Summary
Denne protokol giver en omkostningseffektiv tilgang for at isolere og karakterisere mus primær renal tubulær celler, der kan efterfølgende sub kulturperler for at vurdere renal biologiske funktioner ex vivo, herunder mitokondrie bioenergetik.
Abstract
Mitokondriel dysfunktion i renal tubulær epitelceller (TECs) kan føre til nyre fibrose, en væsentlig årsag til kronisk nyresygdom (Cementovnstøv). Derfor kan vurdere mitokondrie funktion i primære TECs give værdifuld indsigt i de celler, giver indsigt i Patofysiologi af Cementovnstøv bioenergetic status. Mens der er en række komplekse protokoller til isolering og oprensning af proksimale tubuli i forskellige arter, mangler feltet en omkostningseffektiv metode optimeret til rørformede celle isolation uden behov for rensning. Her, leverer vi en isolation-protokol, der giver mulighed for undersøgelser med fokus på både primær mus proksimale og distale renal TECs. Ud over omkostningseffektive reagenser og minimal animalske procedurer, der kræves i denne protokol, de isolerede celler opretholde høje energi niveauer efter isolation og kan være sub kulturperler op til fire passager, giver mulighed for løbende undersøgelser. Derudover vurderer bruger en høj overførselshastighed ekstracellulære flux analyzer, vi den mitokondrielle respiration direkte i de isolerede TECs i en 96-brønd plade som vi give anbefalinger til optimeringen af celle tæthed og sammensatte koncentration. Disse observationer tyder på, at denne protokol kan bruges til renal tubulær ex vivo undersøgelser med en konsekvent, godt standardiseret produktion af renal TECs. Denne protokol kan have bredere fremtidige programmer at studere mitokondriel dysfunktion associeret med nyre lidelser for drug discovery eller narkotika karakterisering formål.
Introduction
Renal tubulær epitelcelle (TEC) funktion er stærkt forbundet med den generelle helbredstilstand i nyrerne. Patologisk signalering i nyrerne forårsager dedifferentiation af TECs, som spiller en stor rolle i nyre fibrose og kronisk nyre sygdom (Cementovnstøv)1,2. Som en meget energisk orgel er nyrerne kun overgået af hjerte i forbrug af ilt, primært gennem mitokondrie oxidativ fosforylering3. Elektronmikroskopi undersøgelser har vist en positiv korrelation af mitokondrie morfologiske ændringer til patologisk begivenheder i de renale tubuli4. Mitokondriel dysfunktion i TECs forårsager renal fibrose gennem epitelial til mesenchymale overgangen5 og defekte fedtsyre oxidation6. Fibrose er en progressiv renal patologi, der resulterer i Cementovnstøv. Forstå den energiske status af renal TECs er derfor en nødvendighed at afdække Patofysiologi af Cementovnstøv.
Der er > 20 celletyper i voksen nyre7. For at studere funktionen af TECs, er en primær kultur af renal epitelceller nødvendig som en platform for molekylær biologi applikationer såsom kemiske behandlinger og genetiske manipulationer. Vigtigere, kan genetiske manipulationer gøres i vivo på mus via transgenese eller ved hjælp af AAV gen levering teknikker8 , så de isoleret primærelementer ville allerede være genetisk manipuleret. Isolering af primær renal tubulær celler fra mus9,10, rotter11,12,13, hjørnetænder14, kaniner15,16, og mennesker17 ,18 er blevet rapporteret med rensning trin til give ren proksimal tubulær celler. I disse tidligere publicerede protokoller, at fokusere på isolering af proksimal tubulær celler, blev gradient centrifugering og sortering eksperimenter udført for rensning formål19. Mens disse protokoller er værdifulde for at studere proksimale tubuli, er de ikke tilstrækkelige, når både proksimale og distale tubuli er nødvendige for at blive undersøgt. For eksempel, har vores undersøgelse på Alport syndrom afsløret at både proksimale og distale renal tubuli spiller en vigtig rolle i sygdom progression20, og derfor begge former for de renale tubuli bør undersøges i kultur. En nylig undersøgelse på renal fluorid toksicitet viste også, at patologiske ændringer fandt sted i både den proksimale og distale tubuli21. Denne isolation protokol er derfor designet og optimeret til både proksimale og distale rørformede celler fra mus nyrerne med en minimal omkostning af reagenser og enkle procedurer. Alternativt kan efterforskere stadig følge protokollen indtil trin 3.1 og tilføje rensning trin9 fra dette punkt fremad til isolering af ren proksimal tubulær celler.
De isolerede celler præsentere høj energiske niveauer og vedligeholde renal epitelial egenskaber efter sub-kulturer til 4 passager. Ved hjælp af en høj overførselshastighed ekstracellulære flux analyzer, vurderer vi den mitokondrielle respiration direkte i de isolerede TECs i en 96-brønd plade, hvilket fører til yderligere indsigt i celle tæthed optimering. Disse observationer tyder på, at denne protokol kan anvendes til renal tubulær ex vivo undersøgelser med en konsekvent, godt standardiseret produktion af renal TECs. En ekstra betydning af denne protokol er dens mulige anvendelse som en høj produktivitet redskab til ex vivo karakterisering af mitokondrie bioenergetik i renal proksimale og distale rørformede celler. Derfor kan det tjene som en platform for drug discovery eller narkotika karakterisering formål af nyre lidelser.
Protocol
Alle eksperimenter, der involverer dyr blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of Miami, svarende til NIH retningslinjer.
1. plade belægning og forberedelse af reagenser
- Forberede kollagen belægning:
- Tilsæt 35 μL af kollagen I til 2 mL af pre filtrerede 20 mM eddikesyreopløsning på en enkelt 60-mm petriskål. Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time og lufttørre det udsætter det for UV.
- Vaske belægningen 3 x med PBS til at fjerne enhver syre rester og gemme det i et 37 ° C CO2-gratis celle kultur inkubator indtil cellerne er klar til såning. Den endelige koncentration af kollagen belægning er 5 μg/cm2.
- Forberede perfusion buffer: tilføje 300 μL af penicillin-streptomycin (P/S) til 30 mL PBS og varm blandingen op i et 37 ° C vandbad indtil isolation begynder.
- Forbereder fordøjelsen buffer: 3,9 mg collagenase type 2 til 30 mL PBS opløses, opløsningen filtreres gennem et filter, 0,2 μm flaske-top og varm det i et vandbad ved 37 ° C, indtil isolationen begynder.
- Forberede celle Kulturmedier:
- Bringe kosttilskud til stuetemperatur. Uden filtrering, tilføje supplement (0,05 mL føtalt kalveserum, 10 ng/mL for epidermal vækstfaktor, 5 μg/mL af insulin, 0,5 μg/mL af adrenalin, 36 ng/mL af hydrocortison, 5 μg/mL transferrin og 4 pg/mL af triiodo-L-thyronin) til 500 mL af renal epitelcelle vækst basal medium 2.
- Varm op medier i et 37 ° C vandbad indtil det er klar til brug.
- Forberede forbindelser: forberede 50 mM FCCP, 10 mM rotenon, 10 mM oligomycinets, 10 mM antimycin A, 50 mM L-carnitin og 50 mM etomoxir lager løsninger i DMSO, alikvot dem, og gemme forbindelser ved-20 ° C.
- Forberede 2,5 mM natrium palmitat i 220 mL af 150 mM NaCl opløsning og varme løsningen op i en 75 ° C vandbad indtil palmitat er helt opløst.
- Forberede bovint serumalbumin (BSA): forberede 0,34 mM fedt-fri BSA i 250 mL af 150 mM NaCl. Kontrolelementet BSA fungerer som en negativ kontrol for palm-BSA løsning, der kan tilberedes ved at følge trin 1.8.
- Konjugat palmitat til BSA (Palm-BSA):
- Tilføje palmitat løsning gradvist oploesningen BSA mens det stadig er varm. Derefter, ph indstilles til 7,4 og bland dem ved 37 ° C i mindst 1 time at fuldføre konjugering.
- Når konjugering er afsluttet, tilføje en anden 150 mL af 150 mM NaCl til løsningen, bland det godt og gemme alikvoter ved-20 ° C. Den endelige løsning indeholder 1 mM natrium palmitat og 0,17 mM BSA og vil blive brugt som en fedtsyre substrat for celler i en fedtsyre-baserede ekstracellulære flux assay.
- Forberede ekstracellulære flux assay basal medier:
- Tilføj 1 pose DMEM pulver og 20 mL af 200 mM L-glutamin (4 mM endelige) til 1 L autoklaveres dH2O og bland dem forsigtigt.
- På dagen for bioenergetik eksperiment, tilføje 100 µM natrium pyruvat til rede basal medierne for efterfølgende præparater af ekstracellulære flux assay medier skal anvendes i en glucose- eller fedtsyre - baseret respiration assay.
- Forberede glucose-baseret medier:
- For at måle cellulær respiration kapacitet gennem glykolysen, tilføje 17,5 mM glukose pulver, 100 µM kontrol BSA (som beskrevet i trin 1,7) og 20 µM etomoxir (til at hæmme fedtsyre oxidation) til basal medierne beskrevet ovenfor i trin 1.9.
- Varme op medier ved 37 ° C, ph indstilles til 7,4 og holde det i et 37 ° C vandbad indtil det bruges i en ekstracellulære flux assay.
- Forberede fedtsyre-baserede medier:
- For at måle cellulær respiration kapacitet gennem fedtsyre oxidation, tilføje 10 mM 2D-glucose pulver (glucose analog til at hæmme glykolyse), 100 µM Palm-BSA (som beskrevet i trin 1,8) og 100 µM L-carnitin til basal medierne beskrevet ovenfor i trin 1.9.
- Varme op medier ved 37 ° C, ph indstilles til 7.4, og holde det i et 37 ° C vandbad, indtil det er anvendt i den ekstracellulære flux assay.
2. perfusion, fordøjelse og høst nyrer fra mus
- Bedøver mus med en isofluran flow og ordne det i en liggende stilling. Kontroller, at isolation kun begynder efter dyret mister sin oprettende reflekser og den bedøvende dybde er overvåget af knivspids vurderinger ved hjælp af atraumatisk pincet, før og under procedure22.
- Fjern pels, bruge en depilatory creme, fra muss bryst til sin maveregion, desinficere det med jod, og tør jod resten.
- Gøre et snit i brystet, skære huden til at åbne hele maveregionen og udsætte hjerte og nyrer.
- Oprette en perfusion pumpe på 32 mL/min og fjerne eventuelle bobler i slangen før du starter perfusion.
- Indsæt en 27-G kanyle ind i venstre hjertekammer gennem hjertet apex, så snart bufferen fylder hjertet, og stikke den højre atrium for at skabe en exit så perfusion buffer cirkulerer som hjertet pumper og til sidst bliver fjernet fra højre atrium-afkørslen.
- Efter perfusion, skifte pumpens omdrejningstal til 30 mL/min. for fordøjelsen.
- Efter 20 mL af fordøjelsen buffer er perfunderet via apex, fjerne begge nyrer til rørformede celle isolation.
3. Vævscentre forarbejdning og primære rørformede celler Isolation
- Fjern renal kapsler og medulla, hakkekød begge nyrer i små stykker, og Inkuber dem i 10 mL af en fordøjelsen buffer i et 37 ° C ovn med blide rotation i 5 min.
- Fjern eventuelle ufordøjet nyre væv ved at passere bufferen gennem en 70-μm filter. Der tilsættes 10 mL af kultur medier at stoppe fordøjelsen.
- For at indsamle rørformede celler, centrifugeres den filtrerede cellesuspension ved 50 x g i 5 min til at indsamle den første pellet. Overføre supernatanten til en ny tube og tilsættes 5 mL af dyrkningsmedier, centrifuge det på 50 x g for 5 min at sikre alle rørformede celler er indsamlet i den anden pellet.
Centrifugeringen er ved en lavere hastighed til primært pellet tunge tubuli. Senere, efter at cellerne tilbagesøge isolationen, er de rene rørformede kultur centrifugeres ved en højere hastighed under sub-kulturer. - Første resuspenderes i 20 mL af dyrkningsmedier og centrifugeres det på 50 x g i 5 min. til at indsamle den tredje pellet.
- Resuspend de anden og tredje pellets i 1 mL af Kulturmedier. Mix 10 µL af cellesuspension med 10 µL af Trypan blå, læg blandingen i afdeling A af en optælling dias, og post cellernes levedygtighed fra automatiske celle counter (Se Tabel af materialer).
- Frø op til 107 celler (en heterogen population) på en enkelt 60-mm parabol overfladebelagt med kollagen og lad de rørformede celler vedhæfte natten over.
4. primære rørformede cellerne sub-kultur og karakterisering
- På dag 1 efter isolering, indsamle dyrkningsmedier og centrifugeres det på 50 x g i 5 min. til at pille enhver flydende tubuli. Fjern supernatanten og resuspenderes celle i 4 mL frisk dyrkningsmedier og plade det tilbage til den samme kultur parabol.
- På dag 4 efter isolation, fjerne den gamle kultur medier og tilføje frisk medier.
- På dag 7 efter isolationen, frigør cellerne ved inkubering ved 37 ° C i 2 mL 0,25% trypsin-EDTA for 5 min. Tilføj 3 mL dyrkningsmedier til reaktionen standses og indsamle cellerne ved centrifugering ved 250 x g i 5 min.
- At sub kultur og karakterisere celler fra P0 til P1, belagt frø 5.000 celler pr. brønd på en 24-godt tallerken med kollagen jeg som beskrevet ovenfor.
- 24 timer efter trin 4.4, lave celler på P1 med 4% PFA i 10 min, permeabilize dem med 0,2% Triton X-100 i 3 min, og blokere dem med 10% æsel serum (DS) i 1 time ved stuetemperatur.
- Fortyndes til 1: 100 10% DS, hver af de følgende proteiner: proksimal tubulær markører angiotensinogen (AGT) og aquaporin 1 (AQP1); den distale rørformede markør E-cadherin; mesangial markøren CD90/Thy1; og makrofag markører EGF-lignende modul-holdige mucin-lignende hormon receptor-1 (F4/80) og klynge af differentiering 68 (CD68), og Inkuber dem med celler natten over ved 4 ° C.
- Den næste dag, opdage eventuelle farvning med 1:200 anti-kanin, anti-mus eller anti-rotte fluorescerende sekundære antistoffer i 45 min. Tage billeder under Konfokal mikroskopi til at bekræfte udtryk markører, som vist i figur 2A.
- Dag 3 efter subkultur af P1, frigør celler for en sub-kultur og karakterisering på P2 ved en farvning af rørformede, mesangial og makrofag markører beskrevet taktfast 4.5. Image farvning under Konfokal mikroskopi til at bekræfte udtryk markører, som vist i figur 2A.
- Dag 3 efter subkultur af P2, frigør celler for en sub-kultur og karakterisering på P3 ved en farvning af rørformede, mesangial og makrofag markører beskrevet taktfast 4.5. Image farvning under Konfokal mikroskopi til at bekræfte udtryk markører, som vist i figur 2A.
- Forberede det væv farvning:
- Lufttørre frosne wild-type og Col4a3- / - nyre dias i 1 time ved stuetemperatur og løse dem med 4% PFA i 10 min. Permeabilize dem med 0,2% Triton X-100 i 10 min og blokere dem med 10% æsel serum (DS) i 1 time ved stuetemperatur. Tilføje antistoffer mod markør proteiner beskrevet taktfast 4.5 på 1:200 og inkuberes dem ved 4 ° C natten over.
- Den næste dag, opdage eventuelle farvning med 1:200 anti-kanin, anti-mus eller anti-rotte fluorescerende sekundære antistoffer i 45 min. Tage billeder under en Konfokal mikroskop at bekræfte udtryk markører, som vist i tal 2B og 2 C.
5. mitokondrier bioenergetik Assay
- Frø P1 rørformede celler på 20.000, 30.000 eller 40.000 celler pr. brønd i 100 μL af kultur medier på en 96-brønd mikrotiterplade overfladebelagt med 5 μg/cm2 kollagen jeg dagen før de ekstracellulære flux assays.
- For hydrering af sensor patron, løft sensor patronen og udfylde hver godt af pladen med 200 μl af en kalibreringsopløsningen. Omhyggeligt indlæses blækpatronen tilbage til dykke sensorer i kalibreringsopløsningen. Placere patronen i et 37 ° C ovn uden CO2 i mindst 7 timer før brug.
For de bedste resultater anbefales overnight patron hydrering. - Forberede forbindelser: forberede 8 µM oligomycinets, 9 µM FCCP og 20 µM rotenon/antimycin A blanding i både glukose (beskrevet taktfast 1,10) og fedtsyrer (beskrevet i trin 1.11) ekstracellulære flux assay medier.
- Ændre medierne: Aspirér celle Kulturmedier, tilføje 175 µL af glucose eller fedtsyre assay medier (afhængig af det stof, der er arbejdes i, se trin 5.3), og Inkuber i 1 time i et 37 ° C CO2-gratis kuvøse.
- Indlæse patron havne med 25 µL af de følgende forbindelser: 8 μM oligomycinets for port A at opnå en endelig koncentration på 1 µM (Bemærk: hver godt vil indeholde 175 µL af medier, sammensat, vil få fortyndet 8 x), 9 μM FCCP i port B at opnå en endelig koncentration på 1 µM (Bemærk: hver godt vil indeholde 175 µL af media plus 25 µL af opløsningen injiceres fra port A, sammensat, vil få fortyndet 9 x), og 20 µM rotenon/antimycin A i port C at opnå en endelig koncentration på 2 µM for hvert stof (Bemærk : som hver godt vil indeholde 175 µL af media plus 50 µL af opløsningen injiceres fra havne A og B, sammensat vil få fortyndet 10 x).
- Tilsæt vand til alle brønde i port D og alle andre havne i baggrunden wells (ingen celler). Inkuber patronen i et 37 ° C CO2-gratis kuvøse i 10 min.
- Tænd den ekstracellulære flux analyzer og controller.
- Åbn Analyzer Software og indtaste følgende protokol:
- Vælg Standard Assay. Tryk på Assay guiden. Brug fanen forbindelser , tildele den sammensatte layout og bruge fanen grupper og etiketter til at mærke de eksperimentelle grupper. Husk at tildele de tomme wells (uden celler) som baggrund.
- Angiv følgende blanding og foranstaltning cykler ved hjælp af de tilgængelige kommandoer, som angivet i tabel 1under fanen protokol : kalibrere, mix i 2 min., vente 2 min, og foranstaltningen for 3 min (Gentag denne cyklus 2-3 x); injicere port A, mix i 2 min., vente 2 min, foranstaltning i 3 min. (Gentag denne cyklus 2-3 x); injicere port B, blandes i 2 min., vente 2 min, foranstaltning i 3 min. (Gentag denne cyklus 2-3 x); injicere port C, blandes i 2 min., vente 2 min, foranstaltning i 3 min. (Gentag denne cyklus 2-3 x). Tryk på udgangen guiden. Det er også muligt at gemme den aktuelle skabelon til fremtidig brug.
- Tryk på Start til at starte kalibreringen. Analyseværktøjet derefter automatisk skubber plade-indehaveren og beder om patron pladen skal indsættes.
- Når kalibrering skridt er gjort (normalt i 20-25 min), skal du trykke på den lynhurtig befale at ændre patron plade til celle plade og fortsætte med at køre.
- Når kørslen er afsluttet, overføre data, og fjerne den 96-brønd plade. Tilføje Hoechst (1:1, 000) til hver af hver brønd og Inkuber dem i 5 min ved 37 ° C. Normalisere OCR data til celletal af en måling af Hoechst fluorescens læsning på en 355-nm excitations- og en 460-nm.
Representative Results
Nyre Perfusion og fordøjelsen udbytte meget levedygtig rørformede epitelceller:
Musen renal tubulær epitelceller blev isoleret efter trinene i afsnit 1-3 i protokollen beskrevet ovenfor.
Efter digestions, var en heterogen population af nyreceller, ufuldstændigt fordøjet tubuli og andre væv rester, der er mindre end 70 µm belagt på kultur parabol isolation dag. Ændringer fra dag 0 til dag 1 efter isolering forventes normalt at ses kun i den celle vedhæftede fil ikke i cellevækst. Ser man gennem den flydende heterogene befolkning, var kun et par rørformede celler fastgjort på dag 1 (figur 1A). En ny samling af celler på dag 1, en centrifugering og en re plating bidraget til at fjerne lys snavs og nøjes med den lille tubulus stykker for den rørformede celle udgivelse. Fra dag 1 til dag 3 forventede ændringer i en bedre celle vedhæftet fil, men også i et bemærkelsesværdigt forbedret celle-vækst, der blev observeret med en tredobbelt celle tæthed i forhold til dag 1 (figur 1A). I den indledende vækstfase, cellerne dannet adskillige kolonier og befolket omkring kolonierne. Fra dette punkt fremad, de isolerede celler var fuldt tilbagebetalt og vises en sund spredning. Dag 5 var cellerne på en 80-90% confluency i en 60-mm petriskål med nogle mellemrum mellem celle til celle og koloni til kolonien (figur 1A).
Sub-kultur og karakterisering af de isolerede rørformede celler:
De isolerede renal tubulær epitelceller blev sub kulturperler for en karakterisering efter trinene beskrevet i punkt 4 i protokollen beskrevet ovenfor.
Fra dag 5, cellerne fuldt tilbagebetalt af isolation og begyndte at formere sig kraftigt. En uge efter isolationen, voksede cellerne til confluency i en 60-mm petriskål. Efter 1 uge i en kultur på passage 0 var cellerne klar til at blive sub kulturperler passage 1 og efterfølgende for 2 flere passager. Samme vækstmønstre blev observeret i passage 1 og passage 2. Normalt tager det mindre end en uge til celler på passage 1 og 2 til at vokse til confluency for yderligere underordnede kulturer (figur 1B). Den kontinuerlige kultur af sammenflydende celler fra passage 0 til passage 2 viste en omfattende dome dannelse23,24 (figur 1B), hvilket tyder på, at de isolerede celler opretholdt en sund status hvor de udskilles væske lignende til statussen i vivo . Dette forårsaget éncellelag celle for at løfte pladen men holde kontakten via stramme kryds.
For at karakterisere cellerne i kulturen, udført vi immunfluorescent farvning i de dyrkede celler fra passage 1 gennem passage 4, samt i en control cell line-menneskelige proksimale renal HK-2 epitelceller. Proksimal tubulær markører, aquaporin 1 (AQP1)25 og angiotensinogen (AGT)9, distale rørformede markør E-cadherin25, epithelial markør glatte muskulatur actin (SMA)26,27,28, makrofag markører F4/8029 og CD6830og mesangial markør thymocyte differentiering antigen 1 (Thy1/CD90)9 blev brugt til karakterisering undersøgelser. Begge proksimal tubulær proteiner AQP1 og AGT var konsekvent stærkt udtrykt i de isolerede rørformede celler fra passage 1 til passage 4 såvel som i de positive kontrol HK-2 proksimale epitel celler (figur 2A). Den distale rørformede protein E-cadherin kom til udtryk i de isolerede rørformede celler gennem passage 4 og blev også observeret i HK-2 celler (figur 2A). SMA blev udtrykt rigeligt i de isolerede rørformede celler og i kontrol HK-2 celler, i overensstemmelse med publicerede rapporter26,27. På den anden side mesangial protein Thy1 og makrofag protein F4/80 var fraværende i både de isolerede rørformede celler og kontrol HK-2 celler (figur 2A). CD68 viste en minimal udtryk i HK-2-celler og i de isolerede rørformede celler passage 1 og passage 2 og så på sit udtryk blev målbart fra passage 3 gennem passage 4 (figur 2A). Resultaterne tyder på, at cellerne isoleret efter denne protokol er en blanding af proksimale og distale rørformede celler. Hvis du vil sammenligne udtryk for disse markør proteiner i vivo, udførte vi farvning i frosne nyre væv. Rørformede markører, herunder AQP1, AGT, og E-cadherin og mesangial protein Thy1 fandtes særdeles udtrykt i nyrerne høstet fra en wild-type sund mus (figur 2B). Lav udtryk for F4/80 og CD68 blev observeret i wild-type nyrerne men udførligt udtrykt i nyrerne høstet fra en Col4a3- / - mus, der udviklet nyresvigt med en makrofag infiltration20,31 ( Figur 2 c).
Mitokondrie bioenergetik Assay på isolerede primære rørformede celler:
Mitokondrie respiration assay trin er beskrevet i punkt 5 i protokollen beskrevet ovenfor.
Den mitokondrielle respiration af isolerede primære rørformede celler er målt ved en ekstracellulære flux analyse af ilt forbrugssats (OCR) ved forskellige plating tætheder. For at titrere plating tæthed, 20.000 og 30.000 og 40.000 primære TECs pr. brønd var seedet til en 96-brønd XF96 mikrotiterplade dagen før (ca 20 h før) ekstracellulære flux assay (figur 3A). Efter den ekstracellulære flux analyse, OCR målinger blev derefter normaliseret til celle tæller med en kvantificering af Hoechst farvning. Forkromning TECs på 20.000, 30.000 eller 40.000 celler/brønd resulterede i en gennemsnitlig basal OCR 25, 45 eller 50 pmol/min, henholdsvis (figur 3A). Derudover afsløret mikroskopiske billeder af forgyldt celler, at 40.000 celler/brønd dækket hele overfladen af bunden af mikrotiterplade wells bedre end de andre plating tætheder (figur 3B). Selv om den maksimal OCR ikke steg med 40.000 celler sammenlignet med tætheden af 30.000 celler, anbefaler vi en celle tæthed på omkring 40.000 celler/brønd for optimal interaktioner mellem celler og forbindelser.
Desuden, i vores forsøg, den optimal koncentration af de hæmmende/uncoupler forbindelser blev vist at være 1 µM oligomycinets, 1 µM FCCP og 2 µM rotenon/antimycin-A (protokoller af ekstracellulære flux analysen og port injektioner er anført i tabel 1 ; optimeringseksperimenter er ikke vist). Men, det anbefales for alle brugere til at køre en indledende test med forskellige koncentrationer af disse forbindelser, ideelt set lavere og højere end de publicerede værdier, til at berettige de bedste resultater.
En ekstracellulære flux analyse giver en række vigtige parametre for at vurdere bioenergetik af renal TECs. For eksempel, som fedtsyre oxidation er vist at være specifikt defekt i TECs, kan brugen af medier indeholdende fedtsyre substrat (palmitat) samt hæmmer af glykolyse (2 DG) tjene som et nyttigt værktøj til direkte evaluere fedtsyre oxidation i TECs på passager 1 og 2 (figur 3 c). Ved renal fibrose forventes den samlede respiration kapacitet af cellerne at være lavere end for en sund nyrer, selvom den glucose-baseret medier ikke kan afsløre eventuelle forskelle.
Tilsammen, den ekstracellulære flux assay, især at vurdere fedtsyre oxidation kapacitet, kan udnyttes som en informativ foranstaltning til at evaluere energiske status af renal TECs i patologiske ændringer påvirker bioenergetik profil spille en stor rolle i renal fibrose og progression til nyresvigt.
| Trin | Tid (min) |
| Kalibrere | |
| Reagensglasset: | 00:12:00 |
| Måling 1 | 3 sløjfer |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Injicere Port en (1 μM oligomycinets) | 2 sløjfer |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Injicere Port B (1 μM FCCP) | 2 sløjfer |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Injicere Port C (2 μM Rotenon/Antimycin) | 2 sløjfer |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
| Mix | 00:02:00 |
| Vent | 00:02:00 |
| Foranstaltning | 00:03:00 |
Tabel 1. Standardiseret ekstracellulære flux analyse kører protokol for optimal OCR målinger i primære rørformede celler.
Figur 1. Celle kultur af isolerede primære rørformede celler. (A) de isolerede primære rørformede celler vedhæfte tidligt på dag 1 og vokse håndfast fra dag 3 til dag 5. Billederne er taget under 10 X og 20 X mål. (B) dette panel viser en subkultur af isolerede primære rørformede celler fra passage 0 til passage 3. Billederne er taget under 10 X og 20 X mål for visioner af celle kupler, og under en 40 X mål for en vision af de morfologiske ændringer gennem passager. Scalebar = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Karakterisering af isolerede primære rørformede celler. (A) immunfarvning med antistoffer mod proksimal tubulær proteiner (AQP1, AGT), en distal rørformede protein (E-cadherin), en epitelial protein (SMA), en mesangial protein (Thy1) og makrofag proteiner (F4/80, CD68) viser, at den isolerede primære rørformede celler og efterfølgende sub-kulturer er ren proksimale og distale rørformede celler. (B) dette panel viser en farvning af proksimale tubulus, distale tubulus og mesangial proteiner i nyre væv fra en sund wild-type mus som positiv kontrol og en ikke-primær negativ kontrol. (C) dette panel viser en farvning af makrofag proteiner F4/80 og CD68 i nyrerne væv indsamlet fra en Col4a3- / - mus som positiv kontrol. Scalebar = 20 µm. For DAPI er vist med blåt. Markør proteiner er vist i grøn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Ekstracellulære flux assay i isolerede primære rørformede celler ved forskellige plating tætheder. (A) stigende cellulære plating tæthed øger basal respiration niveauer i primære rørformede celler, testet på passage 3. (B) dette panel viser mikroskopiske billeder af primære rørformede celler dyrkes på en XF96 mikrotiterplade seedede på 20.000 og 30.000 og 40.000 celler/brønd tætheder. Scalebar = 100 µm. (C) dette panel viser en fedtsyre - eller glucose-baseret ekstracellulære flux assay i primære rørformede celler på passager 2 og 1. Dataene er gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi optimeret en protokol, der giver mulighed for effektiv isolering af musen renal tubulær epitelceller (TECs) og viste, at cellerne kan være sub kulturperler til en ekstracellulær flux analyse at evaluere mitokondrie respiration i overværelse af fedtsyre- og/eller glucose-baseret substrater. Denne protokol er udviklet til undersøgelser med fokus på både proksimale og distale rørformede celler og fungerer som en ramme til at bygge mere komplekse eksperimenter for forståelsen af TEC patologi-associerede nyresygdomme. I forhold til tidligere publicerede protokoller9,10,19, denne metode kræver ikke gradient separationer med lang centrifugering gange eller en rigelig antistof brug for sortering og, derfor, tilbyder en mere effektiv og optimeret guide for forskere, der arbejder i den renal tubulær metaboliske felt. Der er flere vigtige skridt i denne protokol, herunder fordøjelse, fornyet samling, og plating tæthed og sammensatte optimering for ekstracellulære flux assay.
Valg af den korrekte type af collagenase og optimal koncentration er nøglen til en vellykket fordøjelse og dissociation af rørformede celler fra nyre væv. Sammenlignet med andre typer af collagenases, indeholder type 2 collagenase relativt højere niveauer af protease aktivitet, i stand til at adskille kompakt renal strukturer. For at minimere risikoen for forurening som følge af en langvarig perfusion og fordøjelsestid, var 0,013% type 2 collagenase perfunderet på 30 mL/min. Den renale kapsel var kun fjernet efter begge nyrer blev høstet fra dyret og overføres til en steriliseret celle kultur hætte. Nyrerne blev hakket i små stykker og fortsatte deres inkubering med 10 mL af en fordøjelsen buffer til en anden 5 min for en komplet fordøjelse og maksimal frigivelse af de rørformede celler.
Selvom efter fordøjelsen, væv suspension er passeret gennem en 70 µm filter til at fjerne meget store væv stykker, vil der stadig være ufordøjet tubuli, der passerer gennem filteret og holde sig inden for cellesuspension og få belagt på kultur parabol. Det tager længere tid end normalt for disse tubuli at frigive rørformede celler og Vedhæft fast til fadet, kultur. Derfor, er det temmelig vigtigt at indsamle cellesuspension og centrifugeres at pellet løstliggende tubuli og celler andendagen efter celle plating. Trinnet lav hastighed centrifugering yderligere fjerner andre celletyper, der er lysere end rørformede celler og giver mulighed for separate tubuli og rørformede celler til at bilægge.
Identifikation af ordentlig celle tæthed er det første og vigtigste skridt for en vellykket ekstracellulære flux assay. Resultaterne viste, at 40.000 celler pr. brønd på en XF96 mikrotiterplade er ideel til primære rørformede celler i både en fedtsyre og en glucose-baseret respiration assay (figur 3 c). I denne protokol, blev isolerede rørformede celler brugt til den ekstracellulære flux assay på passager 1 og 2. Cellerne sub kulturperler for at passage 3, selv om de opretholdt et udtryk for de rørformede markører (figur 2) og en anstændig ydelse i bioenergetik assays (figur 3A), og viste nedsat basal respiration niveauer i forhold til passage 2 (vist ved at sammenligne OCR i panelerne længst til højre i figur 3A til figur 3 c). Dette fald kan ikke påvirke væsentligt sund rørformede celler, (for eksempel dem isoleret fra unge wild-type mus). Dog til undersøgelser på celler isoleret fra Cementovnstøv musemodeller, der allerede har en formindsket mitokondrie respiration, kan højere passager af celler forårsage et yderligere fald i den basale respiration, hvilket ville påvirke resultaterne af ekstracellulære flux assay. I undersøgelserne, der udføres her, celler fra både passage 1 og passage 2 viste høj basal respiration niveauer. Efter denne protokol anbefaler vi derfor, bruge disse to tidlige passager til mitokondrie respiration undersøgelser med celler isoleret fra både raske og syge dyr. Celler fra passage 2 bør stadig tages i betragtning, hvis passage 1 sub-kultur ikke giver tilstrækkelig celler til flux assay. Ud over bioenergetik undersøgelser viser vores tidligere forskning, at primære TECs på passage 3 kan være meget nyttige for behandlinger med forbindelser efterfulgt af proteiner og RNA undersøgelser (data ikke vist). Når det er sagt, foreslår vi at Efterforskere bruge denne protokol til at isolere rørformede celler omhyggeligt bør vælge den optimale passage til forskellige applikationer.
Funktionsprincip af ekstracellulære flux analyse er baseret på interaktioner mellem de injicerede forbindelser og respiration kæde komplekser og effekten af uncoupler. Oligomycinets er en hæmmer af komplekse V (ATPsyntase) og bruges til at skelne ATP-linked iltforbrug og iltforbrug, der er nødvendige for at overvinde den regelmæssige proton læk over mitokondriets indre membran32. FCCP uncouples iltforbrug fra ATP produktion ved at forstyrre den mitokondrielle membran potentiale. Således, det giver en måling af maksimal respiration kapacitet som det omgår den begrænsede kapacitet af en proton ion efflux af ATPsyntase ved at tillade en proton transport gennem membranen. Antimycin-A, en kompleks III hæmmer, og rotenon, en kompleks jeg blocker, der anvendes i kombination hen til nedlægge den hele mitokondrie respiration at tillade en differentiering mellem den mitokondrielle vs. ikke-mitokondrie iltforbrug i cellerne. Disse forbindelser bør altid titreres til en bestemt celletype før ekstracellulære flux analysen til at bestemme de optimale koncentrationer, der giver de optimale OCR kurver. Her, anbefaler vi 1 µM af oligomycinets, 1 µM af FCCP og 2 µM af rotenon/antimycin A for ekstracellulære flux analysen på primære TECs.
Til sidst, giver denne protokol en enkel og omkostningseffektiv måde at isolere renal primære proksimale og distale rørformede epitelceller der kan bruges til vurdering af mitokondrie bioenergetik ex vivo. Mens denne protokol kan være nyttigt i en lang række molekylærbiologiske undersøgelser at udforske den biologiske funktion af renal tubulær epitelceller, erkender vi sine begrænsninger, når du anvender det til undersøgelser har brug for ren proksimale eller distale tubuli. For eksempel, undersøgelser på Lowe syndrom, en selektiv proksimal tubulær dysfunktion33eller undersøgelser på distale renal tubulær acidose, en distal rørformede dysfunktion34, ville kræve en mere avancerede protokol for celle isolation og rensning. Men for størstedelen af de undersøgelser, der sammenligner tubuli vs glomeruli, og studier til at screene potentielle mitokondrie respiration lovgivere i rørformede celler i almindelighed, protokollen giver en gennemførlig høj overførselshastighed tilgang. Derfor kan denne protokol har bredt programmer at studere mitokondriel dysfunktion associeret med nyre lidelser for drug discovery eller target valideringsformål.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de følgende tilskud til Lina A. Shehadeh: den National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjerte Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
- Bielesz, B., et al. Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).
- Fabian, S. L., et al. Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis. American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).
- Forbes, J. M. Mitochondria-power players in kidney function. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).
- Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys. Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).
- Yuan, Y., et al. Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).
- Terryn, S., et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).
- Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules. American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).
- Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules. American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).
- Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules. American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).
- Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).
- Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).
- Rubera, I., et al. Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules. American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).
- Inoue, C. N., et al. Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter. Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).
- Van der Hauwaert, C., et al. Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling. PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).
- Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells. Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).
- Wen Ding, K. Y., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Quadri, J. A., et al. Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study. Human & Experimental Toxicology. , (2018).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Condorelli, L., et al. Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).
- Aschauer, L., et al. Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).
- George, S. K., et al. Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure. PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).
- Elberg, G., et al. MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).
- Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures. Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).
- Cai, Q., et al. Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).
- Zhao, Y., et al. Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells. BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).
- Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).
- Kim, M., et al. Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment. PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B.
- Bockenhauer, D., et al. Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).
- Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis. BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).
