Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering og karakterisering høy gjennomstrømning ekstracellulære Flux analyse av musen primære nyre rørformede epitelceller

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3,4,5
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Interdisciplinary Stem Cell Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Vascular Biology Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

Summary

Denne protokollen gir en kostnadseffektiv tilnærming for å isolere og karakterisere musen primære nyre rørformede celler som kan senere sub kultivert for å vurdere nyre biologiske funksjoner ex vivo, inkludert mitokondrie bioenergi.

Abstract

Mitokondrielt dysfunksjon i nyre rørformede epitelceller (TECs) kan føre til nedsatt fibrosis, en viktig årsak til kronisk nyresykdom (Parallelt). Derfor kan vurdere mitokondrie funksjon i primære TECs gi verdifull innsikt i bioenergetisk status av celler, gir innsikt i Patofysiologien ved Parallelt. Det finnes en rekke komplekse protokoller tilgjengelig for isolasjon og rensing av proksimale tubules i ulike arter, mangler feltet en kostnadseffektiv metode optimalisert for rørformede cellen aisolering uten behov for rensing. Her gir vi en isolasjon protokoll som tillater studier med fokus på både primær mus proksimale og distale nyre TECs. Kostnadseffektiv reagenser og minimal animal prosedyrer i denne protokollen, isolerte cellene opprettholde høyt energinivå etter isolasjon og kan være sub kulturperler opptil fire passasjer, muliggjør kontinuerlig studier. Videre vurderer bruker en høy gjennomstrømning ekstracellulære flux analysator, vi mitokondrie åndedrett direkte i de isolerte TECs i en 96-brønns plate som vi gir anbefalinger for optimalisering av cellen tetthet og sammensatte konsentrasjon. Disse observasjonene foreslår at denne protokollen kan bli brukt for nyre rørformede ex vivo studier ved konsekvent, godt standardisert produksjon av nyre TECs. Denne protokollen må bredere framtidige applikasjoner å studere mitokondrie dysfunksjon knyttet renal lidelser for medisiner eller narkotika karakterisering formål.

Introduction

Nyre rørformede tarmepitelet (TEC) funksjonen er sterkt assosiert med den generelle helsetilstanden av nyret. Patologisk signalering i nyrene fører til dedifferentiation av TECs, som spiller en viktig rolle i nyre fibrose og kroniske nyre sykdom (Parallelt)1,2. Som en svært energiske orgel er nyre andre bare til hjertet i oksygenforbruk, primært gjennom mitokondrie oxidative fosforylering3. Elektronmikroskop studier har vist en positiv korrelasjon for mitokondrie morfologiske patologisk hendelser i nyre tubuli4. Mitokondrielt dysfunksjon i TECs fører til nyre fibrose gjennom epithelial til mesenchymal overgang5 og defekt fettsyrer oksidasjon6. Fibrose er en progressiv nyre patologi som fører til Parallelt. Forstå statusen energisk for nyre TECs er derfor en nødvendighet å avdekke i Patofysiologien ved Parallelt.

Det er > 20 celletyper i voksen nyre7. For å studere funksjonen i TECs, er en primær kultur for nyre epitelceller nødvendig som en plattform for molekylærbiologi programmer som kjemiske behandlinger og genetisk manipulasjon. Viktigere, kan genetisk manipulasjon gjøres i vivo i mus via transgenesis eller bruker AAV gen levering teknikker8 slik at isolert primære cellene ville allerede være genetisk manipulerte. Isolasjon av primære nyre rørformede celler fra mus9,10, rotter11,12,13, hjørnetann14, kanin15,16og mennesker17 ,18 har blitt rapportert med rensing skritt å gi ren proksimale rørformede celler. I disse publisert tidligere protokoller som fokuserer på isolasjon av proksimale rørformede celler ble gradient sentrifugering og sortering eksperimenter utført for rensing formål19. Mens disse protokollene er verdifulle for å studere proksimale tubuli, er de ikke nok når både proksimale og distale tubuli trengs å bli undersøkt. For eksempel har vår studie for Alport syndromet avdekket at både proksimale og distale nyre tubuli spille viktige roller i sykdom progresjon20, og derfor begge typer på nyre tubuli bør utredes kultur. En fersk studie på nyre fluor toksisitet viste også at patologiske forandringer fant sted i begge proksimale og distale tubuli21. Derfor er denne isolasjon protokollen utformet og optimalisert for både proksimale og distale rørformede celler fra musen nyrer med en minimal reagenser og enkle prosedyrer. Etterforskerne kan eventuelt fortsatt følger protokollen til trinn 3.1 og legge rensing trinn9 fra dette tidspunktet for isolering av ren proksimale rørformede celler.

Isolert cellene presenterer høye energisk nivåer og opprettholde nyre epithelial egenskaper etter sub-kulturer til 4 passasjer. Bruker en høy gjennomstrømning ekstracellulære flux analysator, vurderer vi mitokondrie åndedrett direkte i de isolerte TECs i en 96-brønns plate, som fører til ytterligere innsikt i cellen tetthet optimalisering. Disse observasjonene foreslår at denne protokollen kan brukes til nedsatt tubulær ex vivo studier ved konsekvent, godt standardisert produksjon av nyre TECs. En ekstra betydningen av denne protokollen er mulig bruk som en høy gjennomstrømning verktøy for ex vivo karakterisering av mitokondrie bioenergi i nyre proksimale og distale rørformede celler. Derfor kan det tjene som en plattform for medisiner eller narkotika karakterisering formål renal lidelser.

Protocol

Alle eksperimenter som involverer dyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Universitetet i Miami, til NIH retningslinjer.

1. plate belegg og forberedelse av reagenser

  1. Forbered kollagen belegg:
    1. Tilsett 35 μL av kollagen I til 2 mL av en pre-filtrerte 20 mM eddiksyre løsning på 60mm Petri hovedrett. Inkuber det ved romtemperatur 1t, air-dry den og utsette det for UV.
    2. Vask belegget 3 x med PBS fjerne noen syre rester og lagre det i en 37 ° C CO2-friplass kultur inkubator til cellene er klar for såing. Siste konsentrasjonen av kollagen belegget er 5 μg/cm2.
  2. Forberede perfusjon buffer: legger 300 μL penicillin-streptomycin (P/S) til 30 mL av PBS og varm blandingen i et vannbad 37 ° C til isolasjon begynner.
  3. Forberede fordøyelsen buffer: oppløse 3,9 mg collagenase type 2 til 30 mL av PBS, filtrere løsningen gjennom et 0,2-μm plastflaske-top filter og varme den opp i et vannbad på 37 ° C til isolasjon begynner.
  4. Forbered celle kultur medier:
    1. Ta kosttilskudd til romtemperatur. Uten filtrering, legge tillegget (0,05 mL av fetal kalv serum, 10 ng/mL av epidermal vekstfaktor, 5 μg/mL av insulin, 0,5 μg/mL adrenalin, 36 ng/mL hydrocortisone, 5 μg/mL av transferrin og 4 pg/mL av triiodo-L-thyronine) til den 500 mL nyre epitel celle vekst basale medium 2.
    2. Varm opp media i et vannbad for 37 ° C før det er klart til bruk.
  5. Forberede forbindelser: forberede 50 mM FCCP, 10 mM rotenon, 10 mM oligomycin, 10 mM antimycin A, 50 mM L-carnitine, 50 mM etomoxir lager løsninger i DMSO, aliquot dem og lagre forbindelsene på 20 ° C.
  6. Forberede 2,5 natrium palmitate i 220 mL av en 150 mM NaCl løsning og varme løsningen opp i et vannbad 75 ° C til palmitate er fullstendig oppløst.
  7. Forberede bovin serum albumin (BSA): forberede 0.34 mM fettfri BSA i 250 mL 150 mm NaCl. Kontrollen BSA fungerer som en negativ kontroll for palm-BSA løsningen kan tilberedes ved å følge trinn 1.8.
  8. Bøy palmitate til BSA (Palm-BSA):
    1. Sammenlegge palmitate løsningen gradvis i BSA løsningen mens det er fortsatt varmt. Deretter justere pH 7,4 og bland dem ved 37 ° C i minst 1 time å fullføre Bøyning.
    2. Når Bøyning er fullført, legge en annen 150 mL 150 mM NaCl til løsningen, bland det godt og lagre dele på 20 ° C. Den endelige løsningen inneholder 1 mM natrium palmitate og 0,17 mM BSA og brukes som en fettsyre substrat for celler i en fatty acid-baserte ekstracellulære flux analysen.
  9. Forbered ekstracellulære flux analysen basale media:
    1. Legg 1 pose DMEM pulver og 20 mL 200 mM L-glutamin (4 mM endelige) til 1 L autoklaveres dH2O og bland dem forsiktig.
    2. På dagen for bioenergi eksperimentet, legge til 100 µM natrium pyruvate forberedt basale media for påfølgende preparater ekstracellulære flux analysen medier i en glukose- eller fettsyrer - basert åndedrett analysen.
  10. Forbered glukose-baserte medier:
    1. For å måle cellular respirasjon kapasitet gjennom Glykolysen, legge 17,5 mM glukose pulver, 100 µM kontroll BSA (som beskrevet i trinn 1.7) og 20 µM etomoxir (å hemme fettsyrer oksidasjon) til basale media beskrevet ovenfor i trinn 1.9.
    2. Varme opp media på 37 ° C, justere pH 7,4 og holde det i vannbad 37 ° C før den brukes i ekstracellulære flux analysen.
  11. Forbered fatty acid-baserte medier:
    1. For å måle cellular respirasjon kapasitet gjennom fettsyrer oksidering, legge 10 mM 2D-glukose pulver (glukose analoge å hemme Glykolysen), 100 µM Palm-BSA (som beskrevet i trinn 1.8) og 100 µM L-carnitine til basale media beskrevet ovenfor i trinn 1.9.
    2. Varme opp media på 37 ° C, justere pH 7,4 og holde den i vannbad 37 ° C før den brukes i ekstracellulære flux analysen.

2. perfusjon, fordøyelse og høsting nyrer fra mus

  1. Bedøve musen med en isoflurane flyt og fastsette den i supine posisjon. Kontroller isolasjon begynner bare etter dyret mister sin rettende reflekser og bedøvende dybden overvåkes av knipe vurderinger bruker atraumatiske tang før og under prosedyren22.
  2. Fjerne pels, ved hjelp av en depilatory fløte, musen er brystet til sin mageområdet, Desinfiser det med jod og tørk jod rester.
  3. Gjøre et snitt i brystet, kutt huden for å åpne hele mageområdet og utsette hjerte og nyrer.
  4. Sette opp en perfusjonsmåling pumpe på 32 mL/min og fjern bobler slangen før perfusjonen.
  5. Sette inn en 27-G-p i venstre ventrikkel gjennom hjertet toppen så snart bufferen fylles opp hjertet og rote høyre atrium for å skape en exit så perfusjon bufferen sirkulerer som hjertet pumper og til slutt blir fjernet fra avkjørselen høyre atrium.
  6. Etter perfusjon, bytte pumpen fart til 30 mL/min for fordøyelsen.
  7. Etter 20 mL fordøyelsen bufferen er perfused gjennom toppen, fjerne begge nyrene for rørformede celle isolasjon.

3. vev behandling og primær rørformede celler isolasjon

  1. Fjerne nyre kapsler og marg, hakke både nyrene i små biter og ruge dem i 10 mL av fordøyelsen buffer i en 37 ° C ovnen med mild rotasjon i 5 min.
  2. Fjern alle ufordøyd nyre vev av bufferen passerer et 70-μm filter. Legge til 10 mL av kultur medier å stoppe fordøyelsen.
  3. For å samle rørformede celler, sentrifuge filtrerte celle suspensjon 50 x g i 5 min å samle det første pellet. Overføre nedbryting til en ny tube og legge 5 mL av kultur medier, sentrifuger det 50 x g i 5 min å sikre alle rørformede celler er samlet inn i det andre pellet.
    Sentrifugering er med en lavere hastighet til primært pellets tunge tubuli. Senere, når cellene gjenopprette fra isolasjon, er ren rørformede kulturen centrifuged på en høyere hastighet under sub-kulturer.
  4. Resuspend den første pellet i 20 mL kultur medier og sentrifuge det 50 x g i 5 min å samle det tredje pellet.
  5. Resuspend andre og tredje pellets i 1 mL av kultur medier. Bland 10 µL av cellen suspensjon med 10 µL Trypan blå, legg blandingen i kammeret A til en telling lysbildet og post celle levedyktigheten fra automatisk celle counter (se Tabell for materiale).
  6. Frø til 107 celler (en heterogen befolkning) på 60 mm hovedrett pre-belagt med kollagen og la rørformede cellene knytte overnatting.

4. primære rørformede celler sub-kultur og karakterisering

  1. På dag 1 etter isolasjon, samle kultur medier og sentrifuge det 50 x g for 5 min til pellets alle flytende tubuli. Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 4 mL av fersk kultur medier og plate den tilbake til den samme kultur parabolen.
  2. På dag 4 etter isolasjon, fjerner gamle kultur media og legge frisk media.
  3. På dag 7 etter isolasjon, koble cellene av rugende dem på 37 ° C i 2 mL 0,25% trypsin-EDTA for 5 min. legge 3 mL kultur medier å stoppe reaksjonen og samle celler med sentrifugering 250 x g i 5 min.
  4. Sub kultur og karakteriserer cellene fra P0 P1, belagt frø 5000 celler per brønn på en 24-vel plate med kollagen jeg som beskrevet ovenfor.
  5. 24 timer etter trinn 4.4, fikse cellene på P1 med 4% PFA for 10 min, permeabilize dem med 0,2% Triton X-100 for 3 min, og blokkerer dem med 10% esel serum (DS) 1t ved romtemperatur.
  6. Fortynne, til 1: 100 i 10% DS, hver av følgende proteiner: den proksimale rørformede markører angiotensinogen (AGT) og aquaporin 1 (AQP1); den distale rørformede markøren E-cadherin; mesangial merket CD90/Thy1; og macrophage markører EGF-lignende modulen som inneholder mucin-lignende hormonet reseptor-1 (F4/80) og cluster for differensiering 68 (CD68), og ruge dem med celler overnatting på 4 ° C.
  7. Neste dag, oppdage noen flekker bruker 1:200 anti-kanin, anti-mus eller anti-rotte fluorescerende sekundære antistoffer i 45 minutter. Ta bilder under AC confocal mikroskopi å bekrefte uttrykk for markører, som vist i figur 2A.
  8. Dag 3 etter sub kultur P1, koble celler for en sub-kultur og karakterisering på P2 av en flekk av rørformede mesangial og macrophage markører beskrevet i trinn 4.5. Bildet flekker under AC confocal mikroskopi å bekrefte uttrykk for markører, som vist i figur 2A.
  9. Dag 3 etter sub kultur P2, koble celler for en sub-kultur og karakterisering på P3 av en flekk av rørformede mesangial og macrophage markører beskrevet i trinn 4.5. Bildet flekker under AC confocal mikroskopi å bekrefte uttrykk for markører, som vist i figur 2A.
  10. Forberede den vev flekker:
    1. Air-Dry frosne vill-type og Col4a3- / - nyre lysbilder 1t ved romtemperatur og fikse dem med 4% PFA for 10 min. Permeabilize dem med 0,2% Triton X-100 på 10 min og blokkerer dem med 10% esel serum (DS) 1t ved romtemperatur. Legg antistoffer mot markør proteiner beskrevet i trinn 4.5 på 1:200 og ruge dem på 4 ° C over natten.
    2. Neste dag, oppdage noen flekker med 1:200 anti-kanin, anti-mus eller anti-rotte fluorescerende sekundære antistoffer i 45 minutter. Ta bilder under AC confocal mikroskop å bekrefte uttrykk for markører, som vist i tall 2B og 2 C.

5. mitokondrier bioenergi analysen

  1. Frø P1 rørformede cellene på 20.000, 30.000 eller 40.000 celler per brønn i 100 μL kultur medier på en 96-brønnen microplate pre-belagt med 5 μg/cm2 kollagen jeg dagen før de ekstracellulære flux analyser.
  2. Hydrering av sensoren kassetten, løfte sensor kassetten og fyll hver brønn av platen med 200 μL av en kalibrering løsning. Nøye laste kassetten tilbake å senke sensorene i kalibrering løsningen. Sett kassetten i 37 ° C ovn uten CO2 for minst 7 h før bruk.
    Overnatting patron hydration anbefales for de beste resultatene.
  3. Forberede forbindelser: forberede 8 µM oligomycin, 9 µM FCCP og 20 µM rotenon/antimycin A blandingen i både glukose (beskrevet i trinn 1,10) og fettsyrer (beskrevet i trinn 1,11) ekstracellulære flux analysen media.
  4. Endre media: Sug opp cellen kultur media, legge til 175 µL glukose eller fettsyrer analysen medier (avhengig av sammensatt som blir jobbet, se trinn 5.3), og Inkuber dem 1t i en 37 ° C CO2-gratis inkubator.
  5. Laste inn kassetten portene 25 µL av de følgende forbindelsene: 8 μM oligomycin for porten A å oppnå en siste konsentrasjon på 1 µM (Merk: som hver vil også inneholde 175 µL av media, sammensatte får utvannet 8 x), 9 μM FCCP port B å oppnå en siste konsentrasjon av 1 µM (Merk: som hver vil også inneholde 175 µL av media pluss 25 µL av løsningen injiseres fra port A, sammensatte får utvannet 9 x), og 20 µM rotenon/antimycin A i port C for å oppnå en siste konsentrasjon av 2 µM for hver sammensatte (Merk : som hver vil også inneholde 175 µL av media pluss 50 µL av løsningen injiseres fra porter A og B, sammensatte får utvannet 10 x).
  6. Tilsett vann til alle brønner i port D og alle andre porter av bakgrunn (ingen celler). Inkuber kassetten i en 37 ° C CO2-gratis inkubator for 10 min.
  7. Slå på den ekstracellulære flux analyzer og kontrolleren.
  8. Åpne Analyzer programvare og inndata følgende protokollen:
    1. Velg Standard analysen. Trykk analysen veiviseren. Bruke kategorien forbindelser , tilordne sammensatte oppsettet og bruker kategorien grupper og etiketter til å merke eksperimentelle gruppene. Husk å tilordne tom brønnene (uten celler) som bakgrunn.
    2. Angi følgende blanding og måle sykluser bruke de tilgjengelige kommandoene som vist i tabell 1under kategorien protokollen : kalibrere, blanding i 2 minutter, vente i 2 minutter, og etter 3 min (gjenta denne syklusen 2-3 x); injisere port A, blanding i 2 minutter, vente i 2 minutter, etter 3 min (gjenta denne syklusen 2-3 x); injisere port B, blande i 2 minutter, vente i 2 minutter, etter 3 min (gjenta denne syklusen 2-3 x); injisere port C, blande i 2 minutter, vente i 2 minutter, etter 3 min (gjenta denne syklusen 2-3 x). Trykk End veiviseren. Det er også mulig å lagre gjeldende mal for fremtidig bruk.
    3. Trykk Start for å starte kalibrering. Analyserer deretter automatisk løser ut platen holderen og ber om patron platen settes.
  9. Når kalibreringstrinnet er gjort (vanligvis i 20-25 minutter), trykker du kommandoen spørsmål å bytte patron plate til celle plate og Fortsett.
  10. Når kjøringen er fullført, overføre dataene og fjerne 96-brønns platen. Legg Hoechst (1:1, 000) til hver av analysen og ruge dem i 5 min på 37 ° C. Normalisere OCR dataene celletall av en måling av Hoechst fluorescens lesing på en 355-nm eksitasjon og en 460-nm utslipp.

Representative Results

Nyre Perfusion og fordøyelsen gir svært levedyktig rørformede epitelceller:
Mus nyre rørformede epitelceller ble isolert følge fremgangsmåten i delene 1-3 av protokollen beskrevet ovenfor.

Etter digestions, en heterogen befolkning nyreceller, ufullstendig fordøyd tubuli og annet vev rusk som er mindre enn 70 µm var belagt på kultur parabol på isolasjon dag. Endringer fra dag 0 dag 1 etter isolasjon er vanligvis forventet å bli sett bare i cellen vedlegget i stedet for celle-vekst. Ser gjennom den flytende heterogene befolkningen, var bare noen få rørformede celler festet på dag 1 (figur 1A). En ny samling av cellene på dag 1, en sentrifugering og et nytt plating hjalp fjerne lys rusk og bosette lite tubule bitene for rørformede cellen-versjonen. Fra dag 1 dag 3 ventet endringer ikke bare i et bedre celle vedlegg, men også i en bemerkelsesverdig forbedret celle vekst som ble observert med en tredoblet celle tetthet i forhold til dag 1 (figur 1A). I den opprinnelige vekst fasen, cellene dannet flere kolonier og befolket rundt koloniene. Fra dette punktet fremover, isolerte cellene gjenvunnet fullt og vises en sunn spredning. Dag 5 var cellene en 80-90% confluency i en 60 mm Petriskål noen mellomrom mellom celle til celle og koloni til koloni (figur 1A).

Sub-kultur og karakterisering av isolerte rørformede cellene:
De isolerte nyre rørformede epitelceller var sub kultivert for en karakterisering følge trinnene beskrevet i § 4 av protokollen beskrevet ovenfor.

Fra dag 5, cellene fullt utvinnes fra isolasjon og begynte å spre kraftig. En uke etter isolasjon, vokste cellene til confluency i en 60 mm Petriskål. Etter 1 uke i en kultur på passage 0 var cellene klar å være sub kulturperler til passering 1 og deretter for 2 mer passasjer. Lignende vekst mønstrene ble observert i passering 1 og passasje 2. Vanligvis tar det mindre enn en uke for cellene på passering 1 og 2 å vokse til confluency for videre sub kulturer (figur 1B). Kontinuerlig kultur confluent celler fra passasje 0 til passering 2 viste en omfattende dome formasjon23,24 (figur 1B), tyder på at isolert cellene opprettholdt en sunn status hvor de utskilles væsker lignende til i vivo status. Dette førte til monolayer i cellene av platen, men holde kontakten via stramt veikryss.

Betegner cellene i kulturen, utført vi immunofluorescent flekker i kulturperler cellene fra passering 1 gjennom passasjen 4 og en kontroll cellen linje-menneskelige proksimale nyre HK-2 epitelceller. Proksimale rørformede markører, aquaporin 1 (AQP1)25 og angiotensinogen (AGT)9, distale rørformede markør E-cadherin25, den epithelial markør glatt muskel utgangen (SMA)26,27,28, macrophage markører F4/8029 og CD6830og mesangial markør thymocyte differensiering antigen 1 (Thy1/CD90)9 ble brukt for karakterisering studiene. Begge proksimale rørformede proteiner AQP1 og AGT ble konsekvent svært uttrykt i isolerte rørformede cellene fra passasje 1 til passering 4 så vel som positive kontroll HK-2 proksimale epitelceller (figur 2A). Det distale rørformede proteinet E-cadherin ble uttrykt i isolerte rørformede cellene gjennom passasjen 4 og ble også observert i HK-2-celler (figur 2A). SMA ble uttrykt helt isolert rørformede cellene og kontroll HK-2 celler, samsvar med publiserte rapporter26,27. På den annen side, mesangial protein Thy1 og macrophage protein F4/80 var fraværende i isolerte rørformede cellene og kontroll HK-2 cellene (figur 2A). CD68 viste et minimalt uttrykk i HK-2-celler og isolert rørformede cellene på passering 1 og passasje 2 og deretter uttrykket ble undetectable fra passering 3 gjennom passasjen 4 (figur 2A). Resultatene tyder på at cellene isolert etter denne protokollen er en blanding av proksimale og distale rørformede celler. Hvis du vil sammenligne av disse markør proteiner i vivo, utført vi flekker i frosne nyre vev. Rørformede markører, inkludert AQP1, AGT, og E-cadherin og mesangial protein Thy1 fant svært uttrykt i nyrene høstet fra en vill-type sunne mus (figur 2B). Lav uttrykk for F4/80 og CD68 ble observert i vill-type nyrer men mye uttrykt i nyrene høstet fra en Col4a3- / - mus som utviklet nyresvikt med en macrophage infiltrasjon20,31 ( Figur 2C).

Mitokondrielt bioenergi analysen på isolerte primære rørformede celler:
Mitokondrielt åndedrett analysen fremgangsmåten er beskrevet i del 5 av protokollen beskrevet ovenfor.

Mitokondrielt åndedrett av isolerte primære rørformede celler er målt ved en ekstracellulære flux analyse av oksygen forbruksraten (OCR) på forskjellige plating tettheter. For å sjarmere plating tetthet, 20.000 og 30.000 40.000 primære TECs per brønn var frø til en 96-brønnen XF96 microplate dagen før (ca 20 h før) ekstracellulære flux analysen (figur 3A). Etter den ekstracellulære flux analysen, OCR målinger ble deretter normalisert til celletall av en kvantifisering av Hoechst flekker. Plating TECs på 20.000, 30.000 eller 40.000 celler/vel resulterte i en gjennomsnittlig basale OCR 25, 45 eller 50 pmol/min, henholdsvis (figur 3A). Videre avslørte mikroskopiske bilder av belagt cellene at 40.000 celler/godt dekket hele overflaten av bunnen av microplate bedre enn de andre plating tettheter (figur 3B). Selv om maksimal OCR ikke økte benytter 40000 celler sammenlignet tettheten av 30.000 celler, anbefaler vi en celle tetthet av rundt 40 000 celler/godt for optimalt interaksjoner mellom celler og forbindelser.

Videre i våre eksperimenter viste optimal konsentrasjon av hemmende/uncoupler forbindelser seg å være 1 µM oligomycin, 1 µM FCCP og 2 µM rotenon/antimycin-A (protokoller av ekstracellulære flux analysen og port injeksjoner er oppført i tabell 1 ; optimalisering eksperimenter vises ikke). Men anbefales for alle brukere å kjøre en foreløpig test med ulike konsentrasjoner av disse forbindelsene, ideelt lavere og høyere enn de publiserte verdiene, garanterer de beste resultatene.

Ekstracellulære flux analysen gir en rekke viktige parametere for å vurdere bioenergi av nyre TECs. For eksempel, som fettsyrer oksidasjon er vist å være spesielt defekt i TECs, kan bruk av mediet som inneholder fettsyrer substrat (palmitate) sammen med inhibitor av Glykolysen (2 DG) tjene som en nyttig verktøyet å evaluere direkte fettsyrer oksidasjon i TECs på passasjer 1 og 2 (Figur 3 c). I nyre fibrose forventes den samlede åndedrett kapasiteten til cellene å bli lavere enn for en sunn nyre selv om glukose-basert media ikke kan avsløre noen forskjeller.

Samlet ekstracellulære flux analysen, spesielt å vurdere fettsyrer oksidasjon kapasiteten, kan benyttes som en informativ tiltak for å vurdere energisk status for nyre TECs der patologisk endringer påvirker bioenergi profil stykket en viktig rolle i nyre fibrose og fremdriften til nyresvikt.

Trinn Tid (min)
Kalibrere
Equilibrate: 00:12:00
Måling 1 3 løkker
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Injisere Port en (1 μM Oligomycin) 2 løkker
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Injisere Port B (1 μM FCCP) 2 løkker
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Injisere Port C (2 μM Rotenon/Antimycin) 2 løkker
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00
Mix 00:02:00
vent 00:02:00
Mål 00:03:00

Tabell 1. Standardisert ekstracellulære flux analyse kjører protokollen for optimale OCR-målinger i primære rørformede celler.

Figure 1
Figur 1. Celle kultur isolert primære rørformede celler. (A) isolert primære rørformede cellene knytte tidlig på dag 1 og vokse robust fra dag 3 dag 5. Bildene er tatt under 10 X og 20 X mål. (B) dette panelet viser en sub kultur for isolert primære rørformede celler fra passasje 0 til passering 3. Bildene er tatt under 10 X og 20 X mål for visjoner av cellen kupler og under et 40 X mål for en visjon av de morfologiske endringene gjennom passasjer. Scalebar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Karakteristikk av isolerte primære rørformede celler. (A) Immunostaining med antistoffer mot proksimale rørformede proteiner (AQP1, AGT), et distale rørformede protein (E-cadherin), en epithelial protein (SMA), en mesangial protein (Thy1) og macrophage proteiner (F4/80, CD68) viser at den isolerte primært rørformede celler og påfølgende sub-kulturer er ren proksimale og distale rørformede celler. (B) dette panelet viser en flekk av proksimale tubule, distale tubule og mesangial proteiner i nyre vev fra en sunn vill-type mus som en positiv kontroll og en ikke-primær negativ kontroll. (C) dette panelet viser en flekk av macrophage proteiner F4/80 og CD68 i nyre vev fra Col4a3- / - musen som en positiv. Scalebar = 20 µm. DAPI vises i blått. Proteiner dataindikator vises i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Ekstracellulære flux analysen i isolerte primære rørformede cellene på ulike plating tettheter. (A) øke cellulære plating tetthet forbedrer basale åndedrett nivåene i primære rørformede celler, testet på passering 3. (B) dette panelet viser mikroskopiske bilder av primære rørformede celler kultivert på en XF96 microplate seeded på 20.000, 30.000 og 40 000 celler/vel tettheter. Scalebar = 100 µm. (C) dette panelet viser en fettsyre - eller glukose-baserte ekstracellulære flux analysen i primære rørformede celler i avsnitt 2 og 1. Dataene er gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi optimalisert en protokoll som gir mulighet for effektiv isolasjon av mus nyre rørformede epitelceller (TECs) og viste at cellene kan sub kultivert for en ekstracellulære flux analyse for å vurdere mitokondrie åndedrett i nærvær av fettsyrer- og/eller glukose-baserte underlag. Denne protokollen er utformet for studier med fokus på både proksimale og distale rørformede celler og fungerer som et rammeverk med å bygge mer komplekse eksperimenter for forståelsen av TEC patologi-assosiert nyre sykdommer. I forhold til tidligere publiserte protokoller9,10,19, denne metoden krever ikke gradering separasjoner lenge sentrifugering ganger eller en rikelig antistoff behandling for sortering og, derfor gir en mer effektiv og optimalisert guide for forskere arbeider i nyre rørformede metabolske feltet. Det er flere viktige trinn i denne protokollen, inkludert fordøyelsen, re samling, og plating tetthet og sammensatte optimalisering for ekstracellulære flux analysen.

Velge riktig collagenase og optimal konsentrasjon er nøkkelen til en vellykket fordøyelsen og av rørformede cellene fra nyre vev. Sammenlignet med andre typer collagenases, inneholder type 2 collagenase relativt høyere nivåer av protease aktivitet, kan dissociating kompakt nyre strukturer. For å minimere sjansene for forurensning som følge av en langvarig perfusjon og fordøyelsen, var 0.013% type 2 collagenase parfyme på 30 mL/min. Nyre kapselen var bare fjernet etter begge nyrer ble høstet fra dyret og overført til sterilisert celle kultur hette. Nyrene ble hakket i små biter og fortsatte sine inkubering med 10 mL av en fordøyelsen buffer for en annen 5 min for en komplett fordøyelsen og maksimal utgivelsen av rørformede cellene.

Selv etter fordøyelsen, vev suspensjon sendes gjennom en 70-µm filter fjerne stor vev stykker, vil det fortsatt være ufordøyd tubuli som passerer gjennom filteret og bo i cellen suspensjon og få belagt på kultur parabolen. Det tar lengre tid enn normalt for disse tubuli å løslate rørformede celler og legge fast kultur parabolen. Derfor er det heller viktig å samle celle suspensjon og sentrifuge det pellets de ledige tubuli og den andre dagen etter at cellen belegget. Dette lav hastighet sentrifugering trinn videre fjerner andre celletyper som er lysere enn rørformede celler og ledige tubuli og rørformede celler å avgjøre.

Identifikasjon av riktig celle tetthet er det første og viktigste trinnet for en vellykket ekstracellulære flux analysen. Resultatene viste at 40.000 celler per brønn på en XF96 microplate er ideell for primære rørformede celler i både en fettsyrer og en glukose-baserte åndedrett analysen (Figur 3 c). I denne protokollen, ble isolerte rørformede celler brukt for ekstracellulære flux analysen på passasjer 1 og 2. Cellene sub kultivert for å passasje 3, selv om de opprettholdt et uttrykk for rørformede markører (figur 2) og en anstendig ytelse i bioenergi analyser (figur 3A), og viste redusert basale åndedrett nivåer sammenlignet passage 2 (vises ved å sammenligne OCR i høyre paneler av figur 3A til Figur 3 c). Denne nedgangen kan ikke påvirke vesentlig friske rørformede celler (for eksempel de isolert fra unge vill-type mus). Men for studier på celler isolert fra CKD musen modeller som har et redusert mitokondrie åndedrett, kan høyere passasjer cellene forårsake en ytterligere reduksjon i basal åndedrett som vil påvirke resultatene av ekstracellulære flux analysen. I studier gjennomført her cellene fra både passering 1 og passasje 2 viste høy basale åndedrett nivåer. Etter denne protokollen anbefaler vi derfor bruker disse to tidlig passasjer for mitokondrie åndedrett studier med celler isolert fra både friske og syke dyr. Celler fra passasje 2 bør likevel tas hensyn hvis passering 1 sub kultur ikke gir nok celler for flux analysen. I tillegg til bioenergi studier viser våre tidligere forskning at primære TECs på passering 3 kan være svært nyttig for behandlinger med forbindelser fulgt av protein og RNA studier (data ikke vist). Som blir sagt, foreslår vi at etterforskerne bruke denne protokollen til å isolere rørformede celler bør nøye velge optimal passasjen til forskjellige forskningsformål.

Det arbeider rettprinsippet ekstracellulære flux analysen er basert på samspillet mellom de injiserte forbindelsene og åndedrett kjeden komplekser og effekten av uncoupler. Oligomycin er en inhibitor av komplekse V (ATP syntase) og brukes til å skille ATP-tilknyttet oksygenforbruk og oksygenforbruk som kreves for å overvinne vanlige proton lekkasjen over en mitokondrie indre membran32. FCCP uncouples oksygenforbruk fra ATP produksjonen ved å forstyrre den mitokondrie membranen potensial. Dermed gir en måleenhet for maksimal åndedrett kapasiteten som det omgår den begrensede kapasiteten på en proton ion middelklasseinnbyggere av ATP syntase ved at proton transport gjennom membran. Antimycin-A, en kompleks III inhibitor, og rotenon, et kompleks jeg blokkering, brukes i kombinasjon for å stenge ned hele mitokondrie åndedrett tillater mellom den mitokondrie vs ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk i cellene. Disse forbindelsene bør alltid være titreres for en bestemt celle type før ekstracellulære flux analysen til å bestemme de optimale konsentrasjonene som gir optimal OCR kurvene. Her anbefaler vi 1 µM oligomycin, 1 µM av FCCP og 2 µM av rotenon/antimycin A for ekstracellulære flux analysen på primære TECs.

Avslutningsvis gir denne protokollen en enkel og kostnadseffektiv måte å isolere nyre primære proksimale og distale rørformede epitelceller som kan brukes for å vurdere mitokondrie bioenergi ex vivo. Mens denne protokollen kan være nyttig i en rekke molekylærbiologi studier utforske biologisk funksjon av nyre rørformede epitelceller, erkjenner vi begrensninger når det gjelder studier trenger ren proksimale eller distale tubuli. For eksempel studier på Lowe syndromet, en selektiv proksimale rørformede dysfunksjon33eller studier på distale nedsatt tubulær acidose, en distale rørformede dysfunksjon34, ville kreve en mer sofistikert protokoll for cellen aisolering og rensing. Men gir for fleste av studiene som sammenligner tubuli g. glomeruli, og studier til skjermen potensielle mitokondrie åndedrett regulatorer i rørformede celler generelt, protokollen en mulig høy gjennomstrømning tilnærming. Denne protokollen kan derfor har bred programmer å studere mitokondrie dysfunksjon knyttet renal lidelser for drug discovery eller mål kontrollhensyn.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å fortolle.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til Lina A. Shehadeh: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjertet Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I Rat Protein, Tail ThermoFisher Scientific A1048301
Acetic Acid J.T.Baker 9508
Collagenase Type II Worthington LS004176
PBS Sigma D8537
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit PromoCell C-26130
2-Deoxy glucose Sigma D6134
Glucose Sigma G8270
L-Carnitine Sigma C0283
Etomoxir Sigma E-1905
Oligomycin Sigma 75351
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Rotenone Sigma R8875
Antimycin-A Sigma A8674
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Sodium palmitate Sigma P9767
NaCl Sigma S7653
Sodium pyruvate Sigma P5280
L-Glutamine 200mM solution Sigma G7513
DMEM powder Sigma D5030-1L
Hoechst 33342 LifeTechnologies H3570
Trypan Blue Staining (0.4%) LifeTechnologies T10282
Counting Slides Bio-Rad 145-0011
Micro Dissecting Forceps Roboz RS-5101
TC10 automated cell counter Bio-Rad 506BR2119
MINIPULS 3 Peristaltic Pump Gilson Inc. GM3P
Seahorse XFe96 Analyzer Seahorse Bioscience S7800A
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) Seahorse Bioscience 10260-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bielesz, B., et al. Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).
  2. Fabian, S. L., et al. Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis. American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).
  3. Forbes, J. M. Mitochondria-power players in kidney function. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).
  4. Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys. Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).
  5. Yuan, Y., et al. Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).
  6. Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).
  7. Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).
  8. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
  9. Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).
  10. Terryn, S., et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).
  11. Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules. American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).
  12. Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules. American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).
  13. Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules. American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).
  14. Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).
  15. Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).
  16. Rubera, I., et al. Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules. American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).
  17. Inoue, C. N., et al. Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter. Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).
  18. Van der Hauwaert, C., et al. Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling. PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).
  19. Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells. Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).
  20. Wen Ding, K. Y., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
  21. Quadri, J. A., et al. Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study. Human & Experimental Toxicology. , (2018).
  22. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
  23. Condorelli, L., et al. Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).
  24. Aschauer, L., et al. Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).
  25. George, S. K., et al. Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure. PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).
  26. Elberg, G., et al. MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).
  27. Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures. Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).
  28. Cai, Q., et al. Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).
  29. Zhao, Y., et al. Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells. BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).
  30. Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).
  31. Kim, M., et al. Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment. PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).
  32. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthethase system. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  33. Bockenhauer, D., et al. Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).
  34. Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis. BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).

Tags

Biologi problemet 136 primær cellen aisolering primære celle karakterisering rørformede epitelceller nyre bioenergi mitokondrier åndedrett høy gjennomstrømning ekstracellulære flux analyse fettsyrer oksidasjon kronisk nyresykdom
Isolering og karakterisering høy gjennomstrømning ekstracellulære Flux analyse av musen primære nyre rørformede epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ding, W., Yousefi, K., Shehadeh, L.… More

Ding, W., Yousefi, K., Shehadeh, L. A. Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (136), e57718, doi:10.3791/57718 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter