Summary
Здесь мы описываем протокол для автоматической сегментации дневно обозначенные тканей на слайдах с помощью системы анализа высоким содержанием widefield (WHCAS). Этот протокол имеет широкие применения в любой области, которая включает в себя количественный флуоресцентных маркеров в биологических тканях, включая биологических наук, медицинской техники и медицинских наук.
Abstract
Автоматизированное сканирование слайдов и сегментация дневно меченых тканей является наиболее эффективным способом для анализа всей слайды или разделов больших ткани. К сожалению многие исследователи проводят большое количество времени и ресурсов, разработке и оптимизации рабочих процессов, которые актуальны только для их собственных экспериментов. В этой статье мы опишем протокол, который может использоваться теми, с доступом к системе анализа высоким содержанием widefield (WHCAS) для изображений слайд установлен ткани, с параметрами для настройки внутри встроенных модулей в соответствующее программное обеспечение. Первоначально не предназначались для сканирования слайдов, шаги подробно в этой статье позволяют приобрести слайд, сканирование изображений в WHCAS, который может быть импортирован в соответствующее программное обеспечение. В этом примере продемонстрировал автоматизированные сегментации слайды опухоли мозга, но возможен автоматизированный сегментации любой дневно меченых ядерные и цитоплазматические маркер. Кроме того существует целый ряд других количественных программных модулей, включая анализы для локализации/транслокации белка, сотовой распространения/жизнеспособности/апоптоз и ангиогенез, которая может быть запущена. Этот метод будет сэкономить время исследователи и усилия и создать автоматизированные протокол для анализа слайд.
Introduction
Точное и точный количественный дневно меченых тканей на слайдах высоко востребованных методика во многих научных областях. Однако исследователи часто вручную количество образцов или потратить значительное количество времени на разработку эзотерических автоматизированных методов для достижения этой цели. Здесь мы предоставляем протокол для автоматизированных слайд сканирование и количественный клеток с использованием WHCAS и его соответствующее программное обеспечение, с innate иммунных клеток в замороженных человеческого мозга опухоль секций в качестве примера. Соответствующее программное обеспечение предлагает широкий спектр встроенных настраиваемых модулей от neurite нарост подсчета для дифференцировки клеток типы1,2,3,4,5, 6. Цель данного метода является предоставить исследователям старт финиш, легко воспроизводимые протокол для получения изображения и quantitate дневно меченых образований в тканях любой слайд установлен.
В этом протоколе WHCAS в основном используется для визуализации пластины для последующего анализа на соответствующее программное обеспечение, несмотря на то, что слайд-адаптер и основам скользить сканирования7 были доступны. Это было непомерно изображения слайдов, потому что тщательного пространственных калибровки области приобретения, выбор соответствующих журналах, создание специализированных loadouts и связь с представителями продукта необходимы. В организме более широкого литературы, вместо покупки выделенный слайд томографии и анализа аппарат8предыдущих технологических отчет с доступом к это программное обеспечение обойти захвата изображений слайдов на WHCAS altogether9. Анализ изображений приобретения или изображения на различных платформах требует дополнительную работу, чтобы убедиться, что каждый совместим с другой.
Возможность использования WHCAS и его программное обеспечение для захвата изображений позволит избежать ненужных осложнений поиска или разработки рабочего процесса, чужды эти инструменты. В этой статье, шаги, необходимые для создания малое увеличение обзор сканирования и соответствующие высоким увеличением изображения, рассматривая слайд как плита, и последующего анализа с использованием модуль сегментация мульти волны клеток скоринга позволяют повторное использование из WHCAS. Это легко использовать протокол предоставляет преимущество над альтернативные методы потому, что нет необходимости разрабатывать алгоритмы или многоэтапный подсчета протоколы10,11 после изображения приобретаются на WHCAS. Этот протокол уменьшает время, необходимое для оптимизации количественный метод, является более точным12 и эффективным, чем ручной подсчет и максимизирует использование WHCAS. Этот протокол может легко и широко использоваться поскольку он дает возможность обработки изображений и анализа любых дневно меченых тканей на слайдах.
Protocol
Опухоль образцы были получены в соответствии с протоколом утвержден Комитетом местного институционального обзора Совет и этики и проводились в соответствии с национальными правилами. WHCAS и его соответствующее программное обеспечение, используемое в этой статье перечислены в Таблице материалов.
1. Импорт журналов
- Откройте соответствующее программное обеспечение.
- Скачайте журнал suite, указано в Таблице материалов.
- Импортировать журнал люкс в подходящий каталог, нажав в главном меню раздел журнала, выбрав Люкс журнал импорта...и нажав кнопку Импорт.
2. Создание настроек для предварительного сканирования приобретения
- В диалоговом окне Пластины приобретение установки перейдите к закладке цель и камеры выберите 4 X как масштаб, 1 как биннинга камеры и 2 как выгоды.
- Входные параметры на рисунке 1A на вкладке плиты – Slidescanning.
Примечание: Эти параметры были созданы, чтобы разрешить пользователю просматривать и перемещаться до 3 слайды. Каждый слайд был разделен на 3 соседних скважин для легкой навигации и «жить» визуализации кусочки ткани или клетки. - На вкладке сайты для посещения заполните скважин равномерно с сайтами.
- Нажмите на Редактировать пластины нижней настройки... и введите значения, отображаемые в рисунке 1B.
- На вкладке Приобретение цикла введите желаемой длины волны (любой ядерный пятно в этом примере) для проверки предварительного просмотра. За лучший контраст и упором на основе изображений использование ярких флуоресцентного сигнала (например, часто ядерной пятно).
Примечание: Окрашивание тканей с ярким пятном таких ядерных пятно рекомендуется, поскольку это обеспечивает высокую контрастность по сравнению с фон. Не только будет эта помощь в папке образца, но когда изображений более чем одного Флюорофор в следующее высокое увеличение приобретения, яркие цвета будет использоваться для визуализации смещение других цветов на. - Включите Коррекцию затенения в режиме пластины приобретения, чтобы сшить изображения.
- Сохранить эти настройки как параметр A.
3. Создание параметров для приобретения слайд с высоким увеличением
- В диалоговом окне Пластины приобретение установки перейдите к закладке цель и камеры выберите 40 X как масштаб, 1 как биннинга камеры (для высоких цифровое разрешение) и 2 как прибыль (для увеличения сигнала и яркость изображения).
Примечание: Нижняя цель увеличения параметр может использоваться, но авторы нашли 40 X быть оптимальные настройки для анализа человеческого Микроглия и макрофагов в опухолевой ткани мозга с помощью модуля Мульти волны клеток скоринга . - Обеспечить все параметры вкладки плиты – Slidescanning и Пластина внизу параметов... являются таким же, как для параметра A (см. шаг 2).
- Если изображения, полученные не хрустящий, измените глубина скважины, Высота пластиныи Параметров нижней плиты для регулировки фокуса. Если все еще существует проблема с фокус, выберите лазер с образ восстановления в разделе Параметры автофокусом .
- На вкладке Приобретение цикла введите количество волн в образце. Проверьте параметры позволяют на основе лазера упором и позволяют на основе образа упором (для восстановления приобретения или лазерный) .
- На вкладке автофокусировки выберите акцент на тарелку и хорошо снизу.
- На вкладке журналы выберите параметры, как указано в Рисунок 2, обеспечение предотвращения асинхронного аппаратных движется также выбран.
- Сохранить эти настройки как настройки б.
4. размещение слайд в системе анализа Widefield высоким содержанием
- Нажмите клавишу F4 , чтобы получить Главное меню. Выберите слайд сканирование. Нажмите кнопку открыть дверь-извлечь слайд и вставить слайды и слайд адаптер (который может содержать до трех слайдов) в WHCAS (Рисунок 3А и 3Б). Ориент слайд с coverslip вниз и ярлык на стороне паз в слайд-адаптер (рис. 3A).
Примечание: Слайды, используемые в этом эксперименте были стандартные 25 x 75 x 1 мм слайдов. - Нажмите на Закрыть дверь – загрузка слайда.
5. получение предварительного просмотра сканирования
- Под заголовком скрининга , выберите пластины приобретения и управления... и Пластины приобретение установки... и загрузить настройки а.
- На вкладке скважин для посещения перейти к хорошо содержащие образец, используя кнопку правой кнопкой мыши на мыши. На вкладке сайты для посещения перейти к различным сайтам с захвата изображения Live до тех пор, пока клетки расположены. Сосредоточиться на образце или использовать автофокусомвручную. Использование оснастки для захвата изображения.
Примечание: Образец легче найти с больше сайтов, а также установив сайты для колодца (см. шаг 2.3). - В главном меню выберите Просмотр слайдов.
- В диалоговом окне, которое появляется автоматически выберите параметр отражает, сколько слайдов будет проверяться. Одновременно сканировать один слайд. Нажмите кнопку OK. Выберите 4 X в качестве масштаба. Нажмите кнопку OK. Выберите ориентацию слайдов (используйте Коррекция воротник, если используется другой coverslip толщина) Coverslip вниз (0,17 мм) . Нажмите кнопку OK. Нажмите продолжить.
Примечание: Если пользователь желает приобрести Просмотр сканов для 2 или более слайдов, каждый просмотр сканирования должен быть открыт индивидуально до приобретения соответствующего образа с большим увеличением. - Под Нагрузкой сканирования слайдов параметрубедитесь, что приобретение настройки и калибровки установлены флажки. Нажмите кнопку Отмена. Когда появляется поле Параметры сканирования слайдов , выберите продолжить.
- Когда откроется диалоговое окно Scan слайд , настройте параметры как предлагается в рисунке 4A-4 C. Выберите Закрыть после завершения.
Примечание: Увеличение камеры биннинга и уменьшая время экспозиции камеры приведет к быстрее сканирования, хотя и на более низкое разрешение цифровой и динамический диапазон, соответственно, поэтому снижение качества изображения. Затенение коррекции обеспечит равномерное интенсивности через одного поля зрения. Включение аппаратного и автофокусировки изображения обеспечит сканирование находится в фокусе, но будет замедлить сканирование. Ради экономии времени, рекомендуется иметь затенение коррекции и оборудования и автофокусировки изображения от приобретая малое увеличение сканирования, но эти варианты включен для шага 6 во время большого увеличения изображений. Разрешение сканирования низкий масштаб не влияет на разрешение сканирования высокого масштаба. - Выберите каталог для сканирования данных слайда. Нажмите кнопку ОК. Введите имя для файла. Нажмите кнопку ОК.
- Автоматически появится диалоговое окно Область рисования . Используйте средство прямоугольная область (Рисунок 5A) выберите регион сканирования всего предварительного просмотра, как показано на рисунке 5B. Нажмите продолжить.
- Появится диалоговое окно Установка завершена . Выберите продолжить.
Примечание: Просмотр слайд сканирования теперь начнется. - По завершении предварительного просмотра появится диалоговое окно Проверка завершена . Выберите продолжить. Не закрывайте окно предварительного просмотра сканирования (в этом примере окно Сканирования DAPI ; см. рис. 6).
Примечание: Настройки и малое увеличение сканирования приобретение процесс займет примерно 20 мин. Время приобретения последующих высокое увеличение изображения будет зависеть количество сайтов, выбрали а также выдержек для каждого канала.
6. высокое увеличение сканирование
- Загрузка, установка б.
- Определите, какие скважины к записи образа. На вкладке скважин для посещения перейти к хорошо содержащие образец, используя кнопку правой кнопкой мыши на мыши.
Примечание: Здесь техника подтверждается визуализации также 1. - На вкладке сайты для посещения переместите к различным сайтам с функцией Live находится клетки или ткани. Сосредоточиться на образце или использовать автофокусомвручную. Использование оснастки для захвата изображения.
Примечание: Для помощи в поиске образца с высоким увеличением, используйте диалоговое окно пластины приобретения и управления скорректировать размер шага от 5 до 100 мкм найти образец, если автофокусом нельзя. - На вкладке W1 DAPI нажмите кнопку Авто разоблачить. Убедитесь, что Пластины приобретение Snap - DAPI изображения четкими.
- В главном меню нажмите на Журнал раскрыть тянуть вниз. Выберите запустить журнал....
- Дважды щелкните на Слайд региона приобретение установки журнал для его запуска. Когда откроется диалоговое окно Установки слайд региона приобретения , выберите продолжить.
- Проинструктировано, правильно выберите DAPI сканирования для выбора изображений слайд низкого увеличение. Нажмите кнопку OK. Аналогичным образом выделите пластины приобретение Snap - DAPI когда его спросили, для приобретения оснастки пластины. Нажмите на кнопку ОК.
- Когда появится поле Create или регионах нагрузки , используйте инструмент «Прямоугольная область» для выбора () регион(ы) интерес на DAPI сканирования (рис. 6). Нажмите продолжить.
Примечание: Максимальная площадь, которые могут быть выбраны в 40 X-45 столбцов 35 строк. Если выбраны несколько областей, представляющих интерес, регионах будет изменен на поле с наибольшей площадью. Коробки могут быть приложена после изменения размера. - Выберите нет в диалоговом окне Загрузки регионов .
Примечание: Выбор Да загружает сохраненные регионов для пакетов слайдов с того же региона интерес мест. - Используя средство локатора , выделите крупнейший регион интерес и нажмите продолжить в диалоговом окне « Выбрать регион ». Когда появится Подтверждение регионов , выберите продолжить. Решите, необходимо ли регион сохранены когда появится диалоговое окно Сохранить регионов .
- Следующем диалоговом окне Интервал сайта, позволяет пользователю выбирать плиточный, что приводит в изображении без дублирования, или 10% перекрываются. Выберите нужный вариант и нажмите кнопку ОК. Авторы решили плиточный.
- Теперь будут отображаться три диалоговых окна. Поле Завершения установки могут быть уволены, нажав продолжить. Не закрывайте окно Настройки сайта приобретение 40 X (рис. 7A) сейчас так, как это делает ясно сколько столбцов и строк должны быть введены в поле Приобретение установки пластины (рис. 7B). Держите поле WellPositions (рис. 7 c), которая появляется в левом нижнем углу открытыми для длительности визуализации.
- В поле Приобретение установки плиты , колодцы для посещения, должно быть одинаковое количество скважин как регионы интереса ранее выбранных выделены (рис. 7 d).
Примечание: Авторы разработали этот протокол для максимум девяти регионов интерес каждого слайда. Если есть больше, просто увеличьте количество столбцов или строк на вкладке плиты - SlideScanning , чтобы отразить количество областей, представляющих интерес. Эти скважины не представляют пространственно расположение областей интереса к любым способом, но соответствующий номер должен быть выделенной (левой). - В поле Пластины приобретение установки перейдите на вкладку сайты для посещения введите предлагаемые столбцы и строки (рис. 7B). Не забудьте нажать на сайтах плитки.
- Чтобы исключить догадки поиска сайты, содержащие образец, нажмите Приобрести пластины на вкладке резюме для позиционирования этап в предварительно выбранной области интереса. После того, как камера панорамирование за сайт, содержащий ячейки, нажмите кнопку Отмена в правом нижнем углу, чтобы остановить получение изображения. Обеспечить стадии сейчас находится над образца.
- Оптимизируйте параметры волны для обеспечения целенаправленного и высокий динамический диапазон изображения. Когда удовлетворены, нажмите на вкладке резюме и Приобрести пластины.
7. анализ
- Выберите нужный настраиваемый модуль.
Примечание: Авторы выбрали Мульти волны клеток забил модуль для демонстрации автоматизированной сегментации слайдов опухоли мозга. - Запустите анализ на всех сайтах. Если параметры анализа являются одинаковыми для многих слайды, анализ может быть включен в поле Пластины приобретение установки на вкладке После приобретения .
- После завершения анализа, исключите любые сайты плохого изображения качества, чтобы не исказить результаты. Поскольку цель этого анализа заключается в количественном определении Микроглия и макрофагов в опухоль паренхимы, выберите регион интерес в пределах края образца тумора. Кроме того исключите сайты, которые не в фокусе и/или содержат складок ткани или пузыри и слезы в ткани. Для демонстрации смотрите Результаты представитель. Кроме того, использовать лазерный фокус Оценка для каждого сайта в зависимости от амплитуды лазерного отражения как порог ниже сайты, которые должны быть исключены (порог является настраиваемым и зависит от параметров, таких как время экспозиции и Тип используемых средств массовой информации).
Примечание: Высокое увеличение изображения позволяют конкретно исключить структур, таких как крупных кровеносных сосудов и зонах некроза, в случае необходимости. Это также можно включать только области интереса, таких как те, которые являются hypercellular. Таким образом, специфичность и точность анализов может быть увеличено.
Representative Results
Изображения можно рассматривать в рамках программного обеспечения WHCAS. Рисунок 8 показывает высокое увеличение эскизов всех сайтов в пределах определенной области интереса. Обзор каждого сайта, чтобы определить те, которые должны быть исключены из анализа (примеры приводятся в низкой и высокой масштаб в рисунке 8 и Рисунок 9, соответственно). Например 149 сайт находится не в фокусе (рис. 9а), сайт 219 имеет пузыри (рис. 9B) и 54 сайта содержит складку (рис. 9C) и должны быть исключены. Это типично для исключения 10-15% всех сайтов, отображаемого. В примере, 15,3% участков были исключены (25/300 было пузыри, 17/300 были не в фокусе, 3/300 были сложены, и 1/300 был на краю). Рисунок 10А -образ представителя, выбранных для анализа (его соответствующий эскиз малое увеличение показан на рис. 8). Здесь, соответствующие оверлеи, генерируемые модулем мульти волны клеток скоринга продемонстрировать результаты автоматической сегментации, на сайте 59, настроенные для авторов спецификации (ядер минимальная ширина = 2,5 мкм, максимальная ширина = 7,5 мкм, и интенсивности выше местных фон = 35 graylevels; Минимальная ширина CD11b-положительных клеток = 4 мкм, максимальная ширина = 18 мкм, минимальная окрашенных области = 15 мкм2и интенсивности выше местных фон = 310 graylevels; и CD45-положительных клеток минимальная ширина = 4 мкм, максимальная ширина = 18 мкм, минимальная окрашенных области = 15 мкм2и интенсивности выше местных фон = 50 graylevels). После сегментации, количественные данные о доле клеток, окрашивание позитивные для каждого маркера (6,2 ± 5,1% и 3,8 ± 2,1% CD11b+ и CD45+ клеток, соответственно), оба маркера (3,5% ± 2,1 CD11b+CD45+ клетки), нет маркеров (86,6 ± 9,0% CD11b–CD45– клетки; Рисунок 10B), значит, окрашенных области (40,0 ± 9.2 мкм и 36,7 ± 7,6 мкм CD11b+ и CD45+ клеток, соответственно; Рисунок 10 c) и означают интенсивности флуоресценции (408.9 ± 40,3 относительной флуоресценции единиц и 373.9 ± 38,1 относительной флуоресценции единиц CD11b+ и CD45+ клеток, соответственно; Рисунок 10D) может быть получен.
Рисунок 1: параметры для приобретения слайд при низком увеличении. A. это изображение отображает параметры пластины. Б. здесь, отображаются параметры нижней пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: параметры для приобретения слайд с высоким увеличением. Эта цифра показывает выделение соответствующих журналах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: демонстрация того, как загрузить слайды с помощью адаптера слайд. А. слайд помещается coverslip вниз с меткой на стороне Позолоченный адаптер слайд. Б. слайд-адаптер загружается в системе анализа высоким содержанием widefield. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: параметры просмотра слайд. А. Эта цифра отображает параметры для приобретения. Б. здесь отображаются значения для параметров длины волны Hoescht/DAPI. C. это изображение показывает параметры журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Рисование слайд региона. А. инструмент «Прямоугольная область» (нельзя использовать другие инструменты рисования) используется для выбора области проверки предварительного просмотра и создания областей интереса на DAPI сканирования. Б. наброски Тил на этом рисунке показано, как следует выбрать всю область слайда (включая метку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: создание областей интереса на просмотр сканирования. Предварительный просмотр или сканирования DAPI представляет область весь слайд. В этом примере есть три последовательных мозга разделов ткани (сплошной белый прямоугольные очертания). В область выше этих разделов представляет круговой этикетки на слайде. Различные секции договоренностей не будет ограничивать последующего отбора областей, представляющих интерес. Области интереса в этом конкретном примере отображается с пунктирной белый прямоугольный контур. Scalebar = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: образ приобретения необходимых windows для большого увеличения. А. Настройка сайта приобретение окно покажет, сколько столбцов и строк находятся в пределах регион(ы) интерес. Б. обеспечить правильное количество столбцов и строк, указанных в Рисунок 7а вводятся в поле пластины приобретение установки и сайты находятся кафельный. C. это необходимо держать открытыми для продолжительности захвата изображений окна WellPositions, хотя это пустой. Д. необходимо выделить соответствующее количество областей, представляющих интерес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: представитель имиджа региона интерес. Каждый сайт может отображаться в композитный эскиз области интереса. Представитель сайты, которые были исключены (отмеченные красной коробки) и пример включенного сайта (отмеченные зеленым поле) показано с большим увеличением. Рекомендуется для обзора каждого сайта, чтобы убедиться, что это достаточно высокого качества для анализа. Scalebar = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: примеры сайтов, которые должны быть исключены из анализа. А. В разделах опухоли мозга человека витражи с CD11b (зеленый) и CD45 (красный), маркеры Микроглия и макрофагов. Это изображение находится не в фокусе и были исключены из анализа. Б. пузыри присутствуют в этот образ, который был исключен из окончательного анализа. C. Этот сайт был исключен из анализа из-за раз в ткани. Масштаб гистограммы являются 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: представитель изображений и анализ. А. Каждое изображение отображается рядом с накладками, представляющие результаты автоматической сегментации. В оверлее ядер отображаются в белом и положительно окрашенные клетки показаны зеленым цветом для CD11b и красный для CD45. После исключения участков неадекватного качества от анализа и объединения результатов всех остальных сайтов, B. средняя доля общего числа клеток в каждом сайте, окрашенных позитивные для каждого маркера и совместно с надписью для обоих маркеров, C. среднем окрашенные области и D. Средняя ячейка интенсивности графически представлены. РФС = относительная флуоресценции единицы. Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Масштаб гистограммы являются 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Общие проблемы еще, препятствующих эффективности исследований в области биологических наук является разработка протоколов для объективной, точной и точные количественной дневно меченых тканей и их структур. Значительное количество времени и усилий направлена на поиск путей для анализа тканей слайды после того, как они были образы. Многие существующие методы предоставляют алгоритмы для пользователей, чтобы воссоздать в рамках программы12,,1314. Эти методы являются приемлемыми, но значение этого доклада является, что она позволяет пользователю легко и быстро создать целостный образ приобретение и Протокол анализа, если пользователь имеет доступ к WHCAS. Анализов, которые дифференцировать типы клеток и количественно несколько структур и процессов, анализ клеточного цикла и ядерной транслокации, к примеру, уже доступны в соответствующее программное обеспечение.
Установка включает в себя несколько важных шагов. Во-первых пространственные параметры слайда определены как будто это блюдо. Во-вторых малое увеличение обзор сканирования будет создан, из которой отбираются областей, представляющих интерес для большого увеличения изображений. И наконец сайты, которые влияют на точность и повторяемость последующих анализов исключаются. Крупнейших ограничением этой методики является, что его применимости зависит от, если пользователь имеет доступ к WHCAS. Однако, растущая потребность для высоких контент-анализа систем, многие учреждения предоставляют эти их исследователям, чтобы оставаться конкурентоспособным15. Устранение неполадок необходимо чаще всего когда разделов ткани не имеют той же толщины. Если выбраны несколько областей, представляющих интерес, некоторые будут в центре внимания, в то время как другие не будут. В идеале при резании, пользователь будет заботиться для создания однородной образцы. Однако если образцы являются несовместимыми, акцент на ядерной пятно волны (или ярких Флюорофор пользователя), который используется для фокус, может быть подрегулировано для каждого из из фокус региона интерес и даже для каждого поля зрения. Как другие длины волн просто смещение от ядерной пятно волны, только этой волны требует переналадки.
В настоящем докладе мы подробно, как проверять и анализировать слайды с помощью WHCAS и соответствующее программное обеспечение. Мульти волны клеток скоринга модуль позволяет пользователю автоматически рассчитывать любой ядерной или цитоплазматических маркеров, которые помечены дневно. После настройки фокуса и определение сотовой характеристиками, как ширина и области для настройки модуля в ткани образы, нет никаких дальнейших необходимость вмешательства пользователя для получения образа слайды и количественных данных. До трех слайдов может отражаться в то время, и могут быть определены несколько областей, представляющих интерес. Этот протокол позволяет WHCAS пользователей, которым необходимо анализировать слайды воспользоваться настраиваемым, многоцелевые, автоматизированные рабочие процессы, которые требуют немного не оптимизации и может применяться в любых проектов в будущем, которые включают гистологический анализ ткани.
Disclosures
Авторы имеют без финансовых интересов в продуктов, описанных в этой рукописи и ничего больше, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Этот проект финансировался грант от канадской институтов медицинских исследований и Альберта новшество - решения/Альберта рак Фонда здравоохранения. Авторы хотели бы отметить блок регенерации в нейробиологии основной объект для использования их оборудования, работа Paula Gedraitis в здании фундамент, на котором слайд сканирование на WHCAS стало возможным и создатель продукции упомянутые в этой статье, молекулярных устройств.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL |
Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Gedraitis, P. Slide Region Acquisition Journal Suite. , Available from: http://metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide (2013).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
