Summary
Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.
Abstract
Mitophagy seçici autophagy makine kullanarak hasarlı ya da gereksiz mitokondri kaldırılması işlemidir. Yakın bağları arızalı mitophagy ve nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları arasında bulunmuştur. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu mitophagy normal hücresel süreçler, başkalaşım ve gelişimi gibi ilgilenmektedir göstermiştir. Ancak, kesin rolü ve moleküler mekanizmaları mitophagy altında yatan daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, bu değişiklikler mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlam ve uygun bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Burada, mitophagy etkinlik mitokondri hedefli floresan protein Keima (mt-Keima) kullanarak akış sitometresi ile kantitatif değerlendirilmesi için detaylı bir protokol açıklayın. Bu akış sitometresi tahlil daha hızlı ve hassas Yöntemler konvansiyonel mikroskopi veya immunoblotting göre daha mitophagy etkinliğini çözümleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı çeşitli hücre tiplerinin mitophagy etkinliğini çözümlemeye uygulanabilir.
Introduction
Mitokondri hücre çoğalması ve Fizyoloji için gerekli olan organelleri vardır. Mitokondri ATP tedarik Oksidatif fosforilasyon üzerinden % 80'den fazla oluşturmaktan sorumlu vardır ve onlar da biyosentezi ve metabolizma1,2için çeşitli metabolik ara ürün sağlamak. Enerji arzı ve metabolizma rolleri yanı sıra, mitokondri reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, hücre ölümü ve intrasellüler Ca2 + dynamics3 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok diğer önemli süreçlerinde, merkezi rol oynarlar . Mitokondriyal işlevde değişiklik kanser, diyabet ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar4,5de dahil olmak üzere insan hastalıkları ile ilişkili bulunmuştur. Artan mitokondrial disfonksiyon ve mitokondriyal DNA mutasyonlar da normal yaşlanma süreçlerini6,7,8' e katkıda düşünülmektedir. Bu nedenle, kalite kontrol mitokondri içinde çok önemli bir konudur. Mitokondri sürekli uzun ağlar ve kısa, parçalanmış bir form arasında kendi şeklini değiştirebilirsiniz son derece dinamik organelleri vardır. Mitokondri dynamics mitokondri yanı sıra onların yıkımı ile mitophagy9fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar.
Mitophagy bütün mitokondri autophagy makine kullanarak Seçmeli bozulma içerir bir mekanizmadır. Mitophagy ilke mekanizması temel mitokondrial ciro ve zarar görmüş veya işlevsiz mitokondri kaldırılması olduğunu. Bu süreçte, mitokondri ilk organellerin hydrolytic Bozulması9ile sigorta autophagosomes oluşumu sonuçlanan bir zar çevrilidir. Önceki genetik çalışmalarda Drosophila iki önerilen Parkinson hastalığı ile ilgili genleri, sözde kinaz PTEN kaynaklı 1 (PINK1) (PARK6) ve Parkin (PARK2), aynı yolu10,11' işlev. Strüktür çalışmaları PINK1-Parkin yolu bozuk mitokondri ortadan kaldırılması için sorumludur ve işlevsel olmayan mitophagy bu yolu sonuç kusurları ve insan hastalıkları12,13için katkıda bulunabilir göstermiştir. Hatalarına mitophagy süreçlerde son zamanlarda çeşitli insan hastalıkları, kanser, kalp hastalığı, karaciğer hastalıkları ve nörodejeneratif hastalık 14gibi bulduk. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu mitophagy ayırt etme, geliştirme ve bağışıklık yanıtı15,16,17,18 gibi birçok fizyolojik süreçleri için çok önemlidir göstermiştir ,19o mitophagy hücre fonksiyonları kontrol daha aktif bir rol oynamak düşündüren,.
Mitophagy mitokondri her iki kalite kontrol önemli bir rol oynar ve insan hastalık, mitophagy temel moleküler mekanizmaları kalır kötü son onay rağmen anladım. Her ne kadar mitophagy ile ilgili mekanizmalar sistematik olarak Maya incelenmiştir, mitophagy ile ilgili mekanizmalar memeli hücrelerinde keşfetmek yönelik çalışmaları esas olarak PINK1-Parkin yolu üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar PINK1-Parkin yolu öncelikle mitophagy12,20,21üzerinden hasarlı mitokondri seçici kaldırılması için sorumludur kurduk. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bazı modelleri mitophagy fonksiyonel PINK122,23,24olmadığında da etkinleştirilebilmesi için bildirdin. Bu sonuçlar PINK1-Parkin yolu ek olarak, orada mitophagy etkinleştirebilirsiniz ek bir tanımlanamayan yolu göstermektedir.
Mitophagy etkinliğini değerlendirmek için uygun bir yöntem mitophagy ve patofizyolojik olaylarda rolü düzenleyen yollar keşfetmek için büyük bir engel bulunmamasıdır. Elektron mikroskobu doğrudan autophagosome yuttu mitokondri görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Ancak, elektron mikroskobu mitophagy aktivite miktarının içinde sınırlamalar vardır. Her ne kadar Mikrotubul ilişkili protein-1 kullanmak stratejileri zinciri 3 (LC3) ışık-GFP-LC3 gibi konjuge floresan problar vardır şu anda en çok kullanılan yaklaşımlar25, LC3 tabanlı sinyal geçici doğasını ve onun yüksek oranda yanlış sinyalleri mitophagy hücreleri26algılama hassasiyeti sınırlayın. Mitokondrial protein seviyesi, Mitokondrial DNA ve floresan mikroskopi analiz mitokondri ya autophagosomes ya da organellerin ile colocalize için miktar ölçmek için western Blot bir arada değerlendirmek için iyi bir yaklaşım olurdu mitophagy. Ancak, miktar kısıtlamaları ve uygunluk-in mevcut metodolojiler eksikliği yeni yaklaşımlar için çağrı. Giriş bir yeni pH bağımlı floresan protein, mitokondrial hedef Keima (mt-Keima), mitophagy27algılama yeteneğini büyük ölçüde geliştirilmiş. Sitokrom c oksidaz alt birim VIII (COX VIII) Keima içine mitokondrial hedefleme dizisi eritme tarafından mt-Keima mitokondrial matris yönlendirilir. 440 büyük vardiya Keima uyarma tepe içinde nm 586 (pH 7 ve pH 4, sırasıyla karşılık) nm olabilir kullanılan hassas in vitro ve in vivo deneyler28,29 iyilikle mitophagy değerlendirmek için . Daha da önemlisi, mt-Keima lizozomal bozulması için direnç organellerin mitophagy aktivite kolay nicel ölçüm için izin, mt-Keima sinyal entegrasyonu neden olur. Mt-Keima içinde oluşur floresans değişikliği her iki confocal mikroskobu kullanılarak analiz veya akış sitometresi28,29. Ancak, mt-Keima kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı yöntemi ayrıntılı tarihi için sağlanmış olan değil.
Burada, mt-Keima kullanarak hücreleri mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi tabanlı tekniği için detaylı bir protokol açıklayın. Her ne kadar biz burada Akış Sitometresi Analizi HeLa hücreleri Parkin ifade başarıyla CCCP kaynaklı mitophagy tespit göstermiştir, bu teknik çok çeşitli hücre tipleri için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nesil HeLa hücreleri mito-Keima (mt-Keima) ifade
-
Mt-Keima lentivirus hazırlanması
- 2 mL % 0.001 poli-L-lizin/fosfat-tamponlu tuz (PBS) ekleyerek bir 100-mm Kültür yemek kat ve oda sıcaklığında 5 min için stand sağlar.
- Bir vakum için bağlı bir cam pipet kullanarak poli-L-lizin çözümü kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kültür bulaşık yıka.
- Plaka 1.5 x 106 HEK293T hücreleri kaplamalı kültür üzerine 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile yemek ve CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür için bir günü.
- Mt-Keima lentiviral plazmid29 DNA 2 µg DNA'lar (psPAX 2 µg ve pVSVG 0,25 µg) paketleme ile birlikte transfect için üreticinin yönergelerine göre 8 h transfection reaktif kullanarak.
- Transfection ortamını çıkarın ve 8 mL taze medya ekleyin.
- Viral parçacıkların 48 saat sonra içeren medya toplamak. Santrifüjü 500 x g 5 min için de tarafından toplanan medyadan hücresel enkaz kaldırmak ve bir 0.45 µm şırınga filtre ile.
Not: Uzun vadeli kullanım için aliquots lentiviral parçacıkların yapmak ve örnekleri-80 ° C'de depolayın Donma-çözülme döngüsü için etkili viral enfeksiyon için viral örnekleri tabi kaçının.
-
Mt-Keima lentivirus ile Parkin HeLa hücreleri bulaşmasını
- Plaka 5 x 104 HeLa hücreleri 60 mm kültür tabağına 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C'de mt-Keima lentivirus hasat önce bir gün içeren DMEM ile Parkin (HeLa-Parkin) ifade.
Not: Endojen Parkin ifade HeLa hücreleri30, burada daha fazla açıkça göstermek CCCP kaynaklı mitophagy için kullanılan HeLa-Parkin hücre yokluğu nedeniyle. Bu yordamı ayrıca diğer birincil veya ölümsüzleştirdi hücrenin satırlarına uygulanır. - Ertesi gün büyüme orta kaldırın ve 1 mL mt-Keima lentiviral medya ekleyin. Büyüme orta 3 µL polybrene hisse senedi çözüm (8 mg/mL distile su) içeren bir ek 2 mL ekleyin. Bir gün bir CO2 doku kültürü kuluçka için kuluçkaya.
- Mt-Keima lentiviral karışımı ertesi gün kaldırmak ve hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Büyüme orta 4 mL ekleyin ve iki gün boyunca 2 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi.
- İki gün sonra puromisindir seçimi, büyüme orta kaldırmak ve hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Büyüme orta ekleyin ve hücreleri bir CO2 kuluçka kadar kullanmak kültür.
Not: Bu yöntem stabil mt-Keima diğer hücre satırları ve primer hücre de dahil olmak üzere, hızlı hücreler üretmek için uygulanabilir.
- Plaka 5 x 104 HeLa hücreleri 60 mm kültür tabağına 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C'de mt-Keima lentivirus hasat önce bir gün içeren DMEM ile Parkin (HeLa-Parkin) ifade.
2. inducing CCCP tedavi kullanarak ve FACS örnekleri hazırlama mitophagy
- MT-Keima 60 mm Kültür ifade plaka 5 x 104 HeLa-Parkin hücreleri 4 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin içeren DMEM ile bulaşık ve onları bir gün bir CO2 doku kültürü kuluçka 37 ° C'de için kültür.
- Ertesi gün büyüme orta kaldırmak ve taze DMEM 10 µM karbonil siyanür m-chlorophenylhydrazone (CCCP) içeren 4 mL ekleyin. HeLa-Parkin-mt-Keima hücreleri bir CO2 doku kuluçka 6 h için kuluçkaya.
- Büyüme orta 6 h daha sonra kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile tedavi bunları ayırmak ve tripsin büyüme orta % 10 içeren ekleyerek devre dışı bırakın FBS. Hücreleri 15 mL konik tüp içine aktarın.
- 500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi.
- Dikkatli aspirasyon tarafından büyüme orta kaldırmak ve 1 mL soğuk 1 x PBS hücrelerle resuspend.
- Hücreler uygun FACS tüp içine aktarmak ve buza koyun.
Not: Bulaşmamış HeLa hücreleri bir negatif kontrol hazırlayın.
Not: Buzda birkaç saat için uygun hücrelerdir ve mt-Keima floresan sinyallerini de kararlı kalır.
3. FACS Analizi mitophagy
Not: Bu çalışmada, hücreleri 405 nm ve 561-nm lazer ile donatılmış bir akış sitometresi ile analiz edildi. Hücreleri bir menekşe lazer ile heyecan (405 nm) 610 ± 10 nm sarı-yeşil lazer ile BV605 dedektörü ile tespit emisyon ile (561 nm) ile 610 ± 10 nm'de aynı anda bir PE-CF594 dedektörü tarafından algılanan emisyon (Şekil 1).
-
Perdeleme canlı hücreleri
- Akış Sitometresi ve bilgisayarı açın ve analiz yazılımı oturum.
- Yeni bir deneme oluşturmak veya varolan bir deney çoğaltabilirsiniz. Violet ile hücreleri heyecanlandırmak için (405 nm) ve sarı-yeşil (561 nm) lazerler ve emisyon 610 ± 10 nm dedektörü, algılamak, ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) gerekli fluorophores ise parametre penceresinde ek olarak BV605 ve PE-CF594 seçin.
Not: Tüm fluorophores doğrusal bir modda eklenmelidir. - Girdap kısaca hücre dağıtmak için her hücre örnek toplar.
- Mt-Keima lentivirus örnek enjeksiyon portu ile enfekte olmayan bir denetim HeLa-Parkin hücre örnek içeren tüpü yerleştirin ve sitometresi üzerinde "Çalıştır" düğmesine basın.
- FSC SSC karşı nokta mezarlığına hücreleri nokta Arsa ortasına yerleştirmek için FSC ve SSC gerilim ayarlayın.
- Canlı hücrelerin etrafında Çokgen simgesini kullanarak bir P1 kapı çizmek ve ölü hücreleri ve hücre artıkları (Şekil 2A) ortadan kaldırmak.
-
Mor ve yeşil lazer gerilimleri ayarlamak
- Mt-Keima lentivirus üzerinde örnek enjeksiyon ile enfekte içeren HeLa-Parkin hücreleri port ve sitometresi üzerinde "Çalıştır" düğmesine basın tüpü yerleştirin.
- BV605 nokta Arsa (405 nm) mt-Keima ifade HeLa-Parkin mt-Keima (Şekil 2B) ifade değil Denetim hücrelerden açıkça ayırt edici hücrelerdir BV605 gerilim SSC karşı ayarlayın.
- PE-CF594 nokta Arsa (561 nm) mt-Keima ifade HeLa-Parkin hücreleri kontrol hücreleri (Şekil 2B) açıkça ayırt edici SSC karşı PE-CF594 gerilim ayarlayın.
-
Mitophagy hücrelerde yüzdesi değerlendirmek
- BV605 PE-CF594 nokta Arsa doğrusal bir ölçek kullanarak karşı kazanmak. Mt-Keima ifade hücrelerin etrafında Çokgen simgesini kullanarak bir kapı çizin ve mt-Keima (Şekil 3A) ifade değil hücreleri ortadan kaldırmak. Mt-Keima floresan pozitif hücre nüfus "mt-Keima" kapısı olarak adlandırılır.
- BV605 PE-CF594 tek "mt-Keima" gösterilen karşı olan başka bir nokta çizim oluşturma-hücrelere geçişli. Bu nokta mezarlığına tedavi edilmezse mt-Keima pozitif hücrelerin etrafında bir kapı çizin. Bazal mitophagy aktivite kontrol HeLa hücreleri düşük ve PE-CF594/BV605, emisyon oranını 1'den. Bu kapı, böylece, "düşük" kapısı olarak adlandırılır.
- "Düşük" kapısının yukarıdaki bölge içeren başka bir kapı çizin. Hücreleri emisyon PE-CF594/BV605 (Şekil 3B), yüksek bir oranı yüksek mitophagy etkinliği ile diğer bir deyişle, hücreler içerdiğinden bu kapı "yüksek" kapısı olarak adlandırılır.
- "Yüksek" gate hücrelerde yüzdesini hesaplamak için "Nüfus hiyerarşi göster" menü. "Üst yüzde" (% üst) değerinin mt-Keima pozitif halk arasında "yüksek" gate hücrelerde yüzdesini temsil eder.
- "Mt-Keima" durdurma kapıda kaydetmek ve her örneği çalıştırmak için en az 10.000 olayları ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CCCP kaynaklı mitophagy HeLa-Parkin hücrelerdeki Akış Sitometresi Analizi örneği Şekil 4' te gösterilmiştir. Yukarıda açıklanan Akış Sitometresi Analizi yöntemi kullanılarak, biz "yüksek" gate mitophagic hücrelerde dramatik bir artış algılayabilir. "Yüksek" gate hücrelerinin yüzde 10 kat daha fazla tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında yükseltilmiştir. Mitophagy aktivite bu artış tamamen bafilomycin A (BFA) (Şekil 4A ve 4B) ile ortak tedavi tarafından kaldırıldı.
Resim 1 . Mitophagy akış sitometresi ile ölçmek için kullanılan yönteminin şematik Gösterim. Düzen hücreleri mitophagy akış sitometresi tarafından geçiren ölçmek için gerekli ana adımları özetliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Akış Sitometresi parametrelerini ayarlama. (A) Gating canlı hücre. Bir bölge canlı hücreler için FSC karşı ölü hücreleri ve hücre artıkları dışlamak için SSC arsa üzerinde tespit edilmiştir. (B) denetim HeLa kullanarak 405 nm ve 531-nm lazerler ayarlayarak hücreleri ve HeLa hücreleri ifade mt-Keima. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Mitophagic hücre oranı akış sitometresi tarafından hesaplanıyor. (A) mt-Keima ifade Gating HeLa hücreleri. (B) mitophagic hücreleri çoğunluğuna ve istatistik aracı kullanarak oran hesaplama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . CCCP kaynaklı mitophagy HeLa hücreleri akış sitometresi tarafından yapılan miktar. (A) mt-Keima ifade HeLa-Parkin hücreleri 10 µM CCCP 6 h ile veya olmadan 100 nM bafilomycin A (BFA) ile tedavi. Hücreleri BV605 ve PE-CF594 dedektörleri kullanarak FACS tarafından analiz edildi. (B) hücreleri ile PE-CF594/BV605 oranı yüksek ("yüksek") seçildi ve onların oran hesaplanır. Üç tekrarlanan deneylerin sonuçlarını standart sapmalar ile çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, mt-Keima ifade hücreleri hücresel mitophagy etkinliğini ölçmek için akış sitometresi kullanmanın hızlı ve hassas yöntemi mevcut. Mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri sergi PE-CF594 artan bir oranını (561 nm) / BV605 (405 nm) uyarma. Böylece, mitophagy etkinlik 561/405 oranı yüksek sergilenmesi hücre yüzdesi olarak ifade edilebilir. PE-CF594 bir nokta arsa üzerinde "yüksek" kapısı bölgesinde hücre yüzdesi hesaplanan (561 nm) BV605 karşı (405 nm), ve CCCP ile tedavi mitophagy HeLa-Parkin hücrelerinde artış indüklenen sonuçlar gösterdi. Biz daha önce mt-Keima lentivirus-aracılı overexpression kendisi mitokondriyal işlev veya hücresel Fizyoloji31etkileyeceğini gösterdi. Her ne kadar bizim el yazması göstermiştir bu Akış Sitometresi Analizi başarıyla algılayabilir Parkin ifade CCCP kaynaklı mitophagy yılında HeLa hücreleri, bu teknik mt-Keima tanıtımı sonra hücre herhangi bir türü için uygulanabilir. Biz daha önce bu hipoksi indüklenen mitophagy HeLa hücreleri ektopik Parkin ifade29olmadan tespit gösterdi. Buna ek olarak, bizim ve bu diğer gruplar da dahil olmak üzere önceki çalışmalarda mt-Keima floresan analiz primer hücre fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) gibi mitophagy tespit edebilen gösterdi ve HeLa, HEK293 ve SH-SY5Y hücreleri gibi hücreler ölümsüzleştirilmiş 28 , 29 , 32.
Onlar hızlı, tekrarlanabilir analizleri hücreleri31çok sayıda izin o diğer mikroskopi veya immunoblotting tabanlı mitophagy deneyleri ile karşılaştırıldığında, akış sitometresi deneyleri avantajlara sahip. Mikroskopi tabanlı analizleri, araştırmacı önyargı sonuçları deforme edebilirsiniz ise, bu nedenle, bu önyargı bir akış sitometresi deneyleri kullanırken mesele değil.
Az 1 x 106 Akış Sitometresi Analizi için gerekli hücrelerdir. Buna ek olarak, bir örnek Analizi sadece 1-2 dakika sürer çünkü örnekleri onlarca ilâ 1-2 saat içinde çözümlenebilir. Ayrıca, akış sitometresi deneyleri ile iyi duyarlılık mitophagic hücrelerde artar algılayabilir. Bizim Akış Sitometresi Analizi, 10 kat artış mitophagic hücreleri tedavi CCCP ile 6 h sonra tespit ettik.
Akış Sitometresi kullanarak mitophagy analiz etmek için kritik adım "yüksek" ve "düşük" kapıları doğru mitophagy yüksek düzeyde geçiren hücreleri ayırt etmek için ayarlamaktır. Bazal mitophagy seviyeleri hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir, "yüksek" ve "düşük" geçit ayarlama bazı hücre hatlarında zor olabilir. Böyle bir durumda, HeLa hücreleri gibi düşük bazal mitophagy aktivite ile kontrol hücre satırı eklemek yararlıdır. Buna ek olarak, klorokin gibi lizozomal bir önleyici ile tedavi hücreler için bafilomycin A doğru çoğunluğuna yukarı ayarlamak için düşük mitophagy denetimi olarak dahil edilebilir. Lentiviruses ilginç proteinler ektopik ifade için yaygın olarak kullanılmasına rağmen bazı hücre satırları virüs enfeksiyonu için duyarlı olabilir. Lentivirus enfeksiyon hücre büyümesini veya mitokondri işlev değişiklikleri sonuçlanırsa, başka bir yöntem mt-Keima ifade için düşünülmelidir. Mt-Keima ifade düzeyini de hücre türüne bağlı olarak değişebilir. Mt-Keima floresan sinyal çok zayıf veya çok heterojen ise, yalnızca güçlü mt-Keima floresan sinyal hücreleri hücre sıralayıcısı veya yine birkaç gün daha yüksek bir konsantrasyon puromisindir antibiyotik ile tedavi mt-Keima hücreleri kullanarak toplanabilir . Mt-Keima sinyal müstakil hücre istikrarlı sürece hücreleri uygulanabilir, ancak örnekleri akış sitometresi tarafından mümkün olduğunca hızlı bir şekilde analiz öneririz.
Bizim akış sitometresi tahlil, mitophagy analiz için sağlam ve uygun bir yöntem olmakla birlikte, bazı sınırlamalar vardır. Hücreleri tek hücre düzeyi için akış sitometresi olarak ayrılması gerektiğini, ilk olarak, bu yöntem doku veya organ mitophagy fizyolojisi değiştirmeden analiz etmek için uygulamak zor çünkü. Ayrıca, mt-Keima floresan pH bağımlı özellikleri fiksasyon sonra kaybeder ve böylece, tüm örneklerin canlı hücreler olarak analiz edilmelidir. Bu yukarıda belirtilen örnek depolama sınırlaması ve başka bir sınırlama bir ek ayirt leke uygularken sonuçlanır. Bu teknik mitophagy aktivitesinin kantitatif ölçüm yapabilir miyim ama mitokondrial morfoloji veya mitophagy işlemi9' önemli roller oynamak için bilinen dynamics, değişiklikleri izlemek değiştiremiyor. Araştırmacılar karmaşıklığı ve mitophagy belirsiz yönlerini tutmalı. Bu nedenle, olası hata önlemek için mitophagy işlemi daha fazla elektron mikroskobu, mitokondrial protein ciro, bir azalma dahil olmak üzere diğer ortak mitophagy analiz yöntemleri kombine sonuçlarını tarafından onaylanması daha önce açıklanan33,34,35mitokondrial DNA ve mitokondri organellerin veya autophagosomes olarak colocalization ölçme floresans mikroskobu. Mitophagy herhangi bir gözlenen artış da daha fazla hücre mt-Keima ifade confocal mikroskobu ile incelenebilir. Mitophagic hücrelerde, mt-Keima parlak punctate desen confocal mikroskobu28,29altında gözlenen yüksek bir 586/440 oranı ile ifade edilir.
Hızlı ve hassas mitophagy algılamak için onun yetenek göz önüne alındığında, bu akış sitometresi tahlil çalışmaları çeşitli için değerli bir ilk adım yaklaşım sağlar. Sadece mt-Keima lentivirus içeren hücreleri bulaşmasını tarafından mitophagy faaliyet değişiklikleri kolayca istenen herhangi bir hücreye bir ölçü olabilir. Hücre sıralayıcısı işlevi ile birlikte, mitophagy faaliyet belirli bir düzeyde içeren hücreler olabilir özellikle izole ve rolleri ve düzenleyici mekanizmaları mitophagy altında yatan çalışırdım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser (J. U. için) Ulusal Araştırma Vakfı Kore'den (2016R1D1A1B03931949), bir hibe ve Kore (NMG) hibe (için J.Y Kore government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir .)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientific | R0531 | |
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
References
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Kang, D., Hamasaki, N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging. BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).
- Yun, J., Finkel, T.
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival. Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).
- Um, J. H., Yun, J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).
- Al Rawi, S., et al. Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission. Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).
- Kim, M. J., et al. SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages. Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).
- Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation. BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).
- Sandoval, H., et al. Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).
- Sato, M., Sato, K. Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos. Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).
- Geisler, S., et al. PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Kubli, D. A., et al. PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes. PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. The emerging links between sirtuins and autophagy. Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).
- Sun, N., et al. Measuring In vivo Mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Denison, S. R., et al. Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers. Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: Basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).
- Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy. Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).
- Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice. Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).
