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Biology

अलगाव, लक्षण वर्णन, और माउस प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के उच्च प्रवाह Extracellular फ्लक्स विश्लेषण

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3,4,5
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Interdisciplinary Stem Cell Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Vascular Biology Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल एक लागत प्रभावी दृष्टिकोण को अलग करने और माउस प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं है कि बाद में उप हो सकता है की विशेषताएं प्रदान करता है गुर्दे जैविक कार्यों mitochondrial जैव ऊर्जा सहित पूर्व vivo, का आकलन करें ।

Abstract

गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (TECs) में Mitochondrial रोग गुर्दे फाइब्रोसिस, क्रोनिक गुर्दे की बीमारी (सीकेडी) का एक प्रमुख कारण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, प्राथमिक TECs में mitochondrial समारोह का आकलन कोशिकाओं की अधिक ऊर्जावान स्थिति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान, सीकेडी के pathophysiology में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । जबकि विभिन्न प्रजातियों में अलगाव और समीपस्थ नलिकाओं के शोधन के लिए उपलब्ध जटिल प्रोटोकॉल के एक नंबर रहे हैं, क्षेत्र शुद्धि के लिए आवश्यकता के बिना ट्यूबलर कोशिका अलगाव के लिए अनुकूलित एक लागत प्रभावी विधि का अभाव है । यहाँ, हम दोनों प्राथमिक माउस समीपस्थ और बाहर की ओर गुर्दे TECs पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन के लिए अनुमति देता है कि एक अलगाव प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. लागत प्रभावी रिएजेंट और इस प्रोटोकॉल में आवश्यक ंयूनतम पशु प्रक्रियाओं के अलावा, अलग कोशिकाओं के अलगाव के बाद उच्च ऊर्जा का स्तर बनाए रखने और उप हो सकता है चार मार्ग तक संस्कृति, सतत अध्ययन के लिए अनुमति दी । इसके अलावा, एक उच्च प्रवाह extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर, हम mitochondrial श्वसन का आकलन सीधे अलग TECs में एक ९६ में अच्छी तरह से थाली जिसके लिए हम सेल घनत्व और यौगिक एकाग्रता के अनुकूलन के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल गुर्दे TECs के एक सुसंगत, अच्छी तरह से मानकीकृत उत्पादन के साथ गुर्दे ट्यूबलर पूर्व vivo अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल व्यापक भविष्य अनुप्रयोगों mitochondrial दवा खोज या दवा लक्षण वर्णन प्रयोजनों के लिए गुर्दे विकारों के साथ जुड़े रोग का अध्ययन हो सकता है ।

Introduction

गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिका (टेक) समारोह दृढ़ता से गुर्दे की समग्र स्वास्थ्य हालत के साथ जुड़ा हुआ है. गुर्दे में रोग संकेतन TECs के भेदभाव का कारण बनता है, जो गुर्दे की फाइब्रोसिस और क्रोनिक गुर्दे की बीमारी (सीकेडी)1,2में एक प्रमुख भूमिका निभाता है । एक उच्च ऊर्जावान अंग के रूप में, गुर्दे ऑक्सीजन की खपत में केवल दिल के लिए दूसरा है, मुख्य रूप से mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण3के माध्यम से । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन गुर्दे नलिकाओं4में रोग की घटनाओं के लिए mitochondrial रूपात्मक परिवर्तन का एक सकारात्मक संबंध से पता चला है । TECs में Mitochondrial रोग गुर्दे फाइब्रोसिस उपकला के माध्यम से mesenchymal संक्रमण5 और दोषपूर्ण फैटी एसिड ऑक्सीकरण6का कारण बनता है । फाइब्रोसिस एक प्रगतिशील गुर्दे विकृति है कि सीकेडी में परिणाम है । इसलिए, गुर्दे TECs की ऊर्जावान स्थिति को समझने सीकेडी के pathophysiology को उजागर करने के लिए एक आवश्यकता है ।

वहां रहे है > 20 वयस्क गुर्दे में सेल प्रकार7। TECs के समारोह का अध्ययन करने के लिए, गुर्दे उपकला कोशिकाओं की एक प्राथमिक संस्कृति ऐसे रासायनिक उपचार और आनुवंशिक जोड़तोड़ के रूप में आणविक जीवविज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक मंच के रूप में की जरूरत है. महत्वपूर्ण बात, आनुवंशिक जोड़तोड़ transgenesis के माध्यम से चूहों में vivo में किया जा सकता है या AAV जीन वितरण तकनीक8 का उपयोग करके ताकि अलग प्राथमिक कोशिकाओं को पहले से ही आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जाएगा । चूहों9,10, चूहों11,12,13, कुत्ते14, खरगोश15,16, और मानव 17 से प्राथमिक गुर्दे ट्यूबलर कोशिकाओं का अलगाव ,18 शुद्ध समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं उपज के लिए शुद्धिकरण कदम के साथ सूचित किया गया है । इन पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल है कि समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं के अलगाव पर ध्यान केंद्रित में, ढाल केंद्रापसारक और छंटाई प्रयोगों शुद्धि प्रयोजनों के लिए प्रदर्शन किया गया19। जबकि इन प्रोटोकॉल समीपस्थ नलिकाओं अध्ययन के लिए मूल्यवान हैं, वे पर्याप्त नहीं है जब दोनों समीपस्थ और बाहर नलिकाओं अध्ययन किया जा करने के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, Alport सिंड्रोम पर हमारे अध्ययन से पता चला है कि दोनों समीपस्थ और बाहर गुर्दे नलिकाओं रोग प्रगति20में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और इसलिए गुर्दे नलिकाओं के दोनों प्रकार के संस्कृति में जांच की जानी चाहिए । गुर्दे फ्लोराइड विषाक्तता पर हाल के एक अध्ययन में यह भी दिखाया गया है कि रोग परिवर्तन दोनों समीपस्थ और बाहर नलिकाओं21में जगह ले ली. इसलिए, इस आइसोलेशन प्रोटोकॉल डिज़ाइन किया गया है और एक न्यूनतम लागत वाले एजेंट और सरल प्रक्रियाओं के साथ माउस गुर्दे से समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कक्षों दोनों के लिए अनुकूलित । वैकल्पिक रूप से, जांचकर्ता अभी भी कदम ३.१ जब तक प्रोटोकॉल का पालन करें और शुद्ध समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस बिंदु आगे से शुद्धि चरण9 जोड़ सकते हैं ।

अलग कोशिकाओं उच्च ऊर्जावान स्तर मौजूद है और 4 मार्ग को उप संस्कृतियों के बाद गुर्दे उपकला विशेषताओं को बनाए रखने. एक उच्च प्रवाह extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करना, हम एक ९६-well थाली में अलग TECs में सीधे mitochondrial श्वसन का आकलन है, जो कोशिका घनत्व अनुकूलन में आगे अंतर्दृष्टि की ओर जाता है । इन टिप्पणियों का सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल गुर्दे TECs के एक सुसंगत, अच्छी तरह से मानकीकृत उत्पादन के साथ गुर्दे ट्यूबलर पूर्व vivo अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का एक जोड़ा महत्व गुर्दे समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कोशिकाओं में mitochondrialता के पूर्व vivo लक्षण वर्णन के लिए एक उच्च प्रवाह उपकरण के रूप में अपनी व्यवहार्य उपयोग है । इसलिए, यह दवा की खोज या गुर्दे विकारों की दवा लक्षण वर्णन प्रयोजनों के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

Protocol

सभी प्रयोगों जानवरों को शामिल करने के लिए NIH दिशा निर्देशों के अनुरूप, मियामी विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. प्लेट कोटिंग और रिएजेंट की तैयारी

  1. कोलेजन कोटिंग तैयार:
    1. जोड़ें ३५ कोलेजन के μL मैं एक पूर्व के 2 मिलीलीटर के लिए एक एकल ६० मिमी पेट्री डिश पर 20 मिमी एसिटिक एसिड समाधान फ़िल्टर्ड । यह 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर यह मशीन, हवा सूखी, और यह यूवी को बेनकाब ।
    2. पंजाब के साथ कोटिंग 3x धो किसी भी एसिड अवशेषों को हटाने और यह एक ३७ डिग्री सेल्सियस सह2मुक्त सेल संस्कृति मशीन में बचाने के लिए जब तक कोशिकाओं को बोने के लिए तैयार हैं । कोलेजन कोटिंग के अंतिम एकाग्रता है 5 μg/
  2. छिड़काव बफर तैयार करें: ३०० μL (पी/एस) के पंजाब के 30 मिलीलीटर के लिए और मिश्रण गर्म एक ३७ ° c पानी के स्नान में जब तक अलगाव शुरू होता है जोड़ें ।
  3. तैयार पाचन बफर: भंग ३.९ collagenase प्रकार 2 के मिलीग्राम पंजाब के 30 मिलीलीटर में, एक ०.२-माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर और एक पानी में स्नान में गर्म अप ३७ ° c जब तक अलगाव शुरू होता है ।
  4. सेल कल्चर मीडिया तैयार करें:
    1. कमरे के तापमान के लिए खुराक ले आओ । निस्पंदन के बिना, पूरक जोड़ें (भ्रूण बछड़ा सीरम के ०.०५ मिलीलीटर, 10 एपिडर्मल वृद्धि कारक के एनजी/एमएल, 5 μg/एमएल इंसुलिन की, ०.५ μg/एमएल के एड्रेनालाईन, ३६ के एनजी/एमएल, hydrocortisone के 5 μg/एमएल, और कैल्सीटोनिन के 4 स्नातकोत्तर/एमएल-एल triiodo) के लिए ५०० मिलीलीटर गुर्दे की उपकला कोशिका वृद्धि बेसल मध्यम 2.
    2. एक ३७ ° c पानी स्नान में मीडिया को गर्म जब तक यह प्रयोग करने के लिए तैयार है ।
  5. तैयार यौगिकों: ५० मिमी FCCP, 10 मिमी रोटेनोन, 10 मिमी oligomycin, 10 मिमी antimycin एक, ५० मिमी एल carnitine, और ५० मिमी etomoxir में सभी DMSO स्टॉक समाधान, उन्हें aliquot, और-20 डिग्री सेल्सियस पर यौगिकों की दुकान.
  6. एक १५० मिमी NaCl समाधान की २२० मिलीलीटर में २.५ मिमी सोडियम palmitate तैयार करने और palmitate पूरी तरह से भंग है जब तक एक ७५ ° c पानी के स्नान में समाधान गर्म ।
  7. तैयार गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA): १५० mm NaCl के २५० मिलीलीटर में ०.३४ mm फैट-free BSA तैयार करें । नियंत्रण BSA पाम-BSA समाधान है कि चरण १.८ का पालन करके तैयार किया जा सकता है के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है ।
  8. संयुग्मी को palmitate BSA (खजूर-BSA):
    1. यह अभी भी गर्म है, जबकि BSA समाधान में धीरे-palmitate समाधान जोड़ें । फिर, ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें और उन्हें ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण करने के लिए कम से विकार पूरा करने के लिए 1 ज.
    2. जब विकार पूरा हो गया है, तो समाधान के लिए १५० mM NaCl की एक और १५० मिलीलीटर जोड़ें, यह अच्छी तरह से मिश्रण है, और aliquots पर-20 ° c सहेजें । अंतिम समाधान 1 मिमी सोडियम palmitate और ०.१७ mm BSA शामिल है और एक फैटी एसिड आधारित extracellular फ्लक्स परख में कोशिकाओं के लिए एक फैटी एसिड सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  9. extracellular फ्लक्स परख बेसल मीडिया तैयार करें:
    1. DMEM पाउडर के 1 बैग और २०० मिमी एल के 20 मिलीलीटर जोड़ें-glutamine (4 मिमी अंतिम) 1 एल के autoclaved डीएच2हे और उंहें धीरे मिश्रण ।
    2. इस दिन में, extracellular फ्लक्स परख मीडिया के बाद की तैयारी के लिए तैयार बेसल मीडिया के लिए १०० µ एम सोडियम पाइरूवेट जोड़ने के लिए एक ग्लूकोज या फैटी एसिड आधारित श्वसन परख में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  10. ग्लूकोज-आधारित मीडिया तैयार करें:
    1. glycolysis के माध्यम से सेलुलर श्वसन क्षमता को मापने के लिए, जोड़ें १७.५ mM ग्लूकोज पाउडर, १०० µ एम नियंत्रण BSA (के रूप में चरण १.७ में वर्णित), और 20 µ m etomoxir (फैटी एसिड ऑक्सीकरण को बाधित करने के लिए) बेसल के लिए चरण १.९ में ऊपर वर्णित मीडिया ।
    2. ३७ ° c पर मीडिया को गर्म, ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और यह ३७ ° c पानी स्नान में रखने के लिए जब तक यह एक extracellular फ्लक्स परख में प्रयोग किया जाता है ।
  11. फैटी एसिड आधारित मीडिया तैयार:
    1. फैटी एसिड ऑक्सीकरण के माध्यम से सेलुलर श्वसन क्षमता को मापने के लिए, 10 मिमी 2d-ग्लूकोज पाउडर जोड़ने (glycolysis को बाधित करने के लिए ग्लूकोज एनालॉग), १०० µ एम पाम-BSA (के रूप में चरण १.८ में वर्णित), और १०० µ एम एल-carnitine के लिए बेसल चरण १.९ में ऊपर वर्णित मीडिया.
    2. ३७ ° c पर मीडिया को गर्म, ७.४ के लिए पीएच समायोजित, और यह ३७ ° c पानी स्नान में रखने के लिए जब तक यह extracellular फ्लक्स परख में प्रयोग किया जाता है ।

2. छिड़काव, पाचन और चूहों से गुर्दे की कटाई

  1. एक isoflurane प्रवाह के साथ माउस Anesthetize और यह एक लापरवाह स्थिति में ठीक । सुनिश्चित करें कि अलगाव के बाद ही शुरू होता है पशु अपने लेकन सजगता खो देता है और संवेदनाहारी गहराई चुटकी मूल्यांकन से पहले और प्रक्रिया के दौरान22atraumatic संदंश का उपयोग करके नजर रखी है ।
  2. फर निकालें, एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग कर, माउस के सीने से उसके उदर क्षेत्र के लिए, आयोडीन के साथ यह संक्रमित, और आयोडीन अवशेषों पोंछ ।
  3. छाती में एक चीरा बनाओ, त्वचा को काटने के लिए पूरे उदर क्षेत्र खोलने के लिए, और दिल और गुर्दे का पर्दाफाश ।
  4. ३२ मिलीलीटर/मिनट पर एक छिड़काव पंप सेट और छिड़काव शुरू करने से पहले टयूबिंग में किसी भी बुलबुले को हटा दें ।
  5. एक 27-G सुई बाईं निलय में डालें जैसे ही बफर के रूप में दिल सुप्रीम के माध्यम से ऊपर दिल भरता है, और सही atrium प्रहार करने के लिए एक बाहर निकलें बनाने के लिए तो छिड़काव बफर दिल पंप के रूप में प्रसारित होता है और अंततः सही atrium से बाहर निकाल दिया जाता है ।
  6. छिड़काव के बाद, पाचन के लिए 30 एमएल/मिनट के लिए पंप गति स्विच ।
  7. पाचन बफर के 20 मिलीलीटर के बाद एपेक्स के माध्यम से perfused है, ट्यूबलर कोशिका अलगाव के लिए दोनों गुर्दे निकालें ।

3. ऊतक प्रसंस्करण और प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं अलगाव

  1. गुर्दे कैप्सूल और मज्जा निकालें, छोटे टुकड़ों में दोनों गुर्दे कीमा, और उन्हें 5 मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में एक पाचन बफर के 10 मिलीलीटर में गर्मी ।
  2. एक ७०-माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बफर पारित करके किसी भी अपच गुर्दे के ऊतकों को हटा दें । पाचन को रोकने के लिए संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. ट्यूबलर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, पहली गोली इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए ५० x g पर फ़िल्टर्ड सेल निलंबन केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, यह 5 मिनट के लिए ५० x g पर केंद्रापसारक सुनिश्चित करने के लिए सभी ट्यूबलर कोशिकाओं को दूसरी गोली में एकत्र कर रहे हैं ।
    इस केंद्रापसारक एक कम गति के लिए मुख्य रूप से भारी नलिकाओं गोली है । बाद में, कोशिकाओं अलगाव से उबरने के बाद, शुद्ध ट्यूबलर संस्कृति उप संस्कृतियों के दौरान एक उच्च गति से केंद्रापसारक है ।
  4. संस्कृति मीडिया के 20 मिलीलीटर में पहली गोली reसस्पेंड और 5 मिनट के लिए ५० x g पर यह तीसरी गोली इकट्ठा करने के लिए ।
  5. संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में दूसरी और तीसरी छर्रों reसस्पेंड । मिश्रण 10 Trypan नीले रंग के µ एल के साथ सेल निलंबन के µ एल, एक गिनती स्लाइड के चैंबर में एक मिश्रण लोड, और स्वचालित सेल काउंटर से सेल व्यवहार्यता रिकॉर्ड ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  6. 107 कोशिकाओं को बीज (एक विषम जनसंख्या) पर एक एकल ६०-mm डिश पूर्व कोलेजन के साथ लेपित और दो ट्यूबलर कोशिकाओं रात भर देते हैं ।

4. प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं उप संस्कृति और लक्षण वर्णन

  1. 1 दिन अलगाव के बाद, संस्कृति मीडिया को इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए ५० x g पर यह किसी भी अस्थाई नलिकाओं गोली के लिए केंद्रापसारक । supernatant निकालें और ताजा संस्कृति मीडिया के 4 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और यह एक ही संस्कृति पकवान वापस थाली ।
  2. 4 दिन अलगाव के बाद, पुराने संस्कृति मीडिया को हटाने और ताजा मीडिया जोड़ें ।
  3. 7 दिवस पर अलगाव के बाद, उंहें ३७ ° c में ०.२५% trypsin के 2 मिलीलीटर-5 मिनट के लिए EDTA में मशीन द्वारा कोशिकाओं को अलग । संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और 5 मिनट के लिए २५० x जी में केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  4. उप संस्कृति और P0 से P1 के लिए कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए, बीज ५,००० कोशिकाओं पर अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से प्लेट कोलेजन के साथ लेपित के रूप में ऊपर वर्णित है ।
  5. कदम ४.४ के बाद 24 ज, 10 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ P1 पर कोशिकाओं को ठीक, ०.२% ट्राइटन एक्स के साथ permeabilize 3 मिनट के लिए १००, और उंहें 10% गधा सीरम (डी एस) के लिए 1 घंटे के कमरे के तापमान पर के साथ ब्लॉक ।
  6. पतला, 10% डी एस में 1:100 के लिए, निंनलिखित प्रोटीन के प्रत्येक: समीपस्थ ट्यूबलर मार्करों angiotensinogen (AGT) और aquaporin 1 (AQP1); बाहर ट्यूबलर मार्कर ई-cadherin; mesangial मार्कर CD90/Thy1; और मैक्रोफेज मार्करों EGF-जैसे मॉड्यूल-युक्त mucin हार्मोन रिसेप्टर की तरह 1 (F4/80) और ६८ विभेद के क्लस्टर (CD68), और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं के साथ गर्मी ।
  7. अगले दिन, किसी भी 1:200 विरोधी खरगोश, विरोधी माउस, या विरोधी चूहे फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए ४५ मिनट का उपयोग कर धुंधला का पता लगाने । मार्क्स की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत चित्र लें, जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है ।
  8. 3 दिवस पर उप संस्कृति P1 के बाद, अलग एक उप के लिए कक्षों-संस्कृति और लक्षण वर्णन P2 पर ट्यूबलर, mesangial, और मैक्रोफेज मार्करों के एक धुंधला द्वारा चरण ४.५ में वर्णित है । छवि फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत दाग मार्करों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए, के रूप में चित्र 2aमें दिखाया गया है ।
  9. 3 दिन पर उप के बाद P2 की संस्कृति, अलग एक उप के लिए कक्षों-संस्कृति और लक्षण वर्णन p पर ट्यूबलर, mesangial, और मैक्रोफेज मार्करों के एक धुंधला द्वारा चरण ४.५ में वर्णित है । छवि फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत दाग मार्करों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए, के रूप में चित्र 2aमें दिखाया गया है ।
  10. ऊतक दाग तैयार:
    1. एयर सूखी जमे हुए जंगली प्रकार और Col4a3-/- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए गुर्दे स्लाइड और उंहें 10 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ ठीक । 10 मिनट के लिए उंहें ०.२% ट्राइटन X-१०० के साथ Permeabilize और उंहें 10% गधा सीरम (डी एस) के लिए 1 घंटे के कमरे के तापमान पर के साथ ब्लॉक । मार्कर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी जोड़ें 1:200 पर ४.५ कदम में वर्णित है और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।
    2. अगले दिन, 1:200 विरोधी के साथ किसी भी धुंधला खरगोश, विरोधी माउस, या विरोधी चूहे फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी ४५ मिनट के लिए पता लगाने । मार्क्स की अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत चित्र लें, जैसा कि आंकड़े 2 बी और 2cमें दिखाया गया है ।

5. Mitochondria की ताकतें परख

  1. बीज P1 ट्यूबलर कोशिकाओं २०,०००, ३०,०००, या ४०,००० कोशिकाओं में प्रति अच्छी तरह से १०० μL में संस्कृति मीडिया के एक ९६ पर-अच्छी तरह से microplate पूर्व 5 μg के साथ लेपित/cm2 कोलेजन मैं दिन extracellular फ्लक्स परख से पहले ।
  2. सेंसर कारतूस के जलयोजन के लिए, सेंसर कारतूस उठा और एक अंशांकन समाधान के २०० μL के साथ प्लेट की एक अच्छी तरह से भरें । सावधानीपूर्वक अंशांकन समाधान में सेंसर को जलमग्न करने के लिए वापस कारतूस लोड । सह2 के बिना एक ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में कारतूस प्लेस से कम 7 के लिए उपयोग करने से पहले एच ।
    सबसे अच्छा परिणाम के लिए, रातोंरात कारतूस जलयोजन की सिफारिश की है ।
  3. तैयार यौगिकों: तैयार 8 µ m oligomycin, 9 µ एम FCCP, और 20 µ m रोटेनोन/antimycin दोनों ग्लूकोज में एक मिश्रण (१.१० कदम में वर्णित) और फैटी एसिड (१.११ कदम में वर्णित) extracellular फ्लक्स परख मीडिया ।
  4. मीडिया बदलें: सेल संस्कृति मीडिया महाप्राण, ग्लूकोज या फैटी एसिड परख मीडिया के १७५ µ एल जोड़ने (यौगिक है कि में काम किया जा रहा है पर निर्भर है, ५.३ कदम देखें), और उंहें एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2-मुक्त मशीन में 1 घंटे के लिए मशीन ।
  5. निंनलिखित यौगिकों के 25 µ एल के साथ कारतूस बंदरगाहों लोड: 8 बंदरगाह एक के लिए माइक्रोन oligomycin 1 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए (नोट: के रूप में एक अच्छी तरह से मीडिया के १७५ µ एल शामिल होंगे, यौगिक पतला हो जाएगा 8 x), 9 पोर्ट बी में माइक्रोन FCCP 1 के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए µ मी (note: के रूप में प्रत्येक अच्छी तरह से १७५ µ एल के मीडिया से अधिक 25 µ एल के समाधान बंदरगाह से इंजेक्शन एक, यौगिक पतला हो जाएगा 9), और 20 µ m रोटेनोन/antimycin ए पोर्ट सी में एक परिसर के लिए 2 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए (नोट : के रूप में प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया से अधिक १७५ µ एल समाधान के ५० µ एल बंदरगाहों ए और बी से इंजेक्शन, यौगिक पतला हो जाएगा 10x) शामिल होंगे ।
  6. बंदरगाह डी और पृष्ठभूमि कुओं के सभी अंय बंदरगाहों में सभी कुओं में पानी जोड़ें (कोई कोशिकाओं) । 10 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस सह2मुक्त मशीन में कारतूस मशीन ।
  7. extracellular फ्लक्स विश्लेषक और नियंत्रक पर चालू करें ।
  8. विश्लेषक सॉफ़्टवेयर खोलें, और निम्न प्रोटोकॉल इनपुट:
    1. मानक परखचुनें । प्रेस परख जादूगर। यौगिकों टैब का उपयोग करना, यौगिक लेआउट असाइन करें और प्रयोगात्मक समूहों लेबल करने के लिए समूहों और लेबल टैब का उपयोग. खाली कुओं (कोशिकाओं के बिना) पृष्ठभूमि के रूप में आवंटित करने के लिए याद रखें ।
    2. प्रोटोकॉल टैब के अंतर्गत, तालिका 1में दर्शाई गई उपलब्ध आदेशों का उपयोग करके निम्न मिश्रण और माप चक्र सेट करें: जांचना, 2 मिनट के लिए मिश्रण, 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, और 3 मिनट के लिए उपाय (इस चक्र 2-3x दोहराएँ); एक बंदरगाह सुई, 2 मिनट के लिए मिश्रण, 2 मिनट के लिए रुको, 3 मिनट के लिए उपाय (इस चक्र 2-3x दोहराने); 2 मिनट के लिए बंदरगाह बी, मिश्रण, 2 मिनट के लिए रुको, 3 मिनट के लिए उपाय (इस चक्र 2-3x दोहराने); इंजेक्षन बंदरगाह सी, 2min के लिए मिश्रण, 2 मिनट के लिए रुको, 3 मिनट के लिए उपाय (दोहराने इस चक्र 2-3x). अंत विज़ार्डदबाएं । यह भी भविष्य के उपयोग के लिए वर्तमान टेंपलेट को बचाने के लिए संभव है ।
    3. अंशांकन शुरू करने के लिए प्रारंभ दबाएं । विश्लेषक तो स्वचालित रूप से प्लेट धारक बाहर निकालता है और कारतूस की थाली के लिए पूछता है डाला जाएगा ।
  9. अंशांकन कदम (आमतौर पर 20-25 मिनट में) किया जाता है, तो सेल प्लेट को कारतूस प्लेट बदलने के लिए और रन जारी रखने के लिए त्वरित आदेश दबाएँ.
  10. जब रन पूरा हो गया है, डेटा हस्तांतरण, और ९६-well प्लेट निकालें । Hoechst जोड़ें (1:1000) परख कुओं में से प्रत्येक के लिए और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन । एक ३५५-एनएम उत्तेजना और एक ४६०-एनएम उत्सर्जन पर Hoechst प्रतिदीप्ति पढ़ने की माप द्वारा सेल गिनती करने के लिए ओसीआर डेटा को सामान्य ।

Representative Results

गुर्दे छिड़काव और पाचन उपज अत्यधिक व्यवहार्य ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं:
माउस गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के वर्गों 1-3 में उल्लिखित चरणों का पालन अलग थे.

अपच के बाद, गुर्दे की कोशिकाओं की एक विषम आबादी, पूरी तरह से पचा नलिकाओं, और अंय ऊतक मलबे कि ७० µm से छोटी है अलगाव दिवस पर संस्कृति पकवान पर चढ़ाया गया । 0 दिन से 1 दिन तक परिवर्तन अलगाव के बाद आमतौर पर सेल के विकास के बजाय केवल सेल लगाव में ही देखा जाने की उम्मीद है । फ्लोटिंग heterogenous जनसंख्या के माध्यम से खोज, केवल कुछ ट्यूबलर कोशिकाओं को दिन में संलग्न थे 1 (आंकड़ा 1a). 1 दिन में कोशिकाओं का एक पुनः संग्रह, एक केंद्रापसारक, और एक फिर से चढ़ाना प्रकाश मलबे को हटाने और ट्यूबलर सेल रिलीज के लिए छोटे tubule टुकड़े बसने में मदद की । 1 दिन से 3 दिन के लिए, परिवर्तन न केवल एक बेहतर सेल लगाव में, लेकिन यह भी एक उल्लेखनीय सुधार सेल वृद्धि की दर है कि एक तिहरा सेल घनत्व के साथ मनाया गया था में उंमीद की गई 1 दिन की तुलना में (आंकड़ा 1a) । प्रारंभिक विकास चरण में, कक्षों में कई कालोनियों का गठन किया और कालोनियों के आसपास आबाद । इस बिंदु से आगे, पृथक कोशिकाओं को पूरी तरह से बरामद किया गया और एक स्वस्थ प्रसार प्रदर्शित । 5 दिन तक, कोशिकाओं में एक ८०-९०% सेल और कॉलोनी के लिए कॉलोनी के लिए सेल के बीच कुछ स्थानों के साथ एक ६० मिमी पेट्री डिश में प्रवाह (आंकड़ा 1a) थे ।

उप संस्कृति और पृथक ट्यूबलर कोशिकाओं के लक्षण वर्णन:
अलग गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं उप थे ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के खंड 4 में उल्लिखित चरणों के बाद एक लक्षण वर्णन के लिए संस्कृति ।

5 दिन से, कोशिकाओं को पूरी तरह से अलगाव से बरामद किया और जोरदार पैदा करना शुरू कर दिया । एक सप्ताह के अलगाव के बाद, कोशिकाओं को ६० मिमी पेट्री डिश में प्रवाह करने के लिए वृद्धि हुई । 0 मार्ग में एक संस्कृति में 1 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को उप होने के लिए तैयार थे 1 पारित करने के लिए और, बाद में 2 और मार्ग के लिए, संस्कृति । इसी तरह के विकास पैटर्न पारित 1 और 2 मार्ग में मनाया गया । आमतौर पर, यह एक सप्ताह से भी कम समय बीतने पर कोशिकाओं के लिए लेता है और 2 को आगे उप संस्कृतियों (आंकड़ा 1b) के लिए प्रवाह हो जाना । 0 बीतने से धाराप्रवाह कोशिकाओं के सतत संस्कृति 2 एक व्यापक गुंबद गठन23,24 (आंकड़ा 1b), सुझाव है कि अलग कोशिकाओं को एक स्वस्थ स्थिति बनाए रखा जहां वे तरल पदार्थ इसी तरह उत्सर्जित vivo स्थिति में एक करने के लिए । इस कारण कोशिकाओं की monolayer से लिफ्ट प्लेट बंद हो गई लेकिन तंग जंक्शनों के जरिए जुड़े रहिए.

संस्कृति में कोशिकाओं की विशेषता, हम मार्ग 4 के माध्यम से 1 गद्यांश से प्रसंस्कृत कोशिकाओं में धुंधला immunofluorescent प्रदर्शन किया, साथ ही साथ एक नियंत्रण सेल लाइन में-मानव समीपस्थ गुर्दे उपकला एच-2 कोशिकाओं. समीपस्थ ट्यूबलर मार्करों, aquaporin 1 (AQP1)25 और angiotensinogen (AGT)9, बाहर ट्यूबलर मार्कर ई-cadherin25, उपकला मार्कर चिकनी मांसपेशी actin (SMA)26,27,28, मैक्रोफेज markers F4/8029 और CD6830, और mesangial मार्कर thymocyte भेदभाव प्रतिजन 1 (Thy1/CD90)9 लक्षणात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया । दोनों समीपस्थ ट्यूबलर प्रोटीन AQP1 और AGT लगातार उच्च 1 गद्यांश से अलग ट्यूबलर कोशिकाओं में व्यक्त किए गए 4 के रूप में अच्छी तरह के रूप में सकारात्मक नियंत्रण में एच-2 समीपस्थ उपकला कोशिकाओं (चित्रा 2a). बाहर ट्यूबलर प्रोटीन ई cadherin गद्यांश 4 के माध्यम से पृथक ट्यूबलर कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था और यह भी एच-2 कोशिकाओं (चित्रा 2a) में मनाया गया था । SMA अलग ट्यूबलर कोशिकाओं में बहुतायत से व्यक्त किया गया था और नियंत्रण में एच-2 कोशिकाओं, प्रकाशित रिपोर्ट के साथ संगत26,27. दूसरी ओर, mesangial प्रोटीन Thy1 और मैक्रोफेज प्रोटीन F4/80 अलग ट्यूबलर कोशिकाओं और नियंत्रण एच-2 कोशिकाओं (चित्रा 2a) दोनों में अनुपस्थित थे । CD68 एच-2 कोशिकाओं में एक ंयूनतम अभिव्यक्ति और मार्ग 1 और मार्ग 2 पर पृथक ट्यूबलर कोशिकाओं में दिखाया गया है, और फिर अपनी अभिव्यक्ति 4 गद्यांश (चित्रा 2a) के माध्यम से 3 मार्ग से undetectable बन गया । परिणाम सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल के बाद अलग कोशिकाओं समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कोशिकाओं का मिश्रण कर रहे हैं । vivo मेंइन मार्कर प्रोटीन के भाव की तुलना करने के लिए, हम जमे हुए गुर्दे के ऊतकों में दाग प्रदर्शन किया । AQP1, AGT, और ई cadherin, और mesangial प्रोटीन Thy1 सहित ट्यूबलर मार्करों अत्यधिक एक जंगली प्रकार स्वस्थ माउस (चित्रा बी) से काटा गुर्दे में व्यक्त पाया गया । F4/80 और CD68 के कम भाव जंगली प्रकार के गुर्दे में मनाया लेकिन बड़े पैमाने पर एक Col4a3-/- माउस से काटा गुर्दे में व्यक्त किया गया है कि एक मैक्रोफेज घुसपैठ के साथ गुर्दे की विफलता विकसित20,31 ( चित्र 2c).

Mitochondrial पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं पर ऊर्जा की परख:
mitochondrial श्वसन परख कदम प्रोटोकॉल के खंड 5 में उल्लिखित है ऊपर वर्णित है ।

पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं के mitochondrial श्वसन अलग चढ़ाना घनत्व पर ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) के एक extracellular फ्लक्स विश्लेषण द्वारा मापा जाता है । चढ़ाना घनत्व अनुमापन करने के लिए, २०,०००, ३०,०००, और ४०,००० प्राथमिक TECs प्रति अच्छी तरह से एक ९६ पर वरीयता प्राप्त थे-अच्छी तरह से XF96 microplate पहले दिन (लगभग 20 पहले ज) extracellular फ्लक्स परख (3 ए आंकड़ा) । extracellular फ्लक्स विश्लेषण के बाद, ओसीआर माप तो Hoechst धुंधला के एक ठहराव से कोशिका गिनती करने के लिए सामान्यीकृत थे । २०,०००, ३०,००० पर TECs चढ़ाना, या ४०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से 25, ४५, या ५० pmol/मिनट के एक औसत बेसल ओसीआर के परिणामस्वरूप, क्रमशः (3 ए आंकड़ा) । इसके अलावा, मढ़वाया कोशिकाओं के सूक्ष्म छवियों से पता चला कि ४०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से अंय चढ़ाना घनत्व (चित्र बी) से बेहतर microplate कुओं के नीचे की पूरी सतह को कवर किया । हालांकि अधिक से अधिक ओसीआर ३०,००० कोशिकाओं के घनत्व की तुलना में ४०,००० कोशिकाओं का उपयोग नहीं बढ़ा था, हम चारों ओर ४०,००० कोशिकाओं के एक सेल घनत्व की सिफारिश/

इसके अलावा, हमारे प्रयोगों में, निरोधात्मक/unयुग्मक यौगिकों के इष्टतम एकाग्रता 1 µ एम oligomycin, 1 µ m FCCP, और 2 µ m रोटेनोन/antimycin-A (extracellular फ्लक्स परख और बंदरगाह इंजेक्शन के प्रोटोकॉल 1 तालिका में सूचीबद्ध है दिखाया गया था ; ऑप्टिमाइज़ेशन प्रयोग नहीं दिखाए जाते हैं). हालांकि, यह सभी उपयोगकर्ताओं के लिए सिफारिश की है इन यौगिकों के विभिंन सांद्रता के साथ एक प्रारंभिक परीक्षण चलाने के लिए, आदर्श रूप से कम और प्रकाशित मूल्यों की तुलना में अधिक है, के लिए सबसे अच्छा परिणाम वारंट ।

एक extracellular फ्लक्स परख गुर्दे TECs की ऊर्जा का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों के एक नंबर पैदावार । उदाहरण के लिए, फैटी एसिड ऑक्सीकरण के रूप में TECs में विशेष रूप से दोषपूर्ण हो दिखाया गया है, मीडिया का उपयोग फैटी एसिड सब्सट्रेट युक्त (palmitate) glycolysis के अवरोधक के साथ (2DG) सीधे TECs में फैटी एसिड ऑक्सीकरण का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं मार्ग 1 और 2 (चित्रा 3सी) पर । गुर्दे फाइब्रोसिस के मामले में, कोशिकाओं की समग्र श्वसन क्षमता एक स्वस्थ गुर्दे की तुलना में कम होने की उम्मीद है भले ही ग्लूकोज आधारित मीडिया के किसी भी मतभेद प्रकट नहीं हो सकता है.

एक साथ ले लिया, extracellular फ्लक्स परख, विशेष रूप से फैटी एसिड ऑक्सीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए एक जानकारीपूर्ण उपाय के रूप में उपयोग किया जा सकता है गुर्दे TECs की ऊर्जावान स्थिति का मूल्यांकन जिसमें रोग के परिवर्तन को प्रभावित करने के लिए एक खेल गुर्दे फाइब्रोसिस और गुर्दे की विफलता के लिए प्रगति में प्रमुख भूमिका ।

चरणों समय (min)
जांचना
Equilibrate: 00:12:00
माप 1 3 छोरों
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
एक बंदरगाह (1 माइक्रोन Oligomycin) इंजेक्षन 2 छोरों
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
बंदरगाह बी इंजेक्षन (1 माइक्रोन FCCP) 2 छोरों
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
इंजेक्षन बंदरगाह सी (2 माइक्रोन Rotenon/Antimycin) 2 छोरों
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00
मिश्रण 00:02:00
ज़रा रुको 00:02:00
उपाय 00:03:00

तालिका 1. मानकीकृत extracellular फ्लक्स प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं में इष्टतम ओसीआर माप के लिए प्रोटोकॉल चल रहा विश्लेषण.

Figure 1
चित्र 1. पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं की कोशिका संस्कृति । (क) पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं 1 दिन में जल्दी देते है और 5 दिन से दिन 3 से मजबूती से बढ़ती है । चित्र 10x और 20X उद्देश्यों के तहत लिया जाता है । (ख) यह पैनल 0 पारित करने के लिए 3 पारित करने से अलग प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं की एक उप संस्कृति से पता चलता है । चित्र सेल गुंबदों की दृष्टि के लिए 10x और 20X उद्देश्यों के तहत लिया जाता है, और मार्ग के माध्यम से रूपात्मक परिवर्तन की दृष्टि के लिए एक 40X उद्देश्य के तहत । scalebar = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2. पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं का लक्षण वर्णन । (एक) समीपस्थ ट्यूबलर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ Immunostaining (AQP1, AGT), एक बाहर ट्यूबलर प्रोटीन (ई-cadherin), एक उपकला प्रोटीन (SMA), एक mesangial प्रोटीन (Thy1), और मैक्रोफेज प्रोटीन (F4/80, CD68) बताते हैं कि पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं और बाद में उप संस्कृतियों शुद्ध समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कोशिकाओं रहे हैं । (ख) इस पैनल के एक सकारात्मक नियंत्रण और एक नहीं प्राथमिक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक स्वस्थ जंगली प्रकार माउस से समीपस्थ tubule, बाहर का tubule, और गुर्दे के ऊतकों में mesangial प्रोटीन के एक दाग से पता चलता है । (ग) इस पैनल एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक Col4a3-/- माउस से एकत्र गुर्दे के ऊतकों में मैक्रोफेज के प्रोटीन F4/80 और CD68 के एक दाग से पता चलता है । Scalebar = २० µm. DAPI नीले रंग में दिखाया गया है । मार्कर प्रोटीन हरे रंग में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. अलग चढ़ाना घनत्व पर पृथक प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं में Extracellular फ्लक्स परख । (क) सेलुलर चढ़ाना घनत्व में वृद्धि प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं में बेसल श्वसन के स्तर को बढ़ाता है, 3 बीतने पर परीक्षण किया । (ख) इस पैनल के प्राथमिक ट्यूबलर २०,०००, ३०,००० पर वरीयता प्राप्त एक XF96 microplate पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के सूक्ष्म छवियों से पता चलता है, और ४०,००० कोशिकाओं/ Scalebar = १०० µm. (ग) यह पैनल एक फैटी एसिड से पता चलता है-या ग्लूकोज-मार्ग 2 और 1 में प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं में extracellular प्रवाह परख आधारित है । डेटा ± SEM मतलब है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

हम एक प्रोटोकॉल है कि माउस गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (TECs) के कुशल अलगाव के लिए अनुमति देता है अनुकूलित और पता चला है कि कोशिकाओं को उप हो सकता है एक extracellular फ्लक्स विश्लेषण के लिए संस्कृति के लिए फैटी एसिड की उपस्थिति में mitochondrial श्वसन का मूल्यांकन- और/या ग्लूकोज आधारित सब्सट्रेट । इस प्रोटोकॉल दोनों समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित कर अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक रूपरेखा के साथ जो टेक विकृति से जुड़े गुर्दे की बीमारियों की समझ के लिए और अधिक जटिल प्रयोगों के निर्माण के लिए कार्य करता है । पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में9,10,19, इस विधि लंबे समय केंद्रापसारक समय या छंटाई के लिए एक पर्याप्त एंटीबॉडी उपयोग के साथ ढाल जुदाई की आवश्यकता नहीं है और इसलिए, एक अधिक प्रदान करता है गुर्दे ट्यूबलर चयापचय क्षेत्र में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए कुशल और अनुकूलित गाइड. इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, पाचन सहित, पुनः संग्रह, और चढ़ाना घनत्व और extracellular फ्लक्स परख के लिए यौगिक अनुकूलन ।

collagenase और इष्टतम एकाग्रता का सही प्रकार का चयन एक सफल पाचन और गुर्दे के ऊतकों से ट्यूबलर कोशिकाओं के पृथक्करण की कुंजी है । collagenases के अन्य प्रकारों की तुलना में, टाइप 2 collagenase को छेड़ने वाली गतिविधि के अपेक्षाकृत उच्च स्तर होते हैं, dissociating कॉम्पैक्ट गुर्दे संरचनाओं में सक्षम होते हैं । प्रदूषित होने की संभावना को कम करने के लिए एक लंबे समय तक छिड़काव और पाचन समय का एक परिणाम के रूप में, ०.०१३% प्रकार 2 collagenase पर perfused था 30 एमएल/ गुर्दे कैप्सूल केवल दोनों गुर्दे जानवर से काटा गया था और एक निष्फल सेल संस्कृति हुड में स्थानांतरित करने के बाद हटा दिया गया था । गुर्दे छोटे टुकड़ों में भरती किया गया और एक पूर्ण पाचन और ट्यूबलर कोशिकाओं के अधिक से अधिक रिहाई के लिए एक और 5 मिनट के लिए एक पाचन बफर के 10 मिलीलीटर के साथ उनकी गर्मी जारी रखा ।

हालांकि, पाचन के बाद, ऊतक निलंबन एक ७० के माध्यम से पारित कर दिया है-µm फिल्टर बहुत बड़े ऊतक टुकड़े को दूर करने के लिए, वहाँ अभी भी पच नलिकाओं कि फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं और सेल निलंबन के भीतर रहने और संस्कृति पकवान पर चढ़ाया जाना होगा. यह इन नलिकाओं के लिए सामांय से अधिक समय लगता है ट्यूबलर कोशिकाओं को जारी करने और संस्कृति पकवान को मजबूती से देते हैं । इसलिए, यह बजाय सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस सेल चढ़ाना के बाद unattached नलिकाओं और कोशिकाओं दूसरे दिन गोली करने के लिए केंद्रापसारक । यह कम गति के केंद्रापसारक कदम आगे अंय कोशिका प्रकार है कि ट्यूबलर कोशिकाओं की तुलना में हल्का कर रहे है और unattached नलिकाओं और ट्यूबलर कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है निकालता है ।

उचित कोशिका घनत्व की पहचान एक सफल extracellular फ्लक्स परख के लिए पहला और महत्वपूर्ण कदम है । परिणाम से पता चला है कि एक XF96 microplate पर अच्छी तरह से प्रति ४०,००० कोशिकाओं दोनों एक फैटी एसिड में प्राथमिक ट्यूबलर कोशिकाओं के लिए आदर्श है और एक ग्लूकोज आधारित श्वसन परख (3 सी आंकड़ा) । इस प्रोटोकॉल में, पृथक ट्यूबलर कोशिकाओं extracellular फ्लक्स परख के लिए मार्ग 1 और 2 में इस्तेमाल किया गया । कोशिकाओं उप-3 बीतने के लिए संस्कृति, हालांकि वे ट्यूबलर मार्करों की अभिव्यक्ति बनाए रखा (चित्रा 2) और एक सभ्य प्रदर्शन में ऊर्जा की परख (3 ए आंकड़ा), और दिखाया कम बेसल श्वसन स्तर की तुलना में 2 पारित करने के लिए (चित्रा 3 सी के rightmost पैनलों में ओसीआर की तुलना करके दिखाया गया है) । इस कमी काफी स्वस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं को प्रभावित नहीं कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, लोगों को युवा जंगली प्रकार चूहों से अलग). हालांकि, सीकेडी माउस मॉडल है कि पहले से ही एक कम mitochondrial श्वसन, कोशिकाओं के उच्च मार्ग है से पृथक कोशिकाओं पर अध्ययन के लिए बेसल श्वसन जो extracellular फ्लक्स परख के परिणामों को प्रभावित करेगा में एक और कमी का कारण हो सकता है । यहां किए गए अध्ययनों में, दोनों मार्ग 1 और मार्ग 2 से कोशिकाओं उच्च बेसल श्वसन स्तर दिखाया । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के बाद, हम दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त पशुओं से पृथक कोशिकाओं के साथ mitochondrial श्वसन अध्ययन के लिए इन दो प्रारंभिक मार्ग का उपयोग करने की सलाह देते हैं । 2 पारित होने से कोशिकाओं को अभी भी ध्यान में रखा जाना चाहिए अगर पारित 1 उप संस्कृति प्रवाह परख के लिए पर्याप्त कोशिकाओं उपज नहीं है । इस अध्ययन के अलावा, हमारे पिछले अनुसंधान से पता चलता है कि 3 गद्यांश में प्राथमिक TECs प्रोटीन और आरएनए अध्ययन के बाद यौगिकों के साथ उपचार के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है (दिखाया नहीं डेटा). यह कहा जा रहा है, हमारा सुझाव है कि जांचकर्ताओं इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने ट्यूबलर कोशिकाओं को अलग सावधानी से विभिंन अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम मार्ग चुनना चाहिए ।

extracellular फ्लक्स विश्लेषण के कार्य सिद्धांत इंजेक्शन यौगिकों और श्वसन श्रृंखला परिसरों और unयुग्मक के प्रभाव के बीच बातचीत पर आधारित है । । Oligomycin परिसर वी (एटीपी सिंथेस) के एक अवरोधक है और एटीपी से जुड़े ऑक्सीजन की खपत और ऑक्सीजन की खपत है कि एक mitochondrial भीतरी झिल्ली३२भर में नियमित रूप से प्रोटॉन रिसाव को दूर करने के लिए आवश्यक है भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है । FCCP से mitochondrial झिल्ली की क्षमता में खलल पड़ने से एटीपी प्रोडक्शन से आक्सीजन की खपत होती है । इस प्रकार, यह अधिक से अधिक श्वसन क्षमता का माप प्रदान करता है क्योंकि यह एटीपी सिंथेस द्वारा एक प्रोटॉन आयन समाप्ति की सीमित क्षमता को झिल्ली के माध्यम से एक प्रोटॉन परिवहन की अनुमति देकर दरकिनार कर देता है । Antimycin-ए, एक जटिल III अवरोध करनेवाला, और रोटेनोन, एक जटिल मैं अवरोधक, संयोजन में प्रयोग किया जाता है नीचे पूरे mitochondrial श्वसन mitochondrial बनाम गैर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत के बीच एक भेदभाव की अनुमति बंद कोशिकाओं । इन यौगिकों हमेशा extracellular फ्लक्स परख से पहले एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए titrated होना चाहिए इष्टतम सांद्रता कि उपज इष्टतम ओसीआर घटता निर्धारित करने के लिए । यहां, हम oligomycin के 1 µ m, FCCP के 1 µ m, और µ/रोटेनोन के 2 antimycin मीटर प्राथमिक extracellular पर TECs फ्लक्स परख के लिए सलाह देते हैं ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल mitochondrial पूर्व vivoका आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि गुर्दे प्राथमिक समीपस्थ और बाहर ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है. हालांकि इस प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के जैविक समारोह की खोज अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोगी हो सकता है, हम अपनी सीमाओं को स्वीकार जब यह शुद्ध समीपस्थ या बाहर नलिकाओं की जरूरत अध्ययन करने के लिए आवेदन । उदाहरण के लिए, लोव सिंड्रोम पर अध्ययन, एक चयनात्मक समीपस्थ ट्यूबलर रोग३३, या बाहर गुर्दे ट्यूबलर दाखवते पर अध्ययन, एक बाहर ट्यूबलर रोग३४, सेल अलगाव के लिए एक और अधिक परिष्कृत प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी और शोधन. हालांकि, अध्ययन है कि नलिकाओं बनाम glomeruli की तुलना के बहुमत के लिए, और अध्ययन के लिए सामांय में ट्यूबलर कोशिकाओं में संभावित mitochondrial श्वसन नियामकों स्क्रीन करने के लिए, प्रोटोकॉल एक व्यवहार्य उच्च प्रवाह दृष्टिकोण प्रदान करता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल mitochondrial दवा खोज या लक्ष्य सत्यापन प्रयोजनों के लिए गुर्दे विकारों के साथ जुड़े रोग का अध्ययन करने के लिए व्यापक अनुप्रयोगों हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के लिए निंनलिखित अनुदान द्वारा समर्थित था लीना Shehadeh: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R56HL132209 और 1R01HL140468) और मियामी हार्ट रिसर्च इंस्टीट्यूट ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I Rat Protein, Tail ThermoFisher Scientific A1048301
Acetic Acid J.T.Baker 9508
Collagenase Type II Worthington LS004176
PBS Sigma D8537
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit PromoCell C-26130
2-Deoxy glucose Sigma D6134
Glucose Sigma G8270
L-Carnitine Sigma C0283
Etomoxir Sigma E-1905
Oligomycin Sigma 75351
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Rotenone Sigma R8875
Antimycin-A Sigma A8674
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Sodium palmitate Sigma P9767
NaCl Sigma S7653
Sodium pyruvate Sigma P5280
L-Glutamine 200mM solution Sigma G7513
DMEM powder Sigma D5030-1L
Hoechst 33342 LifeTechnologies H3570
Trypan Blue Staining (0.4%) LifeTechnologies T10282
Counting Slides Bio-Rad 145-0011
Micro Dissecting Forceps Roboz RS-5101
TC10 automated cell counter Bio-Rad 506BR2119
MINIPULS 3 Peristaltic Pump Gilson Inc. GM3P
Seahorse XFe96 Analyzer Seahorse Bioscience S7800A
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) Seahorse Bioscience 10260-100

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जीव विज्ञान अंक १३६ प्राथमिक कोशिका अलगाव प्राथमिक सेल लक्षण वर्णन ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं गुर्दे जैव ऊर्जा mitochondria श्वसन उच्च प्रवाह extracellular फ्लक्स विश्लेषण फैटी एसिड ऑक्सीकरण क्रोनिक गुर्दे की बीमारी
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Ding, W., Yousefi, K., Shehadeh, L.… More

Ding, W., Yousefi, K., Shehadeh, L. A. Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (136), e57718, doi:10.3791/57718 (2018).

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