Summary
यहां हम एक widefield उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणाली (WHCAS) का उपयोग कर स्लाइड पर फ्लोरोसेंट से लेबल किए गए ऊतकों के स्वचालित विभाजन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल व्यापक है किसी भी क्षेत्र है जो जैव विज्ञान, चिकित्सा अभियांत्रिकी, और स्वास्थ्य विज्ञान सहित जैविक ऊतकों में फ्लोरोसेंट मार्करों के quantitation शामिल में आवेदन पत्र ।
Abstract
स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग और फ्लोरोसेंट-लेबल वाले ऊतकों के विभाजन पूरी स्लाइड या बड़े ऊतक वर्गों का विश्लेषण करने के लिए सबसे कारगर तरीका है । दुर्भाग्य से, कई शोधकर्ताओं समय और संसाधनों की बड़ी मात्रा में खर्च के विकास और कार्यप्रवाह है कि केवल अपने प्रयोगों के लिए प्रासंगिक है अनुकूलन । इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक widefield उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणाली (WHCAS) के लिए उपयोग के साथ उन द्वारा उपयोग किया जा सकता है किसी भी स्लाइड-घुड़सवार ऊतक छवि, पूर्व में अनुकूलन के लिए विकल्प के साथ, निर्मित मॉड्यूल में पाया संबंधित सॉफ्टवेयर में मिला वर्णन । नहीं मूल रूप से स्लाइड स्कैनिंग के लिए, इस लेख में विस्तृत कदम यह संभव WHCAS जो संबद्ध सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है में स्लाइड स्कैनिंग छवियों को प्राप्त करने के लिए करना । इस उदाहरण में, ब्रेन ट्यूमर स्लाइड के स्वचालित विभाजन प्रदर्शन किया है, लेकिन किसी भी फ्लोरोसेंट-लेबल परमाणु या cytoplasmic मार्कर के स्वचालित विभाजन संभव है । इसके अलावा, वहाँ प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए परख सहित अन्य मात्रात्मक सॉफ्टवेयर मॉड्यूल की एक किस्म है/translocation, सेलुलर प्रसार/व्यवहार्यता/apoptosis, और angiogenesis कि चलाया जा सकता है । इस तकनीक के शोधकर्ताओं समय और प्रयास को बचाने और स्लाइड विश्लेषण के लिए एक स्वचालित प्रोटोकॉल बनाने होगा ।
Introduction
स्लाइडों पर फ्लोरोसेंट-लेबल वाले ऊतकों की सटीक और सटीक quantitation कई वैज्ञानिक क्षेत्रों में एक अत्यधिक मांग के बाद तकनीक है । हालांकि, शोधकर्ताओं अक्सर मैंयुअल रूप से नमूनों की गिनती या समय के काफी मात्रा में खर्च गूढ़ स्वचालित तकनीक विकसित करने के लिए इस लक्ष्य को प्राप्त । इस के साथ साथ, हम स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग और एक उदाहरण के रूप में जमे हुए मानव मस्तिष्क ट्यूमर वर्गों में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एक WHCAS और उसके संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोशिकाओं के quantitation के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । संबद्ध सॉफ्टवेयर की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है निर्मित neurite से अनुकूलन मॉड्यूल में सेल प्रकार के भेदभाव के लिए गिनती1,2,3,4,5, 6. इस विधि का लक्ष्य एक शुरू करने के लिए खत्म, आसानी से reproducible प्रोटोकॉल की छवियों को प्राप्त करने के लिए और किसी भी स्लाइड-माउंटेड ऊतकों में quantitate फ्लोरोसेंट-लेबल संस्थाओं के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए है ।
इस प्रोटोकॉल में, WHCAS मुख्य रूप से संबंधित सॉफ़्टवेयर पर क्रमिक विश्लेषण के लिए इमेजिंग प्लेट्स के लिए उपयोग किया जाता है भले ही कोई स्लाइड एडेप्टर और7 स्कैन करने के लिए मूल बातें उपलब्ध थीं । यह छवि स्लाइड के लिए निषिद्ध था क्योंकि अधिग्रहण क्षेत्र के सावधान स्थानिक अंशांकन, उपयुक्त पत्रिकाओं के चयन, सिलवाया loadouts के निर्माण, और उत्पाद के प्रतिनिधियों के साथ एक संपर्क की आवश्यकता थी । साहित्य के व्यापक शरीर में, एक समर्पित स्लाइड-इमेजिंग और विश्लेषण उपकरण8खरीद के एवज में, इस सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ एक पिछले तकनीकी रिपोर्ट WHCAS पर स्लाइड की छवि अधिग्रहण दरकिनार9। विभिंन प्लेटफार्मों पर छवि अधिग्रहण या छवि विश्लेषण प्रदर्शन आवश्यक अतिरिक्त काम करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक दूसरे के साथ संगत है ।
WHCAS और छवि पर कब्जा करने के लिए अपने सॉफ्टवेयर का उपयोग करने की क्षमता के लिए खोज या एक कार्यप्रवाह इन उपकरणों के लिए विदेशी विकासशील की अनावश्यक जटिलताओं से बचना होगा । इस अनुच्छेद में, एक थाली के रूप में स्लाइड के इलाज के द्वारा एक कम आवर्धन अवलोकन स्कैन और इसी उच्च आवर्धन छवियों बनाने के लिए आवश्यक कदम, और बाद के विश्लेषण बहु तरंग दैर्ध्य सेल स्कोरिंग विभाजन मॉड्यूल का उपयोग कर के लिए अनुमति repurposing का WHCAS । यह आसानी से प्रयोग करने योग्य प्रोटोकॉल वैकल्पिक तकनीक पर एक लाभ प्रदान करता है क्योंकि वहां कोई एल्गोरिदम या बहु कदम गिनती प्रोटोकॉल10,11 एक बार छवियों WHCAS पर अधिग्रहीत कर रहे है विकसित करने की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल को एक quantitation तकनीक का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक समय कम है, और अधिक सटीक है12 और मैनुअल गिनती से कुशल और WHCAS के उपयोग को अधिकतम । इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से किया जा सकता है और आसानी से इस्तेमाल के बाद से यह इमेजिंग और स्लाइड पर किसी भी फ्लोरोसेंट-लेबल ऊतकों का विश्लेषण सक्षम बनाता है ।
Protocol
ट्यूमर नमूनों स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्ड और आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किए गए थे और राष्ट्रीय विनियमों के अनुसार आयोजित किया । WHCAS और इसके संबद्ध सॉफ़्टवेयर इस आलेख में प्रयुक्त सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
1. पत्रिकाओं का आयात
- संबद्ध सॉफ़्टवेयर खोलें ।
- सामग्री तालिकामें इंगित जर्नल सुइट डाउनलोड करें ।
- मुख्य मेनू शीर्षक पत्रिकापर क्लिक करके एक उपयुक्त निर्देशिका में जर्नल सुइट आयात, आयात जर्नल सुइटका चयन..., और क्लिक करके आयात।
2. पूर्वावलोकन स्कैन प्राप्ति के लिए सेटिंग्स बनाना
- प्लेट प्राप्ति सेटअप संवाद बॉक्स में, उद्देश्य और कैमरा टैब पर जाएं । आवर्धन के रूप में 4x का चयन करें, कैमरा बिन्नी के रूप में 1, और लाभ के रूप में 2 ।
- टैब प्लेट के नीचे चित्रा 1a में सेटिंग्स इनपुट -Slidescanning।
नोट: उपयोगकर्ता को देखने और 3 स्लाइड तक नेविगेट करने की अनुमति देने के लिए ये सेटिंग्स बनाई गई हैं । प्रत्येक स्लाइड आसान नेविगेशन और ऊतक स्लाइस या कोशिकाओं के ' लाइव ' दृश्य के लिए 3 आसंन कुओं में विभाजित किया गया है । - साइट पर जाएं टैब में, साइट्स के साथ समान रूप से कुओं को भरें ।
- संपादित करें प्लेट नीचे सेटिंग्स ... पर क्लिक करें और चित्र 1bमें प्रदर्शित मानों दर्ज करें ।
- प्राप्ति लूप टैब के अंतर्गत, पूर्वावलोकन स्कैन के लिए इच्छित तरंग दैर्ध्य (इस उदाहरण में कोई भी परमाणु दाग) दर्ज करें । सबसे अच्छा इसके विपरीत और छवि आधारित ध्यान केंद्रित करने के लिए, प्रतिभाशाली फ्लोरोसेंट संकेत (जैसे, अक्सर एक परमाणु दाग) का उपयोग करें ।
नोट: इस तरह के एक परमाणु दाग के रूप में एक चमकदार दाग के साथ दाग ऊतकों की सिफारिश की है क्योंकि यह एक उच्च पृष्ठभूमि की तुलना में विपरीत प्रदान करता है । न केवल नमूना स्थान में इस सहायता होगा, लेकिन जब इमेजिंग निंनलिखित उच्च आवर्धन अधिग्रहण में एक से अधिक fluorophore, प्रतिभाशाली रंग पर अंय रंग के इमेजिंग ऑफसेट आधार का इस्तेमाल किया जाएगा । - छवियों को एक साथ सिलाई करने के लिए प्लेट प्राप्ति मोड में छायाप्रभाव सुधार सक्षम करें ।
- ए सेटिंग के रूप में इन सेटिंग्स को सहेजें ।
3. उच्च आवर्धन पर स्लाइड अधिग्रहण के लिए सेटिंग्स बनाना
- प्लेट प्राप्ति सेटअप संवाद बॉक्स में, उद्देश्य और कैमरा टैब पर जाएं । आवर्धन के रूप में 40X का चयन करें, कैमरा (उच्चतम डिजिटल रिज़ॉल्यूशन के लिए), और 2 के रूप में लाभ (छवियों के संकेत और चमक बढ़ाने के लिए) ।
नोट: एक कम उद्देश्य आवर्धन सेटिंग इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन लेखकों 40X पाया मानव microglia और मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक में मैक्रोफेज के विश्लेषण के लिए इष्टतम सेटिंग बहु-तरंग दैर्ध्य सेल स्कोरिंग मॉड्यूल का उपयोग कर. - सुनिश्चित करें कि थाली के लिए सभी सेटिंग्स -Slidescanning और संपादित करें प्लेट नीचे सेटिंग्स... टैब्स एक (चरण 2 देखें) को स्थापित करने के लिए के रूप में ही हैं ।
- प्राप्त छवियों कुरकुरा नहीं कर रहे हैं, तो फोकस को समायोजित करने के लिए अच्छी तरह से गहराई, प्लेट ऊंचाई, और प्लेट नीचे सेटिंग्स बदल जाते हैं. अगर फ़ोकस के साथ अभी भी कोई समस्या है, तो स्वत फोकस विकल्प अनुभाग के अंतर्गत लेजर छवि पुनर्प्राप्ति चुनें ।
- प्राप्ति लूप टैब के अंतर्गत, नमूने में मौजूद तरंग दैर्ध्य की संख्या दर्ज करें । सक्षम लेजर आधारित ध्यान केंद्रित और सक्षम छवि आधारित (अधिग्रहण या लेजर वसूली के लिए) विकल्प के लिए ध्यान केंद्रित की जांच करें ।
- फ़ोकस टैब के तहत, प्लेट और अच्छी तरह से नीचे पर फ़ोकसकरें चुनें ।
- जर्नल टैब में, चित्रा 2में दर्शाई गई विकल्पों का चयन करें, एसिंक्रोनस हार्डवेयर चालों को रोकने के लिए यह सुनिश्चित करना भी चुना गया है ।
- इन सेटिंग्स को सेटिंग B के रूप में सहेजें ।
4. Widefield उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणाली में स्लाइड रखने
- मुख्य मेनूप्राप्त करने के लिए F4 दबाएं । स्लाइड स्कैनिंगका चयन करें । दरवाजा खोलें – स्लाइड निकाल े और स्लाइड (फ़ाइलें) और स्लाइड एडेप्टर (जो तीन स्लाइडों तक होल्ड कर सकते हैं) को WHCAS ( चित्र 3 ) में) स्लाइड एडेप्टर (चित्र 3ए) में पायदान के किनारे पर नीचे की ओर coverslip और लेबल का सामना कर रहा है ।
नोट: इस प्रयोग में उपयोग की गई स्लाइड मानक 25 x ७५ x 1 mm स्लाइड थी । - बंद दरवाजा-लोड स्लाइडपर क्लिक करें ।
5. एक पूर्वावलोकन स्कैन प्राप्त करना
- स्क्रीनिंग हेडिंग के तहत प्लेट अधिग्रहण और कंट्रोल का चयन... और प्लेट अधिग्रहण सेटअप ... और लोड सेटिंग A.
- कुओं के लिए यात्रा टैब के तहत, अच्छी तरह से नमूना युक्त करने के लिए ले जाएँ, माउस पर राइट-क्लिक करें बटन का उपयोग कर. साइट पर जाएं टैब के तहत, लाइव छवि कैप्चर के साथ विभिंन साइट्स पर ले जाएं जब तक कक्ष स्थित न हों । नमूना पर मैंयुअल रूप से फ़ोकस करें या ध् यान दें। छवि कैप्चर करने के लिए स्नैप का उपयोग करें ।
नोट: नमूना अधिक साइटों के साथ पता लगाने के लिए आसान है, और अच्छी तरह से साइटों फिटिंग द्वारा (चरण २.३ देखें). - मुख्य मेनू पर, स्लाइड्स का पूर्वावलोकनकरें चुनें ।
- स्वचालित रूप से पॉप अप संवाद बॉक्स में, यह दर्शाने वाले विकल्प का चयन करें कि कितनी स्लाइड्स स्कैन की जा रही हैं. एक समय में एक स्लाइड स्कैन करें । ठीकदबाएं । आवर्धन के रूप में 4x का चयन करें । ठीकदबाएं । स्लाइड ओरिएंटेशन के रूप में Coverslip down (०.१७ mm) का चयन करें (एक अलग Coverslip मोटाई का उपयोग किया जाता है, तो सुधार कॉलर का उपयोग करें) । ठीकदबाएं । जारी रखेंक्लिक करें ।
नोट: यदि उपयोगकर्ता 2 या अधिक स्लाइड के लिए पूर्वावलोकन स्कैन प्राप्त करने के लिए चाहता है, प्रत्येक पूर्वावलोकन स्कैन संबंधित उच्च आवर्धन छवि के अधिग्रहण करने से पहले व्यक्तिगत रूप से खोला जा करने के लिए है । - स्कैन स्लाइड सेटिंग लोडकरें के अंतर्गत, प्राप्ति सेटिंग्स और अंशांकन बक्सों को चेक इन किया गया है । रद्दकरें दबाएं । स्लाइड सेटिंग्स स्कैन करें बॉक्स के फिर से दिखने पर, जारी रखेंचुनें ।
- जब स्कैन स्लाइड संवाद बॉक्स प्रकट होता है, तो चित्र 4a-4cमें सुझाए गए अनुसार सेटिंग्स समायोजित करें । समाप्त होने पर बंद करें चुनें ।
नोट: कैमरा बिन्नी बढ़ाने और कैमरा जोखिम समय कम तेजी से स्कैनिंग में परिणाम होगा, हालांकि एक कम डिजिटल संकल्प और गतिशील रेंज में, क्रमशः, इसलिए छवि गुणवत्ता कम । छायाप्रभाव सुधार दृश्य के किसी एकल फ़ील्ड में एक समान तीव्रता सुनिश्चित करेगा । हार्डवेयर और छवि पर फ़ोकस चालू करना सुनिश्चित करेगा कि स्कैन ध्यान में है लेकिन स्कैनिंग को धीमा कर देगा. समय की बचत के हित में, यह कम आवर्धन स्कैन प्राप्त करने के दौरान छायाप्रभाव सुधार और हार्डवेयर और छवि पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुशंसा की जाती है, लेकिन इन विकल्पों के लिए उच्च आवर्धन इमेजिंग के दौरान चरण 6 के लिए चालू है । कम आवर्धन स्कैन का रिज़ॉल्यूशन उच्च आवर्धन स्कैन के रिज़ॉल्यूशन को प्रभावित नहीं करेगा । - स्लाइड स्कैनिंग डेटा के लिए किसी निर्देशिका का चयन करें । ठीकक्लिक करें । फ़ाइल के लिए कोई नाम दर्ज करें । ठीकक्लिक करें ।
- क्षेत्र आरेखित करें संवाद बॉक्स अपने आप दिखाई देगा । चित्र 5Bमें दर्शाए अनुसार संपूर्ण पूर्वावलोकन स्कैन क्षेत्र का चयन करने के लिए आयताकार क्षेत्र उपकरण (चित्र 5) का उपयोग करें । जारी रखेंक्लिक करें ।
- सेटअप पूर्ण संवाद बॉक्स दिखाई देगा । जारी रखेंका चयन करें ।
नोट: पूर्वावलोकन स्लाइड स्कैन अब शुरू होगा । - पूर्वावलोकन के पूरा होने पर, स्कैनिंग पूर्ण संवाद बॉक्स दिखाई देगा । जारी रखेंका चयन करें । स्कैन विंडो का पूर्वावलोकन बंद न करें (इस उदाहरण में DAPI स्कैन विंडो; चित्र 6देखें) ।
नोट: सेटअप और कम आवर्धन स्कैन अधिग्रहण प्रक्रिया लगभग 20 मिनट लग जाएगा । बाद में उच्च आवर्धन छवि अधिग्रहण समय चुना साइटों की संख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम बार पर निर्भर करेगा ।
6. उच्च आवर्धन स्कैनिंग
- लोड सेटिंग B.
- पता लगाएं कि कौन से कुओं की छवि होनी चाहिए । कुओं के लिए यात्रा टैब के तहत, अच्छी तरह से नमूना युक्त करने के लिए ले जाएँ, माउस पर राइट-क्लिक करें बटन का उपयोग कर.
नोट: तकनीक यहां इमेजिंग अच्छी तरह से 1 का प्रदर्शन किया है । - साइट पर जाएं टैब के अंतर्गत, लाइव सुविधा के साथ विभिंन साइट्स पर तब तक ले जाएं जब तक कि कक्ष या ऊतक स्थित न हो । नमूना पर मैंयुअल रूप से फ़ोकस करें या ध् यान दें। छवि कैप्चर करने के लिए स्नैप का उपयोग करें ।
नोट: एक उच्च आवर्धन पर नमूना का पता लगाने में सहायता करने के लिए, यदि फ़ोकस नहीं कर सकता, तो नमूना ढूँढने के लिए 5 से १०० µm के लिए कहीं भी चरण आकार समायोजित करने के लिए प्लेट प्राप्ति और नियंत्रण संवाद बॉक्स का उपयोग करें । - W1 DAPI टैब के अंतर्गत, ऑटो exposक्लिक करें । सुनिश्चित करें कि प्लेट प्राप्ति स्नैप-DAPI छवि खस्ता है ।
- मुख्य मेनू के अंतर्गत, पुल-डाउन प्रकट करने के लिए जर्नल पर क्लिक करें । जर्नल चलाएं चुनें...।
- इसे लॉंच करने के लिए स्लाइड क्षेत्र प्राप्ति सेटअप जर्नल पर डबल-क्लिक करें । जब सेटअप स्लाइड क्षेत्र प्राप्ति संवाद बॉक्स प्रकट होता है, तो जारी रखेंका चयन करें ।
- निर्देश दिए जाने पर, कम आवर्धन स्लाइड छवि का चयन करने के लिए ठीक से DAPI स्कैन का चयन करें । ठीकदबाएं । इसी तरह, प्लेट अधिग्रहण स्नैप-DAPI पर प्रकाश डालते हैं जब थाली अधिग्रहण स्नैप के लिए कहा जाता है । ठीकपर क्लिक करें ।
- जब बनाएं या लोड क्षेत्र बॉक्स प्रकट होता है, तो DAPI स्कैन (चित्र 6) पर रुचि के (a) क्षेत्र (a) का चयन करने के लिए आयताकार क्षेत्र उपकरण का उपयोग करें । जारी रखेंदबाएं ।
नोट: अधिकतम क्षेत्र 40X पर चुना जा सकता है ४५ कॉलम ३५ पंक्तियों के द्वारा है । यदि रुचि के एकाधिक क्षेत्रों का चयन किया जाता है, तो क्षेत्रों को सबसे बड़ा क्षेत्र के साथ बॉक्स में आकार दिया जाएगा । बक्से का आकार बदलने के बाद स्थिति हो सकती है । - लोड क्षेत्र संवाद बॉक्स के अंतर्गत नहीं का चयन करें ।
नोट: ब्याज स्थानों के समान क्षेत्र के साथ स्लाइड्स के बैचेस के लिए हां लोड पहले सहेजे गए क्षेत्र का चयन करें । - लोकेटर उपकरण का उपयोग करके, रुचि का सबसे बड़ा क्षेत्र हाइलाइट करें और क्षेत्र चुनें संवाद बॉक्स के अंतर्गत जारी रखें दबाएं । जब क्षेत्रों की पुष्टि करें बॉक्स प्रकट होता है, तो जारी रखेंचुनें । तय करें कि क्षेत्र सहेजें संवाद बॉक्स प्रकट होता है, जब इस विभाग को सहेजना आवश्यक है ।
- अगला संवाद बॉक्स, साइट रिक्ति, उपयोगकर्ता को टाइलचुनने की अनुमति देता है, जिसका परिणाम कोई अधिव्याप्त नहीं या 10% अधिव्याप्तहोने वाली छवि में होता है । कोई विकल्प चुनें और ठीकक्लिक करें । लेखकों ने टाइलें चुनी हैं ।
- तीन संवाद बॉक्स अब दिखाई देंगे । सेटअप पूर्ण बॉक्स को जारी रखेंदबाकर ख़ारिज किया जा सकता है । प्राप्ति साइट सेटअप के लिए 40X बॉक्स (आरेख 7A) अब के लिए खुला रखें क्योंकि यह स्पष्ट करता है कि कितने स्तंभों और पंक्तियों को प्लेट प्राप्ति सेटअप बॉक्स (चित्र 7B) में दर्ज किया जाना आवश्यक है. WellPositions बॉक्स (आरेख 7C) रखें जो इमेजिंग की अवधि के लिए नीचे बाएं-हाथ के कोने में खुलता है ।
- प्लेट अधिग्रहण सेटअप बॉक्स में, कुओं की यात्रा करने के लिए, पहले से चयनित ब्याज के क्षेत्रों के रूप में कुओं की एक ही संख्या (आंकड़ा 7d) पर प्रकाश डाला जाना चाहिए ।
नोट: लेखक स्लाइड प्रति ब्याज के नौ क्षेत्रों की एक अधिकतम के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित की है । यदि अधिक हैं, तो बस रुचि के क्षेत्रों की संख्या को प्रतिबिंबित करने के लिए प्लेट-SlideScanning टैब में स्तंभों या पंक्तियों की संख्या बढ़ाएं । ये कुओं किसी भी तरह से रुचि के क्षेत्रों के स्थान का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, लेकिन उचित संख्या (बाएं क्लिक करें) पर प्रकाश डाला जाना चाहिए । - प्लेट प्राप्ति सेटअप बॉक्स में, यात्रा के लिए साइट टैब पर जाएं । सुझाए गए स्तंभ और पंक्तियाँ (आरेख 7B) दर्ज करें । टाइल साइटोंपर क्लिक करना याद रखें ।
- नमूना युक्त साइटों को खोजने के guesswork को समाप्त करने के लिए, ब्याज के पूर्व चयनित क्षेत्र में मंच की स्थिति के लिए सारांश टैब के तहत अधिग्रहण प्लेट दबाएँ. एक बार कक्ष वाली साइट पर कैमरा पंस, छवि प्राप्ति रोकने के लिए नीचे दाईं ओर कोने पर रद्द करें दबाएं । सुनिश्चित करें कि चरण अब नमूना पर स्थित है ।
- एक केंद्रित है और एक उच्च गतिशील रेंज छवि प्राप्त की है यह सुनिश्चित करने के लिए तरंग दैर्ध्य सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करें । जब संतुष्ट, सारांश टैब पर क्लिक करें और प्लेट प्राप्त।
7. छवि विश्लेषण
- इच्छित कस्टम मॉड्यूल का चयन करें ।
नोट: लेखकों को चुना बहु-तरंग दैर्ध्य सेल स्कोरिंग मॉड्यूल मस्तिष्क ट्यूमर स्लाइड के एक स्वचालित विभाजन का प्रदर्शन करने के लिए । - सभी साइट्स पर विश्लेषण चलाएं । यदि विश्लेषण पैरामीटर कई स्लाइड्स के लिए समान हैं, तो विश्लेषण पोस्ट प्राप्ति टैब के अंतर्गत प्लेट प्राप्ति सेटअप बॉक्स में शामिल किया जा सकता है ।
- एक बार विश्लेषण समाप्त हो गया है, गरीब छवि गुणवत्ता के किसी भी साइटों को बाहर तो नहीं के रूप में परिणाम पूर्वाग्रह । इस विश्लेषण के लक्ष्य के बाद से ट्यूमर पैरेन्काइमा में microglia और मैक्रोफेज यों तो है, ट्यूमर के नमूने के किनारों के भीतर ब्याज के क्षेत्र का चयन करें । इसके अलावा, साइटों है कि ध्यान से बाहर है और/या ऊतक परतों या बुलबुले और ऊतकों में आंसू शामिल बाहर । किसी प्रदर्शन के लिए, प्रतिनिधि परिणामदेखें । वैकल्पिक रूप से, एक सीमा के रूप में लेजर प्रतिबिंब के आयाम के आधार पर प्रत्येक साइट के लिए उत्पंन लेजर फोकस स्कोर का उपयोग करें जो नीचे साइटों के लिए बाहर रखा जा रहे है (दहलीज अनुकूलन योग्य है और इस तरह के जोखिम समय के रूप में मानकों पर निर्भर करता है और उपयोग किया गया मीडिया का प्रकार) ।
नोट: उच्च आवर्धन छवियों को विशेष रूप से संरचनाओं को बाहर करने के लिए संभव बनाते हैं, जैसे कि बड़ी रक्त वाहिकाओं और परिगलन के क्षेत्र, यदि आवश्यक हो । यह भी ब्याज की केवल क्षेत्रों, जैसे कि उन है कि hypercellular है शामिल करने के लिए संभव है । इस तरह विश्लेषणों की विशिष्टता और सटीकता को बढ़ाया जा सकता है ।
Representative Results
छवियों WHCAS सॉफ्टवेयर के भीतर देखा जा सकता है । चित्रा 8 ब्याज की परिभाषित क्षेत्र के भीतर सभी साइटों की उच्च आवर्धन थंबनेल से पता चलता है । उन लोगों को पहचानने के लिए प्रत्येक साइट की समीक्षा करें जिंहें विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए (उदाहरण निंन और उच्च आवर्धन में चित्र 8 और चित्र 9, क्रमशः) में दिखाए जाते हैं । उदाहरण के लिए, साइट १४९ फ़ोकस (चित्र 9A) से बाहर है, साइट २१९ में बबल (चित्र 9B) हैं, और साइट ५४ में एक फ़ोल्ड (आरेख 9C) है और इसे शामिल नहीं किया जाना चाहिए । यह सभी imaged साइटों के 10-15% बाहर करने के लिए विशिष्ट है । प्रदान उदाहरण में, साइटों के १५.३% बाहर रखा गया था (25/300 बुलबुले था, 17/300 ध्यान से बाहर थे, 3/300 जोड़ रहे थे, और 1/300 किनारे पर था) । चित्रा 10A विश्लेषण के लिए चुना एक प्रतिनिधि छवि है (इसकी इसी कम इज़ाफ़ा थंबनेल चित्रा 8में दिखाया गया है). यहाँ, इसी ओवरले बहु-तरंग दैर्ध्य कोशिका स्कोरिंग मॉड्यूल द्वारा उत्पन्न प्रदर्शन साइट ५९ पर प्रदर्शन स्वचालित विभाजन के परिणाम प्रदर्शित करता है, लेखकों के विनिर्देशों के लिए अनुकूलित (नाभिक न्यूनतम चौड़ाई = २.५ µm, अधिकतम चौड़ाई = ७.५ µm, और स्थानीय पृष्ठभूमि के ऊपर तीव्रता = ३५ graylevels; CD11b-सकारात्मक कोशिकाओं ' न्यूनतम चौड़ाई = 4 µm, अधिकतम चौड़ाई = 18 µm, न्यूनतम दाग क्षेत्र = 15 µm2, और स्थानीय पृष्ठभूमि के ऊपर तीव्रता = ३१० graylevels; और CD45-सकारात्मक ' कोशिकाओं ंयूनतम चौड़ाई = 4 µm, अधिकतम चौड़ाई = 18 µm, ंयूनतम दाग क्षेत्र = 15 µm2, और स्थानीय पृष्ठभूमि के ऊपर तीव्रता = ५० graylevels) । विभाजन के बाद, प्रत्येक मार्कर के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं के अनुपात के मात्रात्मक डेटा (६.२ ± ५.१% और ३.८ ± २.१% CD11b+ और CD45+ कोशिकाओं, क्रमशः), दोनों मार्करों (३.५ ± २.१% CD11b+CD45+ कोशिकाओं), कोई मार्करों (८६.६ ± ९.०% CD11b-CD45- कोशिकाओं; चित्रा 10B), मतलब दाग क्षेत्र (४०.० ± ९.२ µm और ३६.७ ± ७.६ µm के CD11b+ और CD45+ कोशिकाओं, क्रमशः; चित्रा 10C), और मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (४०८.९ ± ४०.३ सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों और ३७३.९ ± ३८.१ रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों के CD11b+ और CD45+ कोशिकाओं, क्रमशः; चित्रा 10D) प्राप्त किया जा सकता है ।
चित्र 1: कम आवर्धन पर स्लाइड प्राप्ति के लिए सेटिंग्स । A. यह छवि प्लेट सेटिंग्स प्रदर्शित करता है । यहां, प्लेट नीचे सेटिंग्स प्रदर्शित कर रहे हैं बी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: उच्च आवर्धन पर स्लाइड प्राप्ति के लिए सेटिंग । यह आंकड़ा उपयुक्त पत्रिकाओं का चयन प्रदर्शित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: स्लाइड एडेप्टर का उपयोग करके स्लाइड लोड करने के तरीके का प्रदर्शन. A. स्लाइड को स्लाइड एडेप्टर पायदान के किनारे लेबल के साथ coverslip नीचे रखा गया है । B. स्लाइड एडेप्टर widefield उच्च-सामग्री विश्लेषण सिस्टम में लोड किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4: स्लाइड सेटिंग्स का पूर्वावलोकन करें. A. यह आंकड़ा प्राप्ति के लिए पैरामीटर्स प्रदर्शित करता है । B. यहां, Hoescht/DAPI तरंग दैर्ध्य सेटिंग्स के लिए मान प्रदर्शित होते हैं । C. यह छवि जर्नल सेटिंग्स दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5: स्लाइड क्षेत्र आरेखित करना. A. आयताकार क्षेत्र उपकरण (अंय आरेखण उपकरण उपयोग नहीं किए जा सकते) का पूर्वावलोकन स्कैन क्षेत्र का चयन करने और DAPI स्कैन पर रुचि के क्षेत्रों को बनाने के लिए किया जाता है । B. इस चित्रा में चैती रूपरेखा से पता चलता है कि कैसे (लेबल सहित) स्लाइड के पूरे क्षेत्र का चयन किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6: पूर्वावलोकन स्कैन पर रुचि के क्षेत्र बनाना. पूर्वावलोकन या DAPI स्कैन पूरे स्लाइड क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । इस उदाहरण में, वहाँ तीन धारावाहिक मस्तिष्क ऊतक वर्गों रहे हैं (ठोस सफेद आयताकार रूपरेखा). इन अनुभागों के ऊपर का क्षेत्र स्लाइड पर गोलाकार लेबल्स का प्रतिनिधित्व करता है । विभिंन अनुभाग व्यवस्थाएं ब्याज के क्षेत्रों के बाद के चयन को सीमित नहीं करेंगी । इस विशेष उदाहरण में रुचि के क्षेत्र को एक डैश्ड सफेद आयताकार बाह्यरेखा के साथ दिखाया गया है । scalebar = 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 7: उच्च आवर्धन छवि अधिग्रहण के लिए आवश्यक खिड़कियां । A. प्राप्ति साइट सेटअप विंडो दिखाएगी कि कितने स्तंभ और पंक्तियां रुचि के क्षेत्र (ओं) के भीतर हैं । B. सुनिश्चित करें कि चित्रा 7A में दर्शाई गई स्तंभों और पंक्तियों की सही संख्या को प्लेट अधिग्रहण सेटअप बॉक्स में दर्ज किया गया है और साइट्स टाइल की गई हैं । C. यह रिक्त है, भले ही छवि प्राप्ति की अवधि के लिए WellPositions विंडो खुली रखने के लिए आवश्यक है । Dब्याज के क्षेत्रों की उपयुक्त संख्या को हाइलाइट किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 8: रुचि के क्षेत्र की प्रतिनिधि छवि. प्रत्येक साइट के हित के क्षेत्र के एक समग्र थंबनेल में प्रदर्शित किया जा सकता है । प्रतिनिधि साइटें जिन्हें बाहर रखा गया है (लाल बक्सों से चिह्नित) और एक शामिल साइट का उदाहरण (हरा बॉक्स से चिह्नित) उच्चतर आवर्धन पर दिखाया गया है. यह विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक साइट की समीक्षा करने की सिफारिश की है । scalebar = 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 9: उन साइटों के उदाहरण जिन्हें विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. A. मानव मस्तिष्क ट्यूमर वर्गों CD11b (हरा) और CD45 (लाल), microglia और मैक्रोफेज के मार्करों के साथ दाग दिया गया है । इस छवि को ध्यान से बाहर है और विश्लेषण से बाहर रखा गया है । बीबुलबुले इस छवि है जो अंतिम विश्लेषण से बाहर रखा गया है में मौजूद हैं । सी. इस साइट के ऊतकों में गुना की वजह से विश्लेषण से बाहर रखा गया था । स्केल पट्टियां 20 µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 10: प्रतिनिधि छवियां और विश्लेषण । A. प्रत्येक छवि स्वचालित सेगमेंटेशन के परिणामों का प्रतिनिधित्व करने वाले ओवरले के बगल में प्रदर्शित होती है. ओवरले में, नाभिक सफेद और सकारात्मक रूप से दाग कोशिकाओं में प्रदर्शित कर रहे हैं CD11b और CD45 के लिए लाल के लिए हरे रंग में दिखाया गया है । विश्लेषण से अपर्याप्त गुणवत्ता की साइटों को छोड़कर और सभी शेष साइटों के परिणाम के संयोजन के बाद, बी प्रत्येक साइट में कोशिकाओं की कुल संख्या का औसत अनुपात है कि प्रत्येक मार्कर और सह के लिए सकारात्मक दाग दोनों मार्करों, सीके लिए लेबल । औसत सना हुआ क्षेत्र, और D। औसत सेल तीव्रता रेखांकन का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । RFU = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां । डेटा अर्थ ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । स्केल पट्टियां 20 µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
एक आम समस्या अभी भी जैविक विज्ञान अनुसंधान की दक्षता में बाधा, के लिए प्रोटोकॉल का विकास है निष्पक्ष, सटीक, और सटीक ठहराव की फ्लोरोसेंट-लेबल के ऊतकों और उनके संरचनाओं के भीतर । समय और प्रयास की महत्वपूर्ण मात्रा में ऊतक स्लाइड का विश्लेषण करने के तरीके एक बार वे imaged गया है खोजने की दिशा में निर्देशित कर रहे हैं । कई मौजूदा विधियां उपयोगकर्ताओं को प्रोग्राम के भीतर12,13,14फिर से बनाने के लिए एल्गोरिदम प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों स्वीकार्य हैं, लेकिन इस रिपोर्ट का महत्व है कि यह उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है आसानी से और जल्दी से एक समग्र छवि अधिग्रहण और विश्लेषण प्रोटोकॉल स्थापित यदि उपयोगकर्ता एक WHCAS के लिए उपयोग किया है । परख है कि कोशिका प्रकार अंतर और एकाधिक संरचनाओं और प्रक्रियाओं, कोशिका चक्र विश्लेषण, और परमाणु translocation, उदाहरण के लिए, पहले से ही संबद्ध सॉफ्टवेयर में उपलब्ध है यों तो ।
सेटअप में कुछ महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं । सबसे पहले, स्लाइड के स्थानिक मापदंडों के रूप में परिभाषित कर रहे है अगर यह एक थाली थे । दूसरे, एक कम आवर्धन अवलोकन स्कैन बनाया गया है जिसमें से ब्याज के क्षेत्रों उच्च आवर्धन इमेजिंग के लिए चुना जाता है । अंत में, सटीकता और बाद में विश्लेषण की परिशुद्धता को प्रभावित साइटों को बाहर रखा गया है । इस तकनीक की सबसे बड़ी सीमा है कि इसकी प्रयोज्यता पर निर्भर करता है अगर उपयोगकर्ता एक WHCAS के लिए उपयोग किया है । हालांकि, उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणालियों के लिए बढ़ती जरूरत के साथ, कई संस्थाओं को अपने शोधकर्ताओं को इन प्रदान कर रहे है प्रतिस्पर्धी रहने के लिए15। समस्या निवारण सबसे अधिक आवश्यक है जब ऊतक वर्गों एक ही मोटाई नहीं है । यदि ब्याज के कई क्षेत्रों का चयन किया जाता है, कुछ ध्यान में होगा, जबकि दूसरों को नहीं होगा । आदर्श रूप में, अनुभाग के दौरान, उपयोगकर्ता के लिए सजातीय नमूने बनाने के ख्याल रखना होगा । हालांकि, अगर नमूने असंगत हैं, परमाणु दाग तरंग दैर्ध्य पर ध्यान केंद्रित (या उपयोगकर्ता के प्रतिभाशाली fluorophore), जो ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रत्येक के बाहर-फोकस क्षेत्र के लिए पुनः समायोजन किया जा सकता है ब्याज की और यहां तक कि देखने के प्रत्येक क्षेत्र के लिए । के रूप में अंय तरंग दैर्ध्य बस परमाणु दाग तरंग दैर्ध्य से भरपाई कर रहे हैं, केवल इस तरंग दैर्ध्य पुनर्समायोजन की जरूरत है ।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से एक WHCAS और संबद्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके स्लाइड को स्कैन और विश्लेषित कैसे करें । बहु-तरंग दैर्ध्य कोशिका स्कोरिंग मॉड्यूल उपयोगकर्ता स्वचालित रूप से किसी भी परमाणु या cytoplasmic मार्करों कि फ्लोरोसेंट लेबल कर रहे हैं गिनती करने के लिए अनुमति देता है. फोकस सेटिंग्स को समायोजित करने और चौड़ाई और क्षेत्र के रूप में सेलुलर विशेषताओं को परिभाषित करने के लिए छवि के लिए मॉड्यूल अनुकूलित करने के बाद, वहां छवि स्लाइड और मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के लिए कोई आगे की जरूरत है । अप करने के लिए तीन स्लाइड एक समय में imaged किया जा सकता है और ब्याज के कई क्षेत्रों परिभाषित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल WHCAS उपयोगकर्ताओं को स्लाइडों का विश्लेषण करने की आवश्यकता है जो अनुकूलन, बहुउद्देशीय, स्वचालित कार्यप्रवाह है कि कोई अनुकूलन के लिए कम की आवश्यकता का लाभ ले और भविष्य में किसी भी परियोजनाओं में लागू किया जा सकता है कि ऊतक के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण शामिल ।
Disclosures
इस पांडुलिपि में वर्णित उत्पादों में लेखकों का कोई वित्तीय हित नहीं है और न ही इसका खुलासा करने के लिए कुछ और है ।
Acknowledgments
इस परियोजना के स्वास्थ्य अनुसंधान और अलबर्टा के कनाडाई संस्थानों से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया-स्वास्थ्य समाधान/ लेखक अपने उपकरणों के उपयोग के लिए तंत्रिका जीव विज्ञान कोर सुविधा में पुनर्जनन इकाई को स्वीकार करना चाहते हैं, जो नींव पर WHCAS पर स्कैनिंग स्लाइड संभव बनाया गया था, और उत्पादों के निर्माता के निर्माण में पाउला Gedraitis का काम इस अनुच्छेद में उल्लेख किया है, आणविक उपकरणों ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL |
Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
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