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Biology

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/58099
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 1,2
1Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 3Aging Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Mitophagy, a degradação seletiva da mitocôndria, tem sido implicada na homeostase mitocondrial e é desregulamentado em várias doenças humanas. No entanto, convenientes métodos experimentais para medir a atividade de mitophagy são muito limitados. Aqui, nós fornecemos um ensaio sensível para medir a atividade de mitophagy usando citometria de fluxo.

Abstract

Mitophagy é um processo de remoção seletiva de mitocôndrias danificadas ou desnecessárias usando máquinas de autofagia. Foram encontradas relações estreitas entre mitophagy defeituoso e várias doenças humanas, incluindo doenças neurodegenerativas, câncer e doenças metabólicas. Além disso, estudos recentes têm mostrado que mitophagy está envolvido em processos celulares normais, tais como a diferenciação e desenvolvimento. No entanto, o papel preciso da e mecanismos moleculares subjacentes mitophagy exigem um estudo mais aprofundado. Portanto, é fundamental para desenvolver um método robusto e conveniente para medir as mudanças na atividade de mitophagy. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para avaliar quantitativamente a atividade mitophagy através de citometria de fluxo usando a proteína fluorescente mitocôndrias-alvo Keima (mt-Keima). Este ensaio de citometria de fluxo pode analisar a atividade do mitophagy mais rapidamente e com sensibilidade que os métodos convencionais microscopia ou immunoblotting-based. Este protocolo pode ser aplicado para analisar a atividade mitophagy em vários tipos de células.

Introduction

As mitocôndrias são organelas que são essenciais para a fisiologia e a proliferação celular. As mitocôndrias são responsáveis pela geração de mais de 80% da fonte de ATP via fosforilação oxidativa, e eles também fornecem vários intermediários metabólicos para biossíntese e metabolismo de1,2. Além de seus papéis no abastecimento de energia e metabolismo, as mitocôndrias desempenham um papel central na muitos outros processos importantes, incluindo a geração de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio, a regulação da morte celular e Ca2 + dinâmica intracelular3 . Alterações na função mitocondrial têm sido associadas com doenças humanas, incluindo o câncer, diabetes mellitus e neurodegenerativas várias doenças4,5. Aumento de disfunção mitocondrial e mutações de DNA mitocondriais também são pensadas para contribuir para processos de envelhecimento normal a6,7,8. Portanto, o controle de qualidade é uma questão crucial nas mitocôndrias. As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que continuamente podem mudar a sua forma entre redes alongadas e formulário curto, fragmentado. Dinâmica de mitocôndrias desempenha um papel importante em manter a função das mitocôndrias, bem como a sua degradação a mitophagy9.

Mitophagy é um mecanismo que envolve a degradação seletiva de mitocôndrias inteira usando a maquinaria de autofagia. Mitophagy é o princípio mecanismo subjacente mitocondrial volume de negócios e a remoção de mitocôndrias danificadas ou disfuncionais. Neste processo, as mitocôndrias são primeiro rodeadas por uma membrana, resultando na formação de autophagosomes, que depois se fundem com lisossomos para degradação hidrolítica9. Estudos genéticos anteriores em Drosophila sugeriram que dois genes relacionados com a doença de Parkinson, induzida por PTEN putativa quinase 1 (PINK1) (PARK6) e Parkin (PARK2), funcionam na mesma via10,11. Subsequence estudos têm demonstrado que a via PINK1-Parkin é responsável por eliminar as mitocôndrias danificadas e defeitos deste resultado de percurso em mitophagy disfuncional e pode contribuir para doenças humanas12,13. Recentemente foram encontrados em várias doenças humanas, incluindo câncer, doenças cardíacas, doenças do fígado e de doenças neurodegenerativas 14defeitos em processos de mitophagy. Além disso, estudos recentes têm mostrado também que mitophagy é fundamental para muitos processos fisiológicos, tais como a diferenciação, desenvolvimento e a resposta imune15,16,17,18 ,19, sugerindo que mitophagy pode desempenhar um papel mais ativo no controle de funções de células.

Apesar da recente confirmação que mitophagy desempenha um papel importante no controle de qualidade tanto em mitocôndrias e doenças humanas, os mecanismos moleculares subjacentes mitophagy permanecem mal compreendido. Embora mecanismos relacionados com mitophagy têm sido sistematicamente estudados em levedura, estudos vistos explorar mecanismos relacionados com mitophagy em células de mamíferos têm focado principalmente via PINK1-Parkin. Estudos anteriores estabeleceram que o pathway PINK1-Parkin é principalmente responsável para a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas através de mitophagy12,20,21. No entanto, estudos recentes têm relatado que, em alguns modelos, mitophagy pode ser ativado mesmo na ausência de funcional PINK122,23,24. Estes resultados sugerem que além da via PINK1-Parkin, lá uma adicional via não identificada que pode ativar o mitophagy.

A ausência de um método conveniente para avaliar a atividade de mitophagy é um grande obstáculo para explorar os caminhos que regulam a mitophagy e o seu papel em eventos fisiopatológicos. Microscopia eletrônica é uma poderosa ferramenta para visualizar diretamente as mitocôndrias autophagosome-tragado. No entanto, a microscopia eletrônica tem limitações para quantificar a atividade de mitophagy. Embora as estratégias que usam microtubule-associada da proteína-1 luz corrente 3 (LC3)-conjugadas sondas fluorescentes, tais como a GFP-LC3, são atualmente as abordagens mais amplamente utilizado,25, a natureza transitória do sinal LC3-baseado e sua alta taxa de sinais de falso-positivos limitam sua sensibilidade para a detecção de mitophagy em células26. A combinação da mancha ocidental para medir o nível de proteína mitocondrial, a quantificação do DNA mitocondrial e análise de microscopia de fluorescência para colocalize mitocôndrias com autophagosomes ou lisossomos pode ser uma boa abordagem para a avaliação mitophagy. No entanto, limitações de quantificação e falta de conveniência das metodologias existentes exigem novas abordagens. A introdução de uma nova proteína fluorescente dependente do pH, o alvo mitocondrial Keima (mt-Keima), melhorou muito a capacidade de detectar mitophagy27. Fundindo a sequência mitocondrial-direcionamento de subunidade de citocromo c oxidase VIII (VIII COX) em Keima, mt-Keima é direcionado para a matriz mitocondrial. A grande mudança no pico da excitação de Keima de 440 nm a 586 nm (correspondente a pH 7 e pH 4, respectivamente) pode ser utilizada para avaliar a mitophagy com boa sensibilidade em ambos in vitro e in vivo experimentos28,29 . Mais importante, a resistência de mt-Keima a degradação lisossomal faz com que a integração do sinal do mt-Keima em lisossomos, permitindo a fácil medição quantitativa da atividade mitophagy. A mudança de fluorescência que ocorre no mt-Keima pode ser analisada usando qualquer microscopia confocal ou fluxo cytometry28,29. No entanto, um método baseado em citometria de fluxo para medir a atividade de mitophagy usando mt-Keima não foi apresentado em detalhe a data.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade de mitophagy nas células usando mt-Keima. Embora nós mostramos aqui que análise de citometria de fluxo detectado com sucesso mitophagy CCCP-induzida em células HeLa, expressando Parkin, esta técnica pode ser aplicada a uma ampla variedade de tipos de células.

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Protocol

1. geração de células HeLa expressando mito-Keima (mt-Keima)

  1. Preparação de lentivirus mt-Keima
    1. Revestir uma placa de cultura de 100-mm, adicionando 2 mL de 0,001% poli-L-lisina/fosfato-salino (PBS) e deixe repousar durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Remover a solução de poli-L-lisina, usando uma pipeta de vidro ligada a um vácuo e lavar o prato de cultura, adicionando 2 mL de 1X PBS.
    3. Placa de 1,5 x 106 HEK293T células na cultura revestida prato com 10 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos CO2 por um dia.
    4. Transfect 2 µ g de mt-Keima particulas de Lentivirus shRNA29 DNA juntamente com embalagem DNAs (psPAX 2 µ g e pVSVG 0,25 µ g) usando um reagente de Transfeccao para 8 h de acordo com as instruções do fabricante.
    5. Remova a mídia do transfection e adicionar 8 mL de mídia fresca.
    6. Recolha a mídia que contém partículas virais 48 h mais tarde. Remover restos celulares da mídia coletada por centrifugação a 500 x g durante 5 min e filtrá-los com um filtro de seringa de 0,45 µm.
      Nota: Para uso a longo prazo, fazer alíquotas de particulas de Lentivirus e armazenar as amostras a-80 ° C. Não submeter as amostras virais para congelamento-descongelamento ciclos eficientes de infecção viral.
  2. Infectando as células HeLa-Parkin com mt-Keima lentivirus
    1. Placa de 5 x 104 as células HeLa expressando Parkin (HeLa-Parkin) em um prato de cultura de 60-mm com 4 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina a 37 ° C, um dia antes da colheita do lentivirus mt-Keima.
      Nota: Por causa da ausência de expressão de Parkin endógena em HeLa células30, as células HeLa-Parkin usadas aqui para mais claramente mostrar CCCP-induzida mitophagy. Este procedimento também pode ser aplicado a outras linhas de célula primária ou imortalizado.
    2. Remover o meio de crescimento, no dia seguinte e adicione 1 mL de Lentivirus mídia mt-Keima. Adicione um adicional 2 mL de meio de cultura contendo 3 µ l de solução-mãe de polybrene (8 mg/mL em água destilada). Incube durante um dia em uma incubadora de cultura de tecidos CO2 .
    3. Retire a mistura de Lentivirus de mt-Keima no dia seguinte e lavar as células duas vezes com PBS 1x. Adicionar 4 mL de meio de crescimento e tratar as células com 2 puromicina µ g/mL para dois dias.
    4. Após dois dias de puromicina, retire o meio de crescimento e lave as células duas vezes com 1X PBS. Adicionar meio de crescimento e cultura das células numa incubadora de CO2 até o uso.
      Nota: Esse método pode ser aplicado para gerar células que expressam estàvel mt-Keima, incluindo outras linhas de células e as células primárias.

2. indução de mitophagy usando CCCP tratamento e preparação de amostras de FACS

  1. Placa de 5 x 104 HeLa-Parkin células expressando mt-Keima em uma cultura de 60mm prato com 4 mL de DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura-los por um dia a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos CO2 .
  2. Retire o meio de crescimento no dia seguinte e adicione 4 mL de DMEM fresco contendo 10 µM carbonila cianeto m-clorofenilhidrazone (CCCP). Incube as células HeLa-Parkin-mt-Keima numa incubadora de tecido CO2 para 6 h.
  3. Retire o meio de crescimento 6 h depois e lave as células com 2 mL de 1X PBS. Separar as células, tratando-as com solução de tripsina/EDTA e inativar a tripsina pela adição de meio de cultura contendo 10% FBS. Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL.
  4. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min.
  5. Cuidadosamente Retire o meio de crescimento por aspiração e ressuspender as células com 1 mL de PBS 1x frio.
  6. Células de transferência para o tubo de FACS apropriado e coloque-o no gelo.
    Nota: Prepare as células de HeLa não infectadas como controlo negativo.
    Nota: As células são viáveis no gelo durante várias horas, e sinais de fluorescência de mt-Keima também permanecem estáveis.

3. análise FACS de mitophagy

Nota: Neste estudo, as células foram analisadas com um citômetro de fluxo, equipado com um laser 405 nm e 561-nm. Células estavam animadas com um laser violeta (405 nm) com emissão detectada em 610 nm ± 10 com um detector de BV605 e com um laser verde-amarelo (561 nm) com emissão detectada em 610 nm ± 10 por um detector de PE-CF594 simultaneamente (Figura 1).

  1. Retenção de células vivas
    1. Ligue o citômetro de fluxo e o computador e logar o software de análise.
    2. Gerar uma nova experiência ou duplicar uma experiência existente. Para excitar as células com a violeta (405 nm) e verde-amarelo (561 nm) lasers e detectar emissões no detector de nm ± 10 610, selecione BV605 e PE-CF594 além de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) na janela de parâmetro como fluorophores necessária.
      Nota: Todos os fluorophores deve ser adicionados em um modo linear.
    3. Vórtice cada amostra de célula brevemente para dispersar a célula agrega.
    4. Colocar o tubo contendo uma amostra de célula HeLa-Parkin de controle que não está infectada com mt-Keima lentivirus na porta de injeção de amostra e carregue no botão "executar" o citômetro.
    5. Na trama do ponto do FSC contra SSC, ajuste a voltagem FSC e SSC para colocar pilhas no centro da trama do ponto.
    6. Desenhar uma porta P1 usando o ícone de polígono ao redor de células vivas e eliminar as células mortas e detritos celulares (Figura 2A).
  2. Ajustar voltagens para laser violeta e verde
    1. Coloca o tubo contendo as células HeLa-Parkin infectadas com mt-Keima lentivirus sobre a injeção de amostra da porta e carregue no botão "executar" o citômetro.
    2. Na trama do ponto de BV605 (405 nm) contra SSC, ajustar a tensão de BV605 para que as células HeLa-Parkin expressando mt-Keima distinguem-se claramente das células de controle que não expressam mt-Keima (Figura 2B).
    3. Na trama do ponto de PE-CF594 (561 nm) contra SSC, ajustar a tensão de PE-CF594 para que as células HeLa-Parkin expressando mt-Keima distinguem-se claramente das células de controle (Figura 2B).
  3. Avaliar a percentagem de células em mitophagy
    1. Adquira a BV605 contra a trama do ponto do PE-CF594 usando uma escala linear. Desenhar uma porta usando o ícone de polígono ao redor de células expressando mt-Keima e eliminar as células não expressando mt-Keima (Figura 3A). A população de fluorescência-positivo celular mt-Keima é referida como o "mt-Keima" portão.
    2. Criar outra trama do ponto de BV605 contra CF594-PE mostrando somente "mt-Keima"-condomínio fechado de células. Nesta trama de ponto, desenhe um portão ao redor não tratadas células de mt-Keima-positivo. A atividade de mitophagy basal de controle HeLa células é baixa, e a relação das emissões em PE-CF594/BV605 é menor que 1. Assim, este portão é referido como o "baixo" portão.
    3. Desenhe outro portal que contém a região acima do portão "baixa". Este portão é referido como o "alto" portão porque ele contém células com mitophagy de alta atividade, isto é, células com uma alta proporção de emissões no PE-CF594/BV605 (Figura 3B).
    4. Para calcular a percentagem de células no portão "alta", selecione o menu "Mostrar hierarquia de população". O valor de "Por cento do pai" (% pai) representa a porcentagem de células em "alta" portão entre a população de mt-Keima-positivo.
    5. Defina pelo menos 10.000 eventos para gravar no portão "mt-Keima" parar e executar cada amostra.

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Representative Results

Um exemplo da análise de citometria de fluxo de mitophagy CCCP-induzida em células HeLa-Parkin é mostrado na Figura 4. Usando o método de análise de citometria de fluxo descrito acima, podemos detectar um aumento dramático em células mitophagic na porta do "alta". A percentagem de células no portão "alta" foi aumentada mais de 10-fold em comparação com células controle não tratados (Figura 4A). Este aumento na atividade de mitophagy foi completamente abolido pela co tratamento com bafilomycin A (BFA) (Figura 4A e 4B).

Figure 1
Figura 1 . Representação esquemática do método usado para medir a mitophagy com citometria de fluxo. O esquema descreve as principais etapas necessárias para quantificar células em fase mitophagy por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Definindo o fluxo citômetro parâmetros. (A) Gating de células vivas. Determinou-se uma região de células vivas sobre o FSC contra enredo SSC para excluir as células mortas e detritos celulares. (B) ajustando os lasers de 405 nm e 531 nm usando controle HeLa células e HeLa células expressando mt-Keima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Calcular a proporção de células mitophagic por citometria de fluxo. (A) células HeLa Gating expressando mt-Keima. (B) retenção de células mitophagic e calcular a proporção usando a ferramenta de estatísticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Quantificação de mitophagy CCCP-induzida em células HeLa por citometria de fluxo. (A) células HeLa-Parkin expressando mt-Keima foram tratadas com 10 µM CCCP para 6 h com ou sem 100 nM bafilomycin A (BFA). As células foram analisadas pela FACS usando detectores BV605 e PE-CF594. (B) células com uma alta proporção de PE-CF594/BV605 foram Selecionadodas ("alto"), e sua proporção foi calculada. Os resultados dos três experimentos repetidos são plotados com desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, apresentamos um método rápido e sensível para a utilização de citometria de fluxo para medir a atividade celular mitophagy em células expressando mt-Keima. Passando por um elevado nível de mitophagy de células apresentam uma maior proporção de PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitação. Assim, a atividade mitophagy pode ser expressa como a porcentagem de células exibindo um elevado rácio de 561/405. Calculámos a percentagem de células na região de portão "alto" em um terreno de ponto de PE-CF594 (561 nm) contra BV605 (405 nm), e os resultados mostraram que o tratamento com CCCP induzido aumento mitophagy em células HeLa-Parkin. Demonstramos anteriormente que a superexpressão mediada por lentivirus de mt-Keima não se afeta função mitocondrial ou fisiologia celular31. Embora temos mostrado em nosso manuscrito que análise de citometria de fluxo com êxito pode detectar mitophagy induzida por CCCP em HeLa células expressando Parkin, esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula depois de introduzir o mt-Keima. Mostramos anteriormente que mitophagy induzida por hipóxia pode ser detectada em células HeLa sem gravidez ectópica Parkin expressão29. Além disso, estudos anteriores, incluindo nossos e dos outros grupos, mostraram que a análise de fluorescência de mt-Keima pode detectar mitophagy em células primárias, tais como fibroblasto embrionário de rato (MEFs) e imortalizadas células como as células HeLa, HEK293 e SH-SY5Y 28 , 29 , 32.

Em comparação com outros ensaios de microscopia-immunoblotting baseado ou mitophagy, ensaios de citometria de fluxo têm vantagens em que eles permitem análises rápidas, reprodutíveis de grandes números de células31. Portanto, Considerando que em análises baseadas em microscopia, o viés do pesquisador podem distorcer os resultados, este preconceito não é um problema quando utilizando ensaios de citometria de fluxo.

Menos de 1 x 106 células são necessárias para a análise de citometria de fluxo. Além disso, a análise de uma amostra leva apenas um ou dois minutos, até dezenas de amostras pode ser analisado dentro de uma a duas horas. Além disso, ensaios de citometria de fluxo podem detectar aumentos nas células mitophagic com boa sensibilidade. Na nossa análise de citometria de fluxo, detectamos um aumento de 10 vezes nas células mitophagic após 6 h de tratamento com CCCP.

O passo crítico para a análise de mitophagy usando citometria de fluxo é definir as "altas" e "baixas" gates corretamente para distinguir células passando por um elevado nível de mitophagy. Porque os níveis basais de mitophagy podem ser diferentes dependendo do tipo de célula, definir o portão "alto" e "baixo" pode ser difícil em algumas linhas de célula. Nesse caso, é útil incluir uma linha de celular controle com mitophagy basal baixa atividade, como as células HeLa. Além disso, para as células tratadas com um inibidor dos lisossomos como cloroquina, bafilomycin A pode ser incluído como um controle de baixa mitophagy para configurar o canal correto. Embora lentivírus são comumente usados para a expressão ectópica de proteínas interessantes, algumas linhas de células podem ser suscetíveis à infecção pelo vírus. Se a própria infecção lentivirus resulta em alterações no crescimento celular ou função da mitocôndria, outro método deve ser considerado para a expressão de mt-Keima. O nível de expressão de mt-Keima também pode variar dependendo do tipo de célula. Se o sinal de fluorescência do mt-Keima é muito fraca ou muito heterogêneos, apenas as células com um sinal de fluorescência forte mt-Keima podem ser recolhidas usando um classificador de célula ou células de mt-Keima tratadas novamente com uma maior concentração de antibióticos puromicina durante vários dias . O sinal de mt-Keima das células desanexados são estáveis, enquanto as células são viáveis, mas recomendamos que a análise das amostras por citometria de fluxo mais rápido possível.

Nosso ensaio de citometria de fluxo é um método robusto e conveniente para a análise de mitophagy, mas existem algumas limitações. Primeiro, porque as células devem ser separadas como um única célula nível por citometria de fluxo, este método é difícil aplicar para analisar a mitophagy dos tecidos ou órgãos sem alterar a fisiologia. Além disso, mt-Keima fluorescência perde suas características de pH-dependente após a fixação, e assim, todas as amostras devem ser analisadas como células vivas. Isso resulta na limitação de armazenamento de amostra acima mencionado e outra limitação ao aplicar uma mancha de imunofluorescência adicionais. Esta técnica pode medir a atividade mitophagy quantitativamente, mas é incapaz de monitorar as alterações na morfologia mitocondrial ou dinâmica, que é conhecida por desempenhar um papel importante no processo de mitophagy9. Pesquisadores devem ter em mente a complexidade e aspectos indeterminados de mitophagy. Portanto, para evitar possível erro de julgamento, o processo de mitophagy deve ser ainda mais confirmado pelos resultados combinados de outros métodos de análise de mitophagy comum, incluindo microscopia eletrônica, volume de negócios de proteína mitocondrial, uma redução em DNA mitocondrial e microscopia de fluorescência, medindo o colocalization de mitocôndrias com lisossomos ou autophagosomes como descrevem anteriormente,33,34,35. Qualquer aumento observado de mitophagy também pode ser analisado através de microscopia confocal de células expressando mt-Keima. Em células mitophagic, mt-Keima é expresso em um padrão punctate brilhante com uma alta proporção de 586/440 que pode ser observado sob microscopia confocal28,29.

Dada a sua capacidade de rapidamente e com sensibilidade detectar mitophagy, este ensaio de citometria de fluxo fornece uma aproximação do primeiro passo que seria valiosa para uma variedade de estudos. Ao simplesmente infectar células com o mt-Keima lentivirus, alterações da atividade mitophagy podem ser facilmente medida em qualquer tipo de célula desejada. Em combinação com a função de classificador de célula, células com um nível específico de atividade mitophagy podem ser especificamente isoladas e usadas para estudar as funções de e mecanismos reguladores subjacentes mitophagy.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma concessão do National Research Foundation da Coreia (2016R1D1A1B03931949) (de J. U.) e pela Fundação de pesquisa nacional de concessão de Coreia (NRF), financiado pela government(MSIT) da Coreia (n. º 2016R1A2B2008887, n. º 2016R1A5A2007009) (para J.Y .)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
HEK293T ATCC CRL-3216
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
Turbofect Thermos scientific R0531
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
HeLa ATCC CCL-2
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/ml
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) Sigma-Aldrich C2759 10 mM
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa BD Bioscience LSRFortessa
FACSDIVA BD Bioscience FACSDIVA (v8.0.1)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima
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Um, J. H., Kim, Y. Y., Finkel, T., Yun, J. Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima. J. Vis. Exp. (138), e58099, doi:10.3791/58099 (2018).

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