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Biology

पीएच-निर्भर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मीट्रिक टन-Keima का उपयोग कर प्रवाह Cytometry द्वारा Mitophagy की संवेदनशील माप

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/58099
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 1,2
1Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 3Aging Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Mitophagy, mitochondria के चयनात्मक क्षरण, mitochondrial homeostasis में फंसाया गया है और विभिन्न मानव रोगों में विनियमित है । हालांकि, mitophagy गतिविधि को मापने के लिए सुविधाजनक प्रायोगिक तरीकों बहुत सीमित हैं । यहां, हम प्रवाह cytometry का उपयोग कर mitophagy गतिविधि को मापने के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करते हैं ।

Abstract

Mitophagy autophagy मशीनरी का उपयोग कर क्षतिग्रस्त या अनावश्यक mitochondria के चयनात्मक हटाने की एक प्रक्रिया है । neurodegenerative रोग, कैंसर, और चयापचय रोगों सहित दोषपूर्ण mitophagy और विभिन्न मानव रोगों के बीच घनिष्ठ संबंध पाया गया है । इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि mitophagy सामांय सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है, ऐसे भेदभाव और विकास के रूप में । हालांकि, की सटीक भूमिका और आणविक तंत्र अंतर्निहित mitophagy आगे अध्ययन की आवश्यकता होती है । इसलिए, यह mitophagy गतिविधि में परिवर्तन को मापने के लिए एक मजबूत और सुविधाजनक विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम मात्रात्मक cytometry mitochondria-लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन Keima (एमटी-Keima) का उपयोग प्रवाह के माध्यम से mitophagy गतिविधि का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रवाह cytometry परख mitophagy गतिविधि और अधिक तेजी से और संवेदनशील पारंपरिक माइक्रोस्कोपी-या immunoblotting आधारित तरीकों से विश्लेषण कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल विभिंन प्रकार के सेल में mitophagy गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

Mitochondria organelles हैं जो कोशिका प्रसार और फिजियोलॉजी के लिए आवश्यक हैं । Mitochondria ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी आपूर्ति के ८०% से अधिक उत्पादन के लिए जिंमेदार हैं, और वे भी विभिंन चयापचय मध्यवर्ती संश्लेषण और चयापचय के लिए1,2प्रदान करते हैं । ऊर्जा आपूर्ति और चयापचय में अपनी भूमिकाओं के अलावा, mitochondria कई अंय महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) पीढ़ी, कोशिका मृत्यु के विनियमन, और intracellular Ca2 + गतिशीलता3 सहित . mitochondrial समारोह में परिवर्तन कैंसर, मधुमेह और विभिन्न neurodegenerative रोगों4,5सहित मानव रोगों, के साथ संबद्ध किया गया है. वृद्धि हुई mitochondrial शिथिलता और mitochondrial डीएनए उत्परिवर्तन भी सामांय उंर बढ़ने के लिए योगदान करने के लिए लगा रहे है प्रक्रियाओं6,7,8। इसलिए, गुणवत्ता नियंत्रण mitochondria में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है । Mitochondria अत्यधिक गतिशील organelles है कि लगातार लंबी नेटवर्क और छोटे, खंडित रूप के बीच अपने आकार बदल सकते हैं । Mitochondria गतिशीलता Mitochondria के समारोह के साथ ही9mitophagy के माध्यम से उनके क्षरण को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।

Mitophagy एक तंत्र है कि autophagy मशीनरी का उपयोग कर पूरे mitochondria का चयनात्मक क्षरण शामिल है । Mitophagy सिद्धांत mitochondrial कारोबार अंतर्निहित तंत्र और क्षतिग्रस्त या बेकार mitochondria के हटाने है । इस प्रक्रिया में, mitochondria पहले एक झिल्ली से घिरा हुआ है, autophagosomes के गठन में जिसके परिणामस्वरूप, तो hydrolytic क्षरण9के लिए lysosomes के साथ फ्यूज । पिछले आनुवंशिक अध्ययन Drosophila में सुझाव दिया है कि दो पार्किंसंस रोग से संबंधित जीन, PTEN-प्रेरित ख्यात कळेनासे 1 (PINK1) (PARK6) और Parkin (PARK2), एक ही मार्ग में समारोह10,11। उपक्रम अध्ययनों से पता चला है कि PINK1-Parkin मार्ग बेकार mitophagy में इस मार्ग के परिणाम में क्षतिग्रस्त mitochondria और दोषों को नष्ट करने के लिए जिंमेदार है और मानव रोगों के लिए योगदान कर सकते है12,13। mitophagy प्रक्रियाओं में मनोकामना हाल ही में कैंसर, हृदय रोग, यकृत रोग और neurodegenerative रोग 14सहित विभिन्न मानव रोगों में पाया गया है । इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से यह भी पता चला है कि mitophagy कई शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे भेदभाव, विकास, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया15,16,17,18 ,19, सुझाव है कि mitophagy सेल कार्यों को नियंत्रित करने में एक अधिक सक्रिय भूमिका निभा सकता है ।

हाल ही में पुष्टि के बावजूद कि mitophagy दोनों mitochondria और मानव रोग में गुणवत्ता नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, आणविक तंत्र अंतर्निहित mitophagy खराब समझ में रहते हैं । हालांकि mitophagy से संबंधित तंत्र व्यवस्थित खमीर में अध्ययन किया गया है, स्तनधारी कोशिकाओं में mitophagy से संबंधित तंत्र की खोज के उद्देश्य से अध्ययन मुख्य रूप से PINK1-Parkin मार्ग पर ध्यान केंद्रित किया है । पिछले अध्ययनों की स्थापना की है कि PINK1-Parkin मार्ग मुख्य रूप से mitophagy12,20,21के माध्यम से क्षतिग्रस्त mitochondria के चयनात्मक हटाने के लिए जिंमेदार है । हालांकि, हाल के अध्ययनों में बताया गया है कि कुछ मॉडलों में, mitophagy भी कार्यात्मक PINK1 के अभाव में सक्रिय किया जा सकता है22,23,24। इन परिणामों का सुझाव है कि PINK1-Parkin मार्ग के अलावा, वहां एक अतिरिक्त अज्ञात मार्ग है कि mitophagy सक्रिय कर सकते हैं ।

mitophagy गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सुविधाजनक विधि के अभाव के रास्ते है कि mitophagy और pathophysiological घटनाओं में अपनी भूमिका को विनियमित की खोज करने के लिए एक प्रमुख बाधा है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सीधे autophagosome-घिरा mitochondria कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी mitophagy गतिविधि को बढ़ाता में सीमाएं हैं । हालांकि रणनीति है कि microtubule-1 लाइट चेन 3 (LC3) का उपयोग करें-संयुग्मित फ्लोरोसेंट जांच, जैसे GFP-LC3, वर्तमान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया25दृष्टिकोण, LC3 के क्षणिक प्रकृति-आधारित संकेत और इसकी उच्च दर false-धनात्मक संकेतों में26कक्षों में mitophagy का पता लगाने के लिए अपनी संवेदनशीलता को सीमित करते हैं । पश्चिमी सोख्ता का एक संयोजन mitochondrial प्रोटीन स्तर को मापने के लिए, mitochondrial डीएनए के ठहराव, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण colocalize mitochondria के साथ या तो autophagosomes या lysosomes के आकलन के लिए एक अच्छा दृष्टिकोण होगा mitophagy । हालांकि, ठहराव सीमाएं और मौजूदा तरीकों की सुविधा का अभाव नए दृष्टिकोण के लिए कहते हैं । एक नया पीएच के परिचय-निर्भर फ्लोरोसेंट प्रोटीन, mitochondrial लक्ष्य Keima (मीट्रिक टन-Keima), बहुत mitophagy27का पता लगाने की क्षमता में सुधार । Keima में cytochrome सी oxidase उपइकाई viii (कॉक्स viii) के mitochondrial-लक्ष्यीकरण अनुक्रम से इनकार करके, mt-Keima mitochondrial मैट्रिक्स के लिए निर्देशित किया गया है । ४४० एनएम से ५८६ एनएम के लिए Keima के उत्तेजना पीक में बड़े बदलाव (इसी पीएच 7 और पीएच 4 के लिए, क्रमशः) इन विट्रो में दोनों में अच्छा संवेदी के साथ mitophagy का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और vivo में प्रयोग28,29 . इससे भी महत्वपूर्ण बात, lysosomal क्षरण के लिए मीट्रिक टन-Keima के प्रतिरोध lysosomes में मीट्रिक टन-Keima संकेत के एकीकरण का कारण बनता है, mitophagy गतिविधि के आसान मात्रात्मक माप के लिए अनुमति देता है. प्रतिदीप्ति परिवर्तन है कि मीट्रिक टन में होता है-Keima या तो फोकल माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry28,29का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । हालांकि, mt-Keima का उपयोग करके mitophagy गतिविधि मापने के लिए एक प्रवाह cytometry-आधारित विधि दिनांक को विवरण में प्रदान नहीं किया गया है ।

यहां, हम मीट्रिक टन-Keima का उपयोग कर कोशिकाओं में mitophagy गतिविधि को मापने के लिए एक प्रवाह cytometry आधारित तकनीक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । यद्यपि हम यहां दिखाया गया है कि प्रवाह cytometry विश्लेषण सफलतापूर्वक Parkin व्यक्त हेला कोशिकाओं में CCCP प्रेरित mitophagy का पता लगाया, इस तकनीक को सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

1. हेला कोशिकाओं की पीढ़ी मिळो-Keima (mt-Keima) व्यक्त

  1. एमटी-Keima lentivirus की तैयारी
    1. कोट ०.००१% पाली-L-lysine/फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 2 मिलीलीटर जोड़कर एक १००-mm संस्कृति पकवान और यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. एक निर्वात से जुड़े एक गिलास पिपेट का उपयोग कर पाली-एल lysine समाधान निकालें और 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर जोड़कर संस्कृति पकवान धो लो ।
    3. प्लेट १.५ एक्स 106 HEK293T कोशिकाओं लेपित संस्कृति डिश पर 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और संस्कृति ३७ ° c में एक सह2 ऊतक संस्कृति मशीन एक दिन के लिए में से युक्त DMEM के १० मिलीलीटर के साथ ।
    4. Transfect 2 µ g के एमटी-Keima lentiviral प्लाज्मिड29 DNA को एक साथ पैकेजिंग DNAs (psPAX 2 µ g और pVSVG ०.२५ µ g) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार 8 ज के लिए एक अभिकर्मक रिएजेंट का प्रयोग करते हुए ।
    5. अभिकर्मक मीडिया निकालें और ताजा मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. वायरल कणों युक्त मीडिया लीजिए ४८ ज बाद में । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा एकत्र मीडिया से सेलुलर मलबे निकालें और उंहें एक ०.४५-µm सिरिंज फिल्टर के साथ फिल्टर ।
      नोट: लंबी अवधि के उपयोग के लिए, lentiviral कणों के aliquots बनाने और नमूनों की दुकान पर-८० ° c. कुशल वायरल संक्रमण के लिए फ्रीज-गल चक्र के लिए वायरल के नमूनों के विषय से बचें ।
  2. मीट्रिक टन-Keima lentivirus के साथ हेला-Parkin कोशिकाओं को संक्रमित
    1. प्लेट 5 x 104 हेला कोशिकाओं में Parkin (हेला-Parkin) व्यक्त एक ६०-मिमी संस्कृति डिश में DMEM के 4 मिलीलीटर के साथ 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin की कटाई से पहले ३७ ° c एक दिन में मीट्रिक टन-Keima lentivirus ।
      नोट: हेला कोशिकाओं में अंतर्जात Parkin अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति के कारण30, हेला-Parkin कोशिकाओं को और अधिक स्पष्ट रूप से CCCP प्रेरित mitophagy दिखाने के लिए यहाँ इस्तेमाल किया. यह कार्यविधि अंय प्राथमिक या अमर कक्ष रेखाओं पर भी लागू की जा सकती है ।
    2. अगले दिन विकास माध्यम निकालें और मीट्रिक टन-Keima lentiviral मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें । विकास के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें polybrene स्टॉक समाधान के 3 µ l युक्त मध्यम (आसुत जल में 8 मिलीग्राम/एमएल) । एक सह2 ऊतक संस्कृति मशीन में एक दिन के लिए मशीन ।
    3. एमटी-Keima lentiviral मिक्सचर को अगले दिन निकालकर 1x पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । विकास के 4 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें और दो दिनों के लिए 2 µ जी/एमएल puromycin के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
    4. puromycin चयन के दो दिनों के बाद, विकास के माध्यम को दूर, और 1x पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । विकास के माध्यम जोड़ें, और संस्कृति में एक सह2 मशीन में कोशिकाओं का उपयोग करें जब तक ।
      नोट: यह विधि उन कक्षों को जनरेट करने के लिए लागू की जा सकती है जो कि अन्य कक्ष रेखाओं और प्राथमिक कक्षों सहित छुरा एक्सप्रेस mt-Keima हैं.

2. उत्प्रेरण mitophagy CCCP उपचार का उपयोग कर और FACS नमूनों की तैयारी

  1. प्लेट 5 x 104 हेला-Parkin कोशिकाओं में मीट्रिक टन-Keima एक्सप्रेस एक ६० मिमी संस्कृति डिश के साथ DMEM के 4 मिलीलीटर 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin और संस्कृति एक सह2 ऊतक संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए उन्हें.
  2. अगले दिन विकास मध्यम निकालें और 10 µ एम carbonyl साइनाइड एम-chlorophenylhydrazone (CCCP) युक्त ताजा DMEM के 4 मिलीलीटर जोड़ें । 6 एच के लिए एक सह2 ऊतक मशीन में हेला-Parkin-मीट्रिक टन-Keima कोशिकाओं की मशीन
  3. विकास मध्यम 6 एच बाद में निकालें और 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । trypsin/EDTA समाधान के साथ इलाज और 10% FBS युक्त विकास माध्यम जोड़कर trypsin को निष्क्रिय करके कोशिकाओं को अलग करें । कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित ।
  4. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  5. ध्यान से आकांक्षा द्वारा विकास के माध्यम को हटा दें और ठंड 1x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पुनर्स्थगित ।
  6. उपयुक्त FACS ट्यूब में स्थानांतरण कोशिकाओं और यह बर्फ पर जगह है ।
    नोट: संक्रमित हेला कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में तैयार करें ।
    नोट: कई घंटों के लिए बर्फ पर कोशिकाएं व्यवहार्य होती हैं, और मीट्रिक टन-Keima प्रतिदीप्ति सिग्नल भी स्थिर रहते हैं ।

3. mitophagy का FACS विश्लेषण

नोट: इस अध्ययन में, कोशिकाओं एक प्रवाह एक ४०५ एनएम और ५६१ एनएम लेजर के साथ सुसज्जित cytometer के साथ विश्लेषण किया गया । कोशिकाओं एक वायलेट लेजर (४०५ एनएम) उत्सर्जन के साथ ६१० ± 10 एनएम एक BV605 डिटेक्टर के साथ और एक पीले-हरे रंग की लेजर के साथ (५६१ एनएम) उत्सर्जन के साथ एक पीई-CF594 डिटेक्टर एक साथ द्वारा ६१० ± 10 एनएम में पता चला के साथ उत्तेजित थे (चित्रा 1) ।

  1. गेटिंग लाइव सेल
    1. प्रवाह cytometer और कंप्यूटर को चालू करें और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में लॉग ऑन ।
    2. एक नया प्रयोग उत्पंन करें या कोई मौजूदा प्रयोग डुप्लिकेट करें । वायलेट (४०५ एनएम) और पीले-हरे (५६१ एनएम) पराबैंगनीकिरण के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित और ६१० ± 10 एनएम डिटेक्टर पर उत्सर्जन का पता लगाने के लिए, BV605 और पीई-CF594 के अलावा में आगे तितर बितर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) पैरामीटर विंडो में आवश्यक fluorophores के रूप में ।
      नोट: सभी fluorophores एक रेखीय मोड में जोड़ा जाना चाहिए ।
    3. भंवर सेल समुच्चय फैलाने के लिए संक्षेप में प्रत्येक कोशिका नमूना ।
    4. एक नियंत्रण हेला-Parkin सेल नमूना है कि नमूना इंजेक्शन बंदरगाह पर मीट्रिक टन-Keima lentivirus से संक्रमित नहीं है और cytometer पर "भागो" बटन प्रेस युक्त ट्यूब रखें ।
    5. FSC बनाम एसएससी के डॉट प्लाट में FSC और एसएससी की वोल्टेज को समायोजित करने के लिए डॉट प्लॉट के केंद्र में कक्षों की जगह है.
    6. लाइव कोशिकाओं के आसपास बहुभुज आइकन का उपयोग कर एक P1 गेट ड्रा और मृत कोशिकाओं और सेल मलबे (चित्रा 2a) को खत्म.
  2. बैंगनी और हरे रंग की लेजर के लिए वोल्टेज समायोजित
    1. नमूना इंजेक्शन बंदरगाह पर मीट्रिक टन-Keima lentivirus से संक्रमित हेला-Parkin कोशिकाओं युक्त ट्यूब प्लेस और cytometer पर "भागो" बटन दबाएँ.
    2. BV605 (४०५ एनएम) बनाम एसएससी के डॉट प्लॉट में, BV605 वोल्टेज को समायोजित करें ताकि मीट्रिक टन-Keima व्यक्त करने वाली हेला-Parkin कोशिकाएं स्पष्ट रूप से नियंत्रण कक्षों से प्रतिष्ठित हों जो मीट्रिक टन-Keima (चित्रा बी) को अभिव्यक्त नहीं करती हैं ।
    3. पीई-CF594 (५६१ एनएम) बनाम एसएससी की डॉट साजिश में, पीई-CF594 वोल्टेज को समायोजित करें ताकि मीट्रिक टन-Keima व्यक्त करने वाली हेला-Parkin कोशिकाएं नियंत्रण कक्षों से स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित हो जाएं (चित्रा बीएन) ।
  3. mitophagy में कक्षों के प्रतिशत का आकलन करें
    1. एक रैखिक पैमाने का उपयोग कर BV605 बनाम पीई-CF594 डॉट भूखंड का अधिग्रहण । मीट्रिक टन-Keima व्यक्त कोशिकाओं के आसपास बहुभुज आइकन का उपयोग कर एक गेट ड्रा, और मीट्रिक टन-Keima (चित्रा 3) व्यक्त नहीं कोशिकाओं को खत्म करने. एमटी-Keima प्रतिदीप्ति-पॉजिटिव सेल की आबादी को "एमटी-Keima" गेट के रूप में जाना जाता है ।
    2. केवल "mt-Keima"-gated कक्षों को दिखाते हुए BV605 बनाम पीई-CF594 की एक और डॉट प्लॉट बनाएं । इस डॉट प्लॉट में, अनुपचारित मीट्रिक टन-Keima-सकारात्मक कोशिकाओं के आसपास एक गेट ड्रा । नियंत्रण हेला कोशिकाओं की बेसल mitophagy गतिविधि कम है, और पीई-CF594/BV605 में उत्सर्जन का अनुपात 1 से कम है । इस प्रकार, इस गेट को "कम" गेट के रूप में जाना जाता है ।
    3. "कम" फाटक के ऊपर क्षेत्र युक्त एक और फाटक ड्रा । इस गेट को "उच्च" गेट के रूप में संदर्भित किया जाता है क्योंकि इसमें उच्च mitophagy गतिविधि वाली कोशिकाएं होती हैं, जो कि, पीई-CF594/BV605 (चित्र बी) में उत्सर्जन के उच्च अनुपात वाली कोशिकाएं होती हैं ।
    4. "उच्च" गेट में कक्षों का प्रतिशत परिकलित करने के लिए, "जनसंख्या पदानुक्रम दिखाएँ" मेनू का चयन करें. "पैरेंट का प्रतिशत" (% पैरेंट) मान मीट्रिक टन-Keima-धनात्मक जनसंख्या के बीच "उच्च" gate में कक्षों का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है ।
    5. "mt-Keima" रोक गेट और प्रत्येक नमूना चलाने में रिकॉर्ड करने के लिए कम से १०,००० घटनाओं सेट करें ।

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Representative Results

हेला-Parkin कोशिकाओं में CCCP-प्रेरित mitophagy के प्रवाह cytometry विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 4में दिखाया गया है । ऊपर वर्णित प्रवाह cytometry विश्लेषण विधि का उपयोग करके, हम "उच्च" फाटक में mitophagic कोशिकाओं में एक नाटकीय वृद्धि का पता लगा सकते हैं । "उच्च" फाटक में कोशिकाओं का प्रतिशत अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 4a) के साथ तुलना में अधिक से अधिक 10 गुना बढ़ गया था । mitophagy गतिविधि में यह वृद्धि पूरी तरह से सह उपचार bafilomycin एक (BFA) (चित्रा 4a और 4B) के साथ समाप्त हो गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 . योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व विधि के प्रवाह cytometry के साथ mitophagy को मापने के लिए इस्तेमाल किया । योजना मुख्य प्रवाह cytometry द्वारा mitophagy के दौर से गुजर कोशिकाओं यों तो आवश्यक कदम रूपरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . प्रवाह cytometer पैरामीटर्स सेट कर रहा है । (क) जीवित कोशिकाओं का गेटिंग. जीवित कोशिकाओं के लिए एक क्षेत्र FSC बनाम एसएससी भूखंड पर निर्धारित किया गया मृत कोशिकाओं और सेल मलबे को बाहर करने के लिए । (ख) ४०५-एनएम और ५३१-एनएम पराबैंगनीकिरण का समायोजन नियंत्रण हेला कोशिकाओं और हेला मीट्रिक टन-Keima व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . प्रवाह cytometry द्वारा mitophagic कोशिकाओं के अनुपात की गणना. (क) गेटिंग हेला कोशिकाओं मीट्रिक टन-Keima व्यक्त. (ख) गेटिंग mitophagic कोशिकाओं और आँकड़े उपकरण का उपयोग कर अनुपात की गणना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . प्रवाह cytometry द्वारा हेला कोशिकाओं में CCCP-प्रेरित mitophagy की ठहराव. (क) हेला-Parkin कोशिकाओं एक्सप्रेस मीट्रिक टन-Keima के साथ या १०० एनएम CCCP एक (bafilomycin) के बिना 6 एच के लिए 10 µ एम BFA के साथ इलाज किया गया । कोशिकाओं BV605 और पीई-CF594 डिटेक्टरों का उपयोग FACS द्वारा विश्लेषण किया गया । (ख) उच्च पे-CF594/BV605 अनुपात वाले कक्षों का चयन किया गया ("उच्च"), और उनके अनुपात की गणना की गई । तीन दोहराया प्रयोगों के परिणाम मानक विचलन के साथ साजिश रची है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहाँ, हम मीट्रिक टन-Keima एक्सप्रेस कोशिकाओं में सेलुलर mitophagy गतिविधि को मापने के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए एक तेजी से और संवेदनशील विधि प्रस्तुत करते हैं । mitophagy के एक उच्च स्तर के दौर से गुजर कोशिकाओं पीई-CF594 (५६१ एनएम)/BV605 (४०५ एनएम) उत्तेजना का एक बढ़ा अनुपात प्रदर्शन । इस प्रकार, mitophagy गतिविधि एक उच्च 561/405 अनुपात का प्रदर्शन कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा सकता है । हम एक डॉट भूखंड पर "उच्च" गेट क्षेत्र में कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना पीई-CF594 (५६१ एनएम) बनाम BV605 (४०५ एनएम), और परिणामों से पता चला है कि CCCP के साथ उपचार हेला-Parkin कोशिकाओं में mitophagy में वृद्धि प्रेरित । हम पहले से प्रदर्शित किया है कि lentivirus-Keima मीट्रिक टन की मध्यस्थता में ही नहीं mitochondrial समारोह या सेलुलर फिजियोलॉजी31को प्रभावित करता है । हालांकि हम अपनी पांडुलिपि में दिखाया है कि प्रवाह cytometry विश्लेषण सफलतापूर्वक Parkin व्यक्त हेला कोशिकाओं में CCCP प्रेरित mitophagy का पता लगाने कर सकते हैं, इस तकनीक के सेल के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है mt-Keima शुरू करने के बाद । हम पहले से पता चला है कि हाइपोक्सिया प्रेरित mitophagy हेला कोशिकाओं में अस्थानिक Parkin अभिव्यक्ति के बिना पता लगाया जा सकता है29। इसके अलावा, हमारे और अंय समूहों के उन सहित पिछले अध्ययन, पता चला है कि मीट्रिक टन-Keima प्रतिदीप्ति विश्लेषण प्राथमिक कोशिकाओं में mitophagy जैसे माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) और हेला, HEK293, और एसएच-SY5Y कोशिकाओं के रूप में अमर कोशिकाओं में पता लगा सकते है 28 , 29 , ३२.

अंय माइक्रोस्कोपी आधारित या immunoblotting आधारित mitophagy परख के साथ तुलना में, प्रवाह cytometry परख में लाभ है कि वे तेजी से अनुमति, कोशिकाओं की बड़ी संख्या के reproducible विश्लेषण31। इसलिए, जबकि माइक्रोस्कोपी आधारित विश्लेषण में, शोधकर्ता पूर्वाग्रह परिणाम विकृत कर सकते हैं, इस पूर्वाग्रह एक मुद्दा है जब प्रवाह cytometry परख का उपयोग नहीं है ।

से कम 1 x 106 कोशिकाओं को प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, क्योंकि एक नमूने के विश्लेषण केवल एक से दो मिनट लगते हैं, दर्जनों नमूनों के लिए एक से दो घंटे के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रवाह cytometry परख अच्छी संवेदनशीलता के साथ mitophagic कोशिकाओं में वृद्धि का पता लगा सकते हैं । हमारे प्रवाह cytometry विश्लेषण में, हम CCCP के साथ उपचार के 6 ज के बाद mitophagic कोशिकाओं में 10 गुना वृद्धि का पता लगाया ।

प्रवाह cytometry का उपयोग कर mitophagy का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण कदम "उच्च" और "कम" गेट्स सही ढंग से mitophagy के एक उच्च स्तर के दौर से गुजर कोशिकाओं को भेद करने के लिए सेट है । बेसल mitophagy स्तर सेल प्रकार के आधार पर अलग किया जा सकता है, क्योंकि "उच्च" और "कम" गेट सेटिंग कुछ सेल लाइनों में मुश्किल हो सकता है । ऐसी स्थिति में, यह हेला कोशिकाओं जैसे कम बेसल mitophagy गतिविधि के साथ एक नियंत्रण सेल लाइन को शामिल करने के लिए मददगार है । इसके अलावा, ऐसे क्लोरोक्वीन के रूप में एक lysosomal अवरोधक के साथ इलाज कोशिकाओं के लिए, bafilomycin एक कम mitophagy नियंत्रण के रूप में शामिल किया जा सकता है सही गेटिंग स्थापित करें । हालांकि lentiviruses आमतौर पर दिलचस्प प्रोटीन की अस्थानिक अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, कुछ सेल लाइनों वायरस के संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है । यदि lentivirus संक्रमण ही सेल वृद्धि या mitochondria समारोह में परिवर्तन में परिणाम, एक अंय विधि mt-Keima अभिव्यक्ति के लिए विचार किया जाना चाहिए । mt-Keima का व्यंजक स्तर कक्ष प्रकार के आधार पर भी भिन्न हो सकता है. यदि मीट्रिक टन-Keima प्रतिदीप्ति संकेत बहुत कमजोर है या बहुत विषम, केवल एक मजबूत मीट्रिक टन-Keima प्रतिदीप्ति संकेत के साथ कोशिकाओं एक सेल सॉर्टर या मीट्रिक टन Keima कोशिकाओं का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है फिर कई दिनों के लिए puromycin एंटीबायोटिक दवाओं के एक उच्च एकाग्रता के साथ इलाज . अलग कोशिकाओं के मीट्रिक टन-Keima संकेत कोशिकाओं व्यवहार्य हैं के रूप में लंबे समय के रूप में स्थिर हैं, लेकिन हम जितनी जल्दी हो सके प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं.

हमारे प्रवाह cytometry परख mitophagy विश्लेषण के लिए एक मजबूत और सुविधाजनक तरीका है, लेकिन वहां कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, क्योंकि कोशिकाओं को प्रवाह cytometry के लिए एक एकल कोशिका स्तर के रूप में अलग किया जाना चाहिए, इस विधि शरीर विज्ञान में फेरबदल के बिना ऊतक या अंगों के mitophagy का विश्लेषण करने के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, मीट्रिक टन-Keima प्रतिदीप्ति निर्धारण के बाद अपने पीएच निर्भर विशेषताओं खो देता है, और इस प्रकार, सभी नमूनों जीवित कोशिकाओं के रूप में विश्लेषण किया जाना चाहिए । नमूना भंडारण की सीमा में यह परिणाम ऊपर उल्लेख किया है और एक और जब एक अतिरिक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग लागू करने की सीमा । इस तकनीक mitophagy गतिविधि मात्रात्मक माप कर सकते हैं, लेकिन यह mitochondrial आकृति विज्ञान या गतिशीलता में परिवर्तन की निगरानी करने में असमर्थ है, जो mitophagy प्रक्रिया9में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है । शोधकर्ताओं को mitophagy की जटिलता और अननिर्धारित पहलुओं को ध्यान में रखना चाहिए. इसलिए, संभव फैसले से बचने के लिए, mitophagy प्रक्रिया आगे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहित अन्य आम mitophagy विश्लेषण विधियों, के संयुक्त परिणामों की पुष्टि की जानी चाहिए, mitochondrial प्रोटीन कारोबार, में एक कमी mitochondrial डीएनए, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मापने के colocalization के साथ mitochondria के lysosomes या autophagosomes पहले वर्णित के रूप में३३,३४,३५. mitophagy के किसी भी मनाया वृद्धि भी आगे मीट्रिक टन-Keima एक्सप्रेस कोशिकाओं के फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से जांच की जा सकती है । mitophagic कोशिकाओं में, मीट्रिक टन-Keima एक उच्च 586/440 अनुपात है कि फोकल माइक्रोस्कोपी28,29के तहत मनाया जा सकता है के साथ एक उज्ज्वल कबरा पैटर्न में व्यक्त की है ।

तेजी से और संवेदनशील mitophagy का पता लगाने के लिए इसकी क्षमता को देखते हुए, इस प्रवाह cytometry परख एक पहली कदम सन्निकटन कि अध्ययन की एक किस्म के लिए मूल्यवान होगा प्रदान करता है । बस मीट्रिक टन-Keima lentivirus के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करके, mitophagy गतिविधि के परिवर्तन आसानी से किसी भी वांछित कोशिका प्रकार में माप किया जा सकता है. सेल सॉर्टर समारोह के साथ संयोजन में, mitophagy गतिविधि के एक विशिष्ट स्तर के साथ कोशिकाओं को विशेष रूप से अलग किया जा सकता है और की भूमिकाओं और विनियामक तंत्र अंतर्निहित mitophagy का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (2016R1D1A1B03931949) (जे. यू.) से अनुदान द्वारा समर्थित था, और कोरिया सरकार (MSIT) (सं. 2016R1A2B2008887, no. 2016R1A5A2007009) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा वित्तपोषित अनुदान (सं. सं. सं.) (जे. वाई के लिए) .)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
HEK293T ATCC CRL-3216
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
Turbofect Thermos scientific R0531
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
HeLa ATCC CCL-2
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/ml
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) Sigma-Aldrich C2759 10 mM
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa BD Bioscience LSRFortessa
FACSDIVA BD Bioscience FACSDIVA (v8.0.1)

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References

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
  2. Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
  3. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  4. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  5. Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
  6. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  7. Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
  8. Yun, J., Finkel, T. Mitohormesis. Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  10. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  11. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  12. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  13. Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
  14. Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
  15. Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
  16. Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
  17. Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
  18. Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
  19. Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
  20. Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
  21. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  22. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  23. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  24. Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
  25. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  26. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  27. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  28. Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
  29. Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  30. Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
  31. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  32. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
  33. Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
  34. Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
  35. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).

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जीव विज्ञान अंक १३८ Mitophagy mitochondria मीट्रिक टन-Keima प्रवाह cytometry फ्लोरोसेंट प्रोटीन पीएच-निर्भर जांच
पीएच-निर्भर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मीट्रिक टन-Keima का उपयोग कर प्रवाह Cytometry द्वारा Mitophagy की संवेदनशील माप
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Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T., Yun, J. Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima. J. Vis. Exp. (138), e58099, doi:10.3791/58099 (2018).

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