Summary
Este protocolo proporciona un enfoque rentable para aislar y caracterizar ratón primario células tubulares renales que posteriormente pueden cultivarse el evaluar funciones biológicas renal ex vivo, incluyendo bioenergética mitocondrial.
Abstract
La disfunción mitocondrial en las células epiteliales tubulares renales (TECs) puede conducir a la fibrosis renal, una causa importante de enfermedad renal crónica (ERC). Por lo tanto, evaluar la función mitocondrial en TECs primarias puede proporcionar información valiosa sobre el estado bioenergético de las células, proporcionando la penetración en la patofisiología de CKD. Si bien hay un número de protocolos complejos disponibles para el aislamiento y purificación de túbulos proximales en diferentes especies, el campo carece de un método rentable, optimizado para aislamiento de células tubulares sin necesidad de purificación. Presentamos un protocolo de aislamiento que permite estudios centrados en ambas primarias ratón TECs renales proximales y distales. Además de rentables reactivos y procedimientos animales mínimo requeridos en el presente Protocolo, las células aisladas mantienen altos niveles de energía después de aislamiento y pueden ser el cultos hasta cuatro pasajes, lo que permite estudios continuos. Además, usando un analizador de flujo extracelular de alto rendimiento, evaluar la respiración mitocondrial en los TECs aisladas en una placa de 96 pocillos para las cuales proporcionar recomendaciones para la optimización de la densidad celular y la concentración compuesto. Estas observaciones sugieren que este protocolo puede utilizarse para estudios de tubular renal ex vivo con una producción consistente y bien estandarizada de TECs renales. Este protocolo puede tener futuras aplicaciones más amplio para el estudio de la disfunción mitocondrial asociada a trastornos renales con fines de caracterización de drogas o el descubrimiento de medicamentos.
Introduction
Función de la célula epitelial tubular renal (TEC) está fuertemente asociada con el estado de salud general del riñón. Señales patológicas en el riñón provoca el dedifferentiation de TECs, que juega un papel importante en la fibrosis renal y renal crónica (CKD) de la enfermedad1,2. Como un órgano altamente energético, el riñón es el corazón en el consumo de oxígeno, principalmente a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial3. Estudios de microscopía electrónica han revelado una correlación positiva de cambios morfológicos mitocondriales a eventos patológicos en los túbulos renales4. La disfunción mitocondrial en TECs causa fibrosis renal a través de la transición de epitelio a mesénquima5 y defectuoso ácidos grasos oxidación6. La fibrosis es una patología renal progresiva que resulta en la CKD. Por lo tanto, entender el estado energético de TECs renales es el hecho de que descubrir la fisiopatología de la CKD.
Hay tipos de > 20 células en el riñón adulto7. Para estudiar la función del Spark, es necesario un cultivo primario de las células epiteliales renales como una plataforma para aplicaciones de biología molecular como tratamientos químicos y manipulaciones genéticas. Lo importante, manipulaciones genéticas pueden realizarse en vivo en ratones vía transgénesis o mediante AAV gene entrega técnicas8 para que las células primarias aisladas ya manipuladas genéticamente. El aislamiento de células tubulares renales primarios de ratones9,10ratas11,12,13, caninos14, conejos15,16y los seres humanos17 ,18 se ha divulgado con pasos de purificación para producir puras células tubulares proximales. En estos protocolos previamente publicados que se centran en el aislamiento de las células tubulares proximales, centrifugación del gradiente y clasificación experimentos fueron realizados para fines de purificación19. Mientras que estos protocolos son valiosos para el estudio de túbulos proximales, no son suficientes cuando los túbulos proximales y distales son necesarios a ser estudiados. Por ejemplo, nuestro estudio sobre el síndrome de Alport ha revelado que tanto proximales y distales de los túbulos renales tienen un papel importante en la progresión de la enfermedad del20, y por lo tanto, ambos tipos de los túbulos renales se deben investigar en la cultura. Un reciente estudio sobre la toxicidad renal de flúor también demostró que los cambios patológicos tuvieron lugar en el de los túbulos proximal y distal21. Por lo tanto, este protocolo de aislamiento está diseñado y optimizado para las células tubulares proximales y distales de riñones de ratón con un costo mínimo de los reactivos y procedimientos sencillos. Como alternativa, los investigadores todavía pueden seguir el protocolo hasta el paso 3.1 y agregar purificación pasos9 desde este punto hacia adelante para el aislamiento de las células tubulares proximales puros.
Las células aisladas presentan altos niveles energéticos y mantienen características epiteliales renales después de las subculturas a 4 pasos. Utilizando un analizador de flujo extracelular de alto rendimiento, evaluar la respiración mitocondrial en los TECs aisladas en una placa de 96 pocillos, que conduce a más información sobre optimización de densidad celular. Estas observaciones sugieren que este protocolo se puede aplicar a estudios de tubular renal ex vivo con una producción consistente y bien estandarizada de TECs renales. Una mayor relevancia de este protocolo es su posible uso como una herramienta de alto rendimiento para la caracterización ex vivo de bioenergética mitocondrial en las células tubulares proximales y distales renales. Por lo tanto, puede servir como una plataforma para el descubrimiento de fármacos o drogas caracterización trastornos renales.
Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de Miami, conforme a las directrices de los NIH.
1. placa de recubrimiento y preparación de los reactivos
- Preparar el recubrimiento de colágeno:
- Añadir 35 μL de colágeno I de 2 mL de una solución de ácido acético 20 mM previamente filtrados en un solo plato de Petri 60mm. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h, secado con aire y exponer a los rayos UV.
- Lave la capa 3 veces con PBS para eliminar cualquier residuo ácido y guardar en una de 37 ° C CO2-incubadora de cultivo de células hasta que las células están listas para la siembra. La concentración final de la capa de colágeno es 5 μg/cm2.
- Preparación de buffer de perfusión: Añadir 300 μL de penicilina-estreptomicina (P/S) a 30 mL de PBS y calentar la mezcla en un baño de agua de 37 ° C hasta que comience el aislamiento.
- Preparación de buffer de digestión: disolver 3.9 mg de colagenasa tipo 2 en 30 mL de PBS, filtrar la solución a través de un filtro de 0.2 μm superior de la botella y calentarlo al baño María a 37 ° C hasta que comience el aislamiento.
- Preparar medios de cultivo celular:
- Traer los suplementos a la temperatura ambiente. Sin filtración, añadir el suplemento (0,05 mL de suero de ternera fetal, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 5 μg/mL de insulina, 0,5 μg/mL de epinefrina, 36 ng/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de transferrina y 4 pg/mL de triyodotiroacético-L-thyronine) a 500 mL de renal medio basal de célula epitelial crecimiento 2.
- Calentamiento de los medios de comunicación en un baño de agua de 37 ° C hasta que esté listo para usar.
- Preparar compuestos: preparar 50 mM FCCP, rotenona de 10 mM, oligomycin 10 mM, 10 mM antimicina A, 50 mM L-carnitina 50 mM etomoxir dispone soluciones en DMSO, alícuota de ellos y almacenar los compuestos a-20 ° C.
- Palmitato de sodio de 2,5 mM en 220 mL de una solución de NaCl 150 mM de preparar y calentar la solución en un baño de agua de 75 ° C hasta que se haya disuelto completamente el palmitato.
- Preparación de albúmina de suero bovino (BSA): preparación de BSA libre de grasa de 0.34 m m en 250 mL de NaCl 150 mM. El control de BSA sirve como un control negativo para la solución de BSA de palma que puede ser preparado siguiendo el paso 1.8.
- Conjugar el palmitato de BSA (BSA de Palma):
- Añadir la solución palmitato poco a poco en la solución de BSA mientras está todavía caliente. Luego, ajustar el pH a 7,4 y mezcla a 37 ° C durante al menos 1 hora completar la conjugación.
- Cuando se completa la conjugación, añadir otros 150 mL de 150 mM de NaCl a la solución, mezclar bien y guardar en alícuotas a-20 ° C. La solución final contiene BSA de palmitato y 0,17 mM de sodio 1 mM y se utilizará como sustrato de ácidos grasos de las células en un ensayo de flujo extracelular basado en ácidos grasos.
- Preparar media basal de ensayo de flujo extracelular:
- Añadir 1 bolsa de polvo DMEM y 20 mL de 200 mM L-glutamina (4 mM final) a 1 L de autoclave dH2O y mezclar suavemente.
- En el día del experimento bioenergética, añadir piruvato de sodio de 100 μm al medio basal preparado para posteriores preparaciones de medios de ensayo de flujo extracelular ser utilizado en un ensayo de respiración basada en glucosa o ácidos grasos.
- Preparar medios con glucosa:
- Para medir la capacidad de la respiración celular a través de la glucólisis, añadir polvo de la glucosa de 17,5 mM, control de 100 μm BSA (como se describe en el paso 1.7) y 20 μm etomoxir (para inhibir la oxidación de ácidos grasos) a los medios de comunicación básico descrito en el paso 1.9.
- Calentar el medio a 37 ° C, ajustar el pH a 7,4 y mantenerla en el baño de agua de 37 ° C hasta que se utiliza en un ensayo de flujo extracelular.
- Preparación de medios a base de ácidos grasos:
- Para medir la capacidad de la respiración celular a través de la oxidación del ácido graso, añadir 10 mM 2D-glucosa en polvo (análogo para inhibir la glucólisis de la glucosa), 100 μm Palma-BSA (como se describe en paso 1.8) y 100 μm L-carnitina a los medios de comunicación basal descrito en paso 1.9.
- Calentar el medio a 37 ° C, ajustar el pH a 7,4 y mantenerla en el baño de agua de 37 ° C hasta que se utiliza en el análisis del flujo extracelular.
2. perfusión, digestión y extracción de riñones de ratones
- Anestesiar el ratón con un flujo de isoflurano y fijarlo en una posición supina. Asegúrese de que el aislamiento sólo comienza después de que el animal pierde sus adrizamiento reflejos y la profundidad anestésica es supervisada por pizca evaluaciones usando pinzas atraumáticas antes y durante el procedimiento22.
- Quitar la piel, utilizando una crema depilatoria, de pecho del ratón a la zona abdominal, desinfectar con yodo y limpie los residuos de yodo.
- Hacer una incisión en el pecho, cortar la piel para abrir la zona abdominal entero y exponer el corazón y los riñones.
- Instalar una bomba de perfusión a 32 mL/min y eliminar las posibles burbujas en la tubería antes de iniciar la perfusión.
- Inserte una aguja de 27 G en el ventrículo izquierdo a través del ápice del corazón tan pronto como el buffer se llena el corazón y meter la aurícula derecha para crear una salida para que el búfer de perfusión circula como el corazón bombea y eventualmente consigue eliminar de la salida de la aurícula derecha.
- Después de la perfusión, cambiar la velocidad de la bomba a 30 mL/min para la digestión.
- Después de 20 mL de tampón de digestión se perfunde a través del ápice, quite ambos riñones para el aislamiento de células tubulares.
3. tejido procesamiento y primaria Tubular aislamiento de las células
- Retire las cápsulas renales y médula, pique ambos riñones en pedazos minúsculos e incubar en 10 mL de un tampón de digestión en un horno de 37 ° C con rotación suave durante 5 minutos.
- Quitar cualquier tejido renal no digerida pasando el búfer a través de un filtro de 70 μm. Añadir 10 mL de medio de cultivo para detener la digestión.
- Para recoger las células tubulares, centrifugar la suspensión celular filtrado a 50 x g durante 5 minutos recoger la primera pastilla. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y añadir 5 mL de medio de cultivo, centrífuga 50 x g durante 5 min para todas las células tubulares se recogió en la segunda pastilla.
La centrifugación es a una velocidad inferior a pellet principalmente túbulos pesados. Más tarde, después de que las células de recuperan desde el aislamiento, la pura cultura tubular se centrifuga a mayor velocidad durante las subculturas. - Resuspender el precipitado de primera en 20 mL de medio de cultivo y centrifugue a 50 x g durante 5 minutos recoger la tercera pastilla.
- Vuelva a suspender los pellets de segundo y terceros en 1 mL de medio de cultivo. Mezclar 10 μl de la suspensión celular con 10 μl de azul tripán, cargar la mezcla en la cámara de cuenta diapositiva y record la viabilidad de las células del automático contador celular (véase Tabla de materiales).
- Semilla hasta 107 células (una población heterogénea) en un solo plato 60 mm previamente había revestido con colágeno y dejar que las células tubulares fije durante la noche.
4. primaria Tubular células subcultura y caracterización
- El día 1 después del aislamiento, recoger los medios de cultivo y centrifugue a 50 x g por 5 min a cualquier túbulos flotantes de la pelotilla. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 4 mL de medio de cultivo fresco y placa de nuevo a la misma placa de cultivo.
- El día 4 después del aislamiento, eliminar los antiguos medios de cultivo y añadir medio fresco.
- El día 7 después del aislamiento, separar las células, incubando a 37 ° C en 2 mL de 0.25% tripsina-EDTA para 5 minutos añadir 3 mL de medio de cultivo para detener la reacción y recoger las células por centrifugación a 250 x g durante 5 minutos.
- Para el cultivo y caracterizar las células de P0 a P1, 5.000 células semillas por bien en un plato 24-well recubierta de colágeno I como se describió anteriormente.
- 24 h después de paso 4.4, fijar las células a P1 con un 4% PFA durante 10 min, los permeabilizar con 0,2% Tritón X-100 durante 3 min. y bloquearlos con 10% suero de burro (DS) por 1 h a temperatura ambiente.
- Diluido a 1: 100 en el 10% DS, cada una de las siguientes proteínas: el angiotensinógeno (AGT) de marcadores tubulares proximales y Acuaporina 1 (AQP1); el marcador tubular distal E-cadherin; el marcador de mesangial CD90/Thy1; y el receptor de hormona de mucina-como EGF-como módulo que contiene los marcadores de macrófagos-1 (F4/80) y el cúmulo de diferenciación 68 (CD68) e Incube las células durante la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, detectar cualquier coloración usando 1: 200 anti- conejo, anti-ratón o anti-rata fluorescente secundaria anticuerpos durante 45 minutos. Tomar imágenes bajo microscopia confocal para confirmar la expresión de los marcadores, como se muestra en la figura 2A.
- El día 3 después de la sub-cultura de P1, separar las células para una subcultura y caracterización en P2 por la coloración de los marcadores tubulares, mesangial y macrófagos que se describe en el paso 4.5. La imagen la tinción bajo microscopia confocal para confirmar la expresión de los marcadores, como se muestra en la figura 2A.
- El día 3 después de la sub-cultura de P2, separar las células para una subcultura y caracterización en P3, una coloración de los marcadores tubulares, mesangial y macrófagos que se describe en el paso 4.5. La imagen la tinción bajo microscopia confocal para confirmar la expresión de los marcadores, como se muestra en la figura 2A.
- Preparación de la tinción de tejido:
- Deje secar al aire congelado tipo salvaje y Col4a3- / - diapositivas de riñón por 1 h a temperatura ambiente y fijarlos con 4% PFA 10 min les permeabilizar con 0,2% Tritón X-100 durante 10 min y bloquearlos con 10% suero de burro (DS) por 1 h a temperatura ambiente. Añadir anticuerpos contra las proteínas del marcador descritos en el paso 4.5 a 1: 200 e incubar a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, detectar cualquier coloración con los 1: 200 anti- conejo, anti-ratón o anti-rata fluorescente secundaria anticuerpos durante 45 minutos. Tomar imágenes con un microscopio confocal para confirmar la expresión de los marcadores, como se muestra en las figuras 2B y 2C.
5. las mitocondrias bioenergética análisis
- Células tubulares de semilla P1 en 20.000, 30.000 o 40.000 células por pocillo en 100 μL de medio de cultivo en una microplaca de 96 pozos cubierto primero con 5 μg/cm2 de colágeno I el día antes de los ensayos de flujo extracelular.
- Para la hidratación del cartucho sensor, levante el cartucho de sensor y llene cada uno bien de la placa con 200 μL de una solución de calibración. Ponga cuidadosamente el cartucho nuevo a sumergir los sensores en la solución de calibración. Coloque el cartucho en un horno de 37 º C sin CO2 para por lo menos 7 h antes del uso.
Para obtener los mejores resultados se recomienda hidratación cartucho durante la noche. - Preparar los compuestos: preparar 8 oligomycin μm μm 9 FCCP y mezcla de rotenona/antimycin A 20 μm en glucosa (descrito en el paso 1.10) y medios de ensayo de flujo extracelular de ácidos grasos (se describe en paso 1.11).
- Cambiar los medios de comunicación: aspirar el medio de cultivo celular, añadir 175 μl del medio de ensayo glucosa o ácidos grasos (el dependiente en el compuesto que se está trabajando, ver el paso 5.3) e incubar durante 1 h a 37 ° C CO2-incubadora gratis.
- Carga de los puertos de cartucho con 25 μl de los siguientes compuestos: 8 oligomycin μM para el puerto A lograr una concentración final de 1 μm (Nota: pues bien cada uno contendrá 175 μl de medios de comunicación, el compuesto conseguirá diluido 8 x), 9 μM FCCP puerto B para lograr una concentración final de 1 Μm (Nota: pues bien cada uno contendrá 175 μl de media plus 25 μl de la solución inyectada desde el puerto A, el compuesto conseguirá diluido 9 x) y 20 μm rotenona/antimycin A Puerto C para lograr una concentración final de 2 μm para cada compuesto (Nota : pues bien cada uno contendrá 175 μl de medios más 50 μl de la solución inyectada desde los puertos A y B, el compuesto conseguirá diluido 10 x).
- Añadir agua a todos los pocillos en Puerto D y todos los otros puertos de los pozos de fondo (sin células). Incubar el cartucho en una de 37 ° C CO2-incubadora libre de 10 minutos.
- Abra el analizador de flujo extracelular y el controlador.
- Abra el Software del analizador y de entrada el siguiente protocolo:
- Elegir el ensayo estándar. Asistente de análisisde prensa. Con la ficha de compuestos , asignar el diseño compuesto y utilice la ficha grupos y etiquetas para rotular los grupos experimentales. Recuerda asignar los pozos vacíos (sin células) como fondo.
- En la ficha Protocolo , establece los siguientes ciclos de mezcla y medida utilizando los comandos disponibles como se indica en la tabla 1: calibra, mezcla durante 2 minutos, espere 2 minutos y medida por 3 min (repetición este ciclo 2-3 x); Inyectar el puerto A, mezclar durante 2 min., espere 2 minutos, medida por 3 min (repetir este ciclo 2-3 x); Inyectar el puerto B, mezcle durante 2 minutos, esperar 2 minutos, medida por 3 min (repetir este ciclo 2-3 x); Inyectar el puerto C, mezcle durante 2 minutos, espere 2 minutos, medida por 3 min (repetir este ciclo 2-3 x). Pulse Finalizar asistente. También es posible guardar la plantilla actual para el uso futuro.
- Pulse iniciar para iniciar la calibración. El analizador entonces automáticamente expulsa el sostenedor de la placa y le pide la placa del cartucho ser insertado.
- Cuando el paso de la calibración se hace (generalmente 20-25 minutos), presione el comando prompt para cambiar la placa de la cápsula a la placa celular y continuar la carrera.
- Una vez terminada la carrera, transferencia de datos y retire la placa de 96 pocillos. Añadir Hoechst (1:1, 000) a cada uno de los pocillos de ensayo e incúbelos durante 5 min a 37 ° C. Normalizar los datos OCR para conteo de células por una medida de la fluorescencia de Hoechst leyendo en una excitación de 355 nm y una emisión de 460 nm.
Representative Results
Perfusión del riñón y digestión rendimiento altamente viables células epiteliales tubulares:
Células epiteliales tubulares renales de ratón fueron aisladas siguiendo los pasos descritos en la sección 1-3 del protocolo descrito anteriormente.
Después de la digestión, una población heterogénea de células renales, túbulos incompletamente digeridos y otros residuos de tejido que es menor de 70 μm fueron plateadas sobre el plato de cultura día de aislamiento. Cambios desde el día 0 a día 1 después de que el aislamiento generalmente se espera ser visto solamente en el accesorio de celular y no en el crecimiento celular. Mirando a través de la heterogénea población flotante, sólo algunas células tubulares fueron Unidas en el día 1 (figura 1A). Una nueva recopilación de las células en el día 1, una centrifugación y un nuevo revestimiento ayudó a eliminar los residuos ligeros y colocar las piezas de pequeños túbulos para el lanzamiento de la célula tubular. Día 1 a día 3, se esperan cambios no sólo en un mejor accesorio de la célula, sino también en una tasa de crecimiento de célula notablemente mejorada que se observó con una densidad de célula triplicados en comparación con el día 1 (figura 1A). En la fase de crecimiento inicial, las células formaron varias colonias y poblaron alrededor de las colonias. Desde este punto hacia adelante, las células aisladas se recuperaron completamente y muestran una proliferación sana. Día 5, las células eran en un 80-90% de confluencia en caja Petri de 60 mm con algunos espacios entre célula a célula y la Colonia a Colonia (figura 1A).
Subcultura y caracterización de las células tubulares aisladas:
Las células epiteliales tubulares renales aisladas fueron cultivadas el para un siguiente caracterización los pasos descritos en el artículo 4 del protocolo descrito anteriormente.
Desde el día 5, las células completamente recuperaron del aislamiento y comenzaron a proliferar vigorosamente. Una semana después el aislamiento, las células crecieron a confluencia en caja Petri de 60 mm. Después de 1 semana en una cultura en el paso 0, las células estaban listas para ser cultivados el paso 1 y, posteriormente, para pasajes más 2. Patrones de crecimiento similares se observaron en el paso 1 y paso 2. Por lo general, tarda menos de una semana para las células en el paso 1 y 2 para llegar a la confluencia de otras subculturas (figura 1B). El continuo cultivo de células confluentes de paso 0 a estado paso 2 demostrada una amplia cúpula formación23,24 (figura 1B), lo que sugiere que las células aisladas mantienen una saludable donde excretan líquidos similares a un estado en vivo . Esto causó que la monocapa de células que levante la placa pero manténgase conectado a través de ensambladuras apretadas.
Para caracterizar las células en la cultura, se realizó coloración inmunofluorescente en las células cultivadas del paso 1 a través del paso 4, así como un control de la célula línea humanos proximal renal HK-2 células epiteliales. Marcadores tubulares proximales, Acuaporina 1 (AQP1)25 y angiotensinógeno (AGT)9, la E-cadherina marcador tubular distal del25, el marcador epitelial músculo liso actina (SMA)26,27,28, macrófago marcadores F4/8029 y30de CD68 y el antígeno de diferenciación de timocitos mesangial marcador 1 (Thy1/CD90)9 fueron utilizadas para los estudios de caracterización. Ambas proteínas tubulares proximales AQP1 y AGT fueron constantemente altamente expresadas en las células tubulares aisladas del paso 1 al paso 4, así como en el control positivo HK-2 proximal células epiteliales (figura 2A). La proteína tubular distal E-cadherina se expresa en las células tubulares aisladas a través del paso 4 y también se observó en las células HK-2 (figura 2A). SMA se expresa abundantemente en las células tubulares aisladas y en las células control HK-2, consistentes con los informes publicados26,27. Por otro lado, la proteína de mesangial Thy1 y proteína macrófago F4/80 estuvieron ausentes en las células tubulares aisladas y las células control HK-2 (figura 2A). CD68 mostró una mínima expresión en las células HK-2 y en las células tubulares aisladas en el paso 1 y paso 2 y luego su expresión llegó a ser imperceptible desde paso 3 a paso 4 (figura 2A). Los resultados sugieren que las células aisladas siguiendo este protocolo son una mezcla de células tubulares proximales y distales. Para comparar las expresiones de estas proteínas la marcador en vivo, se realizó la coloración en tejidos de riñones congelados. Marcadores tubulares, incluyendo proteínas AQP1, AGT y E-cadherina y mesangial Thy1 encontraron altamente expresada en los riñones de un ratón sano de tipo salvaje (figura 2B). Bajo expresiones de F4/80 y CD68 fueron observadas en los riñones de tipo salvaje pero expresadas ampliamente en los riñones de un ratón Col4a3- / - que desarrolló la falta renal con una macrófagos infiltración20,31 ( Figura 2).
Análisis de bioenergética mitocondrial en las células tubulares primarias aisladas:
Se describen los pasos del ensayo de respiración mitocondrial en el artículo 5 del protocolo descrito anteriormente.
La respiración mitocondrial de las células tubulares primarias aisladas es medida por un análisis de flujo extracelular de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en placas diferentes densidades. Para valorar la densidad de placas, 20.000, 30.000 y 40.000 TECs primarias por pozo sembraron en una microplaca de 96 pocillos XF96 el día anterior (aproximadamente 20 h antes) el ensayo de flujo extracelular (Figura 3A). Tras el análisis de flujo extracelular, las mediciones de OCR se normalizaron luego a las cuentas de celular de una cuantificación de la tinción de Hoechst. Platear los TECs en 20.000, 30.000 o 40.000 células/pozo dio lugar a un OCR basal media de 25, 45 o 50 pmol/min, respectivamente (Figura 3A). Por otra parte, imágenes microscópicas de las células plateadas revelaron que 40.000 células/pozo cubierto toda la superficie de la parte inferior de los pocillos de la microplaca mejores que las otras densidades de galjanoplastia (figura 3B). A pesar de que el OCR máxima no aumentó con 40.000 células en comparación con la densidad de 30.000 células, recomendamos una densidad celular de alrededor de 40.000 células/pocillo para la óptima interacción entre las células y compuestos.
Por otra parte, en nuestros experimentos, la concentración óptima de los compuestos inhibitorios/uncoupler fue demostrada para ser 1 μm oligomycin, FCCP de 1 μm y 2 μm rotenona/antimycin-A (los protocolos de lo análisis de flujo extracelular y las inyecciones de puerto se enumeran en tabla 1 ; los experimentos de optimización no se muestran). Sin embargo, se recomienda para que todos los usuarios ejecutar una prueba preliminar con diferentes concentraciones de estos compuestos, lo ideal sería inferiores y superiores a los valores publicados, para garantizar los mejores resultados.
Un ensayo de flujo extracelular produce una serie de parámetros importantes para evaluar las variables de bioenergía del Spark renal. Por ejemplo, como oxidación de los ácidos grasos se muestra especialmente defectuoso en TECs, el uso de los medios de comunicación que contiene sustrato ácido graso (palmitato) junto con el inhibidor de la glucólisis (2 DG) puede servir como una herramienta útil para evaluar directamente la oxidación de los ácidos grasos en TECs en los pasos 1 y 2 (figura 3). En el caso de la fibrosis renal, la capacidad total de la respiración de las células se espera que sea menor que la de un riñón sano a pesar de que los medios de comunicación basados en la glucosa no pueden revelar las diferencias.
Tomados en conjunto, el análisis del flujo extracelular, especialmente para evaluar la capacidad de oxidación de ácidos grasos, puede ser utilizado como una medida informativa para evaluar el estado energético de TECs renales en que cambios patológicos que afectan el juego del perfil de bioenergética una papel importante en la fibrosis renal y la progresión a insuficiencia renal.
| Pasos | Tiempo (min) |
| Calibrar | |
| Equilibrar: | 00:12:00 |
| Medida 1 | 3 lazos |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Inyectar un (Oligomycin de 1 μM) de Puerto | 2 lazos |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Inyectar el puerto B (FCCP 1 μM) | 2 lazos |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Inyectar el puerto C (Rotenon de 2 μM, antimicina) | 2 lazos |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
| Mezcla | 00:02:00 |
| Esperar | 00:02:00 |
| Medida | 00:03:00 |
Tabla 1. Normalizados de análisis de flujo extracelular funcionamiento protocolo para las mediciones de OCR óptimo en las células tubulares primarias.
Figura 1. Célula de cultivo de células aisladas de tubulares primarias. (A) las células tubulares primarias aisladas Conecte temprano en el día 1 y crecer sólidamente desde el día 3 hasta día 5. Las imágenes son tomadas bajo 10 X y 20 X objetivos. (B) este panel muestra una subcultura de células tubulares primarias aisladas de paso 0 a paso 3. Las imágenes son tomadas bajo 10 X y objetivos de X 20 visiones de las cúpulas de la célula y bajo un objetivo de X 40 para una visión de los cambios morfológicos a través de los pasajes. El scalebar = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Caracterización de células tubulares primarias aisladas. (A) Immunostaining con los anticuerpos contra proteínas tubulares proximales (AQP1, AGT), una proteína tubular distal (E-cadherin), una proteína epitelial (SMA), una proteína de mesangial (Thy1) y proteínas de macrófagos (F4/80, CD68) muestran que el primario aislado células tubulares y subcultivos posteriores son puras células tubulares proximales y distales. (B) este panel muestra una tinción del túbulo proximal, túbulo distal y mesangial proteínas en tejidos de riñón de un ratón de tipo salvaje sano como control positivo y control negativo no-primaria. (C) este panel muestra una tinción de las proteínas del macrófago F4/80 y CD68 en tejido renal de un ratón Col4a3- / - como control positivo. Scalebar = 20 μm. El DAPI se muestra en azul. Las proteínas del marcador se muestran en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ensayo de flujo extracelular en células tubulares primarias aisladas en placas diferentes densidades. (A) aumento celular galjanoplastia densidad aumenta los niveles de la respiración basal en las células tubulares primarias, probada en el paso 3. (B) este panel muestra imágenes microscópicas de las células tubulares primarias cultivadas en una microplaca de XF96 sembrada en 20.000, 30.000 y 40.000 células/pozo densidades. Scalebar = 100 μm. (C) este panel muestra un ensayo de flujo extracelular basado en ácidos grasos o glucosa en las células tubulares primarias en pasos de 2 y 1. Los datos son la media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Tenemos un protocolo que permite el aislamiento eficaz de células epiteliales tubulares renales ratón (TECs) y demostró que las células pueden cultivarse sub para que un análisis de flujo extracelular para evaluar la respiración mitocondrial en presencia de ácidos grasos o sustratos a base de glucosa. Este protocolo está diseñado para estudios centrados en las células tubulares proximales y distales y sirve como un marco construir experimentos más complejos para la comprensión de las enfermedades renales asociadas a patología TEC. Comparado con protocolos previamente publicados9,10,19, este método no requiere separaciones degradados con largos tiempos de centrifugación o con un uso amplio de anticuerpos para la clasificación y, por lo tanto, ofrece más Guía eficiente y optimizada para los investigadores que trabajan en el campo metabólico tubular renal. Hay varios pasos críticos en este protocolo, incluyendo la digestión, nueva recopilación y densidad de placas y la optimización del compuesto para el ensayo de flujo extracelular.
Elegir el tipo correcto de colagenasa y la concentración óptima es la clave para una exitosa digestión y disociación de las células tubulares de los tejidos renales. En comparación con otros tipos de colagenasas, colagenasa tipo 2 contiene relativamente altos niveles de actividad de la proteasa, capaces de disociar las estructuras renales compactas. Para minimizar las posibilidades de contaminación como resultado de una perfusión prolongada y el tiempo de digestión, colagenasa tipo 2 de 0.013% se perfunde a 30 mL/min. La cápsula renal sólo fue quitada después de que ambos riñones fueron extraídas del animal y transferidos en una campana de cultivo celular esterilizada. Los riñones fueron picados en pedazos minúsculos y continuaron su incubación con 10 mL de un tampón de digestión para otros 5 minutos para una digestión completa y máxima liberación de las células tubulares.
Aunque, después de la digestión, la suspensión de tejido se pasa por un filtro de 70 μm para eliminar piezas de tejido muy grande, seguirá habiendo los túbulos no digeridos que pasan por el filtro y permanecen dentro de la suspensión celular y haz plateados sobre el plato de cultura. Tarda más tiempo de lo normal para estos túbulos liberar células tubulares y fije firmemente a la placa de cultivo. Por lo tanto, es muy importante recoger la suspensión de células y centrifugue para pellets los túbulos sueltos y células el segundo día después de la galjanoplastia de la célula. Este paso de centrifugación a baja velocidad adicional elimina otros tipos de células que son más ligeros que las células tubulares y permite túbulos y células tubulares resolver.
La identificación de la densidad celular adecuada es el primer y fundamental paso para un análisis exitoso flujo extracelular. Los resultados mostraron que 40.000 células por pocillo de una microplaca de XF96 es ideal para las células tubulares primarias en un ácido graso y un ensayo de respiración con glucosa (figura 3). En este protocolo, células tubulares aisladas fueron utilizadas para el análisis de flujo extracelular en pasos de 1 y 2. Las células cultivadas para el paso 3, aunque mantuvo una expresión de los marcadores tubulares (figura 2) y un rendimiento decente en los ensayos de bioenergética (Figura 3A) y mostraron niveles de respiración basal disminuida en comparación con el paso 2 el (se muestra mediante la comparación de OCR en los paneles de la derecha de la Figura 3A a la figura 3). Esta disminución no puede afectar substancialmente sanas células tubulares (por ejemplo, los aislados de jóvenes ratones de tipo salvaje). Sin embargo, estudios sobre células aisladas de los modelos de ratón CKD que ya tienen una disminución de la respiración mitocondrial, más pasajes de las células pueden disminuir más en la respiración basal que puede afectar los resultados de la prueba de flujo extracelular. En los estudios realizaron, las células de paso 1 y paso 2 mostraron altos niveles de respiración basal. Por lo tanto, siguiendo este protocolo, se recomienda utilizar estos dos primeros pasos de estudios de la respiración mitocondrial con células aisladas de animales sanos y enfermos. Las células de paso 2 todavía deben tomarse en consideración si la subcultura del paso 1 no produce suficientes células para el análisis de flujo. Además de los estudios de bioenergética, nuestra investigación previa muestra que primaria Spark en el paso 3 puede ser muy útil para los tratamientos con compuestos seguidos por proteínas y RNA estudios (datos no mostrados). Dicho esto, sugerimos que los investigadores usando este protocolo para aislar células tubulares deben elegir cuidadosamente el paso óptimo para aplicaciones de investigación diferentes.
El principio de funcionamiento de los análisis de flujo extracelular se basa en las interacciones entre los compuestos inyectados y los complejos de la cadena de respiración y el efecto de la uncoupler. Oligomycin es un inhibidor del complejo V (ATP sintasa) y se utiliza para distinguir el consumo de oxígeno ligado a ATP y el consumo de oxígeno que se requiere para superar la pérdida de protón regular a través de una membrana mitocondrial interna32. FCCP desacopla el consumo de oxígeno de la producción de ATP alteran el potencial de membrana mitocondrial. Por lo tanto, proporciona una medida de la capacidad máxima de respiración como evita la capacidad limitada de un eflujo de iones de protones por la ATP sintasa permitiendo un transporte de protones a través de la membrana. Antimicina A, un inhibidor del complejo III y la rotenona, un complejo bloqueador, se usan en combinación para cerrar la respiración mitocondrial entera permitiendo una diferenciación entre mitocondrial vs el consumo de oxígeno no mitocondrial las células. Estos compuestos deben titularse siempre para que un tipo de célula específica antes de la prueba de flujo extracelular determinar las concentraciones óptimas que las curvas óptimas del OCR. Aquí, recomendamos 1 μm de oligomycin, 1 μm de FCCP y 2 μm de rotenona/antimycin A para el análisis de flujo extracelular en TECs primarias.
En conclusión, este protocolo proporciona una forma sencilla y rentable para aislar renales primarias proximales y distales células epiteliales tubulares que pueden utilizarse para evaluar la bioenergética mitocondrial ex vivo. Mientras que este protocolo puede ser útil en una amplia gama de estudios de biología molecular explora la función biológica de las células epiteliales tubulares renales, reconocemos sus limitaciones cuando se aplica a los estudios que necesitan puros túbulos proximal o distales. Por ejemplo, estudios sobre el síndrome de Lowe, una disfunción tubular proximal selectiva33o estudios sobre acidosis tubular renal distal, una disfunción tubular distal34, requeriría un protocolo más sofisticado para aislamiento de células y purificación. Sin embargo, para la mayoría de los estudios que comparan los túbulos y glomérulos, estudios detectar posibles reguladores de la respiración mitocondrial en células tubulares en general, el protocolo ofrece un enfoque factible de alto rendimiento. Por lo tanto, este protocolo puede tener amplias aplicaciones para el estudio de la disfunción mitocondrial asociada a trastornos renales para la droga descubrimiento o destino validación.
Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones a Lina A. Shehadeh: el Instituto Nacional de salud (R56HL132209 y 1R01HL140468) y el Miami Heart Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
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