخلفية المحلية = جرايليفيلس 35؛ الحد الأدنى للعرض CD11b--إيجابية الخلايا = 4 ميكرومتر، الحد الأقصى للعرض = 18 ميكرومتر، الحد الأدنى الملون المجال = 15 ميكرون2، وكثافة أعلاه الخلفية المحلية = جرايليفيلس 310؛ والحد الأدنى لعرض الخلايا CD45 إيجابية = 4 ميكرومتر، الحد الأقصى للعرض = 18 ميكرومتر، الحد الأدنى الملون المجال = 15 ميكرون2، وكثافة أعلاه الخلفية المحلية = 50 جرايليفيلس). بعد التجزئة، والبيانات الكمية من نسبة الخلايا تلطيخ إيجابية بالنسبة لكل علامة (6.2 ± 5، 1% و 2.1 3.8 ± في المائة من CD11b+ و CD45 الخلايا+ ، على التوالي)، علامات على حد سواء (3.5 ± 2.1% CD11b+CD45+ الخلايا)، لا علامات (86.6 ± 9.0% CD11b–CD45 الخلايا– ؛ الرقم 10 باء)، يعني الملون منطقة (40.0 ميكرومتر ± 9.2 و 36.7 ± 7.6 ميكرومتر من CD11b+ و CD45 الخلايا+ ، على التوالي؛ الشكل 10)، وتعني كثافة الفلورية (408.9 ± 40.3 fluorescence النسبي الوحدات ووحدات fluorescence النسبي ± 38.1 373.9 CD11b+ و CD45 الخلايا+ ، على التوالي؛ الرقم 10) يمكن الحصول عليها.
رقم 1: إعدادات لاقتناء شريحة في تضخم منخفض. أ. هذه الصورة يعرض إعدادات لوحة. ب. هنا، يتم عرض الإعدادات أسفل اللوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعدادات لاقتناء شريحة في التكبير عالية. يعرض هذا الشكل التحديد من دفاتر اليومية المناسبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: البيان العملي لكيفية تحميل الشرائح باستخدام محول الشريحة. أ. يتم وضع الشريحة ساترة إلى أسفل مع التسمية على جانب الشق محول الشريحة. ب. يتم تحميل محول الشرائح في نظام تحليل محتوى عالي ويديفيلد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: إعدادات معاينة الشريحة. أ. هذا الرقم تعرض المعلمات للحصول على. ب. هنا، يتم عرض قيم إعدادات الطول الموجي هويخست/DAPI. ج. تظهر هذه الصورة إعدادات دفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 5: رسم منطقة شريحة. أ. أداة منطقة مستطيلة (لا يمكن استخدام أدوات الرسم الأخرى) تستخدم لتحديد منطقة المسح الضوئي المعاينة وإنشاء مناطق للفائدة على الفحص DAPI. ب-مخطط أزرق مخضر في هذا الشكل يبين كيف يجب تحديد المنطقة بأكملها من الشريحة (بما في ذلك التسمية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إنشاء المناطق ذات الاهتمام على الفحص معاينة. معاينة أو مسح DAPI يمثل منطقة الشريحة بأكملها. في هذا المثال، هناك ثلاثة أقسام أنسجة الدماغ المسلسل (صلبة بيضاء مستطيلة الخطوط العريضة). تمثل المنطقة أعلاه هذه المقاطع التسميات التعميم على الشريحة. لن يحد من قسم مختلف الترتيبات اللاحقة اختيار المناطق ذات الاهتمام. يتم عرض منطقة الفائدة في هذا المثال خاصة مع مخطط مستطيل أبيض متقطع. سكليبر = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: التقاط صور windows الأساسية للتكبير عالية. أ-سوف تظهر نافذة "اقتناء موقع الإعداد" هي كم عدد الأعمدة والصفوف داخل region(s) للفائدة. ب. التأكد من العدد الصحيح للأعمدة والصفوف هو مبين في الشكل 7 ألف يتم إدخالها في مربع "الإعداد اقتناء لوحة" والمواقع التي يتم تجانب. ج-من الضروري الحفاظ على إطار ويلبوسيشنز مفتوحة لمدة الحصول على الصورة حتى ولو كان فارغاً. د. يجب إبراز العدد المناسب من المناطق ذات الاهتمام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: صورة الممثل لمنطقة الاهتمام. يمكن عرض كل موقع في صورة مصغرة مركب لمنطقة الاهتمام. ويرد في تكبير أعلى المواقع التمثيلية التي تم استبعاد (ملحوظ مع مربعات حمراء) ومثال موقع شملت (ملحوظ مع مربع أخضر). من المستحسن أن تستعرض كل موقع للتأكد من أنها ذات نوعية كافية للتحليل. سكليبر = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: أمثلة للمواقع التي ينبغي استبعادها من التحليل- أ-أقسام ورم الدماغ البشري قد تم الملون مع CD11b (الأخضر) و CD45 (أحمر)، علامات microglia والضامة. هذه الصورة خارج التركيز وقد استبعدت من التحليل. ب-فقاعات موجودة في هذه الصورة التي استبعدت من التحليل النهائي. ج. تم استبعاد هذا الموقع من التحليل بسبب إضعاف في الأنسجة. هي أشرطة مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: الصور التمثيلية والتحليل- أ. يتم عرض كل صورة بجوار التراكبات تمثل نتائج تجزئة الآلي. في التراكب، نويات يتم عرضها باللون الأبيض وتظهر الخلايا الملون إيجابيا في الأخضر CD11b والأحمر ل CD45. وبعد استبعاد هذه المواقع ذات نوعية غير كافية من التحليل، والجمع بين النتائج من جميع المواقع المتبقية، ب. نسب متوسط العدد الإجمالي للخلايا في كل موقع الملون إيجابية بالنسبة لكل علامة وشارك المسمى لكل علامات، ج. المتوسط الملون المنطقة، ود. خلية متوسط الكثافة تمثيلاً رسومياً. رفو = وحدات fluorescence النسبي. يتم التعبير عن البيانات يعني ± الانحراف المعياري. هي أشرطة مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ما زالت مشكلة مشتركة التي تعوق كفاءة بحوث العلوم البيولوجية هو وضع بروتوكولات للتحديد الكمي غير متحيزة ودقيقة، ودقيقة للأنسجة المسمى فلوريسسينتلي وهياكلها داخل. كميات كبيرة من الوقت والجهد تتجه نحو إيجاد طرق لتحليل شرائح الأنسجة بمجرد أنهم قد تم تصويرها. توفر العديد من الأساليب القائمة خوارزميات للمستخدمين لإعادة داخل البرامج12،،من1314. هذه الأساليب مقبولة، ولكن أهمية هذا التقرير أنه يمكن للمستخدم بسهولة وبسرعة إنشاء الحصول على صورة شاملة وتحليل البروتوكول إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى وكاس. فحوصات أن التفريق بين أنواع الخلايا وقياس عدة هياكل وعمليات وتحليل دورة الخلية والنووية إزفاء، على سبيل المثال، متاحة بالفعل في البرنامج المقترن.
ويشمل برنامج الإعداد بضع خطوات حاسمة. أولاً، يتم تعريف المعلمات المكانية للشريحة كما لو كانت لوحة. ثانيا، يتم إنشاء تفحص نظرة عامة على تكبير منخفض الذي يتم تحديد المناطق ذات الاهتمام لتصوير التكبير عالية. وأخيراً، يتم استبعاد المواقع التي تؤثر على دقة ودقة التحاليل اللاحقة. الحد الأكبر من هذا الأسلوب أن تطبيقه يعتمد على إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى وكاس. ومع ذلك، مع تزايد الحاجة إلى نظم تحليل المحتوى السامي، يقدمون العديد من المؤسسات هذه للباحثين على أن تظل قادرة على المنافسة15. استكشاف الأخطاء وإصلاحها هو الحاجة الأكثر شيوعاً عند أبواب الأنسجة لا تملك نفس سمك. إذا لم يتم تحديد مناطق متعددة من الفائدة، سيكون بعض في التركيز، بينما الآخرين لن. ومن الناحية المثالية، أن العناية خلال تمزيقها، المستخدم لإنشاء عينات متجانسة. ومع ذلك، إذا كانت العينات غير متناسقة، يمكن تعديل التركيز على الطول الموجي وصمة عار النووية (أو ألمع fluorophore المستخدم)، الذي يستخدم للتركيز، لكل منطقة خارج نطاق التركيز للاهتمام، وحتى بالنسبة لكل حقل من عرض. ويقابل الأطوال الموجية الأخرى ببساطة من الطول الموجي النووية وصمة عار، فقط هذا الطول الموجي تحتاج التعديل.
في هذا التقرير، نحن بالتفصيل كيفية مسح وتحليل الشرائح باستخدام وكاس والبرامج المرتبطة بها. الوحدة النمطية "سجل خلية" متعددة الطول الموجي يسمح للمستخدم بالعد تلقائياً أي من علامات النووية أو هيولى المسماة فلوريسسينتلي. بعد ضبط إعدادات التركيز وتحديد الخصائص الخلوية مثل العرض والمجال لتخصيص وحدة للأنسجة المصورة، هناك أي حاجة لتدخل المستخدم للحصول على الشرائح المصورة والبيانات الكمية. يمكن تصويرها ما يصل إلى ثلاث شرائح في وقت واحد، ويمكن تعريفها بمناطق متعددة من الفائدة. يتيح هذا البروتوكول وكاس المستخدمين الذين هم بحاجة إلى تحليل الشرائح الاستفادة من التخصيص، متعددة الأغراض، الآلي مهام سير العمل التي تتطلب القليل إلى أي التحسين ويمكن تطبيقها في أي مشاريع في المستقبل التي تنطوي على التحليل النسيجي للأنسجة.
Disclosures
المؤلفون أية مصالح مالية في المنتجات الموصوفة في هذه المخطوطة ولها أن تكشف عن أي شيء آخر.
Acknowledgments
وكان هذا المشروع ممول بمنحه من المعاهد الكندية للبحوث الصحية ويبتكر ألبرتا-صحة الحلول/ألبرتا مؤسسة مكافحة السرطان. الكتاب يود الاعتراف "وحدة التجدد" في بيولوجيا الأعصاب الأساسية مرفق لاستخدام معداتهم، عمل جيدريتيس بولا في بناء الأساس الذي تسنى الشريحة المسح على وكاس، والخالق من المنتجات المشار إليها في هذه المادة، "الأجهزة الجزيئية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL |
Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Gedraitis, P. Slide Region Acquisition Journal Suite. , Available from: http://metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide (2013).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
